Indukowana światłem adsorpcja molekularna białek z wykorzystaniem systemu PRIMO do mikrowzorcowania w celu zbadania odpowiedzi komórek na białka macierzy zewnątrzkomórkowej

Mikrowzorce są bardzo potężnym narzędziem, ponieważ pozwalają badać reakcje komórkowe w celu zdefiniowania sygnałów biochemicznych i biofizycznych, które komórki napotykają w organizmach żywych. W przeciwieństwie do innych metod, opisana metoda jest bardziej elastyczna w generowaniu wzorców. Na przykład umożliwia tworzenie gradientów i mikrowzorów wielu białek o wysokiej odtwarzalności.

Nasza grupa wykorzystuje LIMAP nie tylko do badania odnajdywania ścieżek neuronalnych, ale także do badania tego, jak inne komórki reagują na sygnały, które mają wpływ na proliferację, różnicowanie i migrację komórek. Mikrowzorce służą do udzielania odpowiedzi na podstawowe pytania w biologii komórki. Zdobyta wiedza może być wykorzystana do modyfikacji istniejących urządzeń w medycynie regeneracyjnej, na przykład naprawy nerwów po uszkodzeniu nerwów obwodowych.

Zacznij od zaprojektowania szablonów do tworzenia wzorów w oprogramowaniu do rysowania cyfrowego. Wybierz rozmiar obrazu o długości 1 824 pikseli i szerokości 1 140 pikseli. Zaprojektuj szablon i zapisz go jako 8-bitowy plik TIFF.

Przed przystąpieniem do modelowania należy oczyścić i aktywować powierzchnię za pomocą myjki plazmowej przy użyciu ciśnienia procesowego od 1 000 do 1 300 militorów i mocy 29,6 wata przez jedną do pięciu minut. Użyj naczynia ze szklanym dnem o 20-milimetrowym rozmiarze dołu wewnętrznym i grubości szkła od 0,16 do 0,19 milimetra. Wybierz naczynie sześciodołkowe lub jednodołkowe, w zależności od liczby badanych warunków.

Wytnij szablony PDMS w sterylnych warunkach, aby upewnić się, że zmieszczą się w wewnętrznej studni ze szklanym dnem. Usuń wewnętrzne wypełnienia mikrostudzienki za pomocą sterylnych kleszczyków i przyklej szablony do szklanej studzienki. Przygotuj roztwór PLL-PEG o stężeniu 0,1 miligrama na mililitr w PBS i dodaj 20 mikrolitrów do każdej mikrostudzienki.

Następnie inkubuj naczynie w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po inkubacji usuń 15 mikrolitrów PLL-PEG z każdej studzienki i umyj ją pięć razy 20 mikrolitrami PBS, nie dopuszczając do wyschnięcia. Przygotuj jedną mikrostudzienkę, aby utworzyć wzór odniesienia, usuwając 18 mikrolitrów PBS z pojedynczej studzienki i dodając pięć mikrolitrów fotoinicjatora, pozostawiając PBS w pozostałych mikrostudzienkach.

Następnie użyj fluorescencyjnego zakreślacza, aby dobrze zaznaczyć pustą szklankę wewnętrzną. Umieść studnię nad obiektywem i dostosuj ostrość obiektywu, aż logo PRIMO i slogan zadbają o twoje komórki. Następnie zapisz pozycję Z płaszczyzny ogniskowej.

Aby utworzyć wzór odniesienia, zwizualizuj krawędź mikrostudzienki za pomocą fotoinicjatora, wykorzystując światło przepuszczane przez kamerę, a następnie wybierz symbol ROI z menu po prawej stronie. Wybierz PRIMO, aby przesłać żądany szablon wzorca, który będzie rzutowany na ROI jako jednostka projektowa. Przejdź do peryferyjnego obszaru mikrostudzienki, wybierz Zablokuj i ustaw ostrość na pozycję Z kalibracji.

Następnie wybierz opcję Odtwórz, aby rozpocząć tworzenie fotowzoru referencyjnego. Umyj mikrostudzienkę wzorca referencyjnego trzykrotnie 20 mikrolitrami PBS w celu usunięcia fotoinicjatora. Następnie dodaj 20 mikrolitrów znakowanego fluorescencyjnie roztworu białka macierzy zewnątrzkomórkowej lub ECM.

Inkubuj naczynie w temperaturze pokojowej przez 10 do 20 minut, upewniając się, że dobrze chronisz odniesienie przed światłem. Po inkubacji usuń 18 mikrolitrów roztworu białkowego i umyj studzienkę trzykrotnie 20 mikrolitrami PBS. Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego, aby zwizualizować wzór odniesienia.

Dostosuj ostrość na krawędziach wzoru na ścieżce kamery i zapisz pozycję Z zgodnie z najlepszą ostrością. Ta pozycja będzie optymalnym ogniskiem lasera używanym do późniejszego modelowania. W sterylnych warunkach usuń 18 mikrolitrów PBS ze wszystkich mikrostudzienek.

Dodaj pięć mikrolitrów fotoinicjatora do każdej studzienki i homogenizuj, pipetując w górę iw dół. W przypadku modelowania wielu białek w tej samej mikrostudzince, prześlij jednocześnie wszystkie zestawy pożądanych szablonów wzorców. Następnie wybierz liczbę wierszy, kolumn i dawkę.

Zapisz konfigurację szablonu jako plik w oprogramowaniu. Przejdź do obszaru, w którym został utworzony wzorzec odniesienia, i ustaw ostrość do optymalnej pozycji Z. Następnie wybierz opcję Odtwórz, aby zainicjować tworzenie fotowzorów.

Jednostki projektowe zmieniają kolor z czerwonego na niebieski po zakończeniu tworzenia fotowzorów. Wyjmij fotoinicjator z mikrostudzienek, myjąc je trzykrotnie 20 mikrolitrami PBS. Po ostatnim myciu usuń 18 mikrolitrów PBS z każdej mikrostudzienki i dodaj 20 mikrolitrów roztworu białka ECM.

Inkubuj naczynie w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut, chroniąc je przed światłem. Następnie usuń 15 mikrolitrów roztworu białka ECM i umyj mikrostudzienki trzykrotnie za pomocą 20 mikrolitrów PBS. Aby zapobiec wiązaniu krzyżowemu, dodaj 20 mikrolitrów PLL-PEG lub BSA do mikrodołków i inkubuj naczynie w temperaturze pokojowej przez godzinę, w ciemności.

Następnie usuń 15 mikrolitrów środka blokującego i umyj wszystkie mikrostudzienki trzykrotnie 20 mikrolitrami PBS. Usuń 18 mikrolitrów PBS i dodaj 5 mikrolitrów fotoinicjatora do każdej mikrostudzienki, upewniając się, że fotoinicjator jest jednorodny na całej powierzchni mikrostudzienek. Przejdź do pierwszej mikrostudzienki i załaduj zapisaną wcześniej konfigurację szablonu.

Następnie wybierz działania, które mają być wzorowane w drugiej rundzie fotowzorcowania, upewniając się, że odznaczyłeś działania z pierwszej rundy. Po fotopatterningu usuń PLPP, myjąc PBS. Następnie inkubować przez 20 minut z drugim roztworem białka ECM i przemyć mikrostudzienki trzykrotnie 20 mikrolitrami PBS.

Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego, aby zwizualizować i zobrazować wydrukowane wzory. Gdy będziesz gotowy do płytki komórek, dodaj jeden mililitr pożywki z komórkami do wewnętrznej szklanej studzienki, upewniając się, że pokryłeś wszystkie mikrodołki. I umieść naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

W celu zapewnienia, że wygenerowane wzory są dokładnym odwzorowaniem szablonu, pomiary intensywności fluorescencji są uzyskiwane wzdłuż pasków oraz z odpowiedniego obszaru tła nad każdym paskiem. Powtarzalne, zdefiniowane mikrowzory uzyskuje się o szerokości od 20 do 2 mikrometrów, ale efekt krawędzi można zaobserwować przy drukowaniu elementów o grubości 20 mikrometrów lub szerszej. Określone stężenia białka uzyskuje się albo przez inkubację z różnymi stężeniami białka, albo przez zmianę dawki lasera, która jest używana do rozszczepiania filmu antyadhezyjnego.

Natężenie lasera jest proporcjonalne do poziomu skali szarości szablonu, generując gradienty oświetlenia UV. Pomiar profilu intensywności fluorescencji wzdłuż paska gradientu jest liniowy w szablonie wzoru oraz w wygenerowanym wzorze gradientu. Protokół ten może być stosowany do tworzenia mikrowzorów z wieloma białkami w tej samej mikrostudzince, takich jak wzory krzyżowe z poziomymi paskami fibronektyny i pionowymi paskami lamininy.

Ale etap blokujący jest konieczny, aby zapobiec wiązaniu krzyżowemu białek. Wygenerowane wzorce krzyżowe można następnie wykorzystać do testów komórkowych z liniami komórek neuronalnych lub komórkami CAD lub neuronami pierwotnymi, DRG szczurów. Podczas wykonywania tego protokołu najważniejszymi aspektami, o których należy pamiętać, są wykonanie prawidłowej kalibracji systemu, niedopuszczenie do wyschnięcia mikrostudzienek podczas wielu etapów mycia oraz użycie odpowiednich parametrów do inkubacji i blokowania białek.

Analiza zachowania komórek zazwyczaj obejmuje mikroskopię, taką jak fluorescencja, film poklatkowy, AFM. Dalsza charakterystyka może obejmować inne metody biochemiczne, takie jak profilowanie ekspresji genów.