Metoda badania tworzenia się de novo domen chromatyny

Przedstawiamy system do oceny dynamicznego tworzenia domen chromatyny. Wykorzystujemy ten system do śledzenia rekrutacji i rozprzestrzeniania się domen chromatyny za pośrednictwem PRC2 w komórkach. Proces można wstrzymać w dowolnym momencie, aby przeanalizować trwające zdarzenia

System ten może być nastawiony na monitorowanie dynamicznych zmian w dowolnym procesie komórkowym, a zatem nie ogranicza się do śledzenia tworzenia domen chromatyny. Zacznij od zaprojektowania przewodnikowych RNA do usuwania eksonów 10 i 11 endogennej kopii rozwoju ektodermy embrionalnej lub EED w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą narzędzia do projektowania CRISPR. Sklonuj przewodnikowe RNA do plazmidu CRISPR/Cas9 zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.

W formacie płytki sześciodołkowej należy przetransfekować 200 000 mysich embrionalnych komórek macierzystych lub mESC za pomocą jednego mikrograma każdego prowadzącego RNA przy użyciu odczynników do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta. Zmień pożywkę 24 godziny po transfekcji. Dwa dni po transfekcji wyizolować komórki GFP-dodatnie za pomocą FACS.

Wydajność transfekcji waha się od około 10 do 30%, więc sortuj około 500 000 komórek, aby wychwycić wystarczającą liczbę komórek GFP dodatnich do posiewu. Umieść izolowane komórki GFP-dodatnie na 15-centymetrowych płytkach, które są wstępnie pokryte 0,1% żelatyną do zbierania kolonii. Hoduj komórki w pożywce ESC przez około tydzień, aż widoczne będą pojedyncze kolonie, upewniając się, że zmieniasz pożywkę co dwa dni.

Wybierz co najmniej 48 kolonii, używając końcówki pipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby zeskrobać kolonię podczas aspiracji. Nie dzieląc kolonii na pojedyncze komórki, przenieś ją na 96-dołkową płytkę zawierającą Akutazę. Inkubuj kolonie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby oddzielić komórki.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów pożywki ESC do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Dobrze wymieszaj i umieść komórki na dwóch oddzielnych płytkach 96-dołkowych. Użyj jednej z płytek do genotypowania, a drugą utrzymuj wzrost, aż do zakończenia genotypowania.

Ekstrahuj DNA z płytki za pomocą dostępnych w handlu odczynników i postępując zgodnie ze wskazówkami producenta. Użyj starterów genotypowania, które obejmują usunięte miejsce, aby przeprowadzić genotypowanie PCR z polimerazą DNA Taq. Obserwuj produkt DNA o mniejszej masie cząsteczkowej w komórkach z homozygotyczną delecją w stosunku do komórek typu dzikiego.

Przewodnik projektowania RNA, aby wprowadzić cięcie w intronie po eksonie 9 EED za pomocą narzędzia do projektowania CRISPR i sklonować je do plazmidu CRISPR/Cas9 zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Zaprojektuj matrycę DNA dawcy, która zawiera sekwencję cDNA EED po eksonie 9 i znacznik C-końcowy Flag-HA przed sekwencją T2A-GFP, a wszystko to w odwrotnej orientacji w odniesieniu do endogennej sekwencji genu. Umieść kasetę z akceptorem splicingu i sekwencją poliadenylacji zagnieżdżoną między heterologicznymi odwróconymi miejscami loxP i uwzględnij co najmniej 500 par zasad ramion homologii od każdego końca.

Podziel szablon dawcy na dwa segmenty fragmentów genu gBlocks i złóż je w wektor PCR Blunt za pomocą klonowania Gibsona zgodnie z instrukcjami producenta. W formacie płytki sześciodołkowej należy wykonać transfekcję 200 000 mESC za pomocą jednego mikrograma przewodnika RNA i jednego mikrograma matryc dawcy. Następnie wyizoluj komórki GFP-dodatnie za pomocą FACS.

Wyizoluj poszczególne kolonie w celu genotypowania zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Użyj cytometrii przepływowej, aby potwierdzić, że mESC nie mają nieszczelnej ekspresji GFP, a jeśli tak, wyizoluj komórki GFP-ujemne za pomocą FACS przed rozpoczęciem eksperymentu. Roznárzyj komórki na pięć 15-centymetrowych płytek i indukuj ekspresję EED typu dzikiego lub zmutowanego w klatce, podając 5-mikromolowy 4-hydroksytamoksyfen przez pięć różnych okresów czasu, od zera godzin do ośmiu dni.

Zmień podłoże po 12 godzinach, aby zabiegi trwały dłużej. Wyizoluj pomyślnie zrekombinowane komórki za pomocą FACS przy użyciu GFP i wykonaj sekwencję ChIP-seq dla H3K27me2 i H3K27me3, aby zbadać ich czasowe osadzanie się na chromatynie w odpowiedzi na reekspresję EED typu dzikiego lub zmutowanego w klatce. Aby zwalidować indukowalne systemy ratowania typu dzikiego i indukowalnego mutantów, western blot przeprowadzono na całych ekstraktach po indukcji EED typu dzikiego lub zmutowanego w klatce za pomocą 4-hydroksytamoksyfenu.

Analiza cytometrii przepływowej została wykorzystana do potwierdzenia skuteczności ekspresji T2A-GFP w komórkach i-WT-r przed i po leczeniu 4-hydroksytamoksyfenem, co świadczy o pomyślnym odwróceniu odwróconej kasety. Sekwencję ChIP-seq H3K27me3 przeprowadzono po reekspresji EED typu dzikiego lub zmutowanego w klatce. Pojawienie się H3K27me3 obserwuje się po 12 godzinach od ekspresji EED typu dzikiego w dyskretnych miejscach zarodkowania, a następnie po 24 godzinach w regionach odległych od początkowych miejsc zarodkowania.

ChIP-seq został również wykorzystany do śledzenia czasowego osadzania się H3K27me2, które wydaje się poprzedzać osadzanie H3K27me3. Ogniska H3K27me3 i ich wzrost zostały również uwidocznione za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Po 12 godzinach ekspresji EED typu dzikiego istnieją dowody na tworzenie ognisk H3K27me3

Ogniska te zwiększają swoją liczbę i rozmiar w ciągu 24 godzin i ostatecznie rozprzestrzeniają się na duże obszary jądra w ciągu 36 godzin. Dokładne zaprojektowanie konstruktów DNA jest bardzo ważne dla wygenerowania pożądanego indukowalnego systemu ratunkowego. Metoda ta może zapewnić czasową i specjalną kontrolę mutacji białek u myszy.

W ten sposób można było określić efekt mutacji w określonej tkance lub na określonym etapie rozwoju. Obecnie używamy tego systemu do monitorowania dynamicznego ustanawiania innej domeny chromatyny, kompleksu represyjnego Polycomb 1.