Name: Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Poznaj metodę transferu komórek adoptowanych z iPSC-derwowanych limfocytów T specyficznych dla wirusa HBV w celu hamowania replikacji wirusa u myszy. Technika ta wykorzystuje komórki o naiwnym fenotypie i pojedynczym receptorze TCR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. Adamowi J. Gehringowi z Instytutu Badawczego Szpitala Ogólnego w Toronto za dostarczenie cDNA dla HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI) - specyficznych dla A2 genów hybrydy ludzko-mysiej TCR, oraz Dr. Pei-Jer Chen z National Taiwan University za dostarczenie konstruktu pAAV/HBV 1.2. Prace te są wspierane przez National Institute of Health Grant R01AI121180, R01CA221867 i R21AI109239 dla J. S.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Texas A&M (IACUC; #2018-0006) i są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Stowarzyszenia Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi. Myszy stosuje się w wieku 6–9 tygodni.
1. Wytwarzanie wirusowych limfocytów T CD8+ specyficznych dla Ag z iPSC (limfocyty T iPSC-CD8+)
<ol>
	<li>Tworzenie konstruktów retrowirusowych 
	UWAGA: Geny TCR α i β są połączone z sekwencją samorozszczepiającą 2A. Wektor retrowirusowy MSCV-IRES-DsRed (MiDR) to DsRed+ 23.
	<ol>
		<li>Subklonowanie specyficznych dla HBs183-191 (FLLTRILTI) genów TCR (s183 TCR) ludzko-mysiej hybrydy ludzko-mysiej (s183 TCR) do MiDR w celu stworzenia konstruktu MiDR s183 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A)25.</li>
	</ol>
	 </li>
	<li>Transdukcja retrowirusowa 
	UWAGA: Komórki Platinum-E (Plat-E) są używane do pakowania retrowirusów (przenoszących geny s183 TCR), które będą używane do transdukcji retrowirusowej. Komórki Plat-E są skutecznymi komórkami pakującymi retrowirusa leżącymi u podstaw komórek 293T, które zostały opracowane za pomocą unikalnych konstruktów pakowania za pośrednictwem promotora EF1α do ekspresji białka struktury retrowirusowej, w tym GAG, Pol i ekotropowego env.
	<ol>
		<li>Na naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm wysiać 3 x 106 komórek Plat-E w 8 ml pożywki hodowlanej DMEM zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 1 dzień przed transfekcją.</li>
		<li>W dniu 0 transfekuj konstrukt MiDR s183 do komórek Plat-E za pomocą odczynnika do transfekcji DNA25.</li>
		<li>W dniu 1 wysiewaj 1 x 106 iPSC (GFP+) na wstępnie pokrytą żelatyną płytkę hodowlaną.</li>
		<li>W dniach 2–3 należy pobrać supernatant zawierający retrowirusy z hodowli komórkowej Plat-E w celu transdukcji iPSC z TCR s183 w obecności roztworu 1,6-dibromoheksanu25.</li>
		<li>W dniu 4 trypsynizuj iPSC transdukowane genem s183 TCR, wiruj przy 400 x g przez 5 minut i wysiewaj 3 × 105 iPSC w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm wstępnie pokrytym 3 x 106 napromieniowanymi komórkami zasilającymi SNL76/7 (irSNL76/7)25.</li>
		<li>W 5 lub 6 dniu konfluencji trypsynizować komórki, wirować przy 400 x g przez 5 minut i przetwarzać w celu sortowania komórek. Bramkowanie na żywych komórkach sortuje podwójnie dodatnie komórki GFP i DsRED (iPSC transdukowane genem s183 TCR) za pomocą szybkiego sortownika komórek. Podobnie jak w kroku 1.2.5, przeprowadź wspólną hodowlę posortowanych komórek na komórkach zasilających irSNL76/7 do wykorzystania w przyszłości25.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różnicowanie limfocytów T iPSC-CD8 + specyficznych dla HBV 
	UWAGA: Komórki zrębu OP9-DL1 / DL4 nadmiernie eksprymują zarówno ligandy Notch DL1, jak i DL4, a współhodowla iPSC z iPSC może promować różnicowanie limfocytów T za pośrednictwem sygnalizacji Notch26.
	<ol>
		<li>Hoduj transdukowane genem s183 TCR iPSC (s183 / iPSC) w monowarstwie komórek OP9-DL1-DL4 w pożywce o minimalnej α niezbędnej pożywce (MEM) zawierającej 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)27. Włączyć mysi ligand Flt3 (mFlt-3L; stężenie końcowe = 5 ng/ml) do hodowli.</li>
		<li>W dniu 0 wysiewaj 0,5–1,0 x 105 S183/iPSC w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym wcześniej wyhodowanym z komórkami OP9-DL1-DL4. Sprawdź, czy komórki OP9-DL1-DL4 są w stanie konfluencji 80%–90%.</li>
		<li>W 5 dniu przepłucz iPSC 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), odessaj PBS, dodaj ją do 4 ml 0,25% trypsyny i inkubuj w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 10 minut. Następnie dodaj dodatkowe 8 ml pożywki iPSC, aby zakończyć trawienie trypsyny. Zebrać wszystkie roztwory trawienne zawierające komórki i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 15–30 °C.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki iPSC. Przenieść zawiesinę komórek na nową 10 cm płytkę Petriego i inkubować w inkubatorze przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Po 30 minutach zebrać pożywkę iPSC zawierającą pływające komórki. Przepuścić zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 70 μm i obliczyć liczbę komórek.</li>
		<li>Zasiew: 5 x 105 komórek w naczyniu hodowlanym, wcześniej wyhodowane komórki OP9-DL1-DL4 w stanie zlewania 80%–90%, jak opisano w kroku 1.3.1. 
		UWAGA: W celu różnicowania limfocytów T, co 2-3 dni, komórki pochodzące z iPSC muszą ponownie zasiać się świeżą warstwą komórek OP9-DL1-DL4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ocena
	<ol>
		<li>Zmiany morfologiczne różnicujących się iPSC
		<ol>
			<li>Obserwuj komórki pod mikroskopem w różne dni. 
			UWAGA: Do 5 dnia kolonie mają cechy podobne do mezodermy, wykazując klasyczną morfologię w kształcie wrzeciona przypominającą ludzkie fibroblasty skóry i trwały wzrost in vitro. W 8 dniu zaczynają pojawiać się małe okrągłe skupiska komórek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Analiza różnicowania iPSC za pomocą cytometrii przepływowej
		<ol>
			<li>W różnych dniach wspólnej hodowli analizuj komórki pochodzące z iPSC, jak opisano wcześniej25 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B,C).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Analiza funkcjonalna różnicowania iPSC
		<ol>
			<li>W 28 dniu kohodowli należy pobrać limfocyty T iPSC-CD8 + z hodowli poprzez zebranie pływających komórek, trypsynizować pozostałe komórki 0,25% trypsyny, ponownie zawiesić w 8 ml pożywki iPSC, wirować przez 5 minut w temperaturze 400 x g w temperaturze 15–30 °C, usunąć pożywkę, a następnie ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki.</li>
			<li>Ponownie zawieszone komórki należy przechowywać w świeżym naczyniu o średnicy 10 cm w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 30 minut i zmontować pływające komórki. Następnie przepłucz komórki jeden raz zimnym PBS.</li>
			<li>Inkubować 3 x 10 6 splenocytów zubożonych w limfocyty T (CD4-CD8-) ze śledziony z nokautem H-2 klasy I, myszy transgenicznych HLA-A2.1 (HHD) z peptydem 5 μM s183 (FLLTRILTI) w 200 μL pożywki w temperaturze 4 °C przez 30 min.</li>
			<li>Wyprodukuj mieszaninę limfocytów T iPSC-CD8 + ze splenocytami pulsującymi peptydem s183 (limfocyty T: splenocyty = 1:4; użyj 0,75 x 106 limfocytów T). Mieszaninę komórek inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 przez 40 godzin. W ciągu ostatnich 7 godzin dodać 4 μl rozcieńczonej brefeldyny A do kultury (końcowe stężenie 1,000x, które zostanie rozcieńczone w 1x pożywce hodowlanej) w celu zablokowania procesów transportowych podczas aktywacji komórek.</li>
			<li>Wybarwić komórki i przeprowadzić analizę cytometryczną przepływową wewnątrzkomórkowego IFN-γ, jak opisano wcześniej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
		</ol>
		 </li>
	</ol>
	 </li>
</ol>
2. Indukcja replikacji HBV poprzez hydrodynamiczne dostarczanie plazmidu HBV
UWAGA: konstrukcja pAAV/HBV1.2 została wygenerowana zgodnie z wcześniejszym opisem9. Kompletne DNA HBV 1.2 jest włączone do wektora pAAV.
<ol>
	<li>Hydrodynamiczne dostarczanie plazmidu HBV przez żyłę ogonową
	<ol>
		<li>Ogrzewaj myszy HHD za pomocą lampy grzewczej przez 5 minut w klatce, aby rozszerzyć żyłę ogonową.</li>
		<li>Zatrzymaj zwierzę za pomocą krępa i wyczyść ogony myszy sprayem 70% etanolu.</li>
		<li>Dostarczanie plazmidu do wątroby. </li>
		<li>Zmierz masę ciała myszy za pomocą skali pomiarowej.</li>
		<li>Rozcieńczyć 10 μg plazmidu HBV w 8% równoważniku masy ciała PBS (np. 1,6 ml na 20 g myszy). Umieść rozcieńczony plazmid w strzykawce o pojemności 3 ml za pomocą igły podskórnej o pojemności 26 G × 1⁄2" (0,45 × 12 mm).</li>
		<li>Zlokalizuj jedną z dwóch bocznych żył ogonowych w środkowej jednej trzeciej ogona i umieść igłę w dowolnej żyle bocznej. Wstrzyknięcie zawierające plazmid HBV należy podać przez żyłę ogonową w ciągu 3 - 5 sekund.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja wiremii z surowicy krwi zakażonych myszy 
	UWAGA: Replikacja HBV zachodzi od 3 do 35 dnia w surowicy myszy. Replikacja DNA osiąga szczyt w 7 dniu i stopniowo się zmniejsza. DNA HBV nie jest usuwane z surowicy aż do 35 dnia.
	<ol>
		<li>Pobieranie surowicy krwi od zakażonych myszy
		<ol>
			<li>Zebrać około 0,1 ml krwi w probówce mikrowirówkowej od każdej myszy przez 3, 5, 7 i 10 dni po zakażeniu przez krwawienie zaoczodołowe w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut.</li>
			<li>Odwirować próbkę o masie 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i po odwirowaniu zebrać supernatant surowicy.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oczyść DNA z surowicy krwi za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji DNA zgodnie z zaleceniami producenta. Krótko mówiąc, poddać lizie komórki w kolumnie na bazie krzemionki, przeprowadzić płukanie i wyekstrahować DNA, dodając 100% etanolu do kolumny elucyjnej i odwirowując przy 6000 x g przez 1 min. Eluuj DNA w 50 μl wody wolnej od RNaz.</li>
		<li>Użyj 100 ng DNA HBV z elucji do analizy PCR w czasie rzeczywistym. Użyj następujących starterów i sond: forward 5' TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG 3'; rewers 5' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3'; sonda 5' TCACCTCTGCCTAATC 3'.
		<ol>
			<li>Użyj genomu HBV zawierającego plazmid (pAAV / HBV1.2) dla krzywej wzorcowej i wykonaj PCR w czasie rzeczywistym w całkowitej objętości 10 μL (<silna klasa = "xfig">Figura 3).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ustawić reakcję PCR w całkowitej objętości 10 μl, jak pokazano w Tabeli 1.</li>
		<li>Skonfiguruj program PCR w termocyklerze, jak pokazano w Tabeli 2. Zaprogramowana szybkość zmiany temperatury wynosi 20 °C/s dla denaturacji/wyżarzania i 5 °C/s dla przedłużenia. Zmierz fluorescencję na końcu fazy wyżarzania dla każdego cyklu w celu monitorowania PCR w czasie rzeczywistym.</li>
	</ol>
	 </li>
</ol>
3. Redukcja replikacji HBV przez ACT wirusowych limfocytów T iPSC-CD8+ specyficznych dla Ag
<ol>
	<li>Adoptywny transfer komórek (ACT)
	<ol>
		<li>Różnicować s183/iPSC (1.3.7) na komórkach zrębu OP9-DL1-DL4 w obecności mFlt-3L i mIL-7 przez 8 dni, jak opisano w sekcji 1.3.</li>
		<li>W 22 dniu należy pobrać limfocyty T iPSC-CD8+ z 10-centymetrowej płytki za pomocą trypsyny, a następnie umyć i ponownie zawiesić każdą 10-centymetrową płytkę w 10 ml świeżej pożywki. Dodać komórki do świeżej płytki o średnicy 10 cm i powrócić do inkubatora na 30 minut, jak to opisano w sekcji 1.3. Po 30 minutach zbierz pływające komórki.</li>
		<li>Użyj nylonowego sitka o średnicy 70 μm, aby przepuścić komórki, wyeliminować skupiska komórek i policzyć liczbę komórek. Dostosuj komórki do stężenia 1,5 x 107 komórek/ml w zimnym roztworze PBS i użyj nylonowego sitka o średnicy 70 μm do przepuszczenia komórek, aby w razie potrzeby ponownie wyeliminować skupiska komórek. Utrzymuj komórki na lodzie aż do ACT.</li>
		<li>Wstrzyknij 200 μl zawiesiny komórek (3 x 106 komórek) 4-6 tygodniowym myszom HHD przez żyłę ogonową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja replikacji HBV
	<ol>
		<li>W 14 dniu po transferze komórek należy przeprowadzić hydrodynamiczne dostarczanie plazmidu HBV przez żyłę ogonową, jak opisano w punkcie 2.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie białek wirusa w zakażonej wątrobie
	<ol>
		<li>Ofiaruj myszy w 3, 5, 7, 14 i 21 dniu po zakażeniu. Do eutanazji w każdej klatce należy użyć 1–2 litrów dwutlenku węgla (CO2 ) w pierwszym etapie. Gdy u zwierzęcia dojdzie do utraty przytomności, należy zwiększyć natężenie przepływu CO2 o około 4–5 l/min. Wykonaj eutanazję myszy za pomocą inhalacji CO2 .</li>
		<li>Oddziel wątrobę, przecinając powierzchnię skóry otrzewnej za pomocą nożyczek i kleszczy i lekko ciągnąc wątrobę do tyłu, aby odsłonić wewnętrzną skórę wyściełającą jamę otrzewnej. Zbierz i pokrój próbki wątroby (długość x szerokość x wysokość = 0,5 cm x 0,5 cm x 0,3 cm) zakażonych myszy, aby łatwo zmieściły się w kasecie do osadzania i zablokowały w 10% neutralnym buforze formaliny na 4-24 godziny.</li>
		<li>Odwapnić próbki wątroby za pomocą 2,5 M kwasu mrówkowego; płukać ksylenem przez 3 minuty, płukać 2x w 100% etanolu, płukać 2x w 95% etanolu, płukać 2x w wodzie dejonizowanej (DI) przez 2 minuty, a następnie odwapnić próbki wątroby w 1 mM odpowiednio kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Przechowywać w temperaturze poniżej wrzenia (90 °C) przez 20 minut.</li>
		<li>Schłodzić utrwalone tkanki wątroby przez 30 minut. Płukać tkanki 1x PBS przez 4 minuty i zanurzyć tkanki w parafinie. Odwodnić tkanki w serii rosnących stężeń etanolu, aby zastąpić wodę, a następnie zanurzyć w zanurzeniu w ksylenie. Osadź naciekane tkanki w blokach woskowych. Wykonaj równomierne przekroje pionowe i poziome do barwienia. Przygotować skrawki o wielkości 4 μm za pomocą przesuwnego mikrotomu.</li>
		<li>Przepuść skrawki przez deparafinowanie i ponowne uwodnienie za pomocą ksylenu i etanolu, a następnie wykonaj barwienie immunofluorescencyjne skrawków.</li>
		<li>Wybarwić skrawki 200 μl powierzchniowego przeciwciała swoistego dla Ag HBV (rozcieńczenie 1:100 w roztworze blokującym). Inkubować skrawki z przeciwciałem przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnej w 75%–100% i myć 5x w 1x PBS przez 5 minut.</li>
		<li>Użyj odczynnika zapobiegającego blaknięciu zawierającego 4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) do barwienia jądrowego, aby przeciwdziałać barwieniu szkiełek. Dodać szkiełko nakrywkowe z około 300 μl rozcieńczonego roztworu barwiącego DAPI (300 nM w 1x PBS) i zwalidować całe szkiełko nakrywkowe. Szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu kontroli pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naciek komórek zapalnych u zakażonych myszy
	<ol>
		<li>Ofiaruj myszy zgodnie z opisem w kroku 3.3.1. Pobrać wątrobę i wykonać sekcje zgodnie z opisem w kroku 3.3.4.</li>
		<li>Wybarwić skrawek hematoksyliną i eozyną (H&E), aby ocenić naciekanie komórek zapalnych do wątroby.</li>
		<li>Szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu dalszej analizy pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
		<li>Wizualizuj preparaty pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby wykryć infiltrację komórek zapalnych do wątroby (<silna klasa="xfig">Ryc. 4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie DNA HBV w zakażonej wątrobie
	<ol>
		<li>Izolacja DNA wirusa.</li>
		<li>Poddać myszy eutanazji i pobrać próbki wątroby zgodnie z punktem 3.3.</li>
		<li>Lizować tkanki wątroby w buforze do lizy Nonindet P-40 (NP-40) (50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, 1% NP-40) zawierającym koktajl inhibitorów proteazy.</li>
		<li>Krótko odwirować przy 16 000 x g, aby usunąć jądra i resztki komórek.</li>
		<li>Inkubować lizat cytoplazmatyczny z nukleazą mikrokokową (nukleaza S7; 150 jednostek/ml) i CaCl2 (5 mM) w temperaturze 37 °C przez 90 minut w celu degradacji kwasu nukleinowego poza nukleokapsydami (NC).</li>
		<li>Dezaktywuj nukleazę S7 przez dodanie 10 mM EDTA.</li>
		<li>Wytrącić nukleokapsydy glikolem polietylenowym (PEG), rozbić o 0,5% dodecylosiarczan sodu (SDS) i trawić 0,6 mg/ml proteinazy K (PK) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Odzyskaj wirusowe kwasy nukleinowe przez ekstrakcję chloroformem fenolowym i wytrącanie etanolu.</li>
		<li>Rozpuść wyekstrahowane DNA wirusa na 1,2% żelu agarozowym i wykryj za pomocą standardowej analizy Southern blot za pomocą sondy DNA HBV znakowanej P a32</li>.
	</ol>
	 </li>
</ol>

<ol><li>Scaglione, S. J., Lok, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+hepatitis+B+treatment+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice.</a> Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).</li>
<li>Osiowy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+infancy+and+beyond...+ensuring+a+lifetime+of+hepatitis+B+virus+%28HBV%29+vaccine-induced+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">From infancy and beyond... ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).</li>
<li>Gish, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+HBsAg+antigen+during+treatment+with+entecavir+or+lamivudine+in+nucleoside-naive+HBeAg-positive+patients+with+chronic+hepatitis+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Viral+Hepatitis%22%5BJournal%5D)">Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B.</a> Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).</li>
<li>Kurktschiev, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+CD8%2B+T+cells+in+hepatitis+B+and+C+are+characterized+by+a+lack+of+antigen-specific+T-bet+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (10), 2047-2059 (2014).</li>
<li>Fisicaro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+intrahepatic+T-cell+responses+can+be+restored+by+blocking+programmed+death-1+pathway+in+chronic+hepatitis+B%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B.</a> Gastroenterology. 138 (2), 682-693 (2010).</li>
<li>Schurich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+signal+cytokine+IL-12+rescues+the+anti-viral+function+of+exhausted+HBV-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The third signal cytokine IL-12 rescues the anti-viral function of exhausted HBV-specific CD8 T cells.</a> PLoS Pathogens. 9 (3), 1003208(2013).</li>
<li>Gehring, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+virus-specific+T+cells+that+target+HBV+infected+hepatocytes+and+hepatocellular+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).</li>
<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+Tumor+Necrosis+Factor-alpha+Produced+by+T+Cells+Reduce+the+HBV+Persistence+Form%2C+cccDNA%2C+Without+Cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis.</a> Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).</li>
<li>Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunocompetent+mouse+model+for+the+tolerance+of+human+chronic+hepatitis+B+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (47), 17862-17867 (2006).</li>
<li>Wong, P., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8+T+cell+responses+to+infectious+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD8 T cell responses to infectious pathogens.</a> Annual Review of Immunology. 21, 29-70 (2003).</li>
<li>Murray, J. M., Wieland, S. F., Purcell, R. H., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+hepatitis+B+virus+clearance+in+chimpanzees%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Dynamics of hepatitis B virus clearance in chimpanzees.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (49), 17780-17785 (2005).</li>
<li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8%2B+T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li>
<li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+effector+CD8%2B+T+cells+derived+from+naive+rather+than+memory+subsets+possess+superior+traits+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 117 (3), 808-814 (2011).</li>
<li>Kerkar, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+murine+CD8%2B+and+CD4%2B+T+cells+for+preclinical+adoptive+immunotherapy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies.</a> Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).</li>
<li>Kuball, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitating+matched+pairing+and+expression+of+TCR+chains+introduced+into+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells.</a> Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).</li>
<li>van Loenen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+T+cell+receptor+dimers+harbor+potentially+harmful+neoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (24), 10972-10977 (2010).</li>
<li>Cameron, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Titin-derived+HLA-A1-presented+peptide+as+a+cross-reactive+target+for+engineered+MAGE+A3-directed+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells.</a> Science Translational Medicine. 5 (197), (2013).</li>
<li>Fedorov, V. D., Themeli, M., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1-+and+CTLA-4-based+inhibitory+chimeric+antigen+receptors+%28iCARs%29+divert+off-target+immunotherapy+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses.</a> Science Translational Medicine. 5 (215), (2013).</li>
<li>Maus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+expressing+chimeric+antigen+receptors+can+cause+anaphylaxis+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunolology+Research%22%5BJournal%5D)">T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans.</a> Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).</li>
<li>Haque, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+of+regulatory+T+cells+from+pluripotent+stem+cells+and+prevention+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity.</a> Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+human+tumor+antigen-specific+T+cells+from+iPSCs+derived+from+mature+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).</li>
<li>Lei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+programming+of+tumor+antigen-specific+T+lymphocytes+from+pluripotent+stem+cells+to+promote+cancer+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance.</a> Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).</li>
<li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oct4-induced+pluripotency+in+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells.</a> Cell. 136 (3), 411-419 (2009).</li>
<li>Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+towards+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3986(2012).</li>
<li>Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+naive+single-type+tumor+antigen-specific+CD8%2B+T+lymphocytes+from+murine+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22OncoImmunology%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells.</a> OncoImmunology. 6, (2017).</li>
<li>Haque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+Immunotherapy+in+Mice+Using+Genetically+Engineered+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).</li>
<li>Tan, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Expression+Profiles+of+HBV+DNA+Integrated+Into+Genomes+of+Hepatocellular+Carcinoma+Cells+to+Select+T+Cells+for+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy.</a> Gastroenterology. , (2019).</li>
<li>Wu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly6C%28%2B%29+Monocytes+and+Kupffer+Cells+Orchestrate+Liver+Immune+Responses+Against+Hepatitis+B+Virus+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice.</a> Hepatology. , (2019).</li>
<li>Haque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+tissue-associated+regulatory+T+cells+suppress+the+activity+of+pathogenic+cells+in+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insights%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).</li>
<li>Chisari, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+pathological+effects+of+synthesis+of+hepatitis+B+virus+large+envelope+polypeptide+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).</li>
<li>Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+tolerance+leads+to+autoantibody+production+but+not+autoimmune+liver+disease+in+hepatitis+B+virus+envelope+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice.</a> Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten przedstawia metodę generowania wirusowych iPSC-CTL specyficznych dla Ag do wykorzystania jako ACT w celu zahamowania replikacji HBV w modelu mysim. W przewlekłym zakażeniu HBV genom wirusa tworzy stabilny mini chromosom, kowalencyjnie zamknięty kolisty DNA (cccDNA), który może utrzymywać się przez całe życie hepatocytu. Ukierunkowanie na klirens mini chromosomu wirusa może doprowadzić do wyleczenia przewlekłego zakażenia HBV. Obecna terapia przeciwwirusowa jest ukierunkowana na odwrotną transkryptazę wirusa,...

Po ostrym zakażeniu, adaptacyjny układ odpornościowy (tj. odporność humoralna i komórkowa) kontroluje większość ostrego zapalenia wątroby związanego z HBV. Mimo to wiele osób w regionach endemicznych HBV nie jest w stanie wyeliminować wirusa, a następnie przekształcić się w osoby przewlekłe. U ponad 25% pacjentów przewlekle chorych (>250 milionów ludzi) na całym świecie rozwija się postępująca choroba wątroby, skutkująca marskością wątroby i/lub rakiem wątrobowokomórkowym (HCC)1. W rezultacie, eradykacja uporczywie zakażonych komórek pozostaje ogólnym problemem zdrowotnym, mimo że dostępna jest szczepionka2 i wiele leków przeciwwirusowych jest w fazie rozwoju. Standardowe leczenie zakażenia HBV obejmuje IFN-α, nukleozydy i analogi nukleotydów. Środki te mają bezpośrednią aktywność przeciwwirusową i zdolności modulacji immunologicznej. Niemniej jednak serokonwersja nosicieli antygenu HBe (Ag)+ z przeciwciałem anty-HBe (Ab) i utrata kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) HBV w surowicy występują indywidualnie u około 20% leczonych pacjentów, a pełna kontrola immunologiczna wirusa zweryfikowana przez pozbawienie HBsAg wynosi nie więcej niż 5%3. Co więcej, odpowiedź na leczenie często nie jest trwała. Szczepienie profilaktyczne rekombinowanym HBs Ag jest wysoce skuteczne w zapobieganiu zakażeniu, ale terapeutyczne szczepienie HBs Ag nie jest skuteczne. Oczywiste jest, że odpowiedzi immunologiczne za pośrednictwem limfocytów T odgrywają kluczową rolę w kontrolowaniu zakażenia HBV i zaburzeń czynności wątroby; jednak u pacjentów z przewlekłym zapaleniem wątroby limfocyty T reagujące na HBV są często usuwane, dysfunkcyjne lub przekształcają się w wyczerpanie4,5,6. W związku z tym u osób z przetrwałym zakażeniem HBV nie podjęto żadnych prób przywrócenia odporności swoistej dla HBV (tj. odporności opartej na limfocytach T) za pomocą leków przeciwwirusowych, cytokin immunomodulujących lub immunizacji leczniczej.
Adoptywny transfer komórek (ACT) limfocytów T specyficznych dla HBV Ag jest skutecznym leczeniem ukierunkowanym na ostateczne wyeliminowanie pozostałych hepatocytów za pomocą HBV7,8. Wykazano, że ACT CTL specyficznych dla HBV u myszy zakażonych HBV powoduje przejściowe, łagodne zapalenie wątroby i dramatyczny spadek transkryptów kwasu rybonukleinowego (RNA) HBV w hepatocytach. W tych badaniach CTL nie hamowały transkrypcji genów HBV, ale nasilały degradację transkryptów HBV9. CTL specyficzne dla HBV są ważne dla zapobiegania infekcji wirusowej i pośredniczą w klirensie HBV10,11. W przypadku środków opartych na ACT, ekspansja in vitro limfocytów T specyficznych dla HBV o wysokiej reaktywności w celu przesiedlenia in vivo została uznana za idealną metodę12,13,14; niemniej jednak obecne podejścia są ograniczone pod względem ich zdolności do generowania, oddzielania i hodowania odpowiednich ilości i jakości limfocytów T specyficznych dla HBV od pacjentów do potencjalnych terapii.
Chociaż badania kliniczne prezentują bezpieczeństwo, praktyczność i perspektywiczną aktywność terapeutyczną terapii komórkowych za pomocą zmodyfikowanych limfocytów T, które są specyficzne dla hepatocytów zakażonych wirusem HBV, istnieją obawy o niekorzystne skutki wynikające z reakcji autoimmunologicznych z powodu reaktywności krzyżowej z nieprawidłowego parowania receptora limfocytów T (TCR)15,16, rozpoznawanie Ag poza celem przez niespecyficzny TCR17 i toksyczność chimerycznego receptora Ag (CAR) na cel18,19 ze zdrowymi tkankami. Obecnie genetycznie zmodyfikowane limfocyty T, które utrzymują się tylko przez krótki czas in vivo, są zwykle pośrednimi lub późniejszymi efektorowymi limfocytami T. Do tej pory pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) są jedynym dostępnym źródłem generującym dużą liczbę naiwnych limfocytów T specyficznych dla Ag jednego typu20,21,22,23. Indukowane PSC (iPSC) są po prostu przekształcane z komórek somatycznych pacjenta poprzez zastosowanie transdukcji genów kilku czynników transkrypcyjnych. W rezultacie, iPSC mają podobne cechy jak embrionalne komórki macierzyste (ESC)24. Ze względu na elastyczność i możliwość nieskończonej zdolności do samoodnawiania, oprócz wymiany tkanek, terapie oparte na iPSC mogą być szeroko stosowane w medycynie regeneracyjnej. Co więcej, pułki leżące u podstaw iPSC mogą znacznie poprawić obecne terapie komórkowe.
Ogólnym celem tej metody jest wygenerowanie dużej ilości specyficznych dla HBV CTL z iPSC (tj. iPSC-CTLs) do immunoterapii opartej na ACT. Zaletą w porównaniu z alternatywnymi technikami jest to, że specyficzne dla HBV iPSC-CTL mają pojedynczy typ TCR i naiwny fenotyp, co skutkuje większym rozwojem komórek T pamięci po ACT. Wykazano, że ACT iPSC-CTL specyficznych dla HBV zwiększa migrację funkcjonalnych limfocytów T CD8 + w wątrobie i zmniejsza replikację HBV zarówno w wątrobie, jak i we krwi podawanych myszy. Metoda ta ujawnia potencjalne zastosowanie wirusowych iPSC-CTL specyficznych dla Ag w immunoterapii HBV i może być przystosowana do generowania innych wirusowych komórek iPSC-T specyficznych dla Ag do immunoterapii wirusowej.

<table><tbody><tr><td>Myszy HHD</td><td>Instytut Pasteura, Paryż, Francja</td><td></td><td>Nokaut H-2 klasy I, myszy transgeniczne HLA-A2.1 (HHD)</td></tr><tr><td>IPS-MEF-NG-20D-17</td><td>Bank komórek RIKEN</td><td>APS0001</td><td></td></tr><tr><td>SNL76/7</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1049</td><td></td></tr><tr><td>OP9</td><td>ATCC</td><td>CRL-2749</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pAAV/HBV1.2</td><td>Dr. Dr. Pei-Jer Chen (Narodowy Tajwański Szpital Uniwersytecki, Tajwan)</td><td></td><td>DNA HBV konstruuje</td></tr><tr><td>HBs183-91(s183) (FLLTRILTI) Geny TCR specyficzne dla HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)</td><td>Dr Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Kanada)</td><td></td><td>Specyficzne dla FLLTRILTI geny TCR hybrydy ludzko-mysiej A2 (V&alpha; 34 oraz V&beta; 28)</td></tr><tr><td>OVA257&ndash; 264-specyficzne geny TCR</td><td>Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA)</td><td></td><td>Geny TCR specyficzne dla SIINFEKL H-2Kb</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD3 (17A2)</td><td>Biolegend</td><td>100236</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD44 (IM7)</td><td>BD Pharmingen</td><td>103012</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD4 (GK1.5)</td><td>Biolegend</td><td>100408</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD8 (53-6,7)</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>100732</tr><tr><td>Anty-IFN-&gamma; (XMG1.2) przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>505810</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-TNF-a (MP6-XT22)</td><td>Biolegend</td><td>506306</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-HBs</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA5-13059</td><td></td></tr><tr><td>ACK Bufor do lizy</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FBS Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Fusion sorter komórek</td><td>BD</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>Milipor żelatynySigma</td><td></td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>GeneJammer</td><td>Agilent</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer</td><td>Proimmune</td><td>F027-4A - 27</td><td></td></tr><tr><td>HRP Przeciw mysim przeciwciału wtórnemu</td><td>Invitrogen</td><td>A27025</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>Peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza S7</td><td>Roche</td><td>10107921001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>MilliporeSigma</td><td>P6148-500G</td><td>Uwaga: Alergiczny, rakotwórczy, toksyczny</td></tr><tr><td>bufor przepuszczalności</td><td>Biolegend</td><td>421002</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>MilliporeSigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&trade; Złoty uchwyt Antifade z DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp MinElute Virus Spin Kit</td><td>Qiagen</td><td>57704</td><td></td></tr></tbody></table>

limfocyty t specyficzne dla wirusa ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację hbv u myszy

Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

Zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) jest globalnym problemem zdrowotnym. Zakażenie HBV jest obecnie jedną z głównych przyczyn raka wątroby, której dotyczy ponad 350 milionów ludzi na całym świecie. Jest to poważny problem, zwłaszcza w krajach rozwijających się. Niezdolność układu odpornościowego do wytworzenia skutecznej odpowiedzi na HBV prowadzi do przewlekłego zakażenia. Chociaż szczepionka przeciwko HBV jest już obecna i opracowywane są nowe leki przeciwwirusowe, eradykacja komórek rezerwuarów wirusa pozostaje głównym tematem zdrowotnym. Opisano tutaj metodę wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T (CTL) CD8 + specyficznych dla antygenu wirusowego (Ag) pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) (tj. iPSC-CTL), które mają zdolność tłumienia replikacji HBV. Replikacja HBV jest skutecznie indukowana u myszy poprzez hydrodynamiczne wstrzyknięcie plazmidu ekspresji HBV, pAAV / HBV1.2, do wątroby. Następnie adoptywnie przenoszone są mysie iPSC-CTL specyficzne dla powierzchni HBV, co znacznie hamuje replikację HBV w wątrobie i krwi, a także zapobiega ekspresji powierzchniowego Ag HBV w hepatocytach. Metoda ta demonstruje replikację HBV u myszy po wstrzyknięciu hydrodynamicznym oraz to, że wirusowe CTL specyficzne dla Ag pochodzące z komórek macierzystych mogą hamować replikację HBV. Protokół ten stanowi użyteczną metodę immunoterapii HBV.

Jak pokazano tutaj, specyficzne dla antygenów wirusa HBV komórki iPSC-CD8+ T są generowane w systemie hodowli in vitro. Po ACT tych specyficznych dla antygenów wirusa komórek iPSC-CD8+ T następuje znaczne zahamowanie replikacji HBV w modelu mysim (Supplemental File 1). Mysie iPSC są transdukowane retrowirusowym konstruktem MIDR kodującym hybrydowy ludzko-mysi gen TCR HBV (specyficzny dla HBs183-191, s183）, następnie transdukowane genetycznie iPSC są hodowane wspólnie z ko...

Prezentowany tutaj jest protokół skutecznego tłumienia replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy poprzez wykorzystanie adoptywnego transferu komórek (ACT) limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego (Ag) pochodzących z komórek macierzystych. Procedura ta może być dostosowana do potencjalnej immunoterapii zakażenia HBV opartej na ACT.

Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące adoptywnego transferu komórek T specyficznych dla antygenu wirusowego pochodzących z iPSC w celu skutecznego tłumienia replikacji HBV u myszy. Główną zaletą tej techniki jest to, że limfocyty T specyficzne dla antygenu wirusowego pochodzące z iPSC mają pojedynczy receptor komórek T i naiwny fenotyp. W celu różnicowania limfocytów T CD8-dodatnich iPSC specyficznych dla HBV, należy umieścić iPSC transdukowane genem receptora limfocytów T s183 na monowarstwie OP9-DL1 / DL4 w pożywce o minimalnym alfa uzupełnionej 20% płodową surowicą bydlęcą i mysim ligandem Flt3 do ich wspólnej hodowli w inkubatorze do hodowli komórkowych.Regularnie monitoruj kokulturę, aby ocenić morfologię komórki. W 28 dniu usuń supernatant i pływające komórki, a przylegające komórki odłącz 0,25% trypsyny. Gdy komórki podniosą się z dna pojemnika hodowlanego, zatrzymaj reakcję enzymatyczną za pomocą ośmiu mililitrów pożywki iPSC i zbierz komórki przez odwirowanie.Zawiesić osad w 10 mililitrach świeżego podłoża. Rozcieńczyć komórki do jednego limfocytu T CD8-dodatniego pochodzącego z iPSC do czterech splenocytów pulsujących peptydem s183 na 40-godzinną inkubację w inkubatorze hodowli komórkowych. W ciągu ostatnich siedmiu godzin dodaj do hodowli cztery mikrolitry rozcieńczonej brefeldyny A, aby zablokować procesy transportu podczas aktywacji komórek.Wybarwić komórki do analizy cytometrycznej przepływowej cytokin wewnątrzkomórkowych będących przedmiotem zainteresowania zgodnie ze standardowymi protokołami. W celu hydrodynamicznego dostarczania plazmidu HBV przez żyłę ogonową, należy rozcieńczyć 10 mikrogramów plazmidu HBV w 8% równoważniku masy ciała PBS. Załaduj plazmid do jednej trzymililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 26 i średnicy 1/2 cala na mysz.Podgrzej myszy HHD pod lampą grzewczą przez pięć minut, aby rozszerzyć żyły ogonowe, i ostrożnie wciągnij mysz do plastikowego ogranicznika. Zlokalizuj rozszerzoną boczną żyłę ogonową w środkowej jednej trzeciej ogona i włóż igłę równolegle do żyły, aby dostarczyć całą objętość plazmidu przez żyłę ogonową w ciągu trzech do pięciu sekund. W przypadku transferu adoptywnego komórek T CD8-dodatnich komórek T specyficznych dla antygenu wirusowego iPSC, należy zebrać limfocyty T iPSC CD8-dodatnie w 22 dniu hodowli, jak pokazano, i zasiać komórki na nowej 10-centymetrowej naczyniu do hodowli komórek.Po 30 minutach w inkubatorze do hodowli komórkowych przefiltruj pływające komórki przez nylonowe sitko o średnicy 70 mikrometrów i policz żywe komórki. Rozcieńczyć komórki do 1,5 razy 10 do siedmiu komórek na mililitr stężenia PBS. Wstrzyknij 200 mikrolitrów komórek poszczególnym cztero- do sześciotygodniowym myszom HHD do żyły ogonowej, jak właśnie pokazano.W 14 dniu po transferze komórek wykonaj hydrodynamiczne dostarczanie plazmidu HBV, jak pokazano. W odpowiednich eksperymentalnych punktach końcowych po zakażeniu należy pobrać wątrobę od każdego zakażonego zwierzęcia i pokroić wątrobę na próbki tkanek o wymiarach 0,5 na 0,5 na 0,3 centymetra. Umieść próbki w 10% neutralnym buforze formalinowym na cztery do 24 godzin, a następnie odwapnij w 2,5-molowym kwasie mrówkowym przez sześć do 24 godzin.Następnie płucz próbki w ksylenie przez trzy minuty, a następnie dwa dwuminutowe płukania w 100% etanolu, 95% etanolu i wodzie dejonizowanej. Po ostatnim płukaniu wodą odwapnić tkanki w jednomilimolowym EDTA w temperaturze 90 stopni Celsjusza, a następnie przeprowadzić 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Gdy tkanka ostygnie, przepłukać próbki w PBS przez cztery minuty i użyć ksylenu i etanolu do odparafinowania i ponownego uwodnienia próbek.W celu znakowania immunofluorescencyjnego należy wybarwić skrawki 200 mikrolitrami przeciwciała swoistego dla antygenu powierzchniowego HBV przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w komorze o wilgotności od 75 do 100%. Pod koniec inkubacji przemyć próbki pięcioma pięciominutowymi płukaniami w świeżym PBS dla każdego przemycia. Oznacz komórki DAPI zgodnie ze standardowymi protokołami przed zamontowaniem szkiełek nakrywkowych do obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.W celu analizy immunohistochemicznej wybarwić skrawki hematoksyliną i eozyną zgodnie ze standardowymi protokołami i ocenić naciekanie komórek zapalnych do wątroby za pomocą mikroskopii świetlnej. Analiza cytometryczna przepływowa populacji CD3-dodatniej CD8-dodatniej pochodzącej z iPSC ujawnia, że transdukcja receptora limfocytów T HBV radykalnie zwiększa wytwarzanie wirusowych limfocytów T CD8-dodatnich s183. Po stymulacji splenocytami zubożonymi w T pulsującymi peptydem s183, CD4-ujemne limfocyty T pochodzące z iPSC CD4-ujemne wytwarzają duże ilości interferonu gamma, co wykryto za pomocą wewnątrzkomórkowej analizy cytometrycznej przepływu i ELISA.Po zakażeniu HBV przez wstrzyknięcie hydrodynamiczne replikacja DNA osiąga szczyt w szóstym dniu i stopniowo się zmniejsza, co obserwuje się w analizie PCR w czasie rzeczywistym. Co więcej, replikacja wirusa jest znacznie zmniejszona we wszystkich punktach czasowych u myszy, które otrzymują limfocyty T specyficzne dla wirusa HBV w porównaniu z myszami, które otrzymują komórki kontrolne. Białko powierzchniowe HBV jest również znacznie zmniejszone u myszy, które otrzymują cytotoksyczne limfocyty pre-iPSC specyficzne dla antygenu wirusa HBV w porównaniu z myszami leczonymi komórkami kontrolnymi, co wyraźnie pokazuje, że limfocyty T CD8-dodatnie iPSC specyficzne dla antygenu wirusowego mają zdolność zmniejszania replikacji HBV w modelu mysim.Powinieneś teraz dobrze zrozumieć, jak generować limfocyty T specyficzne dla antygenu wirusowego z iPSC do immunoterapii adoptywnej.

stem-cell-derived-viral-ag-specific-t-lymphocytes-suppress-hbv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

W niniejszej pracy opisujemy pierwszą zgodną z dobrą praktyką wytwarzania (GMP) metodę produkcji wirusowo-specyficznych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) z krwi pępowinowej, która jest źródłem głównie naiwnych limfocytów T.

Ekspansja cytotoksycznych limfocytów T z krwi pępowinowej nakierowanych na cytomegalowirus, wirusa Epstein-Barr i adenowirusa

Film demonstruje test z wykorzystaniem ludzkich komórek macierzystych CD8+ pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w celu zahamowania replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy. Te limfocyty T, zmodyfikowane za pomocą receptorów specyficznych dla HBV, są przenoszone do myszy transgenicznych. Kompetentne replikacyjnie plazmidy genomu HBV są następnie wstrzykiwane bezpośrednio do wątroby, umożliwiając wychwyt DNA wirusa. Gdy antygeny wirusowe ulegną...

Hamowanie replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B za pomocą limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego

Ten protokół opisuje metody konstruowania humanizowanego modelu myszy szpiku kostnego/wątroby/grasicy z opartą na komórkach macierzystych odpornością na zakażenie wirusem HIV.

Zmodyfikowana odporność na zakażenie wirusem HIV oparta na komórkach macierzystych w humanizowanym modelu myszy

Tutaj opisujemy protokół analizy fenotypu limfocytów regulatorowych T (T reg) wyizolowanych od naiwnych i przewlekłych myszy zakażonych wirusem limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Ponadto zapewniamy proces oceny aktywności supresyjnej limfocytówT reg.

Analiza fenotypowa i funkcjonalna aktywowanych limfocytów T regulatorowych wyizolowanych od myszy zakażonych wirusem przewlekłego limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych

Tutaj opisujemy nowo opracowany system zgłaszania wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) do monitorowania wczesnych etapów cyklu życia wirusa HBV. Ten uproszczony system in vitro pomoże w badaniach przesiewowych środków anty-HBV przy użyciu strategii wysokoprzepustowej.

Opracowanie systemu zgłaszania wirusa zapalenia wątroby typu B w celu monitorowania wczesnych etapów cyklu replikacji

Ten protokół opisuje użycie jednołańcuchowych kompleksów MHC klasy I do badania interakcji molekularnych w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8+: generowanie zmodyfikowanych komórek prezentujących antygen wyrażających konstrukty jednołańcuchowe, hodowla klonu ludzkich komórek T CD8+ i eksperymenty z aktywacją limfocytów T.

Zastosowanie technologii jednołańcuchowej MHC do badania koagonizmu w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8 +

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół infekcji wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) w nowych zmodyfikowanych komórkach 293T (293T-NE-3NRs, wyrażających ludzkie NTCP, HNF4α, RXRα i PPARα) oraz tradycyjnych komórkach wątroby (HepG2-NE, wyrażających ludzkie NTCP).

Modelowanie zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B w niewątrobowych komórkach 293T-NE-3NRs

Na podstawie matrycy peptydowej pochodzącej z wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficzne dla HBV mogą być oceniane równolegle z identyfikacją epitopów limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV.

Analiza odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i identyfikacja epitopów komórek T CD4 ograniczonych do HLA-DR na podstawie matrycy peptydowej

Prezentujemy protokół do badania związków wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) ukierunkowanych na etapy cyklu życia przed i po wejściu wirusa, używając izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do pomiaru powinowactwa wiązania (KD) z polipeptydem kotransportującym taurocholan sodu gospodarza. Skuteczność przeciwwirusową określono poprzez supresję markerów cyklu życia wirusa (tworzenie cccDNA, transkrypcja i składanie wirusa).

Kompetentny model hepatocytów badający wnikanie wirusa zapalenia wątroby typu B przez polipeptyd transportujący taurocholan sodu jako cel terapeutyczny

Obecne badanie prezentuje protokoły oceny wczesnego losu specyficznych dla wirusa komórek TFH i manipulowania ekspresją genów w tych komórkach.

Dostęp do wczesnego różnicowania specyficznych dla wirusa pęcherzykowych komórek T pomocniczych CD4 + u myszy zakażonych ostrą LCMV

Poznaj metodę transferu komórek adoptowanych z iPSC-derwowanych limfocytów T specyficznych dla wirusa HBV w celu hamowania replikacji wirusa u myszy. Technika ta wykorzystuje komórki o naiwnym fenotypie i pojedynczym receptorze TCR.

Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy

Przeglądaj więcej filmów