Name: Platforma do przeszczepiania szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj platformę przeszczepu szpiku kostnego służącą do badania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi. Metoda pozwala analizować odpowiedzi immunologiczne po transplantacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie jest wspierane przez grant start-up University of Central Florida College of Medicine (dla HN), grant na rozpoczęcie działalności University of Pittsburgh Medical Center Hillman Cancer Center (dla HL), grant dla NIH w Stanach Zjednoczonych #1P20CA210300-01 oraz grant Ministerstwa Zdrowia Wietnamu #4694/QD-BYT (dla PTH). Dziękujemy dr Xue-zhong Yu z Uniwersytetu Medycznego w Południowej Karolinie za dostarczenie materiałów do badania.

Procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Centralnej Florydy.
1. Indukcja GVHD
UWAGA: Allogeniczny przeszczep komórek szpiku kostnego (BM) (krok 1.2) jest wykonywany w ciągu 24 godzin po napromieniowaniu. Wszystkie opisane poniżej zabiegi wykonywane są w sterylnym środowisku. Wykonaj zabieg w kapturze do hodowli tkankowej i użyj przefiltrowanych odczynników.
<ol>
	<li>Dzień 0: Przygotuj myszy biorców.
	<ol>
		<li>Jako biorców należy użyć samic myszy typu dzikiego (WT) na tle BALB/c (CD45.2+ H2kd+), w wieku 10-12 tygodni.</li>
		<li>Załóż kolczyk na uszy i zważ biorców przed TBI. Następnie umieść do 11 myszy w komorze naświetlającej i trzymaj ją w promienniku. Naświetlać pojedynczą dawką 700 cGy przez 10-15 min.</li>
		<li>Przed przeszczepem należy zwrócić napromieniowane zwierzęta do klatek i umieścić je w pomieszczeniach wolnych od patogenów. 
		UWAGA: Minimalna masa ciała biorców powinna wynosić około 20 g. Użyj tej masy jako odniesienia do obliczenia utraty masy ciała w okresie eksperymentalnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 1: Przygotuj szpik kostny zubożony w limfocyty T (TCD-BM) od myszy dawców.
	<ol>
		<li>Poddaj eutanazji myszy CD45.1 / Ly5.1 C57BL / 6 przez uduszenie CO2 i poczekaj 2-3 minuty, aż stracą przytomność. W razie potrzeby należy wykonać zwichnięcie szyjki macicy jako wtórną eutanazję.</li>
		<li>Umieść każdą mysz na czystej tablicy roboczej. Zdezynfekuj sierść i skórę 70% izopropanolem.</li>
		<li>Zbierz kość piszczelową i kość udową z obu nóg za pomocą kleszczy i nożyczek. Umieść je w lodowatym RPMI zawierającym 1% FCS i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy (1% RPMI) w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Dokładnie oczyść kość udową i piszczelową, usuwając wszystkie tkanki mięśniowe za pomocą kleszczy i nożyczek. Przenieść kość udową i piszczelową z probówek stożkowych o pojemności 50 ml na szalkę Petriego o średnicy 92 mm zawierającą 1% RPMI.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek odetnij końce kości udowej lub piszczelowej. Napełnij probówkę o pojemności 50 ml 25 ml pożywki 1% RPMI 1640. Użyj tego, aby napełnić strzykawkę o pojemności 3 ml dołączoną do igły 26 G 3 ml 1% RPMI. Włożyć tę strzykawkę do kości i wcisnąć tłok, aby wypłukać szpik kostny (BM) z jamy do probówki zbiorczej z 1% RPMI (~3 ml/kość).</li>
		<li>Powtórz krok 1.2.4 dla wszystkich pozostałych kości piszczelowych i udowych innych myszy dawców. Trzymaj wszystkie probówki zbiorcze na lodzie.</li>
		<li>Zawiesinę jednokomórkową należy sporządzić przez przepłukanie fragmentów szpiku kostnego przez sitko siatkowe o wielkości 75 μm. Zawiesinę jednokomórkową należy zebrać do probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Probówki wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w buforze PBS zawierającym 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 20 x 106 komórek/ml. Zapisz podwielokrotność 2 x 106 komórek do barwienia czystością.</li>
		<li>Dodać przeciwciało Thy 1 w stężeniu 0,05 μg/106 komórek14 i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć raz 25 ml lodowatego PBS. Zawiesić w 20 x 106/ml w 0,5% BSA/10% dopełniaczu młodego królika/2% DNazie (10 000 U/ml w sterylnymH2O). Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C i myć 2x jak poprzednio. 
		UWAGA: Limfocyty T są zubożone przy użyciu mAb specyficznego dla Thy1, białka wyrażanego przez wszystkie limfocyty T, ale nie przez inne leukocyty.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 20 ml buforu PBS zawierającego 0,5% BSA. Policz komórki szpiku kostnego w 1% kwasie octowym za pomocą hemocytometru. Zachować podwielokrotność 2 x 106 komórek do kontroli czystości za pomocą cytometrii przepływowej po oczyszczeniu komórek. 
		UWAGA: Jedna mysz dawcy zwykle generuje około 25 x 106 TCD-BM.</li>
		<li>Użyj cytometrii przepływowej, aby potwierdzić pomyślne wyczerpanie limfocytów T. Wybarwić 1 x 106 komórek, zachowanych z etapów 1.2.7 (przed wyczerpaniem limfocytów T) i 1.2.9 (TCD-BM po wyczerpaniu limfocytów T) następującymi przeciwciałami: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1,5) i α-CD8α (53-6,7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 1: Przygotowanie limfocytów T od myszy dawcy
	<ol>
		<li>Użyj myszy typu dzikiego (WT) CD45.2 + H2kb + C57BL / 6 (WT) jako dawców limfocytów T.</li>
		<li>Poddaj eutanazji myszy C57BL/6 przez uduszenie dwutlenkiem węgla (CO2), jak opisano w 1.2.1.</li>
		<li>Dokładnie oczyść sierść i skórę myszy 70% etanolem. Wyciąć śledziony i węzły chłonne i rozdzielić je na jednokomórkową zawiesinę splenocytów za pomocą tłoka strzykawki i siatek o wielkości 40 μm. Przemyć sitko i tłok strzykawki 1% RPMI (1% FBS zawierający pożywkę RPMI), aby zebrać wszystkie splenocyty.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórek przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 5 ml buforu lizującego ACK (1 mM Na2EDTA, 10 mM KHCO3, 144 mM NH4Cl, pH 7,2) po odrzuceniu supernatantu. Inkubować zawiesinę komórkową przez 5 minut w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Bufor do lizy ACK służy do lizy czerwonych krwinek.</li>
		<li>Dodaj 5 ml 1% RPMI, aby zatrzymać lizę. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Przygotuj lodowaty bufor do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) (0,5% BSA, 2 mM EDTA w PBS, pH 7,2). Odgazuj bufor przed użyciem. Ponownie zawiesić osady komórek w 5 ml buforu MACS.</li>
		<li>Policz splenocyty i sprawdź, czy są żywe i martwe komórki za pomocą hemocytometru i 1% błękitu trypanowego. Zapisz podwielokrotność 2 x 106 komórek, aby ocenić wydajność oczyszczania za pomocą analizy cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Zawiesić splenocyty w stężeniu 200 x10 6/ml w buforze MACS. Dodać 0,03 μl biotyny anty-myszy-Ter-119, 0,03 μl biotyny anty-mysiej CD11b, 0,03 μl biotyny anty-myszy-CD45R i 0,03 μl biotyny anty-myszy-DX5 na 106 komórek. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Biotyna anty-mysie-Ter-119, biotyna anty-mysie-CD11b, biotyna anty-mysz-CD45R i biotyna anty-mysz-DX5 były używane do reagowania odpowiednio z erytroidami, granulocytami, komórkami B i komórkami NK. W związku z tym te podzbiory komórek są wyczerpywane w następującym kroku 15.</li>
		<li>Dodać 10 ml lodowatego buforu MACS do zawiesiny komórek. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osady komórkowe w buforze MACS w stężeniu 100 x 106/ml. Dodaj mikrogranulki antybiotyny (0,22 μL/106 komórek) do zawiesiny splenocytów. Dobrze wymieszać i inkubować przez dodatkowe 15 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć zawiesinę komórkową 10 ml lodowatego buforu MACS. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Umieść magnetyczną kolumnę oddzielającą w polu magnetycznym. Przepłukać kolumnę 3 ml buforu MACS. Upuść zawiesinę komórek na kolumnę. Zebrać przepływ składający się z niezwiązanych, wzbogaconych limfocytów T w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Przemyć kolumnę MS 3 ml lodowatego buforu MACS. 
		UWAGA: Upewnij się, że kolumna jest pusta przed wykonaniem etapów mycia.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml buforu MACS.</li>
		<li>Policz komórki w 1% błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru. Zachowaj podwielokrotność 2 x 106 komórek do kontroli czystości za pomocą cytometrii przepływowej. 
		UWAGA: Średnia wydajność limfocytów T śledziony wyizolowanych tą metodą wynosi ~20−25 x 106 komórek na mysz.</li>
		<li>Potwierdź wydajność wzbogacania limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej. Wybarwić 1 x 106 komórek, zachowanych z etapów 1.3.7 (przed wyczerpaniem limfocytów T) i 1.3.13 (TCD-BM po wyczerpaniu limfocytów T), następującymi przeciwciałami: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1,5) i α-CD8α (53-6,7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 1: Wstrzyknij napromieniowanym myszom limfocyty T dawcy i TCD-BM.
	<ol>
		<li>Przemyć TCD-BM i komórki T 2x PBS (800 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C). Ponownie zawiesić komórki w lodowatym PBS do wstrzyknięcia. Dostosuj stężenie komórek do 20 x 106/ml dla TCD BM i 4 x 106/ml dla limfocytów T.</li>
		<li>Podgrzej zwierzę za pomocą lampy grzewczej, aby zwiększyć widoczność obustronnych żył ogonowych. W razie potrzeby umieść mysz w ograniczniku.</li>
		<li>Oczyść powierzchnię ogona za pomocą 70% izopropanolu. Wstrzyknąć TCD-BM (5 x 106 komórek/mysz) z lub bez limfocytów T (0,75 x 106 komórek/mysz). Należy uważać, aby nie wprowadzić powietrza do strzykawki.</li>
		<li>Wyjmij igłę i przyłóż wacik antyseptyczny bezpośrednio do miejsca wstrzyknięcia 5-10 s, aby zatrzymać krwawienie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń GVHD w dniach 2-80.
	<ol>
		<li>Śledź przeżywalność zwierząt. Monitoruj objawy kliniczne GVHD dostosowane do systemu punktacji ustanowionego wcześniej przez Cooka i wsp.16 oraz masę ciała myszy biorców 2x w tygodniu. Użyj masy ciała określonej przed TBI, aby obliczyć utratę masy ciała.</li>
		<li>Zważ każdą mysz indywidualnie. Oceń utratę masy ciała w następujący sposób: ocena 0 = mniej niż 10%; ocena 1 = 10%−20%; Stopień 2 = więcej niż 20%.</li>
		<li>Oceń znak postawy biorców: ocena 0 = brak przeczucia; ocena 0,5 = lekkie zgarbienie, ale prostuje się podczas chodzenia; ocena 1 = zwierzę pozostaje zgarbione podczas chodzenia; ocena 1,5 = zwierzę nie prostuje się; ocena 2,0 = zwierzę stoi na tylnych palcach.</li>
		<li>Oceń znak mobilności odbiorców: ocena 0 = bardzo aktywna; ocena 0,5 = wolniejsza niż naiwne myszy; ocena 1,0 = porusza się tylko po szturchnięciu; ocena 1,5 = porusza się nieznacznie po szturchnięciu; ocena 2,0 = nie porusza się po szturchnięciu.</li>
		<li>Oceń skórę biorców: stopień 0 = brak otarć, zmian lub łuszczenia się; stopień 0,5 = zaczerwienienie w jednym określonym obszarze; stopień 1 = otarcie w jednym obszarze lub łagodne otarcie w dwóch obszarach; stopień 1,5 = poważne otarcia w dwóch lub więcej obszarach; stopień 2,0 = poważne otarcia, pękająca skóra, zaschnięta krew.</li>
		<li>Oceń futro biorców: ocena 0 = brak nieprawidłowych objawów; ocena 0,5 = obsiadka z boku brzucha lub karku, ocena 1,0 = obwisłość w poprzek lub z boku brzucha i szyi; ocena 1,5 = zaniedbane, skołtunione i pomarszczone futro; ocena 2,0 = źle skołtuniona sierść na brzuchu i plecach.</li>
		<li>Oceń biegunkę biorców: stopień 0 = brak biegunki; stopień 0,5 = lekki i miękki stolec; stopień 1,0 = łagodny (żółty stolec); stopień 1,5 = umiarkowany (żółty stolec z niewielką ilością krwi); stopień 2 = ciężki (jasnożółty i krwawy stolec, "wysuszone stolce" pojawiają się w okolicy odbytu).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Model kotransplantacji
<ol>
	<li>Generuj komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego (BM-DC).
	<ol>
		<li>Odizoluj szpik kostny od kości udowych i piszczelowych myszy WT lub czynnika B (fB)-/- na tle B6, jak opisano w krokach 1.2.3−1.2.4. Wiruj komórki w temperaturze 800 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Zawiesić osad w 5 ml buforu lizującego ACK w celu lizy krwinek czerwonych. Inkubować zawiesinę komórkową przez 5 minut na lodzie. Dodać 10 ml 1% RPMI do zawiesiny komórek, aby zatrzymać lizę i odwirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osady komórkowe w 10 ml pożywki hodowlanej (RPMI 1460 zawierającej 10% FBS, 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 2 mM l-glutaminy i 50 mM β-merkaptoetanolu) i dostosować objętość, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Dodać 20 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) do zawiesiny komórkowej. Hodować komórki szpiku kostnego na szalkach Petriego o wymiarach 100 x 15 mm w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 6 dni.</li>
		<li>Zastąp połowę trwających pożywek hodowlanych (około 5 ml) świeżymi pożywkami zawierającymi 40 ng/mL GM-CSF w dniu 3.</li>
		<li>Podgrzej pożywkę hodowlaną w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Zebrać około 5 ml pożywki z szalek do hodowli szpiku kostnego. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w pożywce hodowlanej o pojemności 5 ml zawierającej 40 ng/ml gm-csf.</li>
		<li>Dodać 25 μg/ml lipopolisacharydu (LPS) do pożywki w 6. dniu hodowli, aby dojrzeć BM-DC. Zapisz podwielokrotność 2 x 106 komórek, aby określić skuteczność różnicowania DC za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Zbierz dojrzałe BM-DC: Użyj podnośników komórkowych, aby delikatnie zeskrobać DC z szalek Petriego. Zebrać wszystkie zawiesiny komórek w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Odwirować przy 800 x g, przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Umyj granulki komórek 3x 50 ml lodowatego PBS. Zaoszczędź około 2 x 106 BM-DC do immunologicznej analizy fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj kotransplantację komórek dendrytycznych BMT (BMT współprzeszczepianie DC). 
	UWAGA: Użyj myszy FVB (H2kq) jako dawców komórek T i komórek BM. Napromieniać myszy biorcy B6 Ly5.1 w dawce 1 100 cGy (2 dawki, odstęp 3 godziny). Zobacz szczegóły w kroku 1.1.
	<ol>
		<li>Wyizoluj BM z kości udowych i piszczelowych myszy dawców FVB. Zobacz szczegóły w krokach 1.2.3−1.2.10. 
		UWAGA: W tym modelu należy użyć całkowitego izolowanego szpiku kostnego zamiast TCD-BM.</li>
		<li>Oczyść limfocyty T ze śledziony i węzłów chłonnych myszy dawców FVB. Szczegółowe informacje znajdują się w krokach 1.3.1-1.3.13.</li>
		<li>Wstrzyknąć BM (5 x 106 / mysz), limfocyty T (0,5 x 106 / mysz) z BM-DC (2 x 106 / mysz) w dniu 0 kursu eksperymentalnego.</li>
		<li>W 3 dniu po przeszczepieniu należy zbadać rekonstytucję DC dawcy za pomocą cytometrii przepływowej.
		<ol>
			<li>Zbierz krew z oczu biorców.</li>
			<li>Znieczulić myszy CD45.1 / Ly5.1 B6 przez 3% inhalację izofluranu. Sprawdź głębokość znieczulenia przez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.</li>
			<li>Umieść sterylną szklaną rurkę do pipety w przyśrodkowej kancie oka, skierowaną doogonowo pod kątem 30−45° od płaszczyzny nosa. Wywieraj nacisk, delikatnie obracając rurkę.</li>
			<li>Wrzuć krew do sterylnych probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml zawierających heparynę o pojemności 10 μl. Przenieś 50 μl krwi do szklanych probówek przepływowych o pojemności 5 ml.</li>
			<li>Dodać 2 ml buforu lizującego ACK. Inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 45 minut. Dodać 2 ml buforu barwiącego FACS. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
			<li>Zawiesić osady komórkowe za pomocą 200 μl buforu FACS zawierającego odpowiednie przeciwciała barwiące przepływ (żółty żywy/śmierci, α-H-2Kb, α-CD45.1, α-CD45.2, α-CD11c i α-MHCII). Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Przemyć 2x 1 ml buforu FACS. Zawiesić osady komórkowe w 200 μl buforu FACS i przeprowadzić analizę za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Modele GVHD/GVL BMT
<ol>
	<li>Wykonaj indukcję GVHD/GVL.
	<ol>
		<li>Hodowla chłoniaka z komórek B A20 transdukowanego lucyferazy w pożywkach hodowlanych RPMI.</li>
		<li>Napromieniować biorcę BARLB/c w tle WT lub Ly5.1 w dawce 700 cGy (pojedyncza dawka). Zobacz szczegóły w kroku 1.1.</li>
		<li>Odizolować TCD-BM od kości udowych i piszczelowych witaminy B6. Myszy dawcy Ly5.1. Zobacz szczegóły w krokach 1.2.1−1.2.10.</li>
		<li>Oczyść limfocyty T ze śledziony i węzłów chłonnych myszy dawcy C57BL / 6. Zobacz szczegóły w krokach 1.3.1−1.3.15.</li>
		<li>Umyj chłoniaka A20 2x 25 ml PBS. Ponownie zawiesić granulki komórek w 10 ml lodowatego PBS. Pobrać podwielokrotność zawiesiny komórkowej (10 μl) i policzyć komórki za pomocą 1% błękitu trypanowego i hemocytometru. Dostosuj stężenie komórek do 20 000 komórek/ml.</li>
		<li>Wstrzyknąć TCD-BM (5 x 106 / mysz) z lub bez limfocytów T (0,75 x 106 / mysz) i chłoniaka A20 (5 000 komórek / mysz).</li>
		<li>Monitorowanie przeżycia biorcy, objawów klinicznych GVHD i utraty masy ciała podczas kursu eksperymentalnego. Zobacz szczegóły w kroku 1.5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie bioluminescencyjne.
	<ol>
		<li>Monitoruj wzrost guza u przeszczepionego biorcy, wstrzykując myszom biorcy 4 mg D-lucyferyny. Inkubuj przez 5 minut, aby upewnić się, że lucyferyna reaguje z lucyferazy.</li>
		<li>Znieczulić mysz za pomocą 3% izofluranu w komorze obrazownika bioluminescencyjnego i obrazować biorców przez 5 minut w polu D i czasie ekspozycji 1 min.</li>
		<li>Analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Zmień skalę obrazów pseudokolorowych, aby uzyskać najlepsze wyniki. 
		UWAGA: Wszystkie obrazy muszą być w tej samej skali we wszystkich eksperymentach.</li>
		<li>Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby określić obszary zainteresowania i określić ilościowo gęstość sygnału, obliczając strumień (fotony/s) emitowany z każdego obszaru zainteresowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Shlomchik, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).</li>
<li>Appelbaum, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+cell+transplantation+as+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy.</a> Nature. 411, 385-389 (2001).</li>
<li>Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+graft-versus-host+disease+biology+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Advances in graft-versus-host disease biology and therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).</li>
<li>Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2010+report+from+the+Center+for+International+Blood+and+Marrow+Transplant+Research+%28CIBMTR%29%3A+current+uses+and+outcomes+of+hematopoietic+cell+transplants+for+blood+and+bone+marrow+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Transplantation%22%5BJournal%5D)">2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders.</a> Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).</li>
<li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+graft-versus-host+disease%3A+advances+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+%26+Mechanism%22%5BJournal%5D)">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).</li>
<li>Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+for+Preclinical+Development+of+Allogeneic+Hematopoietic+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation.</a> ILAR Journal. , ily006(2018).</li>
<li>Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+T+cell+subsets+in+lethal+graft-versus-host+disease+%28GVHD%29+directed+to+class+I+versus+class+II+H-2+differences.+II.+Protective+effects+of+L3T4%2B+cells+in+anti-class+II+GVHD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD.</a> Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).</li>
<li>Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosuppressor+and+allohelper+T+cells+in+acute+and+chronic+graft-vs-host+disease.+I.+Alloreactive+suppressor+cells+rather+than+killer+T+cells+appear+to+be+the+decisive+effector+cells+in+lethal+graft-vs.-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).</li>
<li>Lu, Y., Waller, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dichotomous+role+of+interferon-gamma+in+allogeneic+bone+marrow+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).</li>
<li>Abdollahi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+platelet-derived+growth+factor+signaling+attenuates+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li>
<li>Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+regulation+of+graft-versus-host+disease+and+graft-versus-leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia.</a> Blood. 119, 5088-5103 (2012).</li>
<li>Ullmann, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posaconazole+or+fluconazole+for+prophylaxis+in+severe+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease.</a> New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).</li>
<li>Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+specific+cell+populations+by+complement+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Depletion of specific cell populations by complement depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li>
<li>Nguyen, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+of+alloantigen-activated+T+cells+after+hematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).</li>
<li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation%3A+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li>
<li>Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+C3a+and+C5a+receptors+promote+GVHD+by+suppressing+mitophagy+in+recipient+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).</li>
<li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy.</a> Science. 342, 1417(2013).</li>
<li>Negrin, R. S., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+using+bioluminescence%3A+a+tool+for+probing+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).</li>
<li>Roy, D. C., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+vs+minor+histocompatibility+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Major vs minor histocompatibility antigens.</a> Blood. 129, 664-666 (2017).</li>
<li>Gendelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+conditioning+is+a+primary+determinant+in+modulating+the+effect+of+IL-7+on+murine+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease.</a> Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HY-Specific+Induced+Regulatory+T+Cells+Display+High+Specificity+and+Efficacy+in+the+Prevention+of+Acute+Graft-versus-Host+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease.</a> Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).</li>
<li>Zeiser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+CD30+signaling+is+critical+for+adoptively+transferred+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells+in+prevention+of+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 109, 2225-2233 (2007).</li>
<li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Wykorzystanie komórek macierzystych w celu dopasowania do konkretnej osoby jest skutecznym podejściem do leczenia zaawansowanych i opornych nowotworów18. Jednak farmaceutyki małocząsteczkowe od dawna pozostają głównym celem spersonalizowanej terapii przeciwnowotworowej. Z drugiej strony, w terapii komórkowej mnogość interakcji między dawcą a gospodarzem może mieć decydujący wpływ na wyniki leczenia, takie jak rozwój GVHD po BMT1.
Główne mysie mod...

Allogeniczne przeszczepienie krwiotwórczych komórek macierzystych (BMT) jest skuteczną terapią w leczeniu nowotworów hematologicznych1,2 poprzez efekt przeszczep kontra białaczka (GVL)3. Jednak limfocyty dawcy zawsze przeprowadzają niepożądane ataki immunologiczne na tkanki biorcy, w procesie zwanym chorobą przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD)4.
Mysie modele GVHD są skutecznym narzędziem do badania biologii GVHD i odpowiedzi GVL5. Myszy są opłacalnym modelem zwierzęcym do badań. Są one małe i skutecznie dozowane z cząsteczkami i lekami biologicznymi we wczesnych fazach rozwoju6. Myszy są idealnymi zwierzętami badawczymi do badań nad manipulacjami genetycznymi, ponieważ są genetycznie dobrze zdefiniowane, co jest idealne do badania szlaków i mechanizmów biologicznych6. Kilka mysich modeli GVHD z niedopasowanym MHC do głównych układów zgodności tkankowej (MHC) zostało dobrze ustalonych, takich jak C57BL/6 (H2b) do BALB/c (H2d) i FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)5,7. Są to szczególnie cenne modele do określenia roli poszczególnych typów komórek, genów i czynników wpływających na GVHD. Przeszczepienie od dawców rodzicielskich C57/BL/6 (H2b) do biorców z mutacjami w MHC I (B6. C-H2bm1) i/lub MHC II (B6. C-H2bm12) ujawniły, że niezgodność zarówno w MHC klasy I, jak i klasy II jest ważnym wymogiem dla rozwoju ostrej GVHD. Sugeruje to, że zarówno limfocyty T CD4+, jak i CD8+ są niezbędne do rozwoju choroby7,8. GVHD jest również zaangażowana w kaskadę zapalną znaną jako "prozapalna burza cytokinowa"9. Najczęstszą metodą kondycjonowania w modelach mysich jest napromienianie całego ciała (TBI) za pomocą promieniowania rentgenowskiego lub 137Cs. Prowadzi to do ablacji szpiku kostnego biorcy, umożliwiając w ten sposób przeszczepienie komórek macierzystych dawcy i zapobiegając odrzuceniu przeszczepu. Odbywa się to poprzez ograniczenie proliferacji limfocytów T biorcy w odpowiedzi na komórki dawcy. Ponadto różnice genetyczne odgrywają ważną rolę w indukcji choroby, która zależy również od niewielkiego niedopasowania MHC10. Dlatego dawka promieniowania mieloablacyjnego różni się w różnych szczepach myszy (np. BALB/c→C57BL/6).
Aktywacja limfocytów T dawcy przez komórki prezentujące antygen gospodarza (APC) jest niezbędna do rozwoju GVHD. Wśród APC najsilniejsze są komórki dendrytyczne (DC). Są dziedzicznie zdolne do indukowania GVHD ze względu na ich lepszy wychwyt antygenu, ekspresję cząsteczek kostymulujących limfocyty T i produkcję cytokin prozapalnych, które polaryzują limfocyty T w podzbiory patogenne. Centra biorców mają kluczowe znaczenie dla ułatwienia primingu limfocytów T i indukcji GVHD po przeszczepie11,12. W związku z tym DC stały się interesującymi celami w leczeniu GVHD12.
TBI jest wymagane do wzmocnienia wszczepienia komórek dawcy. Ze względu na efekt TBI, biorcy DC są aktywowani i przeżywają przez krótki czas po przeszczepie12. Pomimo znacznych postępów w wykorzystaniu bioluminescencji lub fluorescencji, ustanowienie skutecznego modelu do badania roli biorców DC w GVHD jest nadal wyzwaniem.
Ponieważ limfocyty T dawcy są siłą napędową aktywności GVL, strategie leczenia za pomocą leków immunosupresyjnych, takich jak sterydy, w celu stłumienia alloreaktywności limfocytów T, często powodują nawrót nowotworu lub infekcję13. W związku z tym ukierunkowanie na biorców DC może stanowić alternatywne podejście do leczenia GVHD przy jednoczesnym zachowaniu efektu GVL i uniknięciu infekcji.
W skrócie, obecne badanie dostarcza platformy do zrozumienia, w jaki sposób różne rodzaje sygnalizacji w DC biorców regulują rozwój GVHD i efekt GVL po BMT.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0 100 ml</td><td>Bufor MACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482100</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td>Bufor MACS</td></tr><tr><td>Chłoniak z komórek B A20</td><td>Uniwersytet Środkowej Florydy</td><td>W własnym</td><td>eksperymencie GVL</td></tr><tr><td>ACC1 fl/fl</td><td>Jackson Lab</td><td>30954</td><td>Eksperyment GVL</td></tr><tr><td>ACC1 fl/fl CD4cre</td><td>Uniwersytet Środkowej Florydy</td><td></td><td>Eksperyment GVL</td></tr><tr><td>Mikrokulki antybiotynowe</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td>Wzbogacanie limfocytów T</td></tr><tr><td>Anty-ludzkie/mysie CD45R (B220)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0452-85</td><td>Wzbogacanie limfocytów T Anty-mysie</td></tr><tr><td>B220 FITC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10452-85</td><td>Analiza cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Anty-mysie CD11c- AF700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>117319</td><td>Analiza cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD25 PE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-0251-82</td><td>Barwienie przepływowe</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD4 Biotyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0041-86</td><td>Wzbogacanie limfocytów</td></tr><tr><td>T Anti-Mouse CD4 eFluor&reg; 450 (Pacific Blue&reg; zamiennik)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0042-82</td><td>Barwienie przepływowe</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45.1 PE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-0900-83</td><td>Analiza cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD8a APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-0081-83</td><td>Analiza cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Anti-mysz H-2Kb PerCP-Fluor 710</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-5958-82</td><td>Analiza cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie MHC klasy II APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-5320-82</td><td>Analiza cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Anti-Mouse TER-119 Biotyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-5921-85</td><td>Wzbogacanie limfocytów T</td></tr><tr><td>Anti-Thy1.2</td><td>Bio Excel</td><td>BE0066</td><td>BM generacja</td></tr><tr><td>B6 fB-/-</td><td>myszy University of Central Florida</td><td>W domu</td><td>Odbiorcy</td></tr><tr><td>B6. Myszy Ly5.1 (CD45.1+)</td><td>Charles River</td><td>564</td><td>Dawcy</td></tr><tr><td>BALB/c myszy</td><td>Charles River</td><td>028</td><td>Biorcy przeszczepu</td></tr><tr><td>C57BL/6 myszy</td><td>Charles River</td><td>027</td><td>Dawcy/biorcy</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0112-85</td><td>Wzbogacanie limfocytów T</td></tr><tr><td>CD25-biotyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0251-82</td><td>Wzbogacanie limfocytów T</td></tr><tr><td>CD45R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0452-82</td><td>Wzbogacanie limfocytów T</td></tr><tr><td>CD49b Przeciwciało monoklonalne (DX5)-biotyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-5971-82</td><td>Wzbogacanie limfocytów</td></tr><tr><td>T Sitko do komórek 40 uM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td>Przygotowanie komórek</td></tr><tr><td>Sitko do komórek 70 uM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>Przygotowanie komórek</td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td>Obrazowanie żywych zwierząt</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Atlanta Bilogicals R& System D</td><td>D17051</td><td>Probówki</td></tr> do <tr><td>cytometrii przepływowej</td> do hodowli komórkowych <td>Fisher Scientific</td><td>352008</td><td>Analiza cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>FVB/NCrl</td><td>Charles River</td><td>207</td><td>Dawcy</td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd (LPS)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>DC dojrzała</td></tr><tr><td>kolumna LS</td><td>Mitenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Przygotowanie komórek</td></tr><tr><td>MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>Wzbogacanie limfocytów T</td></tr><tr><td>Inkubator New Brunswick Galaxy 170R</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170 R</td><td>Cell Culture</td></tr><tr><td>Penicylina + streptomycynaPenicylina / Streptomycyna (10 000 jednostek penicyliny / 10 000 mg / ml paciorkowca)</td> <td>GIBCO</td><td>15140</td><td>Media</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scienctific</td><td>11875-093</td><td>Media</td></tr><tr><td>TER119</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>13-5921-82</td><td>Wzbogacanie limfocytów T</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS-200</td><td>Perkin Elmer</td><td>Xenogen IVIS-200</td><td>Obrazowanie żywych zwierząt</td></tr><tr><td>X-RAD 320 Biologiczny naświetlacz</td><td>Precyzyjny X-RAD</td><td>X-RAD 320</td><td>Napromienianie całego ciała</td></tr></tbody></table>

platforma do przeszczepiania szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Allogeniczny przeszczep szpiku kostnego (BMT) jest skuteczną terapią nowotworów hematologicznych spowodowanych efektem przeszczep przeciwko białaczce (GVL) w celu wyeliminowania nowotworów. Jednak jego zastosowanie jest ograniczone przez rozwój choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD), która jest głównym powikłaniem BMT. GVHD jest wywoływana, gdy limfocyty T w przeszczepach dawcy rozpoznają alloantygen wyrażany przez komórki biorcy i przeprowadzają niepożądane ataki immunologiczne na zdrowe tkanki biorcy. Tak więc tradycyjne terapie mają na celu zahamowanie alloreaktywności limfocytów T dawcy. Jednak podejścia te znacznie osłabiają efekt GVL, tak że przeżycie biorcy nie ulega poprawie. Zrozumienie wpływu podejść terapeutycznych na BMT, GVL i GVHD jest zatem niezbędne. Ze względu na zdolność prezentacji antygenu i wydzielania cytokin do stymulacji limfocytów T dawcy, komórki dendrytyczne biorcy (DC) odgrywają znaczącą rolę w indukcji GVHD. W związku z tym określanie docelowe kontrolerów domeny adresatów staje się potencjalnym podejściem do kontrolowania GVHD. Praca ta zawiera opis nowatorskiej platformy BMT w celu zbadania, w jaki sposób DC gospodarza regulują odpowiedzi GVH i GVL po przeszczepie. Zaprezentowano również skuteczny model BMT do badania biologii GVHD i GVL po przeszczepie.

Główny model z dużym niedopasowaniem MHC B6 (H2kb)-BALB/C (H2kd) ściśle odpowiadał rozwojowi GVHD po transplantacji (Rycina 2). Wszystkie sześć objawów klinicznych GVHD, ustalonych wcześniej przez Cooke i współpracowników16, wystąpiło u biorców z przeszczepem limfocytów T WT-B6, ale nie u biorców z samym BM (krok 1.5), którzy stanowili grupę ujemną pod kątem GVHD. W tym modelu rozwój GVHD przebiega w dwóch fazach....

Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi jest poważnym powikłaniem po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego. Komórki dendrytyczne odgrywają kluczową rolę w patogenezie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. W niniejszym artykule opisano nowatorską platformę przeszczepu szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w rozwoju choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi i efektowi przeszczep przeciwko białaczce.

Platforma do przeszczepiania szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Ten nowatorski protokół przeszczepu szpiku kostnego może być wykorzystany do zbadania, w jaki sposób komórki dendrytyczne gospodarza regulują reakcje przeszczep przeciwko gospodarzowi i przeszczep przeciwko białaczce po przeszczepie. Regeneracja komórek ex vivo pozwala na dostosowanie tego protokołu do testowania roli innych populacji komórek odpornościowych, takich jak makrofagi i neutrofile, po prostu poprzez modyfikację warunków hodowli. Procedurę zademonstrują mi kierownik laboratorium Krystal Hossack i student Sanjeev Gurshaney.W przypadku preparatu szpiku kostnego C57BL/6 zubożonego w limfocyty T dawcy, należy pobrać kość udową i piszczelową zgodnie ze standardowymi protokołami od myszy poddanych eutanazji i przenieść kości na szalkę Petriego o średnicy 92 milimetrów zawierającą pożywkę 1% RPMI. Za pomocą nożyczek usuń końce z każdej kości i napełnij trzymililitrową strzykawkę wyposażoną w igłę o rozmiarze 26 świeżym podłożem 1% RPMI. Wprowadzić igłę do jednego końca jednej kości i nacisnąć tłok, aby wypłukać szpik kostny z jamy i do sitka do pobierania komórek.Po zebraniu całego szpiku kostnego przecedź kawałki szpiku kostnego przez filtr siatkowy o średnicy 75 mikrometrów i przenieś zawiesinę jednokomórkową do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Osadzaj komórki przez wirowanie i ponownie zawieś osad w stężeniu 20 razy 10 do sześciu komórek na mililitr w PBS uzupełnionym 0,5% BSA. Następnie dodaj 0,05 mikrograma przeciwciała THI1 na jeden razy 10 do sześciu komórek na 30-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji umyć komórki dwukrotnie 10 mililitrami lodowatego PBS i ponownie zawiesić osad w stężeniu dwa razy 10 do siedmiu komórek na mililitr w 0,5% BSA uzupełnionym 10% dopełniaczem młodego królika i 2% DNAzy w sterylnej wodzie przez 45-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przemyć komórki dwukrotnie 15 mililitrami świeżego PBS na przemycie i ponownie zawiesić osad w 20 mililitrach PBS zawierających 0,5% BSA. Połącz węzły chłonne i śledzionę w sitku porowym o wielkości 40 mikrometrów i użyj tłoka strzykawki, aby macerować tkanki przez filtry, aby uwolnić komórki.Umyj sitko i tłok pożywką RPMI uzupełnioną 1% FBS, aby zebrać wszystkie komórki i osadzać komórki przez odwirowanie. Dodaj pięć mililitrów buforu do lizy ACK do osadu komórkowego. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej zatrzymaj reakcję za pomocą pięciu mililitrów pożywki uzupełnionej 1% FBS i osadź białe krwinki przez odwirowanie.Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach buforu MACS w celu zliczenia i rozcieńczyć komórki do stężenia dwa razy 10 do ośmiu komórek na mililitr w świeżym buforze MACS. Dodaj odpowiednie stężenie przeciwciał anty-erytroidalnych, anty-granulocytowych, anty-komórek B i anty-NK-cell debili na jeden razy 10 do sześciu komórek na 15-minutową inkubację w czterech stopniach Celsjusza. Pod koniec inkubacji przemyć komórki 10 mililitrami lodowatego buforu MACS i ponownie zawiesić osad w stężeniu jeden raz od 10 do ośmiu komórek na mililitr w świeżym buforze MACS.Następnie dodaj 0,22 mikrolitra mikrogranulek antybiotyny na jeden raz 10 do sześciu komórek mieszając przez 15-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przemyć komórki 10 mililitrami lodowatego buforu MACS i zebrać niezwiązane wzbogacone limfocyty T przez separację kulek magnetycznych za pomocą separatora MACSxpress zgodnie ze standardowymi protokołami izolacji kulek. Pod koniec separacji osadź limfocyty T przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach świeżego buforu MACS do zliczenia.Aby wygenerować komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego, należy wyizolować szpik kostny z kości udowych myszy typu dzikiego lub myszy z nokautem czynnika B, jak pokazano, i poddać lizie czerwone krwinki w pięciu mililitrach buforu do lizy ACK, zatrzymując reakcję za pomocą 10 mililitrów RPMI uzupełnionych 1% FBS po pięciu minutach. Po zebraniu pełnych krwinek przez odwirowanie, ponownie zawieś osad w 10 mililitrach pożywki hodowlanej do dwa razy od 10 do szóstych komórek na mililitr stężenia i dodaj 20 nanogramów na mililitr GM-CSF do komórek przed wysianiem 10 mililitrów komórek na poszczególne szalki Petriego o wymiarach 100 na 15 milimetrów w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez sześć dni. Szóstego dnia aktywuj hodowle komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego za pomocą 25 mikrogramów na mililitr LPS na płytkę.Co najmniej 85% hodowanych komórek szpiku kostnego różnicuje się w komórki dendrytyczne. Czystość limfocytów T po wzbogaceniu kulkami magnetycznymi wynosi 90%Główny niedopasowany model MHC C57BL/6 BALB/c ściśle odpowiada rozwojowi GVHD po przeszczepie. Szczyt nasilenia występuje około 11 dni po przeniesieniu komórek, po czym następuje zmniejszenie wyników klinicznych i powrót do masy ciała do 16 dnia.Biorcy jednolicie ulegali GVHD od 30 do 40 dni po przeszczepie. Co ciekawe, przeszczep komórek dendrytycznych z nokautem czynnika B poprawia przeżycie biorcy i wyniki kliniczne GVHD. Chłoniak B z komórek B transdukowany lucyferazą umożliwia monitorowanie wzrostu guza u żywych zwierząt.W tym reprezentatywnym eksperymencie wszyscy biorcy dzikiego typu BALB/c, którzy otrzymali sam szpik kostny plus A20, zmarli z powodu nawrotu nowotworu. Biorcy BALB/c typu dzikiego, którym przeszczepiono limfocyty T dawcy zubożone w szpik kostny i ACC1, zmarli z powodu GVHD. Ponadto zwierzęta, które otrzymały szpik kostny dawcy i limfocyty T zubożone w ACC1, zmarły zarówno z powodu GVHD, jak i nawrotu nowotworu.Aby wytworzyć wystarczającą ilość komórek szpiku kostnego, pobrane kości piszczelowe i udowe muszą być całkowicie wolne od tkanki mięśniowej przed korekcją szpiku kostnego. Ujemne oczyszczanie komórek szpiku kostnego za pomocą biotynylazy anty-CD3 i mikrogranulek antybiotyny może być również przeprowadzone w celu zubożenia limfocytów ze szpiku kostnego.

bone-marrow-transplantation-platform-to-investigate-role-dendritic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejsza praca opisuje prostą technikę indukowania anergii specyficznej dla alloantygenów w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej. Technikę tę można zastosować klinicznie w celu generowania niealloreaktywnych komórek dawcy. Infuzja tych komórek mogłaby poprawić rekonstrukcję immunologiczną i zmniejszyć toksyczność po allogenicznej transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych.

Indukcja anergii specyficznej dla alloantygenu w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej poprzez stymulację alloantygenem z blokadą sygnału kostymulującego

Przeszczepianie szpiku kostnego u myszy jest powszechnie stosowaną techniką badania mechanizmów immunologicznych sterujących chorobą przeszczep przeciw gospodarzowi u ludzi. Możliwość monitorowania wzorców migracji limfocytów T in vivo pozwala na szczegółową analizę rozwoju i utrwalania odpowiedzi limfocytów T podczas choroby przeszczep przeciw gospodarzowi.

Indukcja choroby przeszczep przeciw gospodarzowi i monitorowanie limfocytów T in vivo z wykorzystaniem modelu mysiego dopasowanego pod kątem MHC

Przeszczep szpiku kostnego umożliwia zmianę genotypu komórek pochodzących ze szpiku. Jeśli interesujący nas gen jest ekspresowany zarówno w komórkach pochodzących ze szpiku, jak i w komórkach niepochodzących ze szpiku, przeszczep szpiku kostnego pozwala na zmianę genotypu komórek pochodzących ze szpiku bez zmiany genotypu komórek niepochodzących ze szpiku.

Różnicowanie funkcjonalnych ról ekspresji genów w komórkach immunologicznych i nieimmunologicznych w zapaleniu jelita grubego u myszy za pomocą transplantacji szpiku kostnego

Ten film opisuje protokół generowania komórek dendrytycznych - kluczowych komórek prezentujących antygen, które aktywują limfocyty T - ze szpiku kostnego dorosłej myszy.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego: metoda generowania komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Ten film demonstruje indukcję choroby jelitowej przeszczep przeciwko gospodarzowi, GvHD, u śmiertelnie napromieniowanej myszy biorcy przy użyciu allogenicznych hematopoetycznych komórek macierzystych i indukujących GvHD alloreaktywnych limfocytów T indukujących śledzionę. Protokół ten pomaga w ustaleniu modelu ciężkiej ostrej choroby jelitowej GvHD, aby zrozumieć mechanizm choroby i opracować innowacyjne opcje terapeutyczne.

Indukcja choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w modelach mysich za pomocą allogenicznego przeszczepu szpiku kostnego i komórek śledziony

Tutaj prezentujemy protokół indukcji tolerancji w transplantacji i oceniamy in vitro i in vivo zdolność tłumienia różnych podzbiorów komórek od biorcy oraz status immunologiczny biorcy wobec dawcy lub egzogennych antygenów.

Ocena in vitro i in vivo aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów

Tutaj prezentujemy protokół, który opisuje allogeniczny przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych i umożliwia powtarzalne mini-endoskopowe oceny dystalnej części jelita grubego in situ pod kątem obecności, cech i ciężkości zapalenia jelita grubego u żywych myszy cierpiących na chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi jelit.

Indukcja choroby przeszczep jelitowy przeciwko gospodarzowi i jej miniendoskopowa ocena u żywych myszy

Tutaj prezentujemy protokół do wywoływania i oceniania choroby w modelu xenoGVHD (xenoGVHD) ksenogenicznej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. xenoGVHD dostarcza model in vivo do badania immunosupresji ludzkich limfocytów T. Dodatkowo opisujemy, jak wykrywać ludzkie limfocyty T w tkankach za pomocą cyfrowego PCR jako narzędzia do ilościowego określania immunosupresji.

Indukcja i ocena choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w ksenogenicznym mysim modelu i kwantyfikacja ludzkich limfocytów T w tkankach myszy przy użyciu cyfrowego PCR

Opisujemy ludzką komórkę jednojądrzastą krwi obwodowej (PBMC) — humanizowany model myszy ksenoprzeszczepu do translacyjnych badań immunoonkologicznych. Protokół ten może służyć jako ogólna wskazówka do ustanawiania i charakteryzowania podobnych modeli oceny terapii I-O.

Humanizowany model ksenoprzeszczepu z ludzkimi komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC) do badań immunoonkologicznych translacyjnych (I-O)

Opisujemy trzy metody przeszczepu szpiku kostnego (BMT): BMT z napromienianiem całego ciała, BMT z napromienianiem ekranowanym oraz metoda BMT bez wstępnego kondycjonowania (adoptywna BMT) do badania hematopoezy klonalnej w modelach mysich.

Procedury przeszczepu szpiku kostnego u myszy w celu zbadania hematopoezy klonalnej

Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Poznaj platformę przeszczepu szpiku kostnego służącą do badania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi. Metoda pozwala analizować odpowiedzi immunologiczne po transplantacji.

Platforma do przeszczepiania szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi (Wideo) | JoVE Journal

Platforma do przeszczepiania szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi

Przeglądaj więcej filmów