Adaptacja półwysokoprzepustowa testu ATPazy sprzężonej z NADH do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych

Protokół ten ma zastosowanie w szerokim zakresie projektów przesiewowych mających na celu opracowanie inhibitorów ATPazy, zarówno jako sondy do badań podstawowych, jak i dla potencjalnych związków klinicznych. Ta metoda została zoptymalizowana pod kątem zastosowań przesiewowych o niskiej przepustowości. Został również zaprojektowany tak, aby uniknąć kilku typowych artefaktów i nie wymaga obchodzenia się z materiałami niebezpiecznymi.

W naszym laboratorium wykorzystujemy ten test do opracowywania nowych i specyficznych inhibitorów miozyny II niezwiązanych z mięśniami do leczenia zaburzeń związanych z używaniem metamfetaminy. Teoretycznie metodę tę można łatwo zastosować do dowolnych enzymów wytwarzających ATP. Demonstracja wizualna pomaga wyjaśnić wszystkie ważne szczegóły techniczne.

Na początek przygotuj 4 500 mikrolitrów 20-mikromolowego rozcieńczonego roztworu aktyny na każdą 384-dołkową czarną mikropłytkę polistyrenową, rozcieńczając stężony roztwór podstawowy aktyny w buforze aktyny. Dokładnie wymieszaj roztwór, pipetując w górę i w dół 30 razy, aby rozbić filamenty aktynowe w celu zmniejszenia lepkości i niejednorodności. Następnie odwirować roztwór, aby usunąć wszelkie wytrącone białko

Ostrożnie przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej. Przygotować główną mieszaninę enzymów w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 mililitrów dla każdej płytki testowej, łącząc 3 252,9 mikrolitrów buforu miozyny do testu z udziałem miozyny mięśni szkieletowych II, 171,4 mikrolitrów roztworu LDH i 171,4 mikrolitrów roztworu PK. Przygotuj główną mieszankę substratów w 15-mililitrowej stożkowej probówce wirówkowej dla każdej płytki, łącząc 162,1 mikrolitrów ATP, 162,1 mikrolitrów PEP i 324,1 mikrolitrów roztworu NADH.

Nie dodawaj aktyny w tym momencie, aby uniknąć agregacji i wytrącania się. Aby stworzyć siedmiostopniowe seryjne rozcieńczenia NADH od jednego do dwóch do kalibracji, przygotuj osiem 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek. Wymieszaj 12,3 mikrolitra roztworu podstawowego NADH z 257,7 mikrolitrami buforu miozyny w pierwszej probówce, aby uzyskać roztwór o masie 250 mikromolów.

Następnie podwielokrotność 135 mikrolitrów buforu miozyny do każdej z pozostałych siedmiu probówek. Przenieść 135 mikrolitrów roztworu z pierwszej probówki do drugiej i wymieszać pipetując. Powtarzaj aż do siódmej probówki.

Użyj ostatniej rurki jako kontroli bez NADH z samym buforem. Zawsze uwzględniaj kontrole dodatnie i ujemne na płytkach złożonych oraz rozcieńczenia NADH do kalibracji na płytkach testowych. Te kontrolki są niezwykle ważne dla identyfikowania artefaktów podczas analizy danych.

Za pomocą pipety ośmiokanałowej przenieś 20 mikrolitrów roztworów kalibracyjnych NADH do pierwszego rzędu w trzech powtórzeniach na płytce testowej. Teraz dodaj 4,2 mikrolitra miozyny II mięśni szkieletowych do mieszanki enzymów. Wiruj krótko.

Dodaj miozynę do mieszanki enzymów tuż przed dozowaniem. Długa inkubacja rozcieńczonych roztworów miozyny może powodować utratę aktywności z powodu wytrącania się i niespecyficzne wiązanie z powierzchniami z tworzywa sztucznego. Załaduj przygotowaną mieszaninę enzymów miozyny do jednego z pojemników na próbki automatycznego dozownika.

Na płytce, z wyjątkiem pierwszego rzędu, dozować 8,4 mikrolitra mieszanki enzymów miozyny do każdego dołka płytki testowej. Następnie umieść płytkę testową i płytkę złożoną na pozycjonerach laboratoryjnych zautomatyzowanego systemu obsługi cieczy, który jest wyposażony w głowicę narzędziową o pojemności 100 nanolitrów. Następnie uruchom odpowiednią metodę w oprogramowaniu, aby przenieść 100 nanolitrów roztworów z przygotowanej płytki złożonej na płytkę testową.

Następnie umieścić płytkę testową na wytrząsarce do mikropłytek, aby wstrząsać przez jedną minutę w temperaturze pokojowej przy 1 200 obr./min. Dodać 4 052 mikrolitry odwirowanego roztworu aktyny do mieszaniny substratów i krótko wirować. Aby rozpocząć reakcję enzymatyczną, należy dozować 11,6 mikrolitra mieszanki substratu aktynowego do każdego dołka płytki testowej za pomocą automatycznego dozownika, z wyjątkiem pierwszego rzędu.

Na wytrząsarce do mikropłytek wstrząsać płytką testową przez jedną minutę w temperaturze pokojowej z prędkością 1 200 obr./min. Odwirować płytkę testową z ciśnieniem 101 razy g przez 30 sekund. Do testów należy użyć filtra wzbudzenia o szerokości pasma 380 nanometrów i 10 nanometrach oraz filtra emisyjnego o szerokości pasma 470 nanometrów i długości 24 nanometrów w połączeniu z 425-nanometrowym odciętym zwierciadłem dichroicznym.

Zoptymalizuj liczbę błysków, wzmocnienie detektora, wymiary płytki i wysokość pomiaru przed uruchomieniem testów. Uruchom pomiar w trybie wysokiego stężenia. Upewnij się, że wewnętrzna temperatura czytnika płytek ustabilizowała się na poziomie 25 stopni Celsjusza.

Załaduj płytkę do czytnika płytek i potrząsaj przez kolejne 30 sekund, aby kształt powierzchni cieczy był podobny w każdym dołku i pozwól płytce osiągnąć temperaturę pomiaru. Skanuj płytkę w 45-sekundowych odstępach i rejestruj fluorescencję NADH przez 30 minut. Na podstawie wyeksportowanych danych wykreśl obserwowaną intensywność fluorescencji w czasie dla każdej studzienki.

Wykonaj prostą regresję liniową, aby określić nachylenie i przecięcie odpowiedzi fluorescencyjnych dla każdej studzienki. Nachylenie jest proporcjonalne do wskaźnika zużycia NADH, który może być używany jako bardzo dobre przybliżenie wskaźnika zużycia ATP. Przecięcie jest proporcjonalne do stężenia NADH na początku pomiaru.

Następnie skonstruuj krzywą kalibracyjną dla NADH, wykreślając punkty przecięcia uzyskane dla pierwszego rzędu płytki w stosunku do stężenia NADH. Przechwycenia szacują rzeczywiste intensywności fluorescencji na początku ze znacznie większą pewnością niż średnia surowej intensywności fluorescencji odczytana na początku. Wykonaj prostą regresję liniową, aby uzyskać nachylenie i punkt przecięcia linii kalibracyjnej NADH.

W tym przypadku przecięcia opisują fluorescencyjny sygnał tła bez NADH, podczas gdy nachylenie odpowiada ekstrapolowanej teoretycznej intensywności fluorescencji jednomolowego roztworu NADH. Aby przeliczyć zmiany fluorescencji na wskaźniki zużycia ATP, podziel nachylenie odpowiedzi fluorescencyjnej uzyskanej dla pozostałych studzienek przez nachylenie linii kalibracyjnej NADH. Następnie należy wykreślić wskaźniki zużycia ATP w stosunku do stężenia inhibitora.

Aby wyznaczyć stałe hamowania, należy użyć odpowiedniego oprogramowania statystycznego zdolnego do dopasowania krzywej nieliniowej, takiego jak Origin 2017. Wybierz dopasowanie krzywej nieliniowej, aby dopasować dane dawka-odpowiedź do równania kwadratowego odpowiadającego prostemu modelowi równowagi wiązania jeden do jednego. Y jest wskaźnikiem zużycia ATP.

Y-minimum to wskaźnik zużycia ATP przy braku inhibitora. Y-maksimum to teoretyczny wskaźnik zużycia ATP przy 100% hamowaniu. T i T są całkowitym stężeniem odpowiednio enzymu i inhibitora miozyny.

KI jest stałą hamującą. W tym badaniu reakcje ATPazy miozyny II mięśnia szkieletowego i mięśnia sercowego wykazały ślady liniowej intensywności fluorescencji niezależnie od zastosowanej miozyny lub obecności inhibitorów. Wskaźniki ATPazy aktywowanej aktyną i bazową wykazały liniową zależność od stężenia miozyny II.Współczynnik okna przesiewowego lub współczynnik Z wynoszący 0,78 wskazywał na wiarygodny test z bardzo dobrze oddzielonymi kontrolami pozytywnymi i ujemnymi.

Blebbistatyna, para-aminoblebistatyna i para-nitroblebbistatyna wykazywały regularne krzywe dawka-odpowiedź na poziomie lub poniżej podanych wartości rozpuszczalności. Stałe hamujące zarówno dla miozyny II mięśnia sercowego, jak i mięśni szkieletowych określono poprzez dopasowanie do danych równania kwadratowego reprezentującego prosty model wiązania równowagi. Ślady intensywności fluorescencji blebbistatyny uzyskane w teście ATPazy z użyciem miozyny II mięśni szkieletowych wykazały normalny liniowo malejący sygnał w zależności od ilości obecnego inhibitora.

Jednak powyżej rozpuszczalności blibstatyny zaobserwowano nieoczekiwany wzrost sygnału, najprawdopodobniej spowodowany tworzeniem się jaskrawo fluorescencyjnych kryształów blebbistatyny. W przypadku para-nitroblebistatyny z normalnymi śladami intensywności fluorescencji surowej, szybkości reakcji uzyskane powyżej rozpuszczalności odbiegały od wyznaczonej krzywej dawka-odpowiedź z powodu wytrącania. Stosując tę metodę, opracowaliśmy nowe, silne i selektywne inhibitory miozyny, które mogą być wykorzystane jako narzędzia naukowe w badaniach podstawowych lub jako bezpośredni kandydaci w przyszłości.

Zawsze zaleca się użycie innej ATPazy lub innego testu funkcjonalnego specyficznego dla enzymu będącego przedmiotem zainteresowania, aby odróżnić rzeczywiste i fałszywie dodatnie trafienia. Wszystkie białka wiążą powierzchnie z tworzywa sztucznego. Ten problem może mieć duży wpływ na wyniki, zwłaszcza jeśli białko jest obecne w niskich stężeniach.

Zawsze unikaj niepotrzebnego obchodzenia się z płynami i używaj niewiążących tubek. Alternatywne testy ATPazy zwykle wymagają obchodzenia się z kwasem siarkowym, substancjami toksycznymi lub materiałami radioaktywnymi. W przeciwieństwie do tego, test ATPazy sprzężony z NADH wymaga odczynników o zerowej lub bardzo niskiej toksyczności.