Name: Metoda badania tworzenia się de novo domen chromatyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Poznaj metodę śledzenia dynamicznego tworzenia się domen chromatyny zależnych od kompleksu PRC2 w komórkach macierzystych myszy przy użyciu technologii CRISPR/Cas9. System umożliwia zatrzymanie procesu w dowolnym momencie w celu szczegółowej analizy zmian zachodzących w chromatinie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorom L. Valesowi, D. Ozacie i H. Mou za korektę rękopisu. Laboratorium DR jest wspierane przez Instytut Medyczny Howarda Hughesa oraz Narodowe Instytuty Zdrowia (R01CA199652 i R01NS100897).

Generacja indukowalnych mESC ratunkowych EED
1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Stosować mysie embrionalne komórki macierzyste (mESC) C57BL/6 posiadające stabilnie zintegrowany transgen CreERT2, który może przemieszczać się do jądra po podaniu 4-hydroksytamoksyfenu (4-OHT)13.</li>
	<li>Uprawiaj mESC w konwencjonalnym pożywce ESC<klasa sup="xref">14,15, uzupełnione 1000 U/ml LIF, 1 μM inhibitorem ERK PD0325901 i 3 μM inhibitorem GSK3 CHIR99021. W przypadku konwencjonalnej pożywki ESC należy użyć DMEM z nokautem zawierającym 15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM L-glutaminy, 1X penicyliny/streptomycyny i 0,1 mM 2-merkaptoetanolu.</li>
	<li>Do hodowli mESC należy używać płytek pokrytych 0,1% roztworem żelatyny.</li>
</ol>
2. Generacja klonalnych mESC z nokautem EED (KO)
<ol>
	<li>Przewodnik projektowania RNA (gRNA) w celu usunięcia eksonu 10 i eksonu 11 endogennej kopii EED w mESC za pomocą narzędzia do projektowania CRISPR w Benchling16. EED-KO-gRNA-1 celuje w intron bezpośrednio przed eksonem 10, a EED-KO-gRNA-2 celuje w intron bezpośrednio za eksonem 11. Jednoczesne zastosowanie tych gRNA usuwa zarówno ekson 10, jak i ekson 11 przez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ).</li>
	<li>Sklonuj gRNA do pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) za pomocą instrukcji w Ran et al., 201317.</li>
	<li>W formacie płytki 6-dołkowej należy transfekować 2 x 105 mESC po 1 μg każdego EED-KO-gRNA-1 i EED-KO-gRNA-2 (patrz tabela materiałów) przy użyciu odczynnika do transfekcji, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Zmień pożywkę 24 godziny po transfekcji.</li>
	<li>Dwa dni po transfekcji wyizoluj komórki GFP dodatnie za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Spodziewaj się, że wydajność transfekcji będzie się wahać o około 10-30%. Posortuj około 5 x 105 komórek, aby wychwycić wystarczającą ilość komórek GFP dodatnich do posiewu.</li>
	<li>Izolowane mESC z dodatnim wynikiem GFP należy umieścić na 15-centymetrowych płytkach wstępnie pokrytych 0,1% żelatyną (10-20 x10,3 komórki na płytkę) w celu pobrania kolonii.</li>
	<li>Hoduj komórki w pożywce ESC przez około tydzień, aż widoczne będą pojedyncze kolonie. Zmieniaj nośnik co 2 dni.</li>
	<li>Pobrać co najmniej 48 kolonii za pomocą końcówki do mikropipet o pojemności 20 μl. Zeskrobać kolonię, jednocześnie zasysając do końcówki mikropipety. Nie rozbijaj kolonii na pojedyncze komórki. Przenieść kolonię do 96-dołkowej płytki zawierającej akutazę (20 μl).</li>
	<li>Inkubować kolonie przez 10 minut w temperaturze 37 °C, aż wszystkie komórki zostaną rozdzielone.</li>
	<li>Dodaj 200 μl pożywki ESC do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Dobrze wymieszaj i umieść komórki na dwóch oddzielnych 96-dołkowych płytkach za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Użyj jednej z 96-dołkowych płytek do genotypowania i utrzymuj drugą w uprawie, aż genotypowanie zostanie zakończone. Użyj roztworu do ekstrakcji DNA, aby wyekstrahować DNA z płytki 96-dołkowej, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Użyj starterów genotypowania Gnt_EED-KO-up i Gnt_EED-KO_down, które obejmują usunięte miejsce i wykonaj genotypowanie PCR z polimerazą DNA Taq zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Inne rodzaje polimeraz DNA mogą być również używane do genotypowania, jednak polimeraza DNA Taq oferuje wygodę, ponieważ reakcja PCR może być bezpośrednio załadowana na żel, gdy używany jest jego kolorowy bufor reakcyjny.
	<ol>
		<li>Obserwować produkt DNA o mniejszej masie cząsteczkowej w komórkach z homozygotyczną delecją w stosunku do przypadku typu dzikiego (WT). 
		UWAGA: Aby wygenerować komórki zerowe PRC2, homozygotyczna delecja eksonów 10 i 11 jest niezbędna do destabilizacji i degradacji EED, niezbędnej podjednostki rdzenia PRC213. Skuteczność kierowania CRISPR wynosi około 10</li>%.
	</ol>
	</li>
	<li>Zwaliduj delecję eksonu 10 i 11 EED oraz utratę białka EED odpowiednio przez sekwencjonowanie Sangera i Western blot.</li>
	<li>Potwierdź zubożenie EED i H3K27me2/me3 z chromatyny w komórkach EED KO za pomocą ChIP-seq przy użyciu przeciwciał przeciwko H3K27me2/me3 i EED. Użyj protokołu podanego w Oksuz et al., 201715 dla eksperymentów ChIP-seq.</li>
</ol>
3. Inżynieria mESC z nokautem EED w taki sposób, aby zawierały indukowaną ekspresję EED opartą na Cre-ERT2
<ol>
	<li>Zaprojektuj gRNA (indukowane przez EED-gRNA) w celu wprowadzenia cięcia w intronie po eksonie 9 EED za pomocą narzędzia do projektowania CRISPR w Benchling16 (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Sklonuj gRNA do pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) za pomocą instrukcji w Ran et al., 201317.</li>
	<li>Zaprojektuj matrycę DNA dawcy, która składa się z sekwencji cDNA EED po eksonie 9 i znacznika C-końcowej flagi-HA przed sekwencją T2A-GFP, a wszystko to w odwrotnej orientacji w odniesieniu do endogennej sekwencji genu.
	<ol>
		<li>Umieść kasetę z akceptorem splicingu i sekwencją poliadenylacji zagnieżdżoną między heterologicznymi odwróconymi miejscami loxP (lox66 i lox71)18.</li>
		<li>Uwzględnij co najmniej 500 pz ramion homologicznych z każdego końca. Podziel matrycę dawcy na 2 segmenty fragmentów genu gBlocks (patrz gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" i gBlock-2-cage-mutant "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") i złóż je w wektor PCR Blunt za pomocą klonowania Gibsona zgodnie z instrukcjami producenta. 
		UWAGA: gblock-2 zawiera resztę aromatyczną (Y365) w klatce EED, która jest ważna dla interakcji z H3K27me312. gBlock-2-Wt zawiera resztę typu dzikiego, podczas gdy gblock-2-cage-mutant zawiera mutant klatkowy EED (Y365A), niezdolny do wiązania się z H3K27me3. Indukowalne ratownictwo EED WT jest oznaczone jako i-WT-r, a indukowalne ratownictwo EED z mutacją w klatce jest oznaczone jako i-MT-r dla wygody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W formacie płytki 6-dołkowej należy przeprowadzić transfekcję 2 x 105 mESC z 1 μg gRNA (indukowane EED-gRNA) i 1 μg matryc dawcy (i-WT-r lub i-MT-r) za pomocą odczynnika do transfekcji i wyizolować komórki GFP dodatnie za pomocą FACS.</li>
	<li>Wykonaj kroki 2.3-2.11, aby wyizolować poszczególne kolonie gotowe do genotypowania w celu skutecznego celowania.</li>
	<li>Użyj starterów genotypowania Inducible_Genotype-FW-1 i Inducible_Genotype-REV-1, które obejmują włożoną kasetę i przeprowadzają genotypowanie PCR przy użyciu polimerazy DNA Taq. 
	UWAGA: Skuteczność kierowania dla CRISPR wynosi około 10%.
	<ol>
		<li>Potwierdź poprawną integrację kasety metodą PCR przy użyciu starterów Inducible_Genotype-FW-2 i Inducible_Genotype-REV-2, które znajdują się poza ramionami homologii. 
		UWAGA: Homozygotyczna integracja kasety jest niezbędna do skutecznego ratowania EED. Należy zauważyć, że komórki z integracją homozygotyczną będą wytwarzać pojedynczy duży produkt DNA w porównaniu z WT EED, który będzie wytwarzał krótki produkt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdź integrację kasety przez sekwencjonowanie Sangera.</li>
	<li>Potwierdzić odwrócenie kasety i ekspresję EED i innych podstawowych składników PRC2 (np. EZH2 i SUZ12) po podaniu 4-OHT przez Western blot.</li>
	<li>Potwierdzić ekspresję T2A-GFP i procentową zawartość odwrócenia za pomocą cytometrii przepływowej. Należy zauważyć, że wyrażenie GFP wskazuje na odwrócenie kasety i wyrażenie EED.</li>
</ol>
4. Po zarodkowaniu i rozprzestrzenianiu się aktywności PRC2 na chromatynie
<ol>
	<li>Potwierdzić, że mESC i-WT-r i i-MT-r nie mają nieszczelnej ekspresji GFP za pomocą cytometrii przepływowej. W przypadku nieszczelnej ekspresji GFP, przed rozpoczęciem eksperymentu należy wyizolować komórki GFP-ujemne za pomocą FACS.</li>
	<li>Rozbuduj mESC i-WT-r i i-MT-r na pięć płytek o średnicy 15 cm (5 x 10po 6 komórek na płytkę).</li>
	<li>Wywołać ekspresję WT lub EED z mutacją klatkową, podając 0,5 μM 4-OHT przez 0 godzin, 12 godzin, 24 godziny, 36 godzin i 8 dni (jedna 15 cm płytka na warunek). Zmień podłoże po 12 godzinach w przypadku zabiegów dłuższych niż 12 godzin. Wyizolować pomyślnie zrekombinowane komórki za pomocą FACS przy użyciu GFP. Dostosuj czas zabiegów tak, aby wszystkie warunki zostały zebrane jednocześnie.</li>
	<li>Wykonaj sekwencję ChIP dla H3K27me2, H3K27me3, aby zbadać ich czasowe osadzanie się na chromatynie w odpowiedzi na ponowną ekspresję WT lub EED z mutacją w klatce. Użyj protokołu ChIP-seq, w tym przygotowania biblioteki szczegółowo opisanego w Oksuz et al., 201715.</li>
	<li>Użyj kontroli skoków w każdej próbce, aby umożliwić ilościowe porównanie między różnymi punktami czasowymi19.
	<ol>
		<li>Do kontroli skoków należy użyć chromatyny z Drosophila melanogaster (w stosunku 1:50 do chromatyny pochodzącej z mESC), a także przeciwciała H2Av specyficznego dla Drosophila (1 μl przeciwciała H2Av na 4 μg chromatyny Drosophila zgodnie z instrukcjami producenta) w każdej próbce.</li>
		<li>Przygotuj chromatynę z Drosophila w sposób podobny do tej z mESC, korzystając z protokołu opisanego w Oksuz et al., 201715.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mapuj odczyty sekwencji dla ChIP-seq do genomu mm10 za pomocą Bowtie 2 przy użyciu domyślnych parametrów20.</li>
	<li>Normalizuj odczyty myszy ChIP-seq do skoku Drosophila odczyt liczy21. Oblicz współczynnik normalizacji skoku za pomocą następującego wzoru: 1 x 106 / unikalna liczba odczytów Drosophila. Spodziewaj się, że uzyskasz około 1 x 106 odczytów Drosophila i 20 x 106 odczytów myszy na eksperyment.
	<ol>
		<li>Nie należy uwzględniać chromatyny Drosophila podczas sekwencjonowania próbek wejściowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj narzędzia genomecov z bedtools, aby przekonwertować plik bam na bedgraph22. Następnie przekonwertuj bedgraph na plik bigwig za pomocą narzędzia bedGraphToBigWig z USCS23,24. Zobacz następujący skrypt: 
	gen="ścieżka do genomu MM10" 
	CHR="Ścieżka do rozmiarów chromosomów MM10" 
	inp_bam="┼╝cie┼ka do pliku wejściowego bam " 
	multiply="Oblicz współczynnik normalizacji skoku" 
	bedtools genomecov -bg -scale $multiply -ibam $inp_bam -g $gen > output.bedGraph 
	>sort -k1,1 -k2,2n output.bedGraph > output_sorted.bedGraph 
	>bedGraphToBigWig output_sorted.bedGraph $chr output.bw</li>
	<li>Wizualizacja gęstości odczytu ChIP-seq poprzez przesłanie plików bigwig do przeglądarki genomu USCS24.</li>
</ol>
5. Monitorowanie powstawania i wzrostu ognisk H3K27me3 w jądrach mESC
<ol>
	<li>Płytka 1x 104 mESC do szkiełek 8-dołkowych wstępnie pokrytych 0,1% żelatyną.</li>
	<li>Następnego dnia zacznij wykonywać kolejne indukcje 4-OHT (0,5 μM) w celu zebrania komórek wykazujących ekspresję EED dla wskazanych punktów czasowych (0 h, 12 h, 24 h i 36 h). Zmień podłoże po 12 godzinach w przypadku zabiegów dłuższych niż 12 godzin.</li>
	<li>Utrwalić mESC za pomocą 4% paraformaldehydu w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek za pomocą PBS/0,25% Triton X-100 w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
	<li>Zablokuj komórki PBS/5% surowicy osła/0,1% Triton X-100 (bufor blokujący) w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe H3K27me3 w stosunku 1:500 w buforze blokującym i dodać do komórek.</li>
	<li>Inkubować komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia wykonaj 3 prania z PBS/0,1% Triton X-100.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (Alexa fluor 595) w stosunku 1:1000 w buforze blokującym i dodać do komórek.
	<ol>
		<li>Wykonuj wszystkie inkubacje w ciemności w następujących krokach, ponieważ przeciwciała drugorzędowe sprzężone z Alexa Fluor są wrażliwe na światło.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować przeciwciało drugorzędowe przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wykonaj 3 prania z PBS/0,1% Triton X-100.</li>
	<li>Rozcieńczyć DAPI (1 mg/ml) w stosunku 1:4000 PBS/0,1% Triton X-100 i dodać do komórek.</li>
	<li>Inkubować komórki z DAPI przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zamontuj ogniwa za pomocą uchwytu Aqua.</li>
	<li>Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej w 63-krotnym powiększeniu.</li>
	<li>Przetwarzaj i pseudokoloruj obrazy za pomocą rozkładu ImageJ, Fiji25. </li>
</ol>

<ol><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+function+of+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).</li>
<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li>
<li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li>
<li>Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Domains%3A+An+Important+Facet+of+Genome+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation.</a> Bioessays. 39 (12), (2017).</li>
<li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Polycomb+complex+PRC2+and+its+mark+in+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Polycomb complex PRC2 and its mark in life.</a> Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).</li>
<li>Holoch, D., Margueron, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+Regulating+PRC2+Recruitment+and+Enzymatic+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).</li>
<li>Cao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+histone+H3+lysine+27+methylation+in+polycomb-group+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing.</a> Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).</li>
<li>Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methyltransferase+activity+associated+with+a+human+multiprotein+complex+containing+the+enhancer+of+zeste+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein.</a> Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).</li>
<li>Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+enhancer+of+Zeste%2FESC+complexes+have+a+histone+H3+methyltransferase+activity+that+marks+chromosomal+Polycomb+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites.</a> Cell. 111 (2), 185-196 (2002).</li>
<li>Müller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methyltransferase+activity+of+a+Drosophila+Polycomb+group+repressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex.</a> Cell. 111 (2), 197-208 (2002).</li>
<li>Ferrari, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb-Dependent+H3K27me1+and+H3K27me2+Regulate+Active+Transcription+and+Enhancer+Fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity.</a> Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).</li>
<li>Margueron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+polycomb+protein+EED+in+the+propagation+of+repressive+histone+marks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks.</a> Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).</li>
<li>Oksuz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+Onset+of+PRC2-Mediated+Repressive+Domain+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation.</a> Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).</li>
<li>Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erk1%2F2+activity+promotes+chromatin+features+and+RNAPII+phosphorylation+at+developmental+promoters+in+mouse+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs.</a> Cell. 156 (4), 678-690 (2014).</li>
<li>Oksuz, O., Tee, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+chromatin+modifications+in+response+to+ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing chromatin modifications in response to ERK signaling.</a> Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).</li>
<li>Benchling Inc. Benchling for Academics. Benchling. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://benchling.com">https://benchling.com</a> (2018).</li>
<li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Zhang, Z., Lutz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase-mediated+inversion+using+lox66+and+lox71%3A+method+to+introduce+conditional+point+mutations+into+the+CREB-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein.</a> Nucleic acids research. 30 (17), 90(2002).</li>
<li>Orlando, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+ChIP-Seq+normalization+reveals+global+modulation+of+the+epigenome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome.</a> Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDescostes%2C+N+%22R+package+version+1.2.1%22">R package version 1.2.1</a>. , (2019).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigWig+and+BigBed%3A+enabling+browsing+of+large+distributed+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).</li>
<li>UCSC Genome Browser Home. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://genome.ucsc.edu">https://genome.ucsc.edu</a> (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+auxin-based+degron+system+for+the+rapid+depletion+of+proteins+in+nonplant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells.</a> Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid%2C+Reversible%2C+and+Tunable+Method+to+Regulate+Protein+Function+in+Living+Cells+Using+Synthetic+Small+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules.</a> Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).</li>
<li>Højfeldt, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+H3K27+methylation+can+be+established+de+novo+by+SUZ12-directed+PRC2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).</li>
</ol>

D.R. jest współzałożycielem Constellation Pharmaceuticals i Fulcrum Therapeutics. Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Skutecznym podejściem do zrozumienia szczegółów mechanistycznych podczas tworzenia danej domeny chromatyny jest najpierw zakłócenie domeny, a następnie śledzenie jej rekonstrukcji w komórkach. Proces ten można wstrzymać w dowolnym momencie podczas rekonstrukcji, aby szczegółowo przeanalizować toczące się zdarzenia. Wcześniejsze badania nad domenami chromatyny nie były w stanie rozwiązać takich zdarzeń, ponieważ były one przeprowadzane w warunkach stanu ustalonego (np. porównując nokaut typu dzikiego i nokaut genu). W tym...

Genomy eukariotyczne są wysoce zorganizowane, a zmiany w dostępności chromatyny bezpośrednio kontrolują transkrypcję genów1. Genom zawiera różne typy domen chromatyny, które korelują z aktywnością transkrypcyjną i czasem replikacji2,3. Te domeny chromatyny mają wielkość od kilku kilozasad (kb) do ponad 100 kb i charakteryzują się wzbogaceniem w wyraźne modyfikacje histonów4. Główne pytania brzmią: jak powstają te domeny i jak się rozprzestrzeniają?
Jedna z najlepiej scharakteryzowanych domen chromatyny jest wspierana przez aktywność kompleksu represyjnego Polycomb 2 (PRC2). PRC2 jest kompleksem wielopodjednostkowym złożonym z podzbioru grupy Polycomb (PcG) białek5,6 i katalizuje mono-, di- i trimetylację lizyny 27 histonu H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8,9,10. H3K27me2/me3 są związane ze stanem represyjnym chromatyny, ale funkcja H3K27me1 jest niejasna6,11. Jeden z podstawowych składników PRC2, rozwój ektodermy embrionalnej (EED), wiąże się z produktem końcowym katalizy PRC2, H3K27me3, poprzez jego klatkę aromatyczną, a ta cecha powoduje allosteryczną stymulację PRC212,13. Aktywność enzymatyczna PRC2 ma kluczowe znaczenie dla zachowania tożsamości komórkowej podczas rozwoju, ponieważ niewłaściwa ekspresja niektórych genów rozwojowych, które są przeciwwskazane dla określonej linii, byłaby szkodliwa5,6. W związku z tym rozwikłanie mechanizmów, za pomocą których PRC2 sprzyja tworzeniu represyjnych domen chromatyny u ssaków, ma fundamentalne znaczenie dla zrozumienia tożsamości komórkowej.
Wszystkie poprzednie eksperymentalne systemy zaprojektowane do badania tworzenia domen chromatyny, w tym domen chromatyny za pośrednictwem PRC2, były wykonywane w warunkach stanu ustalonego, które nie są w stanie śledzić wydarzeń związanych z tworzeniem się domeny chromatyny w komórkach. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół generowania indukowalnego systemu komórkowego, który monitoruje początkową rekrutację i propagację domen chromatyny. W szczególności skupiamy się na śledzeniu tworzenia represyjnych domen chromatyny za pośrednictwem PRC2, które zawierają H3K27me2 / 3. Ten system, który może uchwycić mechanistyczne szczegóły tworzenia domen chromatyny, może być przystosowany do włączenia innych domen chromatyny, takich jak szeroko badane domeny zawierające H2AK119ub lub H3K9me. W połączeniu z technologiami genomiki i obrazowania, podejście to ma potencjał, aby skutecznie odpowiedzieć na różne, kluczowe pytania w biologii chromatyny.

<table><tbody><tr><td>(Z)-4-hydroksytamoksyfen (5 mg)</td><td>Sigma</td><td>H7904-5MG</td><td>Do indukcji ekspresji EED</td></tr><tr><td>16% wodny roztwór paraformaldehydu (10x10 ml)</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>Sciences 15710</td><td>Do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanolu</td><td>LifeTechnologies</td><td>21985-023</td><td>Do hodowli mESC</td></tr><tr><td>2% Roztwór żelatyny</td><td>Sigma</td><td>G1393-100ml</td><td>Do mESC kultura</td></tr><tr><td>Accutase 500 ML</td><td>Innovative Cell Tech/FISHER</td><td>AT 104-500</td><td>Do hodowli mESC</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson immunoresaerch</td><td>711-585-152</td><td>Do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Aqua-Mount Mounting Medium</td><td>FISHER/VWR</td><td>41799-008</td><td>Do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>KOMORA SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK</td><td>Fisher Sci</td><td>177445PK</td><td>Do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek) - 10 mg</td><td>Life Tech</td><td>D1306</td><td>Do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>inhibitora ERK, PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>Do hodowli mESC</td></tr><tr><td>ESGRO Rekombinowane mysie białko LIF</td><td>Millipore/Fisher</td><td>ESG1107</td><td>Do hodowli mESC</td></tr><tr><td>FBS Stem Cell Qualified</td><td>Atlanta</td><td>S10250</td><td>Do hodowli mESC</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Do klonowania matrycy dawcy</td></tr><tr><td>Inhibitor GSK3, CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>Do hodowli mESC</td></tr><tr><td>H3K27me2 (D18C8) królik</td><td>mAB Sygnalizacja komórkowa</td><td>Przeciwciało 9728S</td><td>dla ChIP-seq</td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9733S</td><td>Przeciwciało dla ChIP-seq</td></tr><tr><td>Histone H2Av przeciwciało (pAb)Motyw</td> <td>aktywny</td><td>39715</td><td>Kontrola skoków dla ChIP-seq</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td>Do hodowli mESC</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>Do hodowli mESC</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>LifeTech</td><td>11668019</td><td>Do transfekcji</td></tr><tr><td>MangoTaq DNA Polimeraza</td><td>Bioline</td><td>BIO-21079</td><td>Do genotypowania PCR</td></tr><tr><td>Normalna surowica osła (10 ml)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma / Roche</td><td>P0781</td><td>Do hodowli mESC</td></tr><tr><td>pSpCas9 (BB) -2A-GFP (PX458)</td> <td>Addgene</td><td>48138</td><td>Do klonowania gRNA</td></tr><tr><td>Roztwór do ekstrakcji DNA QuickExtract</td><td>Lucigen</td><td>QE0905T</td><td>Do genotypowania PCR</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Zero Blunt PCR Zestaw do klonowania</td><td>Thermo Fisher</td><td>K270020</td><td>do klonowania szablonów dawcy</td></tr> <tr><td>Primers / gBlocks</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>EED-KO-gRNA-1</td><td></td><td></td><td>Sekwencja: ctctggctactgtcaactag. gRNA paruje się do nokautowania EED w C57BL / 6 ESC dla systemów i-WT-r i i-MT-r.</td></tr><tr>Sekwencja <td>EED-KO-gRNA-2</td><td></td><td></td><td>: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNA paruje się do nokautowania EED w C57BL/6 ESC dla układów i-WT-r i i-MT-r.</td></tr><tr>Sekwencja indukowana <td></td><td></td><td>EED-gRNA</td><td>: atggcaccccgaaattagaa. gRNA i dawca do generowania systemu i-WT-r w tle EED-KO.</td></tr><tr>Dawca <td></td><td></td><td>i-WT-r</td><td>https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA i Dawca do wytworzenia układu i-WT-r w tle EED-KO.</td></tr><tr>Sekwencja indukowana <td></td><td></td><td>EED-gRNA</td><td>: atggcaccccgaaattagaa. gRNA i dawca do generowania systemu i-WT-r w tle EED-KO.</td></tr><tr>Dawca <td></td><td></td><td>i-MT-r</td><td>https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA i Dawca do wytworzenia systemu i-MT-r w tle EED-KO.</td></tr><tr><td>Genotypping Primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gnt-EED-KO-FW-1</td><td></td><td></td><td>Sekwencja: ctgtaggctgccatctgtga. Allel typu dzikiego da produkt o wielkości 1,9 kb. Allel nokautujący da produkt o wartości 200 pz.</td></tr><tr><td>Gnt-EED-KO-REV-1</td><td></td><td></td><td>Sekwencja: agccagggctacacagagaa. Allel typu dzikiego da produkt o wielkości 1,9 kb. Allel nokautujący da produkt o wartości 200 pz.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-FW-1</td><td></td><td></td><td>Sekwencja: tgcagtgaaacaaatttggaa. Po włożeniu kasety startery wytworzą 1863 pz. Allel typu dzikiego wytworzy produkt o wartości ~200 pz.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-REV-1</td><td></td><td></td><td>Sekwencja: gagaggggtggcactgtaaa. Po włożeniu kasety startery wytworzą 1863 pz. Allel typu dzikiego wytworzy produkt o wartości ~200 pz.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-FW-2</td><td></td><td></td><td>Sekwencja: ccccctctctttttttct. Po włożeniu kasety startery wytworzą 3200 pz. Allel typu dzikiego wytworzy produkt o wartości 1560 pz.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-REV-2</td><td></td><td></td><td>Sekwencja: atgcctgggtgaatgaaaaa. Po włożeniu kasety startery wytworzą 3200 pz. Allel typu dzikiego wytworzy produkt o wartości 1560 pz.</td></tr></tbody></table>

metoda badania tworzenia się de novo domen chromatyny

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

Organizacja i struktura domen chromatyny są unikalne dla poszczególnych linii komórkowych. Ich nieprawidłowa regulacja może prowadzić do utraty tożsamości komórkowej i/lub choroby. Pomimo ogromnych wysiłków, nasza wiedza na temat powstawania i propagacji domen chromatyny jest nadal ograniczona. Domeny chromatyny badano w warunkach ustalonych, które nie sprzyjają śledzeniu początkowych zdarzeń podczas ich powstawania. W tym miejscu przedstawiamy metodę indukowalnej rekonstrukcji domen chromatyny i śledzenia ich powstawania w funkcji czasu. Chociaż, po raz pierwszy zastosowany w przypadku represyjnego tworzenia domen chromatyny za pośrednictwem PRC2, można go łatwo dostosować do innych domen chromatyny. Modyfikacja i/lub połączenie tej metody z technologiami genomiki i obrazowania dostarczy nieocenionych narzędzi do bardzo szczegółowego badania tworzenia domen chromatyny. Wierzymy, że ta metoda zrewolucjonizuje nasze zrozumienie tego, jak powstają i oddziałują na siebie domeny chromatyny.

Ogólny schemat warunkowego systemu ratunku 
Rycina 1 przedstawia schemat celowania w celu warunkowego uratowania komórek z knockoutem EED (EED KO) za pomocą EED typu dzikiego (WT) lub EED z mutacją w domenie cage (Y365A), eksprymowanych z endogennego locus EED. Po wyeliminowaniu EED, kluczowej podjednostki PRC2, niezbędnej dla jego stabilności i aktywności enzymatycznej, wprowadza się kasetę w obrębie intronu następującego po eksonie 9 genu EED (Rysun...

Ta metoda jest przeznaczona do śledzenia tworzenia domen chromatyny za pośrednictwem PRC2 w liniach komórkowych, a metoda może być dostosowana do wielu innych systemów.

Metoda badania tworzenia się de novo domen chromatyny

The organization and structure of chromatin domains are unique to individual cell lineages. Their misregulation might lead to a loss in cellular identity ...

Przedstawiamy system do oceny dynamicznego tworzenia domen chromatyny. Wykorzystujemy ten system do śledzenia rekrutacji i rozprzestrzeniania się domen chromatyny za pośrednictwem PRC2 w komórkach. Proces można wstrzymać w dowolnym momencie, aby przeanalizować trwające zdarzenia.System ten może być nastawiony na monitorowanie dynamicznych zmian w dowolnym procesie komórkowym, a zatem nie ogranicza się do śledzenia tworzenia domen chromatyny. Zacznij od zaprojektowania przewodnikowych RNA do usuwania eksonów 10 i 11 endogennej kopii rozwoju ektodermy embrionalnej lub EED w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą narzędzia do projektowania CRISPR. Sklonuj przewodnikowe RNA do plazmidu CRISPR/Cas9 zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.W formacie płytki sześciodołkowej należy przetransfekować 200 000 mysich embrionalnych komórek macierzystych lub mESC za pomocą jednego mikrograma każdego prowadzącego RNA przy użyciu odczynników do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta. Zmień pożywkę 24 godziny po transfekcji. Dwa dni po transfekcji wyizolować komórki GFP-dodatnie za pomocą FACS.Wydajność transfekcji waha się od około 10 do 30%, więc sortuj około 500 000 komórek, aby wychwycić wystarczającą liczbę komórek GFP dodatnich do posiewu. Umieść izolowane komórki GFP-dodatnie na 15-centymetrowych płytkach, które są wstępnie pokryte 0,1% żelatyną do zbierania kolonii. Hoduj komórki w pożywce ESC przez około tydzień, aż widoczne będą pojedyncze kolonie, upewniając się, że zmieniasz pożywkę co dwa dni.Wybierz co najmniej 48 kolonii, używając końcówki pipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby zeskrobać kolonię podczas aspiracji. Nie dzieląc kolonii na pojedyncze komórki, przenieś ją na 96-dołkową płytkę zawierającą Akutazę. Inkubuj kolonie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby oddzielić komórki.Następnie dodaj 200 mikrolitrów pożywki ESC do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Dobrze wymieszaj i umieść komórki na dwóch oddzielnych płytkach 96-dołkowych. Użyj jednej z płytek do genotypowania, a drugą utrzymuj wzrost, aż do zakończenia genotypowania.Ekstrahuj DNA z płytki za pomocą dostępnych w handlu odczynników i postępując zgodnie ze wskazówkami producenta. Użyj starterów genotypowania, które obejmują usunięte miejsce, aby przeprowadzić genotypowanie PCR z polimerazą DNA Taq. Obserwuj produkt DNA o mniejszej masie cząsteczkowej w komórkach z homozygotyczną delecją w stosunku do komórek typu dzikiego.Przewodnik projektowania RNA, aby wprowadzić cięcie w intronie po eksonie 9 EED za pomocą narzędzia do projektowania CRISPR i sklonować je do plazmidu CRISPR/Cas9 zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Zaprojektuj matrycę DNA dawcy, która zawiera sekwencję cDNA EED po eksonie 9 i znacznik C-końcowy Flag-HA przed sekwencją T2A-GFP, a wszystko to w odwrotnej orientacji w odniesieniu do endogennej sekwencji genu. Umieść kasetę z akceptorem splicingu i sekwencją poliadenylacji zagnieżdżoną między heterologicznymi odwróconymi miejscami loxP i uwzględnij co najmniej 500 par zasad ramion homologii od każdego końca.Podziel szablon dawcy na dwa segmenty fragmentów genu gBlocks i złóż je w wektor PCR Blunt za pomocą klonowania Gibsona zgodnie z instrukcjami producenta. W formacie płytki sześciodołkowej należy wykonać transfekcję 200 000 mESC za pomocą jednego mikrograma przewodnika RNA i jednego mikrograma matryc dawcy. Następnie wyizoluj komórki GFP-dodatnie za pomocą FACS.Wyizoluj poszczególne kolonie w celu genotypowania zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Użyj cytometrii przepływowej, aby potwierdzić, że mESC nie mają nieszczelnej ekspresji GFP, a jeśli tak, wyizoluj komórki GFP-ujemne za pomocą FACS przed rozpoczęciem eksperymentu. Roznárzyj komórki na pięć 15-centymetrowych płytek i indukuj ekspresję EED typu dzikiego lub zmutowanego w klatce, podając 5-mikromolowy 4-hydroksytamoksyfen przez pięć różnych okresów czasu, od zera godzin do ośmiu dni.Zmień podłoże po 12 godzinach, aby zabiegi trwały dłużej. Wyizoluj pomyślnie zrekombinowane komórki za pomocą FACS przy użyciu GFP i wykonaj sekwencję ChIP-seq dla H3K27me2 i H3K27me3, aby zbadać ich czasowe osadzanie się na chromatynie w odpowiedzi na reekspresję EED typu dzikiego lub zmutowanego w klatce. Aby zwalidować indukowalne systemy ratowania typu dzikiego i indukowalnego mutantów, western blot przeprowadzono na całych ekstraktach po indukcji EED typu dzikiego lub zmutowanego w klatce za pomocą 4-hydroksytamoksyfenu.Analiza cytometrii przepływowej została wykorzystana do potwierdzenia skuteczności ekspresji T2A-GFP w komórkach i-WT-r przed i po leczeniu 4-hydroksytamoksyfenem, co świadczy o pomyślnym odwróceniu odwróconej kasety. Sekwencję ChIP-seq H3K27me3 przeprowadzono po reekspresji EED typu dzikiego lub zmutowanego w klatce. Pojawienie się H3K27me3 obserwuje się po 12 godzinach od ekspresji EED typu dzikiego w dyskretnych miejscach zarodkowania, a następnie po 24 godzinach w regionach odległych od początkowych miejsc zarodkowania.ChIP-seq został również wykorzystany do śledzenia czasowego osadzania się H3K27me2, które wydaje się poprzedzać osadzanie H3K27me3. Ogniska H3K27me3 i ich wzrost zostały również uwidocznione za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Po 12 godzinach ekspresji EED typu dzikiego istnieją dowody na tworzenie ognisk H3K27me3.Ogniska te zwiększają swoją liczbę i rozmiar w ciągu 24 godzin i ostatecznie rozprzestrzeniają się na duże obszary jądra w ciągu 36 godzin. Dokładne zaprojektowanie konstruktów DNA jest bardzo ważne dla wygenerowania pożądanego indukowalnego systemu ratunkowego. Metoda ta może zapewnić czasową i specjalną kontrolę mutacji białek u myszy.W ten sposób można było określić efekt mutacji w określonej tkance lub na określonym etapie rozwoju. Obecnie używamy tego systemu do monitorowania dynamicznego ustanawiania innej domeny chromatyny, kompleksu represyjnego Polycomb 1.

a-method-to-study-de-novo-formation-of-chromatin-domains

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film opisuje protokół ścinania chromatyny za pomocą trawienia enzymatycznego nukleazy mikrokokowej. Ścinanie chromatyny jest niezbędnym krokiem w immunoprecypitacji chromatyny lub przepływie pracy ChIp, który pomaga badać interakcję białko-DNA w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki szpikowej. W protokole funkcji ścinanie chromatyny odbywa się za pomocą sonikacji.

Ścinanie chromatyny: metoda generowania fragmentów chromatyny za pomocą trawienia enzymatycznego

Pytanie o to, jak regulatory chromatyny i stany chromatyny wpływają na genom in vivo, jest kluczowe dla naszego zrozumienia, jak wcześnie podejmowane są decyzje dotyczące losu komórki w rozwijającym się zarodku. ChIP-Seq – najpopularniejsze podejście do badania cech chromatyny na poziomie globalnym – zostało przedstawione tutaj dla zarodków Xenopus.

Migawka całego genomu regulatorów i stanów chromatyny w zarodkach Xenopus za pomocą ChIP-Seq

Sekwencyjna ekstrakcja soli białek związanych z chromatyną jest użytecznym narzędziem do określania właściwości wiązania dużych kompleksów białkowych. Metoda ta może być stosowana do oceny roli poszczególnych podjednostek lub domen w ogólnym powinowactwie kompleksu białkowego do chromatyny masowej.

Sekwencyjne ekstrakcje soli do analizy właściwości wiązania chromatyny luzem przez kompleksy modyfikujące chromatynę

Prezentujemy zmodyfikowaną metodologię sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny natywnej (ChIP-seq) do generowania zestawów danych sekwencji odpowiednich dla struktury analitycznej gęstości nukleosomów ChIP-seq integrującej dostępność nukleazy mikrokokowej (MNazy) z pomiarami modyfikacji histonów.

Generowanie bibliotek sekwencjonowania immunoprecypitacji natywnej chromatyny do analizy gęstości nukleosomów

Plastyczność architektury jądrowej jest kontrolowana przez dynamiczne mechanizmy epigenetyczne, w tym niekodujące RNA, metylację DNA, repozycjonowanie nukleosomów, a także skład i modyfikację histonów. W tym miejscu opisujemy protokół izolacji elementów regulatorowych wspomaganej formaldehydem (FAIRE), który umożliwia określenie dostępności chromatyny w powtarzalny, niedrogi i prosty sposób.

Izolacja elementów regulatorowych wspomagana formaldehydem w celu pomiaru dostępności chromatyny w komórkach ssaków

Ten protokół skupia się na przygotowaniu chromatyny z zamrożonych tkanek i nadaje się do sieciowania immunoprecypitacji chromatyny (X-ChIP), a następnie analizy ilościowej PCR (X-ChIP-qPCR) lub sekwencjonowania nowej generacji (X-ChIP-seq).

Ekstrakcja chromatyny z zamrożonej chimerycznej tkanki wątroby do analizy immunoprecypitacji chromatyny

Ten protokół prezentuje technikę mapowania miejsc replikacji w strukturalnie zachowanej chromatynie in situ, która wykorzystuje kombinację wstępnego znakowania EdU-streptawidyny-Nanogold i ChromEMT.

Obrazowanie domen replikacyjnych w ultrastrukturalnie zachowanej chromatynie za pomocą tomografii elektronowej

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

Tutaj szczegółowo prezentujemy adaptację techniki przechwytywania konformacji chromosomów (3C) z naciskiem na zaangażowanie i naukę na studiach licencjackich.

Uzyskanie A z 3Cs: Przechwytywanie konformacji chromosomów dla studentów

Przedstawiamy trójkolorowy protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej chromatyny (SMLM), który umożliwia powtarzalne mapowanie euchromatyny, heterochromatyny i RNAP II do analizy przestrzennej. Protokół ten umożliwia efektywne wielokolorowe oznakowanie w gęstych środowiskach jądrowych, w tym na celach związanych z chromatyną, co pozwala na niezawodne jednoczesne wykrywanie.

Protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki wieloznaczny do badania chromatyny w gęstym środowisku jądrowym

Poznaj metodę śledzenia dynamicznego tworzenia się domen chromatyny zależnych od kompleksu PRC2 w komórkach macierzystych myszy przy użyciu technologii CRISPR/Cas9. System umożliwia zatrzymanie procesu w dowolnym momencie w celu szczegółowej analizy zmian zachodzących w chromatinie.

Metoda badania tworzenia się de novo domen chromatyny

Przeglądaj więcej filmów