Name: Zaburzanie biomechaniki śródbłonka poprzez zakłócenie strukturalne Connexin 43 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj metodę zakłócania Connexin 43 w celu pomiaru sił mechanicznych komórek śródbłonka. Technika ta umożliwia badanie procesów fizjologicznych i patologicznych, takich jak gojenie ran oraz przerzuty nowotworowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze start-upowe Uniwersytetu Centralnej Florydy oraz Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi Narodowego Instytutu Zdrowia w ramach K25HL132098 przyznanej przez Narodowy Instytut Zdrowia.

1. Wytwarzanie żeli z poliakrylamidu (PA)
<ol>
	<li>Przygotowanie szalki Petriego
	<ol>
		<li>Przygotować wiążący roztwór silanu, mieszając 200 ml ultraczystej wody z 80 μl kwasu octowego i 50 μl metakrylanu 3-(trimetoksysililo)propylu. Silan Bind to roztwór stosowany do funkcjonalizacji powierzchni płytki Petriego ze szklanym dnem do mocowania hydrożelu.</li>
		<li>Mieszać roztwór silanu na płytce mieszającej przez co najmniej 1 godzinę.</li>
		<li>Potraktuj środkową studzienkę szalki Petriego roztworem silanu wiążącego przez 45 minut.</li>
		<li>Usuń wiążący roztwór silanu i opłucz szalkę Petriego ultra czystą wodą 2x-3x.</li>
		<li>Wysuszyć powierzchnię szalki Petriego i przechowywać w temperaturze pokojowej do wykorzystania w przyszłości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu hydrożelu
	<ol>
		<li>Wymieszaj ultraczystą wodę, 40% akrylamidu i 2% bis-akrylamidu w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml zgodnie z tabelą 1.</li>
		<li>Do roztworu hydrożelu dodać 80 μl kulek fluorescencyjnych.</li>
		<li>Delikatnie potrząśnij tubką, aby wymieszać kulki z roztworem żelu.</li>
		<li>Lekko dokręć nakrętkę probówki na probówce wirówkowej i umieść w komorze próżniowej.</li>
		<li>Odgazowywać roztwór żelu przez co najmniej 45 minut w komorze próżniowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Polimeryzacja hydrożelowa
	<ol>
		<li>Najpierw dodaj 75 μl 10% nadsiarczanu amonu (rozpuszczonego w ultraczystej wodzie), a następnie dodaj 8 μl TEMED (N,N,N',N'-tetrametyloetano-1,2-diaminy) do roztworu hydrożelu.</li>
		<li>Umieścić 24 μl roztworu hydrożelu na środku szalki Petriego (patrz Tabela 2).</li>
		<li>Użyj szkiełka nakrywkowego o średnicy 18 mm, aby spłaszczyć hydrożel. Da to wysokość ~100 μm.</li>
		<li>Odczekaj co najmniej 30-40 minut na polimeryzację żelu.</li>
		<li>Zanurz spolimeryzowany hydrożel w ultraczystej wodzie, aby zapobiec odwodnieniu żelu.</li>
		<li>Przykryj szalkę Petriego folią aluminiową, aby zapobiec fotowybielaniu kulek fluorescencyjnych i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Hydrożele można przechowywać przez okres do 3 miesięcy, ale sugeruje się, aby żele te stosować nie dłużej niż 1 tydzień po wyprodukowaniu, aby uzyskać najlepsze rezultaty.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Hodowla ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) w pożywce do hodowli komórkowej 200 (patrz tabela materiałów) uzupełnionej 1% penicyliną-streptomycyną na 0,1% kolbach pokrytych żelatyną w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Przygotowanie szablonu mikrowzoru
<ol>
	<li>Utwardź cienką warstwę polidimetylosiloksanu (PDMS) na szalce Petriego o średnicy 100 mm, mieszając bazę silikonową z utwardzaczem silikonowym w stosunku 20:1 (baza: utwardzacz). 
	UWAGA: Możliwe jest zastosowanie innych proporcji bazy do utwardzacza (np. 10:1 lub 30:1). Jednak niższy stosunek bazy do utwardzacza da sztywniejszy wzór, podczas gdy wyższy stosunek bazy do utwardzacza da bardziej miękki wzór.</li>
	<li>Przygotuj roztwór PDMS w proporcji 20:1 (baza: utwardzacz) i dokładnie wymieszaj w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Odwróć probówkę do góry nogami i energicznie potrząśnij kilka razy, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie roztworu PDMS, ponieważ nierównomierne mieszanie spowoduje niepełną polimeryzację.</li>
	<li>Usunąć pęcherzyki, które zostały wprowadzone z powyższego kroku, odwirowując roztwór PDMS przez 1 minutę przy 190 x g.</li>
	<li>Wlać 5-6 ml roztworu PDMS na środek szalki Petriego o średnicy 100 mm i mieszać szalkę, aż roztwór PDMS pokryje całą powierzchnię szalki Petriego.</li>
	<li>Roztwór PDMS należy utwardzać przez noc w temperaturze 50-60 °C. PDMS można również utwardzać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń okrągły szablon PDMS o średnicy 16 mm za pomocą dziurkacza.</li>
	<li>Użyj stempla do biopsji, aby utworzyć małe otwory w szablonie PDMS. W protokole tym wykorzystuje się stempel biopsyjny o średnicy 1,25 mm.</li>
	<li>Wysterylizuj szablony PDMS, zanurzając je najpierw w 70% etanolu na 2-3 minuty, odsysając nadmiar etanolu, a następnie umieszczając w świetle UV na 5 minut.</li>
</ol>
4. Powłoka hydrożelowa Collagen-I
<ol>
	<li>Usuń szkiełko nakrywkowe z hydrożelu i odessaj nadmiar płynu.</li>
	<li>Umieść szablon PDMS na powierzchni hydrożelu. 
	UWAGA: Pęseta może być używana do lekkiego nacisku na szablon PDMS, aby zapewnić wodoszczelne uszczelnienie między szablonem PDMS a powierzchnią hydrożelową. Nasze szablony PDMS są wodoszczelne, dzięki czemu zapobiegają dostępowi wody między górną powierzchnią żelu a dolną powierzchnią szablonu PDMS. Ponadto sztywność hydrożelu nie musi być regulowana w stosunku do sztywności PDMS.</li>
	<li>Pokryć powierzchnię hydrożelu heksanianem sulfosukcynimidylo-6-(4-azydo-2-nitrofenyloamino) (sulfo-SANPAH) rozpuszczonym w 0,1 M roztworze buforowym HEPES (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym) o stężeniu 1:1000 i umieścić pod lampą UV (moc 36 W) na 8 minut.</li>
	<li>Odessać nadmiar roztworu sulfo-SANPAH i HEPES i dwukrotnie przepłukać hydrożel 0,1 M HEPES, a następnie dodatkowo dwa razy przepłukać ultraczystą wodą.</li>
	<li>Odessać nadmiar ultraczystej wody i pokryć hydrożele 0,1 mg/ml kolagenu-I przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przykryj naczynia i chroń koraliki fluorescencyjne przed fotowybielaniem. 
	UWAGA: Szablony PDMS służą do tworzenia monowarstw z mikrowzorami. Stosowane są monowarstwy z mikrowzorami, ponieważ pozwalają one na jednoczesną obserwację wielu monowarstw o tej samej geometrii i wymiarach podczas każdego eksperymentu. Jeśli jednak mikrowzorce nie są pożądane, można postępować zgodnie z powyższymi krokami, z wyjątkiem kroku 4.2.</li>
</ol>
5. Tworzenie monowarstw HUVEC na hydrożelach
<ol>
	<li>Użyj 1x trypsyny, aby odłączyć komórki od kolb do hodowli tkankowych na 3-5 minut w inkubatorze.</li>
	<li>Po trypsynizacji dodać pożywkę do hodowli komórkowych do roztworu trypsyny i dodać do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirowywać roztwór komórek przez 3 minuty przy 1710 x g. Na dnie probówki wirówkowej powinna być widoczna mała, biała osadka komórek.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce do stężenia 50 x 104 komórek/ml.</li>
	<li>Usuń kolagen-I z hydrożelu i spłucz 1x PBS.</li>
	<li>Dodać 75 x 103 komórki do górnej części szablonu PDMS i pozwolić komórkom przyłączyć się do powierzchni hydrożelu przez co najmniej 1 godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Usuń szablon PDMS i dodaj co najmniej 2 ml pożywki do szalki Petriego. Zanurz szablon PDMS w 10x trypszynie, aby usunąć wszelkie przyczepione komórki i sterylizuj, spryskując 70% etanolem, a następnie umieszczając w świetle UV na 5 minut.</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze i odczekać co najmniej 36 godzin lub do momentu, gdy zaobserwuje się zlewającą się monowarstwę.</li>
</ol>
6. 2,5 dihydroksychalkonu leczenie zaburzeń Cx43
<ol>
	<li>Rozpuścić 2,5 dihydroksychalkonu (chalkonu) w dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 0,1875 mg/ml.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy pożywką do hodowli komórkowych w celu uzyskania podwielokrotności o niskim stężeniu chalkonu (0,2 μg/ml) i podwielokrotności o wysokim stężeniu chalkonu (2 μg/ml).</li>
</ol>
7. Akwizycja danych
<ol>
	<li>Zlokalizuj wyspy komórkowe za pomocą mikroskopu.</li>
	<li>Uzyskuj obrazy kontrastu fazowego i perełek, aby zobrazować odpowiednio morfologię komórek i przemieszczenia hydrożelu. 
	UWAGA: Ten protokół używał 10-krotnego celu do pozyskiwania danych.</li>
	<li>Pod koniec eksperymentu odłącz komórki za pomocą 10x trypsyny i uzyskaj obraz powierzchni żelu bez komórek (obraz referencyjny).</li>
</ol>
8. Barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>Utrwalić monowarstwy 4% formaldehydem i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Usuń 4% formaldehydu i dodaj 0,2% Triton X-100 przez 5 minut w temperaturze 37 °C, aby przepuszczalność komórek.</li>
	<li>Usuń 0,2% Triton X-100 i spłucz monowarstwy PBS 2x-3x.</li>
	<li>Przykryć monowarstwę 2% roztworem albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez 45 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usuń 2% roztwór BSA i przepłucz monowarstwy PBS 2x-3x.</li>
	<li>Dodać do próbki pierwszorzędowe przeciwciało Cx43 w stężeniu 1:400 i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć przeciwciało pierwszorzędowe i przepłukać próbkę PBS 2x-3x.</li>
	<li>Dodać przeciwciało drugorzędowe w stężeniu 3:200 i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Próbki należy przykryć, aby zapobiec fotowybielaniu.</li>
	<li>Usuń przeciwciało wtórne i przepłucz PBS 2x-3x.</li>
	<li>Przykryj próbkę medium montażowym (Fluromount-G DAPI) i uszczelnij szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 18 mm.</li>
</ol>
9. Implementacja mikroskopii siły pociągowej (TFM) i jednowarstwowej mikroskopii naprężeń (MSM)
<ol>
	<li>Obliczanie odkształceń hydrożelu 
	UWAGA: Procedura obliczania przemieszczenia krok po kroku przy użyciu MATLAB jest podana poniżej.
	<ol>
		<li>Otwórz główny plik traction.m w programie MATLAB (wszystkie procedury MATLAB można znaleźć w Materiałach uzupełniających). 
		UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w kodzie, aby ustawić katalog MATLAB.</li>
		<li>Zdefiniuj następujące zmienne: format obrazu, konwersję pikseli na mikrony, moduł Younga, współczynnik Poissona i obiektyw mikroskopu.</li>
		<li>Zlokalizuj obraz koralika, trypsynę i obraz fazy za pomocą podprogramu OpenFiles. 
		UWAGA: W przypadku dużych zestawów danych najlepiej jest nazywać pliki w kolejności sekwencyjnej. Na przykład pliki powinny mieć nazwy "filename1.tif", "filename2.tif" itp.</li>
		<li>Zdefiniuj kwadratowy ROI (obszar zainteresowania) wokół monowarstwy komórki i wykonaj cell_cropper podprogram, aby przyciąć oryginalny obraz.</li>
		<li>Wykonaj podprogram displacement_finder, aby obliczyć przemieszczenia.</li>
		<li>Wykonaj podprogram Dedrift, aby usunąć wszelkie dodatkowe przemieszczenia niekomórkowe, które mogą być spowodowane dryfem stolika mikroskopu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie trakcji 
	UWAGA: W tym przypadku nieograniczona przyczepność jest obliczana przy użyciu naszej niestandardowej procedury MATLAB. Obliczenia trakcji krok po kroku przy użyciu wspomnianej wcześniej procedury MATLAB podano poniżej.
	<ol>
		<li>Zdefiniuj następujące zmienne w ramach procedury traction.m: warunek brzegowy, grubość żelu, wysokość żelu i dryfowanie.</li>
		<li>Wykonaj podprogram traction_finder, aby obliczyć trakcję, a następnie wykonaj podprogram plot_traction, aby wykreślić trakcję. Wszystkie trakcje w kierunku x (Tx) i y-direction (Ty) wraz z odpowiadającymi im lokalizacjami pikseli można znaleźć w pliku traction.dat, który zostanie wygenerowany przez kod.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie naprężeń międzykomórkowych 
	UWAGA: Instrukcje krok po kroku dotyczące obliczania stresu międzykomórkowego przy użyciu wspomnianej wcześniej procedury MATLAB znajdują się poniżej.
	<ol>
		<li>Wykonaj mark_circular_domain podprogram, aby określić granicę monowarstwy. Ta procedura spowoduje sekwencyjne wyświetlenie wszystkich przyciętych obrazów fazowych, aby użytkownik mógł ręcznie narysować granicę wokół monowarstwy. Zanotuj nXPty wygenerowane w oknie poleceń i użyj ich później jako parametrów siatki zarówno na osi X, jak i na osi Y do analizy MES (patrz krok 9.3.2).</li>
		<li>Wykonaj Run_StressCode, aby obliczyć stresy międzykomórkowe. Ten podprogram bezpośrednio odczytuje parametry z pliku "model.in" i wykonuje "island.exe" w celu przeprowadzenia analizy MES. Przed uruchomieniem tej procedury upewnij się, że wszystkie parametry w pliku model.in, tj. parametry siatki w X i Y, konwersja pikseli na mikrony, moduł Younga żelu, współczynnik Poissona, wysokość monowarstwy i wzór monowarstwy (pasek lub otwór), są poprawnie edytowane.</li>
		<li>Wykreślić wszystkie wyniki MES za pomocą podprogramu plot_FEM_results. 
		UWAGA: Wszystkie wygenerowane wyniki zostaną automatycznie zapisane w folderze Wyniki w katalogu MATLAB.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+and+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li>
<li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates%3A+A+guide+to+recent+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li>
<li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li>
<li>Colin-York, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-Resolved+Traction+Force+Microscopy+%28STFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM).</a> Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).</li>
<li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+stress+reconstitution+from+traction+force+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Intercellular stress reconstitution from traction force data.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).</li>
<li>Islam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+Experimental+Methods+of+Cellular+Force+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Journal+of+Science+%26+Technical+Research%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing.</a> Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).</li>
<li>Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear%2C+intercellular+stress%2C+and+endothelial+cell+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).</li>
<li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+forces+during+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+traction+forces%3A+a+useful+parameter+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research.</a> Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).</li>
<li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+driving+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).</li>
<li>Pasqualini, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706(2018).</li>
<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li>
<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+stress+microscopy%3A+limitations%2C+artifacts%2C+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172(2013).</li>
<li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+fields%2C+moments%2C+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li>
<li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li>
<li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).</li>
<li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).</li>
<li>Islam, M. M., Steward, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Endothelial+Cell+Mechanics+through+Connexin+43+Disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Mechanics%22%5BJournal%5D)">Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption.</a> Experimental Mechanics. 59, 327(2019).</li>
<li>Figueroa, X. F., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+in+the+control+of+vascular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Gap junctions in the control of vascular function.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).</li>
<li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gap junctions.</a> Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li>
<li>Sohl, G., Willecke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+and+the+connexin+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Gap junctions and the connexin protein family.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).</li>
<li>Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+connexins+to+the+function+of+the+vascular+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Contribution of connexins to the function of the vascular wall.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).</li>
<li>Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+phosphorylation+in+brain%2C+cardiac%2C+endothelial+and+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).</li>
<li>Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-specific+knockout+of+connexin+43+causes+hypotension+and+bradycardia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).</li>
<li>Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li>
<li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27%2C5%27-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li>
<li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li>
<li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+cytotoxicity+of+2%2C5-dihydroxychalcones+and+related+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pharmacal+Research%22%5BJournal%5D)">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nasza grupa, podobnie jak inne, z powodzeniem wykorzystuje TFM i MSM do badania wpływu połączeń komórka-komórka w różnych patologicznych i fizjologicznych procesach komórkowych in vitro 7,15,18,27. Na przykład Hardin i in. przedstawili bardzo wnikliwe badanie, które sugeruje, że międzykomórkowe przenoszenie stresu kieruje tworzeniem się luk parakomórkowych w komórkach śródbłonka<sup class="xref...

Dziedzina, która odnosi się do badania wpływu sił fizycznych i właściwości mechanicznych na fizjologię i patologię komórek i tkanek, znana jest jako mechanobiologia1. Kilka przydatnych technik, które zostały wykorzystane w mechanobiologii, to jednowarstwowa mikroskopia naprężeń i mikroskopia sił trakcyjnych. Mikroskopia sił trakcyjnych pozwala na obliczenie trakcji generowanych na granicy komórka-podłoże, podczas gdy jednowarstwowa mikroskopia naprężeń pozwala na obliczenie naprężeń międzykomórkowych generowanych między sąsiednimi komórkami w obrębie monowarstwy2,3,4,5,6. Wyniki uzyskane za pomocą poprzednich metod sugerują, że naprężenia mechaniczne pochodzące z komórek odgrywają kluczową rolę w określaniu losu wielu procesów komórkowych3,4,5. Na przykład, po wystawieniu na działanie zewnętrznej siły mechanicznej, grupa komórek migrujących jako kolektyw może zmienić swoją morfologię i spolaryzować swój kształt, aby wyrównać się i migrować zgodnie z kierunkiem przyłożonej siły, częściowo generując trakcje7,8. Trakcje zapewniają metrykę, którą można wykorzystać do oceny kurczliwości komórek i są obliczane za pomocą mikroskopii sił pociągowych (TFM). Mikroskopia sił trakcyjnych (TFM) rozpoczyna się od określenia deformacji podłoża wywołanych przez komórkę, a następnie obliczenia pola trakcyjnego przy użyciu matematycznie rygorystycznego, opartego na mechanice podejścia obliczeniowego. Ponieważ możliwość obliczania trakcji istnieje już od dłuższego czasu, naukowcy wykorzystali TFM do ujawnienia wpływu trakcji na wiele procesów, w tym cancer9, wound healing10 i ocenę zmodyfikowanej tkanki serca11.
Implementacja TFM i MSM razem może być podzielona na trzy zasadnicze kroki, które muszą być wykonane w następującej kolejności: po pierwsze, określa się deformacje hydrożelu wytwarzane przez komórki; po drugie, odzyskuje się trakcje z deformacji hydrożelu; i po trzecie, stosuje się podejście elementów skończonych do obliczania normalnych i ścinających naprężeń międzykomórkowych w całej monowarstwie. Aby obliczyć przemieszczenia żelu, obrazy kulek fluorescencyjnych z komórkami porównano z obrazem referencyjnym kulki (bez komórek) przy użyciu specjalnie napisanej procedury prędkości obrazu cząstek (PIV). Rozmiar okna korelacji krzyżowej i nakładanie się dla analizy PIV zostały wybrane tak, aby wynosiły odpowiednio 32 x 32 piksele i 0,5. W tym czasie przesunięcia pikseli zostały zamienione na mikrony poprzez pomnożenie przez współczynnik konwersji piksel-mikron (dla naszego mikroskopu ten współczynnik konwersji wynosi 0,65) w celu uzyskania przemieszczeń w płaszczyźnie. Błędy związane z ignorowaniem przemieszczeń poza płaszczyzną są znikome12,13. Po obliczeniu przemieszczeń żelu istnieją dwa rodzaje pomiarów trakcji, które można wykorzystać: trakcje z ograniczeniami i trakcje bez ograniczeń8,14. Nieograniczone trakcje zapewniają pole trakcji dla całego pola widzenia (w tym obszarów z komórkami i bez nich), podczas gdy ograniczone trakcje zapewniają pole trakcji tylko dla obszarów, które zawierają komórki14. Następnie oblicza się naprężenia międzykomórkowe za pomocą jednowarstwowej mikroskopii naprężeń (MSM), która jest rozszerzeniem mikroskopii sił trakcyjnych. Implementacja MSM opiera się na założeniu, że lokalne trakcje wywierane przez monowarstwę komórek na granicy komórka-podłoże muszą być równoważone przez siły mechaniczne przenoszone między komórkami na granicy komórka-komórka, zgodnie z wymogami praw Newtona7,12,13. Kluczowym założeniem jest to, że monowarstwę ogniwa można traktować jako cienką elastyczną blachę, ponieważ rozkład trakcji w monowarstwie jest znany, a równowaga sił nie zależy od właściwości materiału ogniwa. Innym kluczowym założeniem jest to, że siły trakcyjne są równoważone przez lokalne naprężenia międzykomórkowe w optycznym polu widzenia (w obrębie monowarstwy), a wpływ tej równowagi sił jest minimalny w obszarze dystalnym (poza monowarstwą)13. W związku z tym warunki brzegowe określone przez naprężenia międzykomórkowe, przemieszczenia lub kombinację obu tych czynników na granicy jednej warstwy mają kluczowe znaczenie dla wykonania MSM13. Biorąc pod uwagę powyższe informacje, wykorzystujemy MSM do przeprowadzenia analizy elementów skończonych (MES) w celu odzyskania maksymalnego naprężenia głównego (σmax) i minimalnego naprężenia głównego (σmin) poprzez obrócenie płaszczyzny naprężenia w każdym punkcie monowarstwy. Te główne naprężenia są następnie wykorzystywane do obliczenia średniego normalnego stresu międzykomórkowego 2D [(σmax + σmin) /2] i maksymalnego naprężenia międzykomórkowego przy ścinaniu 2D [(σmax - σmin) /2] w całej monowarstwie12,13. Ta procedura została opisana bardziej szczegółowo przez Tambe et al.12,13
Jednowarstwowa mikroskopia naprężeń (MSM) pozwala na obliczanie naprężeń międzykomórkowych między komórkami generowanych w monowarstwie6,7,8,12,13. Sugeruje się, że te stresy międzykomórkowe są ważne dla wzrostu i naprawy tkanek, gojenia się ran i przerzutów raka12,15,16,17. Ponadto zasugerowano, że stresy międzykomórkowe są również ważne w migracji komórek śródbłonka i funkcji bariery śródbłonkowej17,18. Podczas gdy sugeruje się, że połączenia komórka-komórka, takie jak połączenia ścisłe i połączenia adherens, odgrywają kluczową rolę w generowaniu i przekazywaniu stresu międzykomórkowego śródbłonka, rola połączeń szczelinowych pozostaje nieuchwytna. Złącza szczelinowe fizycznie łączą sąsiednie komórki i zapewniają ścieżkę dla prądu elektrycznego i cząsteczek (<1 KDa) do przejścia między sąsiednimi komórkami19,20,21. Chociaż komórki śródbłonka wyrażają połączenia szczelinowe Cx37, Cx40 i Cx4319,22, Cx43 jest prawdopodobnie najważniejszy pod względem postępu choroby23. Dowodem na znaczenie Cx43 może być fakt, że genetyczna delecja Cx43 u myszy powoduje niedociśnienie24 i ma niekorzystny wpływ na angiogenezę25. Ponadto udokumentowano, że Cx43 jest ważny dla migracji i proliferacji komórek oraz w progresji miażdżycy18,22,23,24,25.
W tym protokole użyliśmy TFM i MSM, aby zbadać, czy zakłócenie połączenia szczeliny śródbłonkowej Cx43 będzie miało wpływ na trakcję i generowanie stresu międzykomórkowego w obrębie zlewającej się warstwy śródbłonka. Zakłóciliśmy działanie Cx43 za pomocą 2,5-dihydroksychalkonu (chalkonu), cząsteczki, która udokumentowano jako hamującą ekspresję Cx4326. Chalcone został użyty do zakłócenia Cx43 zamiast siRNA, ponieważ chalkon został wcześniej opisany przez Lee i wsp. do zakłócenia ekspresji Cx4326. Ponadto byliśmy szczególnie zainteresowani wpływem chalkonu na śródbłonek, ponieważ doniesiono również, że jest to związek przeciwzapalny i przeciwpłytkowy, który może być potencjalnie stosowany w profilaktyce i leczeniu różnych patologii naczyniowych26. Zabiegi chalkonem przeprowadzono godzinę po rozpoczęciu eksperymentu, monowarstwy traktowane chalkonem obrazowano łącznie przez sześć godzin, a przetwarzanie obrazu przeprowadzono za pomocą specjalnie napisanego kodu MATLAB w celu określenia trakcji, a następnie stresów międzykomórkowych. Nasze wyniki wykazały ogólny spadek trakcji i stresów międzykomórkowych, co sugeruje, że Cx43 odgrywa kluczową rolę w biomechanice śródbłonka.

<table><tbody><tr><td>Szkiełko nakrywkowe 18 mm</td><td>ThermoFisher</td><td>18CIR-1</td><td>Niezbędne do spłaszczania żeli poliakrylamidowych</td></tr><tr><td>2% bis-akrylamid</td><td>BIO-RAD</td><td>1610143</td><td>Składnik żelu poliakryloamidowego</td></tr><tr><td>2&prime;,5&prime;-Dihydroxychalcone</td><td>SIGMA</td><td>IDF00046</td><td>Do rozbijania struktury Cx43</td></tr><tr><td>Metakrylan 3-(trimetoksysililo)propylu</td><td>SIGMA</td><td>2530-85-0</td><td>Roztwór podstawowy do przygotowania mieszaniny silanów wiążących z kwasem octowym i ultraczystą wodą</td></tr><tr><td>40% Akrylamid</td><td>BIO-RAD</td><td>1610140</td><td>Składnik żelu poliakrylamidowego</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>64-19-7</td><td>Niezbędny do przygotowania wiążącego roztworu soli</td></tr> fizjologicznej <tr><td>Alexa Fluro 488 kozi anty-mysi IgG;</td><td>ThermoFisher</td><td>Katalog # A-11001</td><td>Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>BIO-RAD</td><td>1610700</td><td>Środek polimeryzujący żel poliakrylamidowy</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>SIGMA</td><td>9048-46-8</td><td>Do przygotowania roztworu blokującego</td></tr><tr><td>Bydlęcy roztwór Atelo-kolagenu typu I, 3 mg / ml, 100 ml</td><td>Advance Biomatrix</td><td>5005-100ML</td><td>Stosować jako macierz</td></tr> <tr><td>zewnątrzkomórkowąCorning Cell Culture Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x)</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>21040CV</td><td>Bufor soli fizjologicznej potrzebny do hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek, Fisher BioReagents</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>67-68-5</td><td>Do rozpuszczenia chalkonu i przygotowania roztworu podstawowego</td></tr><tr><td>Fluoromount-G z DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>00-4959-52</td><td>Pożywka montażowa do immunostaingu używana do barwienia DAPI</td></tr><tr><td>Mikrosfera flurocyjna Kulki modyfikowane karboksylanem</td><td>ThermoFisher</td><td>F8812</td><td>Kulki modyfikowane karboksylanem 0,5 mikrona (czerwone), 2% substancji stałych</td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES 1 M</td><td>SIGMA</td><td>7365-45-9</td><td>Niezbędny dla</td></tr><tr><td>LVES</td><td>ThermoFisher</td><td>A1460801</td><td>Essential HUEVC media 200 suplement</td></tr><tr><td>Medium 200</td><td>ThermoFisher</td><td>M200500</td><td>Niezbędne podłoża do hodowli</td></tr> <tr><td>komórkowych HUVECMysie przeciwciało monoklonalne Cx43 (CX - 1B1)</td><td>ThermoFisher</td><td>Katalog #13-8300</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe dla Cx43</td></tr><tr><td>Szalka Petriego (średnica 35 mm)</td><td>CellVis</td><td>D35-20-1.5H</td><td>35 mm szalka Petriego z dołkiem środkowym 20 mm</td></tr><tr><td>Środek sieciujący Sulfo-SANPAH 100 mg</td><td>Proteochem</td><td>102568-43-4</td><td>Niezbędny do funkcjonalizacji powierzchni żelu poliakrylamidowego</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>DOW corning</td><td>2646340</td><td>Elastomer silikonowy z utwardzaczem do produkcji PDMS</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BIO-RAD</td><td></td> 1610801 <td>Środek polimeryzujący żel poliakrylamidowy</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SIGMA</td><td>9002-93-1</td><td>Do przepuszczalności komórek</td></tr><tr><td>Trypsyna -EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td>Służy do odłączania komórek</td></tr></tbody></table>

zaburzanie biomechaniki śródbłonka poprzez zakłócenie strukturalne connexin 43

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Komórki śródbłonka zostały stworzone do generowania międzykomórkowych naprężeń i trakcji, ale rola, jaką odgrywają połączenia szczelinowe w śródbłonkowym stresie międzykomórkowym i generowaniu trakcji, jest obecnie nieznana. Dlatego przedstawiamy tutaj oparty na mechanice protokół do badania wpływu koneksyny 43 (Cx43) na biomechanikę śródbłonka poprzez wystawienie zlewających się monowarstw śródbłonka na działanie znanego inhibitora Cx43 2,5-dihydroksychalkonu (chalkonu) i pomiar wpływu tego inhibitora na trakcje i stresy międzykomórkowe. Przedstawiamy reprezentatywne wyniki, które wskazują na spadek zarówno trakcji, jak i stresów międzykomórkowych przy wysokiej dawce chalkonu (2 μg/ml) w porównaniu z kontrolą. Protokół ten można zastosować nie tylko do Cx43, ale także do innych połączeń szczelinowych, zakładając, że stosowany jest odpowiedni inhibitor. Wierzymy, że ten protokół będzie przydatny w dziedzinie badań sercowo-naczyniowych i mechanobiologicznych.

Zdjęcia w kontraście fazowym monowarstw kontrolnych oraz traktowanych chalkonem w stężeniach 0.2 µg/mL i 2 µg/mL wykonano 30 minut przed traktowaniem chalkonem (Figure 1A-C) oraz 2 godziny po traktowaniu chalkonem (Figure 1D-F). Zaobserwowano, że przemieszczenia kulek indukowane przez komórki (µm) uległy zmniejszeniu zarówno w przypadku niskiej, jak i wysokiej dawki chalkonu (<strong class="xfig"...

Tutaj prezentujemy protokół oparty na mechanice, który ma na celu zakłócenie połączenia szczelinowego 43 i zmierzenie późniejszego wpływu, jaki ma to na biomechanikę śródbłonka poprzez obserwację trakcji i naprężeń międzykomórkowych.

Zaburzanie biomechaniki śródbłonka poprzez zakłócenie strukturalne Connexin 43

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala wyjaśnić rolę, jaką siły komórkowe odgrywają w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych, takich jak na przykład gojenie się ran i przerzuty raka. Główną zaletą tej techniki opartej na mechanice jest jej zdolność do jednoczesnego przerywania połączeń komórka-komórka i mierzenia jej wpływu na siły mechaniczne generowane przez komórkę, głównie trakcje i stresory międzykomórkowe. Nasz protokół ma zastosowanie w szerokim zakresie procesów patofizjologicznych, takich jak na przykład przerzuty raka, miażdżyca i nadciśnienie.Nasze metody można zintegrować w celu przeprowadzenia zarówno analizy biochemicznej, jak i biomechanicznej z modelami narządów na chipie, bioinżynieryjnymi konstruktami tkankowymi, systemami dostarczania leków in vitro i systemami kohodowli tkankowej. Nasz protokół jest dość prosty do wykonania. Radzimy jednak tym, którzy stosują ten protokół po raz pierwszy, aby uzbroili się w cierpliwość i nie spieszyli się z krokami tego protokołu.Nasz protokół składa się z unikalnych kroków, które mogą nie być jasne dla początkujących użytkowników. Dlatego zachęcamy użytkowników do postępowania zgodnie z naszymi pisemnymi procedurami krok po kroku i korzystania z prezentacji wizualnych jako wskazówek. Na początek przygotuj roztwór ślepego silanu, mieszając 200 mililitrów ultra czystej wody z 80 mikrolitrami kwasu octowego i 50 mikrolitrami metakrylanu silanu.Mieszać roztwór silanu Bind na płytce mieszającej przez co najmniej godzinę. Środek płytki Petriego należy traktować roztworem Bind-silane przez 45 minut. Usuń roztwór Bind-silan i spłucz szalkę Petriego ultra czystą wodą dwa do trzech razy.Wysuszyć powierzchnię szalki Petriego i przechowywać w temperaturze pokojowej do wykorzystania w przyszłości. Aby przygotować roztwór hydrożelu, wymieszaj 12,49 mililitra ultra czystej wody z 2,062 mililitrami 40% akrylamidu i 375 mikrolitrami 2% bisakryloamidu w 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Dodaj 80 mikrolitrów kulek fluorescencyjnych do roztworu hydrożelu.Delikatnie potrząśnij tubką, aby wymieszać kulki z roztworem żelu. Trzymaj nasadkę luźno na probówce wirówkowej i umieść ją w komorze próżniowej. Odgazować roztwór żelu przez co najmniej 45 minut w komorze próżniowej.Aby spolimeryzować hydrożel, najpierw dodaj 75 mikrolitrów 10% nadsiarczanu amonu, a następnie dodaj osiem mikrolitrów TEMED do roztworu hydrożelu. Umieść 24 mikrolitry roztworu hydrożelu na środku szalki Petriego. Dociśnij hydrożel za pomocą 18-milimetrowego szkiełka nakrywkowego, aby spłaszczyć hydrożel i uzyskać wysokość około 100 mikrometrów.Odczekaj co najmniej 30 do 40 minut na polimeryzację żelu. Zanurz spolimeryzowany hydrożel w ultra czystej wodzie, aby zapobiec odwodnieniu żelu. Przykryj szalkę Petriego folią aluminiową, aby zapobiec fotowybielaniu koralików fluorescencyjnych i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Najpierw wymieszaj silikonową bazę PDMS z utwardzaczem silikonowym w stosunku 20 do jednego w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Odwróć probówkę do góry dnem i energicznie potrząśnij kilka razy, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie roztworu PDMS. Usuń pęcherzyki z roztworu PDMS, wirując przez jedną minutę w temperaturze 190 razy G. Wlej pięć do sześciu mililitrów roztworu PDMS na środek 100-milimetrowej szalki Petriego i mieszaj szalkę, aż roztwór PDMS pokryje całą powierzchnię szalki Petriego.Utwardź roztwór PDMS przez noc w temperaturze od 50 do 60 stopni Celsjusza. Następnie usuń okrągły szablon PDMS o średnicy 16 milimetrów za pomocą dziurkacza. Użyj stempla do biopsji o średnicy 1,25 milimetra, aby utworzyć małe otwory w szablonie PDMS.Wysterylizuj szablony PDMS, zanurzając je w 70% etanolu na dwie do trzech minut, odsysając nadmiar etanolu, a następnie umieszczając w świetle UV na pięć minut. Odessać nadmiar płynu i usunąć szkiełko nakrywkowe z hydrożelu. Umieść szablon PDMS na powierzchni hydrożelu i za pomocą pęsety lekko dociśnij szablon PDMS, aby zapewnić wodoszczelne uszczelnienie między szablonem PDMS a powierzchnią hydrożelu.Pokryj powierzchnię hydrożelu Sulfo-SAMPA rozpuszczonym w 0,1 molowym roztworze buforowym HEPES o stężeniu od jednego do 1 000 i umieść hydrożel pod lampą UV o mocy 36 watów na osiem minut. Odessać nadmiar roztworu Sulfo-SAMPA i HEPES i dwukrotnie przepłukać hydrożel 0,1 molowym HEPES, a następnie dodatkowo dwa razy przepłukać ultra czystą wodą. Odessać nadmiar ultra czystej wody i za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów pokryć hydrożel 0,1 miligrama na mililitr kolagenu-1.Przykryj naczynie, aby chronić koraliki fluorescencyjne przed fotowybielaniem i przechowuj hydrożel w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Teraz dodaj trzy mililitry 1X Trypsyny do kolby i umieść ją w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy do pięciu minut, aby odłączyć komórki od kolby do hodowli tkankowej. Po trypsynizacji dodaj trzy mililitry pożywki do hodowli komórkowych do kolby, zamieszaj do wymieszania i przenieś mieszaninę do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.Odwirować roztwór komórek przez trzy minuty w temperaturze 1,710 razy G. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce do stężenia 50 razy 10 do czterech komórek na mililitr. Wyjmij naczynie hydrożelowe z lodówki. Usuń Collagen-1 z hydrożelu i spłucz jeden raz PBS.Dodaj 75 razy 10 do trzecich komórek w górnej części szablonu PDMS i pozwól komórkom przyczepić się do powierzchni hydrożelu przez co najmniej godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Usuń szablon PDMS i zanurz szablon PDMS w 10X Trypsin na 10 do 15 sekund, aby usunąć wszelkie przyczepione komórki. Dodaj co najmniej dwa mililitry pożywki do szalki Petriego i wysterylizuj szablon, spryskując go 70% etanolem, a następnie umieszczając w świetle UV na pięć minut.Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze na co najmniej 36 godzin lub do momentu, gdy zaobserwuje się zlewającą się monowarstwę. Porównano obrazy z kontrastem fazowym z 30 minut przed leczeniem chalkonem i dwie godziny po leczeniu chalkonem. Zaobserwowano, że przemieszczenia kulek wywołane komórkami zmniejszają się zarówno w warunkach chalkonu o niskiej, jak i wysokiej dawce chalkonu w porównaniu z monowarstwami HUVEC w grupie kontrolnej.Przed leczeniem chalkonem trakcje RMS wynosiły około 51 paskali dla wszystkich schorzeń. Po poddaniu działaniu chalkonu nastąpił niewielki wzrost trakcji RMS do 59 paskali w monowarstwach poddanych działaniu chalkonu w niskiej dawce i prawie dwukrotny spadek trakcji RMS do 18 paskali w monowarstwach traktowanych chalkonem w dużych dawkach w porównaniu z kontrolą. Leczenie chalkonem zwiększało średnią normalną wielkość stresu międzykomórkowego przy niskiej dawce, ale znacznie zmniejszało średnią normalną wielkość stresu międzykomórkowego przy dużej dawce w porównaniu z kontrolą.Leczenie chalkonem zmniejszyło również maksymalne czyste stresy międzykomórkowe zarówno przy niskim, jak i wysokim stężeniu chalkonu w porównaniu z kontrolą. Wpływ leczenia chalkonem jest statystycznie istotny zarówno w oparciu o testy T, jak i jednoczynnikowy test ANOVA. Umieszczając szablon PDMS na żelu, upewnij się, że żel jest wystarczająco suchy, aby zapewnić wodoszczelne uszczelnienie między szablonem PDMS a żelem.Protokół ten można również zastosować do badania biomechanicznego wkładu różnych połączeń komórka-komórka, białek cytoszkieletu, cząsteczek adhezyjnych macierzy komórkowej lub cząsteczek zewnątrzkomórkowych z obrazowaniem na żywo. Dzięki temu protokołowi in vitro naukowcy mogą teraz z powodzeniem badać szereg właściwości biomechanicznych, a także biochemicznych podczas naprawy tkanek, gojenia się ran lub przerzutów nowotworowych bez modelu zwierzęcego. Radzimy naszym widzom, aby byli bardzo ostrożni podczas obchodzenia się z chalkonem i DMSO, ponieważ zgłaszane jest wdychanie tych leków jako szkodliwe.

perturbing-endothelial-biomechanics-via-connexin-43-structural

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Obrazowanie mikroskopowe żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-actin pozwala na charakterystykę dynamicznych zmian w strukturach cytoszkieletu. W przeciwieństwie do technik wykorzystujących utrwalone preparaty, metoda ta umożliwia szczegółową ocenę zmian czasowych w cytoszkielecie aktynowym w tych samych komórkach przed, w trakcie i po różnych bodźcach fizycznych, farmakologicznych lub zapalnych.

Badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny

Mikrofluidyczne komory przepływowe, wytrawione metodą fotolitografii i wykonane z PDMS, są stosowane do badania wyników funkcjonalnych związanych z dysfunkcją EC i stanem zapalnym. W reprezentatywnym eksperymencie wykazano zdolność różnicowego naprężenia ścinającego do modulowania adhezji komórek monocytarnych do monowarstw EC aktywowanych cytokinami.

Fenotypowanie zapalne śródbłonka na chipie

Międzykomórkowe fale Ca2+ są napędzane przez kanały połączeń szczelinowych i półkanały. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru międzykomórkowych fal Ca2 + w monowarstwach komórkowych w odpowiedzi na lokalny bodziec mechaniczny pojedynczej komórki oraz jej zastosowanie do badania właściwości i regulacji kanałów połączeń szczelinowych i półkanałów.

Propagacja fal wapniowych indukowana stymulacją mechaniczną w monowarstwach komórkowych: przykład komórek śródbłonka rogówki bydła

Różne poziomy i wzorce ścinania płynu są znane z modulowania ekspresji genów śródbłonka, fenotypu i podatności na choroby. Omawiamy montaż i zastosowanie "pierścieni ścinających": modelu, który wytwarza jednokierunkowe, okresowe wzorce naprężeń ścinających. Pierścienie ścinane są proste w montażu, ekonomiczne i mogą wytwarzać wysoką wydajność ogniw.

Montaż i zastosowanie "pierścieni ścinających": nowy model śródbłonka dla orbitalnego, jednokierunkowego i okresowego przepływu płynów oraz naprężeń ścinających

Opisano model hodowli komórkowej tętnic oporowych, pozwalający na rozbiór szlaków sygnałowych w śródbłonku, mięśniach gładkich lub między śródbłonkiem a mięśniami gładkimi (połączenie mięśniowo-śródbłonkowe). Selektywne zastosowanie agonistów lub izolacji białek, mikroskopia elektronowa lub immunofluorescencja mogą być wykorzystane przy użyciu tego modelu hodowli komórkowej.

Model hodowli komórkowych tętnic oporowych

Pokazane są tutaj protokoły (1) świeżo izolowania nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu oraz (2) jednoczesnych pomiarów śródbłonka wapnia i potencjału błonowego podczas hiperpolaryzacji pochodzącej ze śródbłonka. Co więcej, metody te pozwalają na farmakologiczne dostrojenie wapnia w komórkach śródbłonka i sygnalizacji elektrycznej jako indywidualnych lub interaktywnych zmiennych eksperymentalnych.

Jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym i nienaruszonym śródbłonku mózgowym myszy

Prezentujemy model choroby naczyniowej in vitro do zbadania interakcji krwi pełnej ze śródbłonkiem pochodzącym od pacjenta. System ten pozwala na badanie właściwości trombogennych pierwotnych komórek śródbłonka w różnych okolicznościach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do oceny trombogenności in situ i terapii przeciwzakrzepowej w różnych fazach krzepnięcia.

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

Tutaj dostarczamy chip mikroprzepływowy i automatycznie sterowany, wysoce wydajny system mikroprzepływowy krążenia, który podsumowuje początkowe mikrośrodowisko neowaskularyzacji, umożliwiając stymulację komórek śródbłonka (EC) przez wysokie naprężenie ścinające światło, fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego i rozkład różnych czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) jednocześnie.

Model mikroprzepływowy naśladujący początkowe zdarzenie neowaskularyzacji

Opisujemy protokół izolacji i hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej (hSVECs). Udostępniamy również szczegółowe metody wytwarzania naprężeń ścinających i rozciągania w celu zbadania naprężeń mechanicznych w hSVEC.

Izolacja komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej człowieka i narażenie na kontrolowane poziomy naprężeń ścinających i rozciągania

Tutaj prezentujemy system modeli assembloid, który naśladuje przesłuch komórkowy ścięgien między tkanką rdzenia ścięgna nośnego a zewnętrznym przedziałem zawierającym populacje komórek aktywowane przez chorobę i uraz. Jako ważny przypadek użycia pokazujemy, w jaki sposób system może zostać wykorzystany do badania istotnej z chorobą aktywacji zewnętrznych komórek śródbłonka.

Inżynieria asembloidów ścięgien do badania przesłuchów komórkowych w chorobach i naprawach

Poznaj metodę zakłócania Connexin 43 w celu pomiaru sił mechanicznych komórek śródbłonka. Technika ta umożliwia badanie procesów fizjologicznych i patologicznych, takich jak gojenie ran oraz przerzuty nowotworowe.

Zaburzanie biomechaniki śródbłonka poprzez zakłócenie strukturalne Connexin 43

Przeglądaj więcej filmów