Name: Testowanie przeciwciał przeciwko receptorom anty-RDL i anty-mGlutR1 w skrawkach mózgu pszczoły miodnej przy użyciu CRISPR-Cas9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Poznaj edycję genów CRISPR-Cas9 w mózgu pszczoły miodnej w celu badania receptorów GABAA i glutaminowych. Ta metoda umożliwia testowanie specyficzności przeciwciał oraz analizę funkcji białek w uczeniu się i pamięci.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została wsparta następującymi nagrodami dla BHS: Human Frontiers Science Program; NIH NIGMS (R01 GM113967); Laboratorium Pomysłów NSF (1556337). Peptyd i przeciwciała przeciwko DmGluRA zostały zaprojektowane w laboratorium dr Serge'a Birmana (Marsylia, Luminy, Francja), gdy IS było wspierane przez Programme d'Urgence FRM/Postdocs UFP20060306548 z Fondation pour la Recherche Medicale. Jesteśmy wdzięczni Danieli Junqueira Marosi i Alexowi Hanterowi z Integrated DNA Technology (IDT) za pomoc w projektowaniu przewodników RDL i testów qPCR.

<ol><li>Harms, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Genome+Editing+Using+the+CRISPR%2FCas+System%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System.</a> Current Protocols in Human Genetics. 83 (15), 7-27 (2014).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Kouranova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRs+for+Optimal+Targeting%3A+Delivery+of+CRISPR+Components+as+DNA%2C+RNA%2C+and+Protein+into+Cultured+Cells+and+Single-Cell+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">CRISPRs for Optimal Targeting: Delivery of CRISPR Components as DNA, RNA, and Protein into Cultured Cells and Single-Cell Embryos.</a> Human Gene Therapy. 27 (6), 464-475 (2016).</li>
<li>Schubert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+labeled+tracrRNA+provides+efficient+genome+editing+while+allowing+cellular+microscopy+and+FACS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Editing%22%5BJournal%5D)">Fluorescently labeled tracrRNA provides efficient genome editing while allowing cellular microscopy and FACS analysis.</a> Genome Editing. , www.idtdna.com 1-3 (2017).</li>
<li>Kucharski, R., Mitri, C., Grau, Y., Maleszka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+metabotropic+glutamate+receptor+in+the+honeybee+%28Apis+mellifera%29%3A+implications+for+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of a metabotropic glutamate receptor in the honeybee (Apis mellifera): implications for memory formation.</a> Invertebrate Neuroscience. 7 (2), 99-108 (2007).</li>
<li>Aronstein, K., Auld, V., Ffrench-Constant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+two+GABA+receptor-like+subunits+in+the+Drosophila+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distribution of two GABA receptor-like subunits in the Drosophila CNS.</a> Invertebrate Neuroscience. 2 (2), 115-120 (1996).</li>
<li>Thompson, M., Steichen, J. C., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+cyclodiene+insecticide+resistance-associated+mutations+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conservation of cyclodiene insecticide resistance-associated mutations in insects.</a> Insect Molecular Biology. 2 (3), 149-154 (1993).</li>
<li>Chung, B. Y., Kilman, V. L., Keath, J. R., Pitman, J. L., Allada, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GABA%28A%29+receptor+RDL+acts+in+peptidergic+PDF+neurons+to+promote+sleep+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The GABA(A) receptor RDL acts in peptidergic PDF neurons to promote sleep in Drosophila.</a> Current Biology. 19 (5), 386-390 (2009).</li>
<li>Taylor-Wells, J., Hawkins, J., Colombo, C., Bermudez, I., Jones, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+functional+expression+of+intracellular+loop+variants+of+the+honeybee+%28Apis+mellifera%29+RDL+GABA+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Cloning and functional expression of intracellular loop variants of the honeybee (Apis mellifera) RDL GABA receptor.</a> Neurotoxicology. 60, 207-213 (2017).</li>
<li>Jones, A. K., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cys-loop+ligand-gated+ion+channel+superfamily+of+the+honeybee%2C+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The cys-loop ligand-gated ion channel superfamily of the honeybee, Apis mellifera.</a> Invertebrate Neuroscience. 6 (3), 123-132 (2006).</li>
<li>Dupuis, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homomeric+RDL+and+heteromeric+RDL%2FLCCH3+GABA+receptors+in+the+honeybee+antennal+lobes%3A+two+candidates+for+inhibitory+transmission+in+olfactory+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Homomeric RDL and heteromeric RDL/LCCH3 GABA receptors in the honeybee antennal lobes: two candidates for inhibitory transmission in olfactory processing.</a> Journal of Neurophysiology. 103 (1), 458-468 (2010).</li>
<li>Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+early+olfactory+processing+by+an+octopaminergic+reinforcement+pathway+in+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee.</a> Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).</li>
<li>Guo, X., Wang, Y., Sinakevitch, I., Lei, H., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNAi+knockdown+effect+of+tyramine+receptor+1+induced+by+dsRNA+and+siRNA+in+brains+of+the+honeybee%2C+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNAi knockdown effect of tyramine receptor 1 induced by dsRNA and siRNA in brains of the honeybee, Apis mellifera.</a> Journal of Insect Physiology. 111, 47-52 (2018).</li>
<li>Roth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+switch+for+worker+nutrition-mediated+traits+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">A genetic switch for worker nutrition-mediated traits in honeybees.</a> PLOS Biology. 17 (3), e3000171(2019).</li>
<li>Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Knockout+Mutants+by+CRISPR%2FCas9+in+the+European+Honeybee%2C+Apis+mellifera+L%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Science+%28BIOONE%29%22%5BJournal%5D)">Production of Knockout Mutants by CRISPR/Cas9 in the European Honeybee, Apis mellifera L.</a> Zoological Science (BIOONE). 33 (5), 505-512 (2016).</li>
<li>Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Efficiency+CRISPR%2FCas9-Mediated+Gene+Editing+in+Honeybee+Apis+mellifera+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-Efficiency CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing in Honeybee Apis mellifera Embryos.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).</li>
<li>Smith, B. H., Burden, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proboscis+Extension+Response+Protocol+for+Investigating+Behavioral+Plasticity+in+Insects%3A+Application+to+Basic%2C+Biomedical%2C+and+Agricultural+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51057(2014).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Protein Blotting Guide. , BIO-RAD. http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_2895.pdf (2019).</li>
<li>Rodriguez, J., Deinhardt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+semipermanent+mounting+medium+for+fluorescent+antibody+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Preparation of a semipermanent mounting medium for fluorescent antibody studies.</a> Virology. 12, 316-317 (1960).</li>
<li>Custom Alt-R® CRISPR-Cas9 guide RNA. , Integrated DNA Technologies. https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM (2019).</li>
<li>Bonnafe, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+thymol+application+on+olfactory+memory+and+gene+expression+levels+in+the+brain+of+the+honeybee+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollutant+Research+%28International%29%22%5BJournal%5D)">Effect of a thymol application on olfactory memory and gene expression levels in the brain of the honeybee Apis mellifera.</a> Environmental Science and Pollutant Research (International). 22 (11), 8022-8030 (2015).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+behaviorally+associated+gene+networks+in+worker+honeybee+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honeybee ovaries.</a> Journal of Experimental Biology. 215 (Pt 1), 124-134 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Charakterystyka anty-RDL i anty-mGlutR1 Po pierwsze, scharakteryzowaliśmy przeciwciała anty-RDL i anty-mGlutR1 za pomocą immunoblot i wstępnej adsorpcji na wycinkach utrwalonych mózgów pszczół miodnych. Każde przeciwciało zostało stworzone tak, aby rozpoznawać wszystkie znane mu izoformy, a zachodnie analizy pokazują, że rozpoznają one prążki, które odpowiadają ich przewidywanej masie cząsteczkowej. Następnie oba przeciwciała zostały zablokowane przez sprzężony peptyd, przeciwko któremu zostały wytworzone na odcinkach mózgu pszczoły miodnej.
Jednym z pierwszych celów naszego badania było ustalenie, że przeciwciała wytwarzane przeciwko specyficznemu sprzężonemu peptydowi są specyficzne dla jego białka w utrwalonej tkance mózgowej. W tym celu wykorzystaliśmy system CRISPR-Cas9. Zaprojektowaliśmy specjalne prowadnice dla pszczół miodnych RDL i mGlutR1 i użyliśmy każdego z nich do wykonania CRISPR-Cas9 znakowanego za pomocą sondy fluorescencyjnej ATTO550. Dla każdego receptora wstrzyknęliśmy mieszaninę trzech różnych rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 do ocelli, aby zmniejszyć ilość docelowego białka w mózgu dorosłej pszczoły miodnej poprzez wyeliminowanie odpowiedniego genu w komórkach, które przyjęły zaprojektowany przez nas system Cas9. W naszym badaniu wykonaliśmy ten krok.
Jednym z pierwszych kluczowych kroków dla powodzenia tych eksperymentów jest zaprojektowanie odpowiednich przewodników RNA. Zalecamy zaprojektowanie do pięciu przewodników RNA, znajdujących się na początku, w środku i na końcu sekwencji genu. W naszych wstępnych pracach przetestowaliśmy je w różnych kombinacjach na trzech do pięciu pszczołach. Próbowaliśmy również różnych stężeń zastrzyków, a także czasów po wstrzyknięciu oraz różnych mieszanek RNP w zastrzykach. Przeanalizowaliśmy mózgi i przetworzyliśmy je za pomocą przeciwciał anty-RDL i anty-mGlutR1. W tych wstępnych testach ustaliliśmy odpowiednią kombinację, czas po wstrzyknięciu, a także stężenie i ilość CRISPR-Cas9 do wstrzyknięcia. Te wstępne testy były podstawą do przeprowadzenia eksperymentów, które szczegółowo opisaliśmy tutaj.
Cel był dwojaki: 1) wykazanie na pszczole, że barwienie przeciwciał uległo zmniejszeniu po leczeniu CRISPR-Cas9 oraz 2) przepracowanie najlepszych warunków eksperymentalnych dla badań behawioralnych. W ten sposób pokazujemy, że jeśli wiele jąder komórkowych zawiera CRISPR-Cas9 48 godzin po wstrzyknięciu, redukcja barwienia anty-RDL i anty-mGlutR1 jest znacząca. Ponadto pokazuje to, że badane przeciwciała specyficznie rozpoznają białko mGlut1 i RDL w preparacie mózgu pszczoły miodnej i że mogą być wykorzystane do badań lokalizacyjnych w mózgu pszczoły miodnej.
Eksperymentalne ustawienie CRISPR-Cas9 do badania behawioralnego Następnie przeprowadziliśmy eksperymenty tak, aby CRISPR-Cas9 mógł być wykorzystany w badaniach behawioralnych. Zebrano osiem lub dziewięć pszczół miodnych do leczenia kontrolnego i eksperymentalnego. Zostali przebadani behawioralnie przed i po wstrzyknięciu, a następnie ich mózgi zostały przetworzone pod kątem ATTO550 i/lub immunocytochemii w celu określenia regionów mózgu, które wykazywały redukcję docelowego białka. W tym miejscu należy zauważyć, że liczba pszczół pobranych do jednego zestawu doświadczeń była ograniczona do nie więcej niż 8-9 pszczół w warunkach kontrolnych i doświadczalnych. W ten sposób oba warunki mogły zostać przetestowane tego samego dnia. Ponadto, gdy już przygotowaliśmy mieszanki CRISPR-Cas9 do wstrzykiwań, nigdy ich nie zamroziliśmy. Mieszanina CRISPR-Cas9 nie zmieniła swojej mocy, gdy była stosowana 3 dni z rzędu i przechowywana w temperaturze 4-8 °C. Nie testowaliśmy go jednak po 3 dniach.
Jak opisaliśmy w sekcji Wyniki dla obu zestawów eksperymentalnych zastrzyków i dla obu przeciwciał, tylko trzy pszczoły z 16 badanych wykazały dużą ATTO550 rozmieszczenia w ciele grzyba, protocerebru i płatach czułkowych. U wszystkich innych pszczół dystrybucja CRISPR-Cas9 była ograniczona do ciała grzyba, kompleksu centralnego i/lub tylnego protocerebrum. Istotne jest, aby zrozumieć dla wszelkich badań behawioralnych, że przy użyciu tej metody wstrzykiwania redukcja białka docelowego będzie ograniczona tylko do ciała grzyba u większości pszczół. Nie rozciąga się na płat antenowy ani zwój podprzełykowy. Tak więc technika iniekcji, której używamy, jest odpowiednia do badania efektu redukcji receptorów w ciele grzyba i kompleksie centralnym w eksperymentach behawioralnych, podczas gdy inna metoda wprowadzania CRISPR-Cas9 będzie bardziej odpowiednia do badania innych obszarów mózgu.
Podsumowując, nasze badanie wykazało udane zastosowanie CRISPR-Cas9 jako kontroli barwienia przeciwciał w mózgu. W przypadku obu przeciwciał (anty-RDL i anty-mGlutR1), gdy wychwyt mGlutR1-CRISPR-Cas9 lub RDL-CRISPR-Cas9 zakończył się sukcesem, poziom odpowiedniego barwienia przeciwciał również uległ znacznemu zmniejszeniu. Należy również zauważyć, że wstrzyknięcie do oczek doprowadziło do dystrybucji CRISPR-Cas9 w mózgu, która nie była jednorodna. Dystrybucja wahała się od minimalnego obszaru otaczającego oczka i ciało grzyba do wielu komórek w całym mózgu. Zmienność wychwytu mGlutR1-lub RDL-CRISPR-Cas9 przez komórki była prawdopodobnie spowodowana zmiennością w iniekcjach. Nasze dane pokazują, że system CRISPR-Cas9 działa u pszczół miodnych, ale metoda wstrzykiwania musi zostać ulepszona, aby zmniejszyć zmienność wchłaniania CRISPR-Cas9 w mózgach poszczególnych pszczół. W ramach tych ograniczeń możliwe jest teraz zastosowanie tej techniki do manipulowania genami u dorosłych pszczół w eksperymentach behawioralnych.

Niedawno odkryty system CRISPR/Cas9 jest potężnym narzędziem, które zostało użyte do zmiany genomowego DNA w różnych systemach modelowych i organizmach. Przyspieszyła ona badania biomedyczne i dokonała ważnych przełomów technologicznych, sprawiając, że modyfikacja genomu jest bardziej wydajna i solidna niż poprzednie metody1. Natywny dla bakterii S. pyogenes system opiera się na endonukleazie Cas9, której aktywność prowadzi do dwuniciowych pęknięć (DSB) w DNA, oraz przewodniku RNA (gRNA), który kieruje białko Cas9 do określonej, zależnej od sekwencji lokalizacji2. Dwuniciowe pęknięcia generowane przez CRISPR/Cas9 mogą być naprawiane poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), proces podatny na błędy, który może prowadzić do przesunięć ramki lub bezpośredniej naprawy homologii, gdy obecny jest szablon dawcy. Sam gRNA składa się z docelowego CRISPR RNA (crRNA) i uniwersalnego transaktywującego crRNA (tracrRNA), które mogą być chemicznie syntetyzowane i dostarczane z oczyszczoną nukleazą Cas9 jako kompleks rybonukleoproteinowy (RNP)2,3. Znakowanie fluorescencyjne nukleazy gRNA lub Cas9 może pozwolić na wykrycie i wewnątrzkomórkową wizualizację składników molekularnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej4.
W naszej obecnej pracy wykorzystujemy system CRISPR-Cas9 do obniżania poziomu białka w mózgach dorosłych pszczół miodnych. Badaliśmy metabotropowy receptor glutaminianu (mGluR) i przeciwciała receptora anty-mGlutR1 oraz podjednostkęreceptora GABA A RDL i przeciwciała anty-RDL. Opracowaliśmy prostą metodę zmniejszania ilości białka w mózgu dorosłej pszczoły miodnej i wykorzystaliśmy ją do przeprowadzenia dodatkowych testów przeciwciał wytworzonych przeciwko odpowiednim białkom. Monitorowanie fluorescencji CRISPR-Cas9 pozwoliło nam oszacować obszary i komórki zaangażowane w redukcję białka.
Korzystając z tej metody, scharakteryzowaliśmy również przeciwciała anty-mGlutR1, które zostały wytworzone u królików przeciwko sprzężonemu peptydowi. Genom pszczoły miodnej koduje wysoce konserwatywny receptor glutaminianu AmGluRA (nazwany mGlutR1 zgodnie z nomenklaturą NCBI) metabotropowy receptor glutaminianu 5. Gen mGlutR1 pszczoły miodnej ma cztery przewidywane warianty splicingu zgodnie z bazą danych NCBI. Doniesiono, że ulega ekspresji w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) zarówno w stadium poczwarki, jak i dorosłej pszczoły i bierze udział w tworzeniu pamięci długotrwałej5. Przeciwciała opracowane przeciwko mGlutR1 mogą być niezbędnym narzędziem do badania układu glutaminergicznego w procesie uczenia się i zapamiętywania u pszczół miodnych.
W naszych badaniach scharakteryzowaliśmy również przeciwciała anty-RDL wytworzone u królików immunizowanych sprzężonymi peptydami z podjednostki receptora RDL Apis mellifera. Gen Rdl pszczoły miodnej, AmRdl (XM_006565102.3, baza danych NCBI), ma 14 przewidywanych wariantów splicingu. Częściowo sklonowany fragment został zgłoszony w bazie danych NCBI AF094822.1. Funkcja receptora RDL i jego fizjologia jest dobrze zbadana u owadów6,7,8, w tym pszczoły miodne9,10,11. Przeciwciała wytworzone przeciwko anty-RDL mogą być niezbędnym narzędziem do badania układu GABA-ergicznego w procesie uczenia się i zapamiętywania u pszczół miodnych.
Wcześniejsze badanie nad rolą receptorów oktopaminy i tyraminy wykorzystywało RNAi wstrzykiwane do mózgu, a następnie testowano ilość białka za pomocą Western blot12,13. RNAi ma jednak pewne istotne ograniczenia. Po wstrzyknięciu RNAi istnieje tylko krótkie okno czasowe, w którym następuje redukcja białka13. CRISPR-Cas9 został niedawno użyty w zarodkach pszczół miodnych do usuwania lub modyfikowania genów w całym zwierzęciu14,15,16. Informowaliśmy o zastosowaniu CRISPR-Cas9 w celu zmniejszenia ilości białka w dorosłej pszczole miodnej. Opracowaliśmy to podejście dla pszczół miodnych ze względu na możliwość powiązania go z behawioralnymi badaniami uczenia się i pamięci w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych17.
W obecnej pracy opracowaliśmy przeciwciała przeciwko dwóm receptorom i przetestowaliśmy je na sekcjach mózgu dorosłej pszczoły miodnej po tym, jak białko zostało zredukowane przez wstrzyknięcie CRISPR-Cas9. Równolegle opracowaliśmy projekt eksperymentalny, który pozwala na wykorzystanie tej metody do eksperymentów behawioralnych.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283_100 mL</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Acrylamide-bis Acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>500 mL 1610156</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0169-250g</td><td>używany z wodą destylowaną do mocowania mózgu pszczoły miodnej w blokach</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment osła IgG anty-królika (H+L)</td><td>Jackson Laboratoria Badawcze</td><td>711-546-152</td><td>przeciwciało drugorzędowe w celu ujawnienia pierwszorzędowych przeciwciał z królika</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO</td><td>IDT</td><td>1075934</td><td>z zaprojektowanym przewodnikiem RNA, tworzy gRNA</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Nukleaza Cas9 V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td>enzym używany do wytwarzania rybonukleoproteiny dla systemu CRISPR</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Bio-RAD</td><td>10 g 1610700</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-mGlutR1</td><td>Covalab (FRANCJA)/21st Century Biochemical</td><td>scharakteryzowane przez autorów w niniejszej pracy</td><td>Stosowane do pierwotnej inkubacji mGlut 1 u pszczół miodnych Przeciwciała</td></tr><tr><td>anty-RDL</td><td>21st Century Biochemical</td><td>scharakteryzowane przez autorów w niniejszej pracy</td><td>Stosowane do pierwotnej inkubacji RDL u pszczół miodnych</td></tr><tr><td>Aprotynina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0001154</td><td>inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Barraquer Iris Nożyczki 7mm Ostrze Ostra końcówka</td><td>World Precision Instruments</td><td>14128-G</td><td>używane do preparacji mózgu pszczoły miodnej</td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12072</td><td>inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Ostrze (łamliwe) do uchwytu ostrza</td><td>Fine Science Tool</td><td>10050-00</td><td>rozwarstwienie do western blotting</td></tr><tr><td>Uchwyt ostrza i łamacz</td><td>Fine Science Tool</td><td>15309</td><td>rozwarstwienie do western blot</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100 F</td><td>do procedury iniekcyjnej</td></tr><tr><td>Chemiluminescencyjny substrat do wykrywania western blot</td><td>Bio-Rad</td><td>1705062</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472476-50mL</td><td>Izolacja RNA</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Łatwy zestaw DNA</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td>Ekstrakcja DNA</td></tr><tr><td>Zestaw bez DNA</td><td>INVITROGEN</td><td>AM1907</td><td>Służy do usuwania DNA</td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipeta, 3-pak</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24 Well Polistyren Multiwell</td><td>Falcon</td><td>351147</td><td>Multiwell</td></tr><tr><td>Kapsułki do zatapiania z płaskim dnem, Polietylenowa</td><td>mikroskopia elektronowa Science</td><td>70021</td><td>kosz na sekcje mózgu</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5 (para)</td><td>Narzędzie do nauki</td> o wysokiej jakości <td>11254-20</td><td>do sekcji mózgu pszczoły miodnej z głowy</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5S (para)</td><td>Narzędzie do nauki o czystości</td><td>11252-00</td><td>do oczyszczania mózgu z tchawicy przed rozbiorem</td></tr><tr><td>Gene Expression Master</td><td>Mix Zintegrowane technologie DNA</td><td>1055770</td><td>test</td></tr> <tr><td>zrzutu qPCRAldehyd glutarowy</td><td>EMS</td><td>16220</td><td>stosowany do otrzymywania koniugatów peptydowych do kontroli peabsorpcji</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500 mL</td><td>western blott, podłoża do zatapiania</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>1610718</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Hydrofobowa siatka nylonowa z filtrem hydrofobowym</td><td>Spectrum Labs</td><td>145910</td><td>na dno kosza na sekcje mózgu</td></tr><tr><td>Izopropyl alkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030-50mL</td><td>izolacja RNA</td></tr><tr><td>Dziurka od klucza hemocyjanina</td><td>likot Sigma-Aldrich</td><td>H7017</td><td>służy do przygotowania koniugatów do kontroli</td></tr><tr><td>Mikroskop kofokalny LSM800</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mGlu_Guide 1</td><td>IDT</td><td></td><td>zaprojektowany przewodnik RNA dla CRISPR-Cas 9. Docelowe sekwencje genomu mGlutR1</td></tr><tr><td>mGlu_Guide 2</td><td>IDT zaprojektowane przez IDT</td><td></td><td>przewodnikowe RNA dla CRISPR-Cas 9. Docelowe sekwencje genomu mGlutR1</td></tr><tr><td>mGlu_Guide 3</td><td>IDT zaprojektowane przez IDT</td><td></td><td>przewodnikowe RNA dla CRISPR. Docelowe sekwencje genomu mGlutR1 metanol</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>96-dołkowa mikropłytka PCR</td><td>Stosowany</td><td>test zrzutu 4346907 qPCR i mikropłytka qRT-PCR</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowa płytka do PCR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z374911</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904_500mL</td><td>do procedury iniekcyjnej</td></tr><tr><td>Model p87 Płonący brązowy ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>Preparat kapilarny</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>do zatapiania roztworu</td></tr><tr><td>Nanolitr 2000</td><td>World Precision Instruments Nanolitrowy</td><td></td><td>aparat iniekcyjny</td></tr><tr><td>Normalna surowica osła Jackson</td><td>Research Laboratories</td><td>AB_2337258</td><td>środek blokujący do immunocytochemii</td></tr><tr><td>Nieimmunologiczna surowica kozia</td><td>Invitrogen</td><td>50-062Z 100 ml</td><td>Środek blokujący do immunoblottingu</td></tr><tr><td>Bufor wolny od nukleaz</td><td>IDT</td><td>1072570</td><td>Bufor wolny od nukleaz, który jest używany do przygotowania iniekcji CRISPR-Cas9</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>IDT</td><td>AM9337</td> woda <td>wolna od nukleaz, która jest używana do przygotowania systemu CRISPR-Cas 9</td></tr><tr><td>OrbitalShaker Mp4</td><td>Genemate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500 g</td><td>używany z PBS do produkcji utrwalacza dla mózgów pszczół</td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-250 mg</td><td>inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>Stosowany z paraformaldehydem jako utrwalaczem; bufor dla przeciwciał</td></tr></tbody></table>

testowanie przeciwciał przeciwko receptorom anty-rdl i anty-mglutr1 w skrawkach mózgu pszczoły miodnej przy użyciu crispr-cas9

Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) to technika edycji genów szeroko stosowana w badaniach nad funkcją genów. Używamy tej metody w tym badaniu, aby sprawdzić swoistość przeciwciał opracowanych przeciwko podjednostce receptora GABAA owadów Oporność na dieldrynę (RDL) i metabotropowemu receptorowi glutaminianu mGlutR1 (mGluRA). Przeciwciała wytworzone były u królików przeciwko sprzężonym peptydom specyficznym dla muszek owocowych (Drosophila melanogaster), a także dla pszczół miodnych (Apis mellifera). Użyliśmy tych przeciwciał w skrawkach mózgu pszczoły miodnej do zbadania rozmieszczenia receptorów w mózgach pszczół miodnych. Przeciwciała oczyszczono pod kątem powinowactwa do peptydu i przetestowano za pomocą immunoblottingu i klasycznej metody preadsorpcji za pomocą koniugatów peptydowych, aby wykazać, że przeciwciała są specyficzne dla odpowiednich koniugatów peptydowych, przeciwko którym zostały wyhodowane. Tutaj opracowaliśmy technikę CRISPR-Cas9 do testowania redukcji docelowych białek w mózgu 48 godzin po wstrzyknięciu CRISPR-Cas9 z przewodnikowymi RNA zaprojektowanymi dla odpowiedniego receptora. Metoda CRISPR-Cas9 może być również stosowana w analizach behawioralnych u dorosłych pszczół, gdy konieczna jest modyfikacja jednego lub wielu genów.

Testy przeciwciał anty-RDL 
Przeciwciała zostały wytworzone przeciwko koniugatom peptydowym RDL, jak pokazano na Ryc. 1A. Pierwszym krokiem w charakterystyce przeciwciał anty-RDL jest analiza homogenatu białka wyekstrahowanego z mózgu pszczoły za pomocą techniki Western blot z użyciem przeciwciał anty-RDL oraz wtórnego przeciwciała koziego anty-króliczego IgG znakowanego HRP (Ryc. 1A, wstawka). Oba przeciwciała anty-RDL rozpoznały prążek znajdujący się na poziomie ~50-60 kD (strzałka), co odpowiada szacowanej masie białek izoform podjednostki RDL. Aby wykazać, że przeciwciała anty-RDL rozpoznają peptyd w przekrojach mózgu, zastosowano kontrolę z preadsorpcją (Ryc. 1B,C). Po preinkubacji przeciwciał z koniugatami peptydowymi barwienie na preparacie zniknęło. Dowiodło to, że przeciwciała anty-RDL rozpoznają koniugat peptydowy, przeciwko któremu zostały wytworzone. W celu wykazania, że przeciwciała anty-RDL rozpoznają białko w utrwalonej tkance mózgowej, wykorzystano system CRISPR-Cas9 do wyciszenia genu RDL odpowiedzialnego za produkcję białka RDL w komórkach. Ryc. 1D1-3 przedstawia kontrolne przekroje przedniej części mózgu pszczoły znakowane przeciwciałami anty-RDL. Pszczoła ta nie otrzymała wstrzykniętego kompleksu RDL-CRISPR-Cas9 RNP. Na Ryc. 1D1 przeciwciała anty-RDL znakują neuropile w przednim przekroju mózgu pszczoły. Ten sam przekrój przedni na Ryc. 1D2 wykazuje brak fluorescencji ATTO50, ponieważ kompleks RDL-CRISPR-Cas9 nie został wstrzyknięty.
Rysunek 1E1-E3 przedstawia przekrój mózgu pszczoły po wstrzyknięciu RDL-CRISPR-Cas 9 i poddaniu go obróbce z użyciem tej samej ilości przeciwciał, co w przypadku mózgu kontrolnego na Rysunku 1D1-D3. Barwienie anty-RDL było znacznie zredukowane w całym mózgu 48 h po wstrzyknięciu, a rozkład barwienia ATTO50 w mózgu (Rysunek 1E2) wskazuje na skuteczność wstrzyknięć RDL-CRISPR-Cas 9 do oczek median w u pszczoły. W wielu rozproszonych komórkach mózgu występuje ATTO50. Skuteczne wstrzyknięcie RDL-CRISPR-Cas 9 zredukowało ekspresję białka w porównaniu z grupą kontrolną (Rysunek 1E1-3). Z ośmiu immunobarwionych mózgów pszczół tylko jeden wykazywał wysoki stopień rozprzestrzenienia RDL-CRISPR-Cas9 w komórkach ciała grzybowego, protocerebrum i płata antenowego, podczas gdy w pozostałych mózgach barwienie ATTO50 komórek występowało w kielichu ciała grzybowego i kompleksie centralnym, ale nie w płacie antenowym. Należy zaznaczyć, że u tych pszczół redukcja immunobarwienia anty-RDL nie była tak gwałtowna, jak w mózgu pokazanym na Rysunku 1E1.
Następnie, aby oszacować poziom zmodyfikowanego gDNA RDL u pszczół 48 h po wstrzyknięciu RDL-CRISPR-Cas9, przeprowadzono test qPCR drop-off, w którym sonda drop-off została zaprojektowana tak, aby odpowiadała obszarowi jednego z gRNA RDL. W tych eksperymentach, w mózgach pszczół poddanych wstrzyknięciu RDL-CRISPR-Cas9, relatywna redukcja fluorescencji odpowiadała liczbie zmodyfikowanego gDNA w próbkach. W naszych testach obszar odpowiadający tej prowadzącej sekwencji w gDNA u 12 pszczół poddanych wstrzyknięciu RDL-CRISPR-Cas9 wyniósł 64 % ± (średnia ± 30 %SD) w porównaniu z gDNA u pszczół niewstrzykniętych (Rycina 3A).
Następnie, aby oszacować poziom RNA RDL w pszczołach 48 h po iniekcji, przeprowadziliśmy analizę qRT-PCR w osobnej grupie pszczół (Rycina 3B). Porównaliśmy poziom RNA RDL u pszczół poddanych iniekcji RDL-CRISPR-Cas 9 (n = 19) z poziomem RNA u pszczół niepoddanych iniekcji (n = 12). W tych eksperymentach względna redukcja mRNA RDL wyniosła 59% ± (średnia ± 15% SE) w porównaniu z poziomem RNA u pszczół niepoddanych iniekcji. Po zbadaniu poziomu RNA RDL u każdej pszczoły indywidualnie, tylko 13 z 19 pszczół wykazało znaczną redukcję RNA. Dane te wskazują, że iniekcja RDL-CRISPR-Cas9 poprzez ocelli może nie zawsze docierać do dużej liczby komórek mózgu, co potwierdza dane uzyskane z immunobarwienia RDL u pszczół poddanych iniekcji RDL-CRISPR-Cas9. W tych preparatach tylko jedna z 8 pszczół miała RDL CRISP-Cas9 w wielu komórkach mózgu (ciało grzybowate, protocerebrum i płat antenowy) w porównaniu z mózgami innych pszczół, gdzie dystrybucja RDL-CRISPR-Cas9 była skoncentrowana w komórkach protocerebrum (kaliкс ciała grzybowatego i kompleks centralny), ale nie w płacie antenowym (Rycina 4A-D).
Testy przeciwciał anty-mGlutR1 
Użyto przeciwciał anty-mGlutR1 otrzymanych od królika przeciwko peptydom sprzężonym specyficznym dla Drosophila melanogaster (Rysunek 2A). Sekwencja tego peptydu wykazuje 94% identyczności z peptydem pszczelim (CLSDKTRFDYFARTVPPD) Rysunek 2A. W pierwszej kolejności sprawdzono reaktywność przeciwciał wobec białek mózgu pszczółly przy użyciu immunoblottingu. Homogenat mózgu pszczół rozdzielono za pomocą 10% SDS-PAGE, przeniesiono elektroforetycznie na błonę nitrocelulozową i inkubowano z przeciwciałami anty-mGlutR1. Wstawka na Rysunku 2A przedstawia dwa prążki o szacowanych masach (103 i 83 kD) odpowiadające dwóm izoformom. Podczas testowania tych przeciwciał na mózgach pszczół miodnych stwierdzono, że znakują one profile neuropilarne i komórki w przekrojach mózgu pszczół, co zilustrowano na Rysunku 2B,D. Po preadsorpcji przeciwciał anty-mGlutR1 sprzężonym peptydem mGlutR1 specyficzne barwienie w przekroju mózgu pszczół zanikło (Rysunek 2C). Potwierdza to, że przeciwciała anty-mGlutR1 rozpoznają ten peptyd (Rysunek 2C). Następnie do oczek środkowych wstrzyknięto mieszaninę mGlutR1-CRISPR-Cas9, stosując jako kontrolę no-guideRNA. U pszczół kontrolnych (n = 7) fluorescencja ATTO50 nie była skoncentrowana w komórkach. W niektórych mózgach zaobserwowano rozproszone znakowanie fluorescencyjne ATTO50. W związku z tym preparat kontrolny na Rysunku 2D1-3 wykazuje barwienie anty-mGlutR1 w mózgu, ale nie wykazuje fluorescencji ATTO50. Po wstrzyknięciu mGlutR1-CRISPR-Cas9 do oczek i jego pobraniu przez wiele komórek, poziom fluorescencji przeciwciał wtórnych był znacznie zredukowany w obszarze, który pobrał funkcjonalne mGlutR1RNP (Rysunek 2E1-3). Pszczoły monitorowano przez 48 h; jedna pszczoła z każdego wariantu eksperymentalnego padła. Zatem w tym eksperymencie sprawdzono siedem pszczół kontrolnych i osiem pszczół CRISPR-Cas9. Wszystkie pszczoły wstrzyknięte CRISPR-Cas9 posiadały komórki, które pobrały mGlutR1-CRISPR-Cas9. Większość tych komórek znajdowała się w kielichu ciała grzybkowatego, kompleksie centralnym i tylnym protocerebrum. Tylko dwie z siedmiu pszczół wykazały znakowanie ATTO550 w wielu komórkach ciała grzybkowatego, kompleksu centralnego i płata antenowego. Przykład jednej z tych pszczół przedstawiono na Rysunku 2E. Redukcja poziomu barwienia mGlutR1 w tych preparatach była istotna. Pozostałe pięć pszczół wykazywało znakowanie ATTO50 odpowiadające pomyślnemu dostarczeniu mGlutR1 CRISPR-Cas9 do ciała grzybkowatego i tylnego protocerebrum, ale nie do płatów antenowych.
Następnie, aby oszacować poziom zmodyfikowanego gDNA mGlutR1 u pszczół 48 h po iniekcji, przeprowadzono test drop-off oparty na qPCR, w którym sonda drop-off została zaprojektowana tak, aby znajdowała się w obszarze w pobliżu przewodnika mGlutR1. W tych eksperymentach, w mózgach pszczół po iniekcji mGlutR1-CRISPR-Cas 9, względna modyfikacja gDNA u 12 pszczół wyniosła 59% ± (średnia ± 3 %SD) w porównaniu z gDNA u pszczół niepoddanych iniekcji (Rycina 3A).
Wyniki te potwierdzono również testami qRT-PCR w innej grupie pszczół, w której oszacowano poziomy RNA mGlutR1 przy użyciu qRT-PCR 48 h po wstrzyknięciu RNPmGlutR1mix (Rycina 3B). Porównano poziom RNA mGlutR1 u pszczół poddanych wstrzyknięciu mGlutR1-CRISPR-Cas9 (n = 6) z poziomami RNA u pszczół niewstrzykniętych (n = 6). W tych eksperymentach względna redukcja mRNA mGlutR1 u pszczół poddanych wstrzyknięciu wyniosła 53% ± (średnia ± 18% SE) w porównaniu do pszczół niewstrzykniętych (Rycina 3B).
Przekroje z czterech różnych pszczół, w których w komórkach Kenyon ciała grzybowatego wyeksponowano RNP RDL-CRISPR-Cas9, przedstawiono na Rysunku 4A-D. Przykład pszczoły z fluorescencją ATTO50 w ciele grzybowatym i płacie czuciowym pokazano na Rysunku 4E,F.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Przewodniki</td>
			<td>Sekwencje</td>
			<td>gRNA</td>
			<td>RNP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[guideRNA:tracrRNA]</td>
			<td>[gRNA:Cas9 Nuclease]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RDL_Guide1</td>
			<td>ACCGTAACGCGACCCCCGCT</td>
			<td>GRDL1</td>
			<td>RRDL1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RDL_Guide2</td>
			<td>AACGTCGATCGACTTGACGT</td>
			<td>GRDL2</td>
			<td>RRDL2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RDL_Guide3</td>
			<td>CCATGACGAAACACGTGCCC</td>
			<td>GRDL3</td>
			<td>RRDL3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mGlu_Guide 1</td>
			<td>CGAAAGTTATCTGACGGT</td>
			<td>GMGL1</td>
			<td>RMGL1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mGlu_Guide 2</td>
			<td>TTCAACGAGAGCAAGTTCAT</td>
			<td>GMGL2</td>
			<td>RMGL2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mGlu_Guide 3</td>
			<td>GCAAACGTCGGTAGGAGTGA</td>
			<td>GMGL3</td>
			<td>RMGL3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Sekwencje nukleotydowe przewodników zaprojektowanych dla RDL oraz mGlutR1.
<img alt="Rozmieszczenie receptorów neurotransmiterów, prążki białkowe, mikroskopia konfokalna, przeciwciało anty-RDL, przekroje mózgu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig1a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1: Charakterystyka przeciwciał anty-RDL. (A) Schemat podjednostki RDL, gdzie różowe kółka wskazują lokalizację peptydu 2 (zewnątrzkomórkowy CVNEKQSYFHIATTSNEFIRI-amid) w N-końcu oraz peptydu 1 (wewnątrzkomórkowy CVRFKVHDPKAHSKGGTL-amid) w C-końcu. Wstawka w A przedstawia prążki w Western blot ekstraktów z mózgu pszczoły miodnej, poddanych obróbce z odpowiadającymi im przeciwciałami anty-RDL (jednym z anty-RDL pep1 i anty-RDL pep2). Każdy immunoblot wykazuje pozorną wielkość białka ~50-60 kD, co odpowiada szacowanym masom różnych izoform podjednostek RDL. (B, C) Preadsorpcja przeciwciał anty-RDL z wykorzystaniem sprzężonego peptydu 1. Obraz w C wykazuje zmniejszenie intensywności barwienia w przekroju, gdy przeciwciała poddano preinkubacji z koniugowanym peptydem 1. Ciało wachlarzowate (Fb) i ciało elipsoidalne (eb) to struktury kompleksu centralnego w mózgu. M = płat przyśrodkowy ciała grzybowatego. (D1-3) Barwienie anty-RDL kontrolnego, niepodanego zastrzyku przekroju mózgu pszczoły po 48 h. Kolor zielony wskazuje profil dodatni pod kątem anty-RDL w mózgu. (D2) Ta pszczoła nie została poddana iniekcji i nie wykazuje fluorescencji ATTO50. (D3) Obrazy z nałożeniem z D1 i D3. (E1-3) Wstrzyknięcie RDL-CRISPR-Cas9 zmniejszyło intensywność barwienia przeciw-RDL po 48 h. (E2Fluorescencja ATTO50 w jądrach komórkowych wskazała na pomyślne dostarczenie RDL-CRISPR-Cas9.E3) Obraz z nałożeniem przeciwciał anty-RDL (zielony) i ATTO50 (czerwony). Pasek skali = 100 μm (B-E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wiązanie peptydów i mikroskopia immunofluorescencyjna, przeciwciało anty-mGluR1, przekroje mózgu, ATTO 50." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig2a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Charakterystyka przeciwciał anty-mGlutR1. (A) Schemat GCPR mGluR, który przedstawia Drosophila melanogaster peptyd użyty do immunizacji. Dla porównania, the Apis mellifera peptyd przedstawiono poniżej. Okrąg wskazuje lokalizację peptydydu w obrębie N-końca domeny zewnątrzkomórkowej receptora mGlutR1. Wstawka w A wykazuje, że przeciwciała anty-mGlutR1 rozpoznały w analizie Western blot mózgów pszczół dwa prążki o masach ~103 kD i ~83 kD, które odpowiadają szacunkowym masom znanych izoform.B,C) Kontrola preadsorpcyjna przeciwciała anty-mGlutR1 w dwóch kolejnych przekrojach kłębków płata czuciowego. Obraz anty-mGlutR1 w przekroju kłębków czuciowych w C wykazuje zmniejszenie intensywności barwienia w wyniku preinkubacji peptydu anty-mGlutR1 z przeciwciałem anty-mGlutR1. Procedura ta powoduje wytrącenie przeciwciała z roztworu, co znosi barwienie w porównaniu z B (kontrola, brak peptydy w preinkubacji). (D1) przedstawia barwienie przeciwciałem anty-mGlutR1 w przekroju mózgu pszczoły po iniekcji kontrolnej w ocelli medianum. Iniekcja ta nie zawierała gRNA dla mGlutR1, które umożliwia wyciszenie receptorów mGlutR1 za pomocą CRISPR-Cas9, w związku z czym intensywność barwienia przeciwciałem anty-mGlutR1 nie uległa zmniejszeniu (kolor zielony). (D2Brak fluorescencji ATTO50 wskazuje na brak funkcjonalnego układu CRISPR-Cas9 w mózgu.D3) Nałożone obrazy przeciwciał anty-mGlutR1 i ATTO50. (E1-E3) przedstawia barwienie przeciwciałem anty-mGlutR1 w przekroju mózgu, w którym mGlutR1 został trwale wyciszony 48 h po wstrzyknięciu mGlutR1-CRISPR-Cas 9 do oczka środkowego. W związku z tym barwienie w tym mózgu jest znacznie zredukowane ze względu na skuteczny knockout mGlutR1 w wielu komórkach. (E2Barwienie ATTO50 w wielu jądrach komórkowych w mózgach pszczół wskazuje, że wstrzyknięcie mGlut1-CRISPR-Cas 9 przebiegło pomyślnie.E3) Nałożone obrazy ATTO50 (czerwony) i anty-mGlutR1 (zielony). Pasek skali = 10 μm (B, C); 100 μm (D,E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki modyfikacji genetycznej CRISPR; test qPCR i analiza ekspresji genów; wykresy słupkowe, RDL, mGlutR1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Ocena zmodyfikowanego gDNA i ekspresji mRNA RDL i mGlutR1 mRNA w mózgach pszczół 48 h po wstrzyknięciu 345 nL odpowiadającego RPN CRISPR-Cas9. (A) Test analizy spadku sygnału (drop-off assay) oparty na qPCR w celu oceny ilości gDNA z obszarem zmodyfikowanym obliczono przy użyciu 2-ΔCt metodą i znormalizowane względem kontrolnych, nieiniekcyjnych mózgów. Dane przedstawiono jako średnia + SD. (B) Do oceny ilości mRNA w pszczołach poddanych iniekcji CRISPR-Cas9 oraz w pszczołach niepoddanych iniekcji wykorzystano test qRT-PCR. Jako gen referencyjny zastosowano AmActin. Względnią ekspresję genu obliczono przy użyciu metody 2-ΔCt metod i znormalizowane względem kontrolnych, niezatrzymanych mózgów. Dane przedstawiono jako średnia + SE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="obrazy przekrojów mózgu CRISPR-Cas9; edycja genów; mikroskopia fluorescencyjna; badanie na modelu owadzym" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig4a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Przykład rozprzestrzeniania się kompleksów RNP CRISPR-Cas9 w mózgach pszczół z obrazowaniem fluorescencyjnym ATTO50. (A-DPrzekroje mózgu czterech różnych pszczół, w których kompleks RNP RDL-CRISPR-Cas9 wykazano w komórkach Kenyona ciała grzybowatego.E, FPrzykład dwóch mózgów 48 h po iniekcji RNPmGlutR1 CRISPR-Cas9. Pasek skali = 150 μm (A-F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Prezentowany tutaj jest protokół użycia systemu CRISPR-Cas9 do zmniejszenia produkcji białka w mózgu dorosłej pszczoły miodnej w celu zbadania swoistości przeciwciał.

Testowanie przeciwciał przeciwko receptorom anty-RDL i anty-mGlutR1 w skrawkach mózgu pszczoły miodnej przy użyciu CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of ...

Po raz pierwszy udało nam się ustalić modyfikację genów kodowanych dla jonotropowych receptorów GABAA i metabotropowych receptorów glutaminianu w podzbiorach neuronów w mózgu dorosłej pszczoły miodnej. Edycja genów CRISPR-Cas9 może być wykorzystana do modyfikacji jednego lub wielu genów w mózgach dorosłych pszczół w celu zbadania ich roli w uczeniu się i zapamiętywaniu w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Metoda ta może być stosowana do badania funkcji określonych białek u dorosłych pszczół, a także do badania swoistości przeciwciał przeciwko odpowiadającym im białkom.Procedurę zademonstrują z Iriną Sinakevitch Lew Kurtzman i Hyun Choi, byli studenci z mojego laboratorium. Aby przetestować ekspresję RDL i mGlutR1 za pomocą analizy immunocytochemicznej po wstrzyknięciu CRISPR-Cas9, najpierw użyj internetowego narzędzia CRISPR-Cas9 do zaprojektowania przewodników przy użyciu sekwencji przewodnika DNA apis mellifera, RDL i mGlutR1. Aby przygotować formacje kompleksu przewodnika RNA dla każdego przewodnika RNA, oznacz jedną probówkę dla każdego przewodnika nazwą przewodnika RNA i dodaj 92 mikrolitry buforu wolnego od nukleotydów, cztery mikrolitry 100 mikromolowego fluoroforu, znakowanego transaktywującego CRISPR RNA i cztery mikrolitry odpowiedniego roztworu przewodnika RNA do każdej probówki.Po dodaniu wszystkich materiałów delikatnie wymieszaj roztwory i obracaj zawartość probówki w wirówce stołowej przez pięć sekund, aby roztworu osadzić. Następnie utrzymuj roztwory w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby utworzyć przewodnik RNA, a następnie 10-minutowe schłodzenie w temperaturze pokojowej. Aby przygotować formacje kompleksu rybonukleoproteinowego, dodaj sześć mikrolitrów każdego przewodnikowego roztworu RNA i sześć mikrolitrów po 0,5 mikrograma na mikrolitr nukleazy SP-Cas9 V3 do odpowiednio znakowanych probówek.Po delikatnym wymieszaniu inkubować roztwory w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut Aby przygotować mieszaniny rybonukleoprotein RNP do wstrzykiwań, pod koniec inkubacji dodać cztery mikrolitry każdej rybonukleoproteiny do odpowiedniego RDL. Aby uzyskać kontrolę, roztwór RNA bez przewodnika zmieszaj cztery mikrolitry znacznikowego RNA z 92 mikrolitrami buforu i czterema mikrolitrami wody. Po dodaniu wody trzymaj roztwór przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza i pozwól mieszaninie ostygnąć, aż osiągnie temperaturę pokojową.Następnie wymieszaj sześć mikrolitrów roztworu RNA bez przewodnika z sześcioma mikrolitrami po 0,5 mikrograma na mikrolitr nukleazy Cas9 V3. W przypadku wstrzyknięcia mieszaniny rybonukleoprotein, po schwytaniu pojedynczych pszczół w fiolkach z małym otworem w nakrętkach, unieruchamić pszczoły na nie dłużej niż trzy minuty na lodzie i zabezpieczyć każdą pszczołę we wcześniej przygotowanych metalowych uchwytach za pomocą taśmy klejącej. Z odsłoniętą tylną klatką piersiową, skrzydłami i głową. Użyj pięciomililitrowej strzykawki, aby nakarmić pszczoły jednomolowym roztworem sacharozy, aż przestaną być głodne, i umieść zabezpieczone pszczoły w pudełku z mokrym ręcznikiem papierowym w celu zapewnienia wilgotności.Następnie umieść wosk na wewnętrznej stronie pokrywek dwóch 35-mililitrowych szalek Petriego i połóż dna naczyń na wosku. Wstrzyknąć jedną sacharozę molową między pokrywę a dno każdej szalki i umieścić jedną szalkę Petriego w białym pudełku z jednym szkiełkiem, a drugą umieścić w czarnym pudełku z jednym szklanym szkiełkiem. Następnie umieść mały grzebień w każdym pudełku i załaduj system mikroiniekcji mieszanką RDL CRISPR-Cas9.W przypadku wstrzyknięcia RDL CRISPR-Cas9 wstrzyknij środkową część oka ośmiu pszczół za pomocą 345 nanolitrów mieszanki rybonukleoproteinowej RDL, a następnie nakarmij jedną sacharozą molową przed wypuszczeniem pszczół do czarnego pudełka eksperymentalnego. Nakarm drugą grupę ośmiu pszczół jako grupę kontrolną bez żadnych zastrzyków i wypuść je do białej skrzynki kontrolnej. Następnie umieść oba pudełka w styropianowym pojemniku z mokrym papierem, obserwując pszczoły dwa razy dziennie, aby upewnić się, że mają wystarczającą ilość pożywienia i dobrą wilgotność.48 godzin po wstrzyknięciu unieruchamić pszczoły na lodzie na 30 sekund i użyć nożyczek, aby odciąć głowę każdemu owadowi. Umieść głowy w 4% paraformaldehydzie w PBS pod mikroskopem preparacyjnym w okapie oparowym i użyj nożyczek do tęczówki Barraquer, aby ostrożnie, ale szybko usunąć czułki, oczy złożone i górny egzoszkielet. Pozostaw głowy w roztworze utrwalającym na 10 minut przed usunięciem reszty szkieletu egzoszkieletu z głowy i całej pozostałej tchawicy.Następnie umieść każdy mózg w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej zawierającej co najmniej jeden mililitr 4% paraformaldehydu przez noc w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza. Następnego ranka dodaj 3,8 grama argrozy do 50 mililitrów wody destylowanej w kolbie Erlenmeyera i podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej, aż argroza się upłynni. Przenieś trzy do czterech utrwalonych mózgów pszczół miodnych na nową 35-milimetrową szalkę Petriego i użyj bibuły, aby usunąć nadmiar utrwalacza.Ostrożnie wylej płynną argrozę na mózgi i ustaw próbki w argrozie tak, aby płaty czułków były skierowane do góry. Po zestaleniu się argrozy użyj skalpela, aby wyciąć pojedyncze bloki argrozy zawierające pojedynczy mózg i napełnij każdą studzienkę 24-dołkowej płytki załadowanej jednym koszem z hydrofobowym dnem z siatki i 600 mikrolitrami PBS na studzienkę. Następnie za pomocą wibratomu uzyskaj 70-mikrometrowe przekroje tkanki mózgowej z każdego bloku argrozy.Umieszczanie skrawków z pojedynczego mózgu na siatce tego samego kosza, w którym są one pozyskiwane. Po znakowaniu skrawków przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem, zgodnie ze standardowymi protokołami, należy osadzić każdy preparat z sekcjami z pojedynczego mózgu za pomocą kropli pożywki montażowej i zwizualizować próbki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Anty-RDL znakuje neuropils w przedniej części mózgów pszczół typu dzikiego, ale nie CRISPR-Cas9 RDL knockout bee brains.Podobną swoistość zaobserwowano w przypadku przeciwciał anty-mGlutR1. W tych reprezentatywnych, ilościowych testach zrzutu PCR w mózgach pszczół, którym wstrzyknięto RDL CRIPSR-Cas9, względne zmniejszenie fluorescencji odpowiadało liczbie zmodyfikowanego przewodnika DNA w próbce. Po wstrzyknięciu mGlutR1 CRISPR-Cas9 względna modyfikacja DNA przewodnika wynosiła około 59% w mózgach pszczół, którym wstrzyknięto implant, w porównaniu z DNA przewodnika obserwowanym w mózgach pszczół, którym nie wstrzyknięto.W tej ilościowej liczbie RT-PCR w oddzielnej grupie pszczół względna redukcja RDL informacyjnego RNA wynosiła około 59% w porównaniu z poziomem RNA u pszczół, którym nie wstrzyknięto, a względna redukcja informacyjnego RNA mGlutR1 u pszczół, którym wstrzyknięto zastrzyk, wynosiła około 53%Warto zauważyć, że wstrzyknięcie RDL CRISPR-Cas9 przez oczka może nie zawsze dotrzeć do dużej liczby komórek mózgowych. Na przykład, w tych preparatach tylko jedna na osiem miała RDL CRISPR-Cas9 w dużej liczbie komórek mózgowych w porównaniu z innymi mózgami pszczół. Z RDL CRISPR-Cas9 skoncentrowanym w komórkach protocerebrum, ale nie w płacie antenowym.Pamiętaj, aby unikać zamrożonego i ponownie zamrożonego RNA. Uważaj, aby nie przechłodzić pszczół. Zapiąć je natychmiast po zatrzymaniu ruchu w fiolce.Technika ta może być wykorzystana do badania wpływu redukcji hamujących receptorów jonotropowych i metabotropowych w ciele grzyba i kompleksie centralnym na zachowanie pszczół miodnych.

anti-rdl-anti-mglutr1-receptors-antibody-testing-honeybee-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym protokole opisujemy dwie strategie, które jednocześnie tłumią dwa geny (podwójny knockdown genu) u pszczół miodnych. Następnie przedstawiamy, jak wykorzystać test odpowiedzi na rozszerzenie trąby (PER) do zbadania wpływu knockdownu podwójnego genu na percepcję smakową pszczoły miodnej.

Pomiar podwójnego knockdownu genu i percepcji smakowej za pośrednictwem RNAi u pszczół miodnych (Apis mellifera)

W ostatnich latach testy oparte na żywych komórkach były z powodzeniem wykorzystywane do wykrywania przeciwciał przeciwko antygenom powierzchniowym i konformacyjnym. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą wysokoprzepustową cytometrię przepływową, umożliwiającą analizę dużych kohort pacjentów. Wykrycie nowych przeciwciał poprawi diagnostykę i leczenie zaburzeń o podłożu immunologicznym.

Wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej oparty na komórkach do wykrywania przeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu lub receptorowi dopaminy-2 w ludzkiej surowicy

Hybrydyzacja in situ (ISH) RNA umożliwia wizualizację RNA w komórkach i tkankach. Tutaj pokazujemy, jak połączenie RNAscope ISH z immunohistochemią lub barwnikami histologicznymi może być z powodzeniem wykorzystane do wykrywania mRNA zlokalizowanych na aksonach w odcinkach mózgu myszy i człowieka.

Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w skrawkach mózgu za pomocą hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości

System CRISPR/Cas9 oferuje potencjał, aby uczynić ukierunkowaną edycję genomu dostępną i przystępną cenowo dla społeczności naukowej. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie, jak tworzyć wirusy, które znokautują interesujący nas gen za pomocą systemu CRISPR/Cas9, a następnie wstrzykną je stereotaktycznie do mózgu dorosłej myszy.

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Ten manuskrypt opisuje kilka protokołów podawania środków farmakologicznych pszczołom miodnym, w tym proste nieinwazyjne metody dla pszczół swobodnie latających, a także bardziej inwazyjne warianty, które pozwalają na precyzyjne, miejscowe leczenie krępowanych pszczół.

Neurofarmakologiczna manipulacja skrępowanych i swobodnie latających pszczół miodnych, Apis mellifera

Ten artykuł opisuje szczegółowy i wysoce skuteczny protokół hybrydyzacji RNA in situ, szczególnie dla niskopoziomowych genów receptora zapachowego (OR), jak również innych genów, w czułkach owadów za pomocą sond znakowanych digoksygeniną (DIG) lub biotyną.

Lokalizacja genów receptora zapachowego w czułkach szarańczy przez hybrydyzację RNA in situ

Aby przetestować hamujące działanie środków farmakologicznych na fosfolipazę C (PLC) w różnych regionach mózgu pszczoły miodnej, przedstawiamy test biochemiczny do pomiaru aktywności PLC w tych regionach. Test ten może być przydatny do porównywania aktywności PLC między tkankami, a także wśród pszczół wykazujących różne zachowania.

Wykrywanie aktywności fosfolipazy C w homogenacie mózgu pszczoły miodnej

Wiele cech eusocjalności owadów opiera się na komunikacji wewnątrz kolonii i podziale pracy. Manipulacja genetyczna kluczowych genów regulatorowych w zarodkach mrówek za pomocą mikroiniekcji i mutagenezy za pośrednictwem CRISPR dostarcza informacji na temat natury zachowań altruistycznych u owadów eusocjalnych.

Iniekcje zarodków w celu mutagenezy za pośrednictwem CRISPR u mrówki Harpegnathos saltator

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.

Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)

Opracowaliśmy test hybrydyzacji Duplex in situ do mapowania izoform receptora insuliny IR-A i IR-B w mysim splocie naczyniówkowym, pokonując ograniczenia tradycyjnych metod. To podejście o wysokiej rozdzielczości ujawnia ekspresję specyficzną dla izoformy, oferując nowe informacje na temat sygnalizacji insuliny w mózgu i potencjalnych terapii ukierunkowanych na izoformy w zaburzeniach neurologicznych.

Precyzyjna wizualizacja receptorów insuliny A i B w mózgu myszy za pomocą testu hybrydyzacji RNA in situ

Tutaj opisujemy prostą i szybką procedurę wykrywania DNA z patogenów pszczół, takich jak Lotmaria passim i Nosema ceranae, przy użyciu lizy komórek gotowej do amplifikacji, amplifikacji polimerazy rekombinazy i testów CRISPR/Cas12a.

Wykrywanie DNA pasożytów trypanosomatydów i Nosema ceranae na miejscu poprzez alkaliczną lizę sprzężoną z systemem RPA/CRISPR/Cas12a

Poznaj edycję genów CRISPR-Cas9 w mózgu pszczoły miodnej w celu badania receptorów GABAA i glutaminowych. Ta metoda umożliwia testowanie specyficzności przeciwciał oraz analizę funkcji białek w uczeniu się i pamięci.

Testowanie przeciwciał przeciwko receptorom anty-RDL i anty-mGlutR1 w skrawkach mózgu pszczoły miodnej przy użyciu CRISPR-Cas9

Przeglądaj więcej filmów