Name: Adaptacja półwysokoprzepustowa testu ATPazy sprzężonej z NADH do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj zoptymalizowany test ATPazy sprzężony z NADH do półwysokoprzepustowego przesiewowego badania inhibitorów małocząsteczkowych. Ta metoda umożliwia badaczom skuteczne opracowywanie nowych związków terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem z National Institute of Neurological Disorders and Stroke oraz National Institute on Drug Abuse NS096833 (CAM).

1. Przygotowanie roztworów zapasowych i odczynników
<ol>
	<li>Przygotować roztwór zapasowy ditiotreitolu (DTT), rozpuszczając krystaliczny DTT w wodzie destylowanej do stężenia końcowego 10 mM. Dostosować pH do 7,0 za pomocą roztworu 1 M NaOH. Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór zapasowy ATP, rozpuszczając krystaliczny ATP w wodzie destylowanej do stężenia końcowego 10 mM. Dostosować pH do 7,0 za pomocą roztworu 1 M NaOH. Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować 10-krotny bufor NADH zawierający 70 mM kwasu 3-(N-morfolinopropanosulfonowego) (MOPS), 10 mM MgCl2, 0,9 mM kwasu etylenoglikol-bis(β-aminoetylowy eter)-N,N,N′,N′-tetraoctowego (EGTA) oraz 3 mM NaN3. Dostosować pH do 7,0 za pomocą roztworu 1 M NaOH. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 1-krotny bufor do miozyny zawierający 10 mM MOPS i 0,1 mM EGTA. Dostosować pH do 7,0 za pomocą roztworu 1 M NaOH. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem dodać albuminę surowicy bydlęcej (BSA) i DTT do stężeń końcowych odpowiednio 0,1% (m/v%) i 1 mM.</li>
	<li>Przygotować 1-krotny bufor do aktyny zawierający 4 mM MOPS, 0,1 mM EGTA, 2 mM MgCl2 oraz 3 mM NaN3. Dostosować pH do 7,0 za pomocą roztworu 1 M NaOH. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem dodać BSA i DTT do stężeń końcowych odpowiednio 0,1% (m/v%) i 1 mM.</li>
	<li>Przygotować roztwór zapasowy NADH, rozpuszczając krystaliczny NADH w 10-krotnym buforze NADH do stężenia końcowego 5,5 mM. Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór zapasowy PEP, rozpuszczając krystaliczny PEP w 10-krotnym buforze NADH do stężenia końcowego 50 mM. Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór zapasowy LDH, rozpuszczając liofilizowany proszek LDH w mieszaninie glicerolu i 10-krotnego buforu NADH (50%:50%) do stężenia końcowego 200 U/mL. Odwirować roztwór w celu usunięcia nierozpuszczonego białka (7,197 x g, 20 °C, 10 min). Ostrożnie przenieść nad precipitates do czystej probówki wirówkowej. Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór zapasowy PK, rozpuszczając liofilizowany proszek PK w mieszaninie glicerolu i 10-krotnego buforu NADH (50%:50%) do stężenia końcowego 10 U/mL. Odwirować roztwór w celu usunięcia nierozpuszczonego białka (7,197 x g, 20 °C, 10 min). Ostrożnie przenieść nad osad do czystej probówki wirówkowej. Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Rekonstytuować liofilizowane próbki miozyny II z mięśnia sercowego i szkieletowego, dodając 10 µL wody destylowanej w celu otrzymania roztworów zapasowych o stężeniu 10 mg/mL, co odpowiada odpowiednio stężeniom miozyny ok. 37,9 µM i ok. 40,8 µM (monomerycznej). Dalsze szczegóły znajdują się w instrukcjach producenta.</li>
	<li>Przygotować F-aktynę z proszku acetonowego mięśni królika zgodnie z opisem Pardee i Spudicha25.</li>
</ol>
2. Pomiar aktywności ATPase i efektów hamujących małych cząsteczek inhibitorów
<ol>
	<li>Przygotuj płytkę z substancjami badawczymi.
	<ol>
		<li>Rozpuść interesujące substancje w wysokiej jakości dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
		<li>Wykonaj piętnastostopniowe rozcieńczenia seryjne 1:2, zaczynając od stężenia substancji 10 mM w DMSO.</li>
		<li>Przenieś próbki do polipropylenowej płytki 384-dołkowej w trzech powtórzeniach (po 12,5 µL każda) za pomocą pipety wielokanałowej. W celu zminimalizowania liczby dołków potencjalnie narażonych na efekty brzeżne, wykorzystaj dwa rzędy na płytce z substancjami dla jednej substancji (zamiast trzech kolumn). Trzy ostatnie dołki w drugim rzędzie dla każdej substancji wykorzystaj jako kontrolę negatywną (sam DMSO). Nie używaj pierwszego ani ostatniego rzędu płytki do rozcieńczania substancji.</li>
		<li>Przenieś czysty DMSO do dołków pierwszego rzędu (zarezerwowanego do kalibracji NADH).</li>
		<li>Ostatni rząd wykorzystaj jako kontrolę pozytywną. 
		UWAGA: W tym celu zastosowano para-aminoblebbistatynę o stężeniu 4 mM w DMSO.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 450 µL rozcieńczonego roztworu aktyny o stężeniu 20 µM dla każdej płytki analitycznej (czarna polistyrenowa mikropłytka 384-dołkowa), rozcieńczając roztwór stokowy aktyny w buforze do aktyny. Dokładnie wymieszaj roztwór, pipetując go 30 razy w górę i w dół za pomocą pipety 5 mL, aby zmniejszyć lepkość i niejednorodność poprzez rozrywanie filamentów aktyny. Odwiruj roztwór, aby usunąć obecne wytrącone białka (7,197 x g, 20 °C, 10 min). Ostrożnie przenieś supernatant do czystej probówki do wirowania.</li>
	<li>Przygotuj master mix zawierający enzymy LDH i PK („mieszanina enzymatyczna”). Dla każdej płytki analitycznej połącz w 15 mL stożkowej probówce do wirowania 171,4 µL roztworu LDH, 171,4 µL roztworu PK oraz odpowiednio 3189,3 µL lub 3252,9 µL buforu do miozyny dla analiz obejmujących miozynę II mięśnia sercowego lub szkieletowego. Na tym etapie nie dodawaj miozyny, aby uniknąć agregacji i wytrącania.</li>
	<li>Przygotuj master mix zawierający wszystkie substraty („mieszanina substratów”). Dla każdej płytki połącz w 15 mL stożkowej probówce do wirowania 162,1 µL ATP, 162,1 µL PEP i 324,1 µL roztworu NADH. Na tym etapie nie dodawaj aktyny, aby uniknąć agregacji i wytrącania.</li>
	<li>Wykonaj siedmiostopniowe rozcieńczenia seryjne 1:2 NADH do kalibracji, zaczynając od 250 µM.
	<ol>
		<li>Wymieszaj 12,3 µL roztworu stokowego NADH z 257,7 µL buforu do miozyny w probówce do mikrodośrodkowka 1,5 mL.</li>
		<li>Odważ 135 µL buforu do miozyny do siedmiu probówek do mikrodośrodkowka 1,5 mL.</li>
		<li>Przenieś 135 µL roztworu z pierwszej probówki do drugiej i wymieszaj poprzez pipetowanie. Powtarzaj, aż do osiągnięcia 7mej probówki.</li>
		<li>Ostatnią probówkę wykorzystaj jako kontrolę bez NADH (sam bufor).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą pipety 8-kanałowej przenieś 20 µL roztworów kalibracyjnych NADH do pierwszego rzędu płytki analitycznej w trzech powtórzeniach.</li>
	<li>Dodaj 68 µL miozyny II z mięśnia sercowego lub 4,2 µL miozyny II z mięśnia szkieletowego do mieszaniny enzymatycznej. Krótko wymieszaj na wortexie.</li>
	<li>Z wyjątkiem pierwszego rzędu, dozuj 8,4 µL przygotowanej mieszaniny miozyny i enzymów do każdego dołka płytki analitycznej za pomocą automatycznego dozownika.</li>
	<li>Przenieś 10 nL roztworów z płytki z substancjami na płytkę analityczną zawierającą mieszaninę enzymatyczną, używając automatycznego systemu obsługi cieczy wyposażonego w głowicę z pinem 10 nL.</li>
	<li>Wstrząsaj płytkę analityczną przez 1 min w temperaturze pokojowej przy 1200 rpm, używając wstrząsarki do mikropłytek.</li>
	<li>Dodaj 4,052 µL odwirConego roztworu aktyny do mieszaniny substratów. Krótko wymieszaj na wortexie.</li>
	<li>Dozuj 1,6 µL mieszaniny aktyny i substratów do każdego dołka płytki analitycznej (z wyjątkiem pierwszego rzędu), aby rozpocząć reakcję enzymatyczną, używając automatycznego dozownika.</li>
	<li>Wstrząsaj płytkę analityczną przez 1 min w temperaturze pokojowej przy 120 rpm, używając wstrząsarki do mikropłytek.</li>
	<li>Odwiruj płytkę analityczną przy 101 x g przez 30 s.</li>
	<li>Upewnij się, że temperatura wewnętrzna czytnika płytek ustabilizowała się na poziomie 25 ˚C. Włóż płytkę i wstrząsaj przez kolejne 30 s. Ten etap wstrząsania jest niezbędny, aby powierzchnia cieczy w każdym dołku była podobna i pozwala płytce osiągnąć temperaturę pomiarową.</li>
	<li>Rejestruj fluorescencję NADH przez 30 min, skanując płytkę w odstępach 45 s. Użyj filtra wzbudzenia 380 nm o szerokości pasma 10 nm oraz filtra emisji 470 nm o szerokości pasma 24 nm wraz z lustrem dichroicznym z odcięciem przy 425 nm. Przeprowadź pomiar w trybie wysokich stężeń. Przed wykonaniem analiz zoptymalizuj liczbę błysków, wzmocnienie detektora, wymiary płytki i wysokość pomiaru. 
	UWAGA: Końcowe warunki analizy to 30 nM miozyny II z mięśnia sercowego/20 nM miozyny II z mięśnia szkieletowego, 10 µM aktyny, 40 U/mL LDH, 20 U/mL PK, 20 µM NADH, 1 mM PEP, 1 mM ATP w buforze zawierającym 10 mM MOPS (pH = 7,0), 2 mM MgCl2, 0,15 mM EGTA, 0,1 mg/mL BSA, 0,5% (v/v) DMSO i 1 mM DTT. Objętość całkowita wynosi 20 µL/dołek. Najwyższe końcowe stężenie substancji wynosi 50 µM. Jako kontrolę pozytywną służy 20 µM para-aminoblebbistatyny w 0,5% DMSO, a jako kontrolę negatywną sam 0,5% DMSO. Wszystkie pomiary wykonuje się w trzech powtórzeniach.</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Należy wykreślić zależność obserwowanej intensywności fluorescencji od czasu dla każdej dołki.</li>
	<li>Wykonaj prostą regresję liniową, aby wyznaczyć nachylenie i punkt przecięcia dla odpowiedzi fluorescencyjnych w każdej studzience. Nachylenie jest proporcjonalne do szybkości zużycia ATP (NADH), natomiast punkt przecięcia jest proporcjonalny do stężenia NADH na początku pomiaru (t = 0 s).</li>
	<li>Stwórz krzywą kalibracyjną dla NADH, nanosząc na wykres wartości odczytów uzyskane dla pierwszego rzędu płytki w funkcji stężenia NADH. Upewnij się, że odczyty są liniowo zależne od stężenia NADH. 
	UWAGA: Punkty przecięcia osi szacują rzeczywiste intensywności fluorescencji w czasie t = 0 s z znacznie większą pewnością niż średnia z surowych odczytów intensywności fluorescencji w czasie t ≈ 0 s.</li>
	<li>Przeprowadź prostą regresję liniową, aby wyznaczyć nachylenie i punkt przecięcia z osią rzędnych linii kalibracyjnej NADH. 
	UWAGA: Punkt przecięcia opisuje sygnał tła fluorescencji (przy braku NADH), natomiast nachylenie odpowiada ekstrapolowanej/teoretycznej intensywności fluorescencji roztworu NADH o stężeniu 1 M w danym eksperymencie.</li>
	<li>Aby przeliczyć zmiany fluorescencji na szybkości zużycia ATP, należy podzielić nachylenie odpowiedzi fluorescencyjnej uzyskane dla pozostałych studzienek przez nachylenie linii kalibracyjnej NADH.</li>
	<li>Nanieś na wykres szybkości zużycia ATP w funkcji stężenia inhibitora.</li>
	<li>Aby wyznaczyć stałe hamowania, należy wykorzystać odpowiednie oprogramowanie statystyczne w celu dopasowania danych z testu dawka-odpowiedź do następującego równania kwadratowego, odpowiadającego prostemu modelowi równowagi wiązania w stosunku jeden do jednego: 
	<img alt="Równanie powinowactwa wiązania dla oddziaływania ligand-białko; wyrażenie matematyczne; analiza naukowa." src="/files/ftp_upload/60017/60017eq01.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
	gdzie Y jest szybkość zużycia ATP, Ymin jest to szybkość zużycia ATP w obecności inhibitora, Ymaks. jest teoretyczna szybkość zużycia ATP przy 10% inhibicji, KI jest stałą inhibicji, [E]t i [I]t odpowiadają odpowiednio całkowitemu stężeniu enzymu (miozyny) oraz inhibitora.</li>
</ol>

<ol><li>Heissler, S. M., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Adaptations+of+Myosins+for+Their+Diverse+Cellular+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions.</a> Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).</li>
<li>Hartman, M. A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myosin+superfamily+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The myosin superfamily at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).</li>
<li>Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+millennial+myosin+census%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A millennial myosin census.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).</li>
<li>Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+classification+of+myosins%2C+a+paneukaryotic+whole-genome+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach.</a> Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).</li>
<li>Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-muscle+myosin+II+in+disease%3A+mechanisms+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Disease Models & Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).</li>
<li>He, Y. M., Gu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+of+myosin+heavy+chain+genes+in+human+genetic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Yi+Chuan%22%5BJournal%5D)">Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases.</a> Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).</li>
<li>Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Myosin+by+Blebbistatin+Derivatives%3A+Optimization+and+Pharmacological+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).</li>
<li>Straight, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+temporal+and+spatial+control+of+cytokinesis+with+a+myosin+II+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor.</a> Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).</li>
<li>Sirigu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+inhibition+of+myosin+motors+provides+the+basis+of+potential+therapeutic+application%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).</li>
<li>Green, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+inhibitor+of+sarcomere+contractility+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice.</a> Science. 351 (6273), 617-621 (2016).</li>
<li>Morgan, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+omecamtiv+mecarbil+the+first%2C+selective%2C+small+molecule+activator+of+cardiac+Myosin%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).</li>
<li>Kepiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((para-Nitroblebbistatin%2C+the+non-cytotoxic+and+photostable+myosin+II+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li>
<li>Varkuti, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+soluble%2C+non-phototoxic%2C+non-fluorescent+blebbistatin+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative.</a> Scientific Reports. 6, 26141(2016).</li>
<li>Verhasselt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+%28S%29-3%27-hydroxyblebbistatin+and+%28S%29-3%27-aminoblebbistatin%3A+polar+myosin+II+inhibitors+with+superior+research+tool+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).</li>
<li>Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+synthesis+and+comparative+analysis+of+the+tool+properties+of+new+and+existing+D-ring+modified+%28S%29-blebbistatin+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).</li>
<li>Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+calcium+pump+using+defined+membrane+components%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).</li>
<li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+protein+exerts+diverse+modes+of+ATPase+activity+on+duplex+DNA+partially+and+fully+covered+with+Rad51+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).</li>
<li>Hanzelmann, P., Schindelin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+of+ATP+Hydrolysis+and+Intersubunit+Signaling+in+the+AAA%2B+ATPase+p97%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97.</a> Structure. 24 (1), 127-139 (2016).</li>
<li>Hackney, D. D., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+kinesin+microtubule-stimulated+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).</li>
<li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADH-coupled+microplate+photometric+assay+for+kinetic+studies+of+ATP-hydrolyzing+enzymes+with+low+and+high+specific+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities.</a> Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).</li>
<li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green%3A+an+improvement+and+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li>
<li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microassay+for+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A microassay for ATPase.</a> Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).</li>
<li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
<li>Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+In+Vitro+ATPase+Activity+for+Enzymatic+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), 54305(2016).</li>
<li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+muscle+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification of muscle actin.</a> Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+blebbistatin+inhibition+of+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II.</a> Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).</li>
<li>Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+blebbistatin+inhibition+and+specificity+for+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).</li>
<li>Kettlun, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+2+Isoapyrases+from+Solanum-Tuberosum+Var+Ultimus%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus.</a> Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).</li>
<li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+binding+assays+at+equilibrium%3A+validation+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).</li>
<li>Motulsky, H. J., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+binding+data%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Analyzing binding data.</a> Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).</li>
<li>Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATPase+Activity+Measurements+by+an+Enzyme-Coupled+Spectrophotometric+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).</li>
<li>Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+protein+stimulates+heteroduplex+DNA+formation+in+the+synaptic+phase+of+DNA+strand+exchange+via+specific+interactions+with+the+presynaptic+Rad51+nucleoprotein+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).</li>
<li>Banik, U., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+fluorimetric+assay+for+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Journal%22%5BJournal%5D)">A continuous fluorimetric assay for ATPase activity.</a> Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).</li>
<li>Xiao, Y. X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIFC1%3A+a+promising+chemotherapy+target+for+cancer+treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?</a> Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).</li>
<li>See, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Dynein+Antagonists+with+Improved+Potency+and+Isoform+Selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity.</a> ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).</li>
<li>Datta, A., Brosh, R. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+Into+DNA+Helicases+as+Druggable+Targets+for+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Krytyczne kroki w protokole
Zoptymalizuj układ płytek, uruchamiając kilka płytek tylko z kontrolą ujemną (reakcja ATPazy bez inhibitora). Dokładnie sprawdź wyniki pod kątem wzorców szybkości reakcji. Mogą one na przykład wynikać z efektów krawędziowych i/lub niedoskonałości hydrofilowej powłoki powierzchniowej "niewiążących" płyt. Jeśli zaobserwowany zostanie wzór, zmień typ płyty i/lub układ blachy, aby zminimalizować artefakty. Na przykład typowa krzywa dawka-odpowiedź (16 s...

Miozyny to mechanochemiczne przetworniki energii, które hydrolizują trifosforan adenozyny (ATP) w celu wygenerowania kierunkowego ruchu wzdłuż włókien cytoszkieletu aktyny u eukariontów1,2. Są one zarówno strukturalnie, jak i kinetycznie przystosowane do różnych funkcji wewnątrzkomórkowych, takich jak transport organelli, skurcz mięśni czy generowanie napięcia cytoszkieletu1,2. Nadrodzina miozyny jest reprezentowana przez ~40 genów miozyny należących do ~12 różnych klas miozyny w ludzkim genomie3,4. Członkowie klas miozyny odgrywają różne role w bardzo zróżnicowanym zestawie zaburzeń, takich jak kilka nowotworów, zaburzenia neurologiczne, miopatie szkieletowe i kardiomiopatia przerostowa5,6. Biorąc pod uwagę dużą liczbę fizjologicznych i patologicznych funkcji tych silników molekularnych, nie jest zaskakujące, że stają się one coraz częściej rozpoznawane jako cele leków w różnych stanach7. Ostatnio poczyniono znaczne postępy w odkrywaniu nowych inhibitorów miozyny8,9,10 i activators11, oraz w ulepszaniu właściwości istniejących12,13,14,15.
Test ATPazy sprzężony z dinukleotydem nikotynamidoadeninowym (NADH) od dawna jest używany do pomiaru aktywności ATPazy różnych enzymów, takich jak pompa ATPase2+ class="xref">16, ATPaza naprawy DNA Rad5417, AAA+ ATPase p9718 lub kinezyna silnika mikrotubuli 19. Test wykorzystuje cykl regeneracji ATP. Difosforan adenozyny (ADP) wytwarzany przez ATPazę jest regenerowany do ATP przez kinazę pirogronianową (PK), która równolegle przekształca jedną cząsteczkę fosfoenolopirogronianu (PEP) w pirogronian. Następnie pirogronian jest redukowany do mleczanu przez dehydrogenazę mleczanową (LDH). To z kolei utlenia jedną cząsteczkę NADH do NAD. Dlatego spadek stężenia NADH w funkcji czasu jest równy szybkości hydrolizy ATP. Cykl regeneracji ATP utrzymuje stężenie ATP prawie stałe, a stężenie ADP niskie tak długo, jak długo PEP jest dostępny. Skutkuje to liniowymi przebiegami czasowymi, co ułatwia określenie początkowych szybkości reakcji i pomaga uniknąć zahamowania produktu przez ADP19. Chociaż test ATPazy sprzężony z NADH został już dostosowany do formatu 96-dołkowego20, wysokie objętości reakcji (~150 μL) sprawiają, że jest on stosunkowo drogi ze względu na duże zapotrzebowanie na odczynniki, co czyni go mniej podatnym na szybkie badania przesiewowe dużej liczby związków. Alternatywne metody, takie jak test zieleni malachitowej19,21, które opierają się na wykrywaniu fosforanu wytwarzanego przez enzym ATPazę, okazały się bardziej odpowiednie do miniaturyzacji i wysokoprzepustowych badań przesiewowych22,23,24. Jednak bardziej prawdopodobne jest, że na test końcowy wpłynie kilka artefaktów (omówionych poniżej), które mogą pozostać nieodkryte w przypadku braku kursów w pełnym wymiarze godzin.
Tutaj test ATPazy sprzężony z NADH został zoptymalizowany pod kątem półwysokoprzepustowych badań przesiewowych inhibitorów małych cząsteczek. Miozyna II mięśnia szkieletowego i mięśnia sercowego oraz inhibitory miozyny blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 i para-nitroblebbistatin12 są używane do zademonstrowania mocy testu, który opiera się na fluorescencji NADH jako odczycie. Protokół ten jest podatny na projekty przesiewowe skoncentrowane na dowolnych enzymach wytwarzających ADP.

<table><tbody><tr><td>384-dołkowy polistyren z płaskim dnem z niskim kołnierzem Mikropłytka NBS</td><td>Corning</td><td>3575</td><td></td></tr><tr><td>ATP (hydrat soli disodowej adenozyno-5&-trifosforanu)</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Dozownik Aurora FRD-IB</td><td>Aurora Discovery, Inc.</td><td></td><td></td>00017425</tr><tr><td>Biomek NXP Wielokanałowa stacja robocza do automatyzacji laboratorium</td><td>Beckman Coulter</td><td>A31841</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatyna</td><td>AMRI</td><td>N/A</td><td>Niestandardowa</td></tr><tr><td>synteza BSA (albumina surowicy bydlęcej, wolna od proteazy)</td><td>Akron Biotech</td><td>AK1391&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5430 R, chłodzona, z rotorem FA-35-6-30</td><td>Eppendorf</td><td>022620663</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5430, bez chłodzenia, z rotorem A-2-MTP</td><td>Eppendorf</td><td>022620568</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimetylosulfotlenek)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>D5545</td><td></td></tr><tr><td>E1 Pipeta wielokanałowa ClipTip; format 384; 8-kanałowa</td><td></td> pipeta <td>wielokanałowa Thermo Scientific</td> 4672010 <td></td></tr><tr><td>E1 ClipTip; 96-formatowa; 8-kanałowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>4672080</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (Glikol-etylen-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraoctowy)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>EnVision 2104 Multilabel Czytnik płytek</td><td>PerkinElmer</td><td>2104-0010</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>LDH (dehydrogenaza L-mlekowa z mięśni królika)</td><td>Sigma</td><td>L1254</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O (sześciowodny chlorek magnezu)</td><td>&nbsp; </td> Wytrząsarka do mikropłytek Sigma <td>M2670</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR&</td><td>nbsp; 12620-926&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytka, 384 dołk, PP, Mała objętość, Studnia głębinowa, Natural</td><td>Greiner Bio-One</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>MOPS (kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>Białko motoryczne miozyny (pełna długość) (mięsień sercowy bydła)</td><td>Cytoszkielet&nbsp;</td><td>MY03</td><td></td></tr><tr><td>Białko motoryczne miozyny (pełna długość) (mięśnie szkieletowe królika)</td><td>Cytoszkielet&nbsp;</td><td>MY02</td><td></td></tr><tr><td>NADH (&beta;-dinukleotyd nikotynamidoadeninowy, zredukowany hydrat soli disodowej)</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>NaN3 (Azydek sodu)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (wodorotlenek sodu)</td><td>&nbsp; Filtr optyczny Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>CFP 470/24nm (emisja)</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-5850</td><td>Kod kreskowy 240</td></tr><tr><td>Filtr optyczny Fura2 380/10nm (wzbudzenie)</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-5390</td><td>Kod kreskowy 112</td></tr><tr><td>Moduł optyczny: Beta Laktamaza</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-4270</td><td>Kod kreskowy 418</td></tr><tr><td>Oprogramowanie OriginPro 2017</td><td>OriginLab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>para-Aminoblebbistatin</td><td>AMRI</td><td>N/A</td><td>Niestandardowa synteza</td></tr><tr><td> para-Nitroblebistatyna</td><td>AMRI</td><td>N/A</td><td>Niestandardowa synteza</td></tr><tr><td>PEP (sól monopotasowa kwasu fosfo(enolu)pirogronowego)</td><td>Sigma</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>PK (kinaza pirogronianowa z mięśni królika)</td><td>Sigma</td><td>P9136</td><td></td></tr><tr><td>Aceton w proszku z mięśni królika</td><td>Pel Freez Biologicals</td><td>41995-2</td><td></td></tr></tbody></table>

adaptacja półwysokoprzepustowa testu atpazy sprzężonej z nadh do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Enzymy ATPazy wykorzystują wolną energię zgromadzoną w trifosforanie adenozyny do katalizowania szerokiej gamy endergonicznych procesów biochemicznych in vivo, które nie zaszłyby spontanicznie. Białka te mają kluczowe znaczenie dla zasadniczo wszystkich aspektów życia komórkowego, w tym metabolizmu, podziału komórek, reakcji na zmiany środowiskowe i ruchu. Przedstawiony tutaj protokół opisuje test ATPazy sprzężony z dinukleotydem nikotynamidoadeninowym (NADH), który został dostosowany do półwysokoprzepustowych badań przesiewowych małocząsteczkowych inhibitorów ATPazy. Test został zastosowany do miozyny II serca i mięśni szkieletowych, dwóch molekularnych ATPaz motorycznych na bazie aktyny, jako dowód zasady. Hydroliza ATP jest sprzężona z utlenianiem NADH w reakcjach enzymatycznych w teście. Po pierwsze, ADP generowany przez ATPazę jest regenerowany do ATP przez kinazę pirogronianową (PK). PK katalizuje równolegle przemianę fosfoenolopirogronianu (PEP) w pirogronian. Następnie pirogronian jest redukowany do mleczanu przez dehydrogenazę mleczanową (LDH), która katalizuje równolegle utlenianie NADH. Zatem spadek stężenia ATP jest bezpośrednio skorelowany ze spadkiem stężenia NADH, po którym następuje zmiana wewnętrznej fluorescencji NADH. Dopóki PEP jest dostępny w układzie reakcyjnym, stężenie ADP pozostaje bardzo niskie, co pozwala uniknąć hamowania enzymu ATPazy przez jego własny produkt. Co więcej, stężenie ATP pozostaje prawie stałe, co daje liniowe przebiegi czasowe. Fluorescencja jest monitorowana w sposób ciągły, co pozwala na łatwe oszacowanie jakości danych i pomaga odfiltrować potencjalne artefakty (np. wynikające z wytrącania się związków lub zmian termicznych).

Typowy schemat rozmieszczenia na płytce stosowany w eksperymentach przesiewowych przedstawiono na Rysunku 1. Pierwszy i ostatni rząd są zarezerwowane odpowiednio dla kalibracji NADH oraz kontroli pozytywnej (20 µM para-aminoblebbistatyny, 0,5% DMSO). Pozostałe rzędy (B do O) służą do badania aktywności hamującej związków. Przygotowuje się piętnastostopniowe rozcieńczenia seryjne 1:2, zaczynając od stężenia związku 10 mM w DMSO, a następnie przenosi s...

Test ATPazy sprzężony z dinukleotydem nikotynamidoadeninowym (NADH) został dostosowany do półwysokoprzepustowych badań przesiewowych małocząsteczkowych inhibitorów miozyny. Ten test kinetyczny jest przeprowadzany w 384-dołkowym formacie mikropłytki, przy całkowitej objętości reakcji wynoszącej zaledwie 20 μl na dołek. Platforma powinna mieć zastosowanie do praktycznie każdego enzymu wytwarzającego ADP.

Adaptacja półwysokoprzepustowa testu ATPazy sprzężonej z NADH do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Protokół ten ma zastosowanie w szerokim zakresie projektów przesiewowych mających na celu opracowanie inhibitorów ATPazy, zarówno jako sondy do badań podstawowych, jak i dla potencjalnych związków klinicznych. Ta metoda została zoptymalizowana pod kątem zastosowań przesiewowych o niskiej przepustowości. Został również zaprojektowany tak, aby uniknąć kilku typowych artefaktów i nie wymaga obchodzenia się z materiałami niebezpiecznymi.W naszym laboratorium wykorzystujemy ten test do opracowywania nowych i specyficznych inhibitorów miozyny II niezwiązanych z mięśniami do leczenia zaburzeń związanych z używaniem metamfetaminy. Teoretycznie metodę tę można łatwo zastosować do dowolnych enzymów wytwarzających ATP. Demonstracja wizualna pomaga wyjaśnić wszystkie ważne szczegóły techniczne.Na początek przygotuj 4 500 mikrolitrów 20-mikromolowego rozcieńczonego roztworu aktyny na każdą 384-dołkową czarną mikropłytkę polistyrenową, rozcieńczając stężony roztwór podstawowy aktyny w buforze aktyny. Dokładnie wymieszaj roztwór, pipetując w górę i w dół 30 razy, aby rozbić filamenty aktynowe w celu zmniejszenia lepkości i niejednorodności. Następnie odwirować roztwór, aby usunąć wszelkie wytrącone białko.Ostrożnie przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej. Przygotować główną mieszaninę enzymów w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 mililitrów dla każdej płytki testowej, łącząc 3 252,9 mikrolitrów buforu miozyny do testu z udziałem miozyny mięśni szkieletowych II, 171,4 mikrolitrów roztworu LDH i 171,4 mikrolitrów roztworu PK. Przygotuj główną mieszankę substratów w 15-mililitrowej stożkowej probówce wirówkowej dla każdej płytki, łącząc 162,1 mikrolitrów ATP, 162,1 mikrolitrów PEP i 324,1 mikrolitrów roztworu NADH.Nie dodawaj aktyny w tym momencie, aby uniknąć agregacji i wytrącania się. Aby stworzyć siedmiostopniowe seryjne rozcieńczenia NADH od jednego do dwóch do kalibracji, przygotuj osiem 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek. Wymieszaj 12,3 mikrolitra roztworu podstawowego NADH z 257,7 mikrolitrami buforu miozyny w pierwszej probówce, aby uzyskać roztwór o masie 250 mikromolów.Następnie podwielokrotność 135 mikrolitrów buforu miozyny do każdej z pozostałych siedmiu probówek. Przenieść 135 mikrolitrów roztworu z pierwszej probówki do drugiej i wymieszać pipetując. Powtarzaj aż do siódmej probówki.Użyj ostatniej rurki jako kontroli bez NADH z samym buforem. Zawsze uwzględniaj kontrole dodatnie i ujemne na płytkach złożonych oraz rozcieńczenia NADH do kalibracji na płytkach testowych. Te kontrolki są niezwykle ważne dla identyfikowania artefaktów podczas analizy danych.Za pomocą pipety ośmiokanałowej przenieś 20 mikrolitrów roztworów kalibracyjnych NADH do pierwszego rzędu w trzech powtórzeniach na płytce testowej. Teraz dodaj 4,2 mikrolitra miozyny II mięśni szkieletowych do mieszanki enzymów. Wiruj krótko.Dodaj miozynę do mieszanki enzymów tuż przed dozowaniem. Długa inkubacja rozcieńczonych roztworów miozyny może powodować utratę aktywności z powodu wytrącania się i niespecyficzne wiązanie z powierzchniami z tworzywa sztucznego. Załaduj przygotowaną mieszaninę enzymów miozyny do jednego z pojemników na próbki automatycznego dozownika.Na płytce, z wyjątkiem pierwszego rzędu, dozować 8,4 mikrolitra mieszanki enzymów miozyny do każdego dołka płytki testowej. Następnie umieść płytkę testową i płytkę złożoną na pozycjonerach laboratoryjnych zautomatyzowanego systemu obsługi cieczy, który jest wyposażony w głowicę narzędziową o pojemności 100 nanolitrów. Następnie uruchom odpowiednią metodę w oprogramowaniu, aby przenieść 100 nanolitrów roztworów z przygotowanej płytki złożonej na płytkę testową.Następnie umieścić płytkę testową na wytrząsarce do mikropłytek, aby wstrząsać przez jedną minutę w temperaturze pokojowej przy 1 200 obr./min. Dodać 4 052 mikrolitry odwirowanego roztworu aktyny do mieszaniny substratów i krótko wirować. Aby rozpocząć reakcję enzymatyczną, należy dozować 11,6 mikrolitra mieszanki substratu aktynowego do każdego dołka płytki testowej za pomocą automatycznego dozownika, z wyjątkiem pierwszego rzędu.Na wytrząsarce do mikropłytek wstrząsać płytką testową przez jedną minutę w temperaturze pokojowej z prędkością 1 200 obr./min. Odwirować płytkę testową z ciśnieniem 101 razy g przez 30 sekund. Do testów należy użyć filtra wzbudzenia o szerokości pasma 380 nanometrów i 10 nanometrach oraz filtra emisyjnego o szerokości pasma 470 nanometrów i długości 24 nanometrów w połączeniu z 425-nanometrowym odciętym zwierciadłem dichroicznym.Zoptymalizuj liczbę błysków, wzmocnienie detektora, wymiary płytki i wysokość pomiaru przed uruchomieniem testów. Uruchom pomiar w trybie wysokiego stężenia. Upewnij się, że wewnętrzna temperatura czytnika płytek ustabilizowała się na poziomie 25 stopni Celsjusza.Załaduj płytkę do czytnika płytek i potrząsaj przez kolejne 30 sekund, aby kształt powierzchni cieczy był podobny w każdym dołku i pozwól płytce osiągnąć temperaturę pomiaru. Skanuj płytkę w 45-sekundowych odstępach i rejestruj fluorescencję NADH przez 30 minut. Na podstawie wyeksportowanych danych wykreśl obserwowaną intensywność fluorescencji w czasie dla każdej studzienki.Wykonaj prostą regresję liniową, aby określić nachylenie i przecięcie odpowiedzi fluorescencyjnych dla każdej studzienki. Nachylenie jest proporcjonalne do wskaźnika zużycia NADH, który może być używany jako bardzo dobre przybliżenie wskaźnika zużycia ATP. Przecięcie jest proporcjonalne do stężenia NADH na początku pomiaru.Następnie skonstruuj krzywą kalibracyjną dla NADH, wykreślając punkty przecięcia uzyskane dla pierwszego rzędu płytki w stosunku do stężenia NADH. Przechwycenia szacują rzeczywiste intensywności fluorescencji na początku ze znacznie większą pewnością niż średnia surowej intensywności fluorescencji odczytana na początku. Wykonaj prostą regresję liniową, aby uzyskać nachylenie i punkt przecięcia linii kalibracyjnej NADH.W tym przypadku przecięcia opisują fluorescencyjny sygnał tła bez NADH, podczas gdy nachylenie odpowiada ekstrapolowanej teoretycznej intensywności fluorescencji jednomolowego roztworu NADH. Aby przeliczyć zmiany fluorescencji na wskaźniki zużycia ATP, podziel nachylenie odpowiedzi fluorescencyjnej uzyskanej dla pozostałych studzienek przez nachylenie linii kalibracyjnej NADH. Następnie należy wykreślić wskaźniki zużycia ATP w stosunku do stężenia inhibitora.Aby wyznaczyć stałe hamowania, należy użyć odpowiedniego oprogramowania statystycznego zdolnego do dopasowania krzywej nieliniowej, takiego jak Origin 2017. Wybierz dopasowanie krzywej nieliniowej, aby dopasować dane dawka-odpowiedź do równania kwadratowego odpowiadającego prostemu modelowi równowagi wiązania jeden do jednego. Y jest wskaźnikiem zużycia ATP.Y-minimum to wskaźnik zużycia ATP przy braku inhibitora. Y-maksimum to teoretyczny wskaźnik zużycia ATP przy 100% hamowaniu. T i T są całkowitym stężeniem odpowiednio enzymu i inhibitora miozyny.KI jest stałą hamującą. W tym badaniu reakcje ATPazy miozyny II mięśnia szkieletowego i mięśnia sercowego wykazały ślady liniowej intensywności fluorescencji niezależnie od zastosowanej miozyny lub obecności inhibitorów. Wskaźniki ATPazy aktywowanej aktyną i bazową wykazały liniową zależność od stężenia miozyny II.Współczynnik okna przesiewowego lub współczynnik Z wynoszący 0,78 wskazywał na wiarygodny test z bardzo dobrze oddzielonymi kontrolami pozytywnymi i ujemnymi.Blebbistatyna, para-aminoblebistatyna i para-nitroblebbistatyna wykazywały regularne krzywe dawka-odpowiedź na poziomie lub poniżej podanych wartości rozpuszczalności. Stałe hamujące zarówno dla miozyny II mięśnia sercowego, jak i mięśni szkieletowych określono poprzez dopasowanie do danych równania kwadratowego reprezentującego prosty model wiązania równowagi. Ślady intensywności fluorescencji blebbistatyny uzyskane w teście ATPazy z użyciem miozyny II mięśni szkieletowych wykazały normalny liniowo malejący sygnał w zależności od ilości obecnego inhibitora.Jednak powyżej rozpuszczalności blibstatyny zaobserwowano nieoczekiwany wzrost sygnału, najprawdopodobniej spowodowany tworzeniem się jaskrawo fluorescencyjnych kryształów blebbistatyny. W przypadku para-nitroblebistatyny z normalnymi śladami intensywności fluorescencji surowej, szybkości reakcji uzyskane powyżej rozpuszczalności odbiegały od wyznaczonej krzywej dawka-odpowiedź z powodu wytrącania. Stosując tę metodę, opracowaliśmy nowe, silne i selektywne inhibitory miozyny, które mogą być wykorzystane jako narzędzia naukowe w badaniach podstawowych lub jako bezpośredni kandydaci w przyszłości.Zawsze zaleca się użycie innej ATPazy lub innego testu funkcjonalnego specyficznego dla enzymu będącego przedmiotem zainteresowania, aby odróżnić rzeczywiste i fałszywie dodatnie trafienia. Wszystkie białka wiążą powierzchnie z tworzywa sztucznego. Ten problem może mieć duży wpływ na wyniki, zwłaszcza jeśli białko jest obecne w niskich stężeniach.Zawsze unikaj niepotrzebnego obchodzenia się z płynami i używaj niewiążących tubek. Alternatywne testy ATPazy zwykle wymagają obchodzenia się z kwasem siarkowym, substancjami toksycznymi lub materiałami radioaktywnymi. W przeciwieństwie do tego, test ATPazy sprzężony z NADH wymaga odczynników o zerowej lub bardzo niskiej toksyczności.

a-semi-high-throughput-adaptation-nadh-coupled-atpase-assay-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Uporczywa aktywacja hamujących receptorów sprzężonych z białkiem G powoduje uwrażliwienie na sygnalizację cyklazy adenylowej. Aby zidentyfikować podstawowe szlaki molekularne, konieczne jest bezstronne podejście; jednak strategia ta wymaga opracowania skalowalnego testu uczulającego na cAMP opartego na komórkach. W niniejszym artykule opisujemy test uczulający do badań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA.

Uwrażliwienie cyklazy adenylowej na leki: usprawnienie i miniaturyzacja testów do zastosowań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA

Kinezyny charakteryzują się zależnym od nukleotydów oddziaływaniem z mikrotubulami: cyklem obrotu ATP sprzężonym z cyklem interakcji mikrotubul. W tym miejscu opisujemy protokoły analizy kinetyki poszczególnych przejść nukleotydowych w cyklu obrotu ATP kinezyny przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie nukleotydów i fluorescencji zatrzymanego przepływu.

Zastosowanie fluorescencji o zatrzymanym przepływie i znakowanych nukleotydów do analizy cyklu obrotu ATP kinezyn

Interakcja między kanałami HCN a ich podjednostką pomocniczą została zidentyfikowana jako cel terapeutyczny w dużym zaburzeniu depresyjnym. W tym artykule przedstawiono opartą na polaryzacji fluorescencyjnej metodę identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów tej interakcji białko-białko.

Metoda identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów oddziaływania białko-białko między HCN1 i TRIP8b

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Testy aktywności oparte na NMR zostały opracowane w celu identyfikacji i scharakteryzowania inhibitorów dwóch nukleozydowych enzymów rybohydrolazy. Przedstawiono protokoły dla początkowych testów związków chemicznych przy 500 μM i 250 μM, testów dawka-odpowiedź do oznaczania wartości IC50, testów przesiewowych licznika detergentów, testów przesiewowych licznika rozcieńczeń skokowych oraz testów w całych komórkach E. coli.

Testy aktywności oparte na NMR do określania inhibicji związku, wartości IC50, aktywności artefaktów i aktywności całych komórek rybohydrolaz nukleozydowych

Prezentowany tutaj jest czuły test fluorescencyjny do monitorowania aktywności N-acylotransferazy apolipoproteiny przy użyciu peptydu diacyloglicerylu i alkinofosfolipidów jako substratów z chemią kliknięć.

Test fluorometryczny oparty na technologii click-chemistry dla N-acylotransferazy apolipoproteiny od charakterystyki enzymu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych

SAMHD1 to trifosfohydrolaza deoksynukleozydowo-trifosforanowa, odgrywająca kluczową rolę w ludzkim zdrowiu i chorobie. Tutaj przedstawiamy wszechstronny test aktywności SAMHD1 sprzężony z enzymami, zastosowany w 384-dołkowym formacie mikropłytki, który pozwala na ocenę małych cząsteczek i analogów nukleotydów jako substratów, aktywatorów i inhibitorów SAMHD1.

Wysokoprzepustowy test aktywności sprzężony z enzymami do badania interakcji małych cząsteczek z dNTPazą SAMHD1

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Protokół ten opisuje test biochemiczny przesunięcia żelu do pomiaru aktywności FEN1 (endonukleazy płatowej 1) i rozwoju inhibitora.

Fluorescencyjne wykrywanie aktywności nukleazy FEN1 i badania przesiewowe inhibitorów drobnocząsteczkowych

Poznaj zoptymalizowany test ATPazy sprzężony z NADH do półwysokoprzepustowego przesiewowego badania inhibitorów małocząsteczkowych. Ta metoda umożliwia badaczom skuteczne opracowywanie nowych związków terapeutycznych.

Adaptacja półwysokoprzepustowa testu ATPazy sprzężonej z NADH do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych

Przeglądaj więcej filmów