Ulepszony test oparty na białku zielonej fluorescencji do badania wzrostu neurytów w neuronach pierwotnych

Niska wydajność transfekcji jest główną przeszkodą w określeniu, w jaki sposób białko reaktywuje wzrost neurytów w neuronach pierwotnych. Nasz protokół rozwiązał ten problem poprzez kotransfekcję EGFP w celu identyfikacji pomyślnie transfekowanych komórek. Wysoki współczynnik kotransfekcji EGFP i białek będących przedmiotem zainteresowania zapewnia dokładność testu.

W związku z tym wymagane jest teraz barwienie immunofluorescencyjne. Ponieważ wzrost neurytów następuje podczas regeneracji neuronów, metoda ta może być stosowana do identyfikacji nowych celów do przywrócenia uszkodzonej sieci neuronalnej w urazach mózgu lub chorobach neurodegeneracyjnych. Przed rozpoczęciem zabiegu należy umieścić sterylne okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 18 milimetrów w każdym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i pokryć każde szkiełko nakrywkowe pięcioma mikrogramami na milimetr roztworu poli-D-lizyny w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę.

Pod koniec inkubacji odessać roztwór poli-D-lizyny i przepłukać szkiełka nakrywkowe sterylną wodą. W 18 dniu embrionalnym umieść macicę pobraną od ciężarnej szczura Sprague Dawley na 10-centymetrowej szalce Petriego i użyj małych nożyczek do preparowania, aby otworzyć macicę i worek owodniowy. Użyj nożyczek, aby usunąć łożysko i użyj kleszczy, aby przenieść jeden cały zarodek na nową, 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą schłodzoną glukozę PBS.

Użyj nożyczek, aby przeciąć wzdłuż strzałkowego szwu czaszki i użyj małej płaskiej szpatułki, aby przenieść embrionalny mózg do nowej 10-centymetrowej szalki Petriego zawierającej świeżą, lodowatą glukozę PBS. Za pomocą dwóch pęset numer pięć i mikroskopu preparacyjnego oddziel dwie półkule mózgowe od móżdżku i pnia mózgu i usuń opony mózgowe. Następnie odizoluj korę od półkul mózgowych i umieść korę w 15-mililitrowej probówce zawierającej świeżą, lodowatą glukozę PBS.

W przypadku pierwotnej hodowli neuronów korowych, w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, pozwól korze osiąść grawitacyjnie przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed zastąpieniem glukozy PBS 0,05% trypsyną EDTA. Wymieszaj z delikatnym stukaniem i inkubuj tkankę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut z dodatkowym delikatnym stukaniem co dwie minuty. Pod koniec inkubacji należy przerwać trawienie czterema mililitrami pożywki podtrzymującej i użyć pipety o wielkości jednego mililitra, aby zdysocjować tkankę za pomocą delikatnego roztarcia.

Osadź komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze pożywki konserwacyjnej do drugiego odwirowania. Ponownie zawiesić osad utworzony po drugim odwirowaniu w jednym mililitrze świeżej pożywki konserwacyjnej do liczenia i umieścić izolowane neurony w stężeniu 6,5 razy 10 do czwartego żywego stężenia na centymetr kwadratowy w jednym mililitrze pożywki konserwacyjnej na studzienkę na płytce 12-dołkowej. Po dwóch dniach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla rozcieńczyć EGFP i plazmidowe DNA z białkiem docelowym oraz odczynnik do transfekcji w dwóch oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 mililitra, a następnie wymieszać je ze sobą.

Transfekcja komórek za pomocą konstruktu EGFP poprzez dodanie mieszanki transfekcyjnej do studzienek. Po 24 godzinach umyj komórki PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza i utrwal je 4% paraformaldehydem w PBS przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przemyć utrwalone komórki trzy razy świeżym PBS na przemycie i dodać minimalną objętość pożywki do montażu fluorescencji na jednym szkiełku mikroskopowym na próbkę.

Następnie ostrożnie przenieś powlekane szkiełka nakrywkowe na nośnik montażowy tak, aby próbki były skierowane w stronę szkiełek podstawowych. Aby zobrazować wzrost neurytów, wybierz obiektyw 40X w mikroskopie epifluorescencyjnym i kliknij start, aby uchwycić obrazy z co najmniej 40 nienaruszonych neuronów EGFP dodatnich na transfekcję. Po zobrazowaniu wszystkich neurytów otwórz przechwycone obrazy w ImageJ za pomocą wtyczki NeuronJ i zmierz długość najdłuższego neurytu każdego neuronu od ciała komórki do czubka stożka wzrostu.

Następnie przeanalizuj dane uzyskane za pomocą oprogramowania, aby określić wpływ docelowych białek na wzrost neurytów. Cytochalazyna D hamuje wydłużanie neurytów w sposób zależny od dawki, podczas gdy wzrost neurytów jest zwiększony w neuronach leczonych czynnikiem wzrostu nerwów. Ponadto białko adaptora wzrostu neuronów FE65 znacząco stymuluje wzrost neurytów dwukrotnie w porównaniu z neuronami nietransfekowanymi.

Pomimo niskiej skuteczności transfekcji, analiza immunofluorescencyjna ujawnia, że ponad 80% dwudniowej hodowli komórkowej można z powodzeniem transfekować za pomocą EGFP i FE65. Ekspresja EGFP jest wykrywana po sześciu godzinach od transfekcji, podczas gdy FE65 jest po raz pierwszy wykrywana w godzinie 12, a oba sygnały są wykrywane przez okres do siedmiu dni po transfekcji. Transfekcja pierwotnych neuronów korowych szczura z różnymi ilościami plazmidowego DNA FE65 ujawnia zależny od dawki wzrost wydłużenia neurytów z 0 do 0,5 mikrograma plazmidu FE65.

Nie obserwuje się jednak znaczącej różnicy we wzroście w neuronach transfekowanych 0,5 lub jednym mikrogramem plazmidu. Podczas próby wdrożenia protokołu ważne jest, aby wyizolować odpowiedni region od mózgu embrionalnego. Technika ta może być również zastosowana do badania wzrostu neuronów w ludzkich neuronach pochodzących z iPSC, które mają cenne narzędzia dla medycyny regeneracyjnej.