Jednostki wiążące SUMO (SUBE) jako narzędzia do wzbogacania, izolacji, identyfikacji i charakterystyki proteomu SUMO w raku wątroby

Jednostki wiążące SUMO umożliwiają izolację endogennych białek SUMOylowanych in vivo. Jest to dość trudne ze względu na obecność aktywnej proteazy specyficznej dla SUMO i niskie frakcje białek SUMOylowanych in vivo. Izolacja proteomu SUMOylowanego za pomocą jednostek wiążących SUMO jest korzystna, ponieważ opóźnia wzrost ogólnego powinowactwa do substratów SUMO.

Wynika to z faktu, że SUBE są powszechne w białkach, które składają się z tandemowych powtórzeń SIM, rozpoznając w ten sposób specyficznie cząsteczki SUMO na zmodyfikowanych białkach. Zastosowanie jednostek wiążących SUMO do izolacji i charakterystyki proteomu SUMOylowanego w raku wątroby jest szybką i czułą metodą. Dostarcza on wcześniejszych informacji na temat raczej nieznanej roli szlaku SUMOylacji w raku wątroby w potencjalnym podejściu terapeutycznym.

Jednostki wiążące SUMO mogą być używane do izolowania i charakteryzowania proteomu SUMOylowanego w innych tkankach poza wątrobą, zarówno z próbek ludzkich, jak i modeli zwierzęcych, a także w kilku modelach komórkowych. Chociaż technika ta jest łatwa do wykonania, należy zachować ostrożność podczas analizowania kilku próbek tego samego typu. chłodniejsza kostka do kilku wymaganych kroków.

Dlatego zalecamy staranne wyrównanie probówek przed rozpoczęciem tego eksperymentu. Wizualna demonstracja użycia jednostek wiążących SUMO ułatwia rewolucję tego protokołu, szczególnie ze względu na trudności w obsłudze bitów i utratę materiału podczas protokołu. Ludzkie komórki wątrobiaka zostały wcześniej przygotowane przez posiew komórek na płytkach P100 o gęstości od 1,2 do 1,5 miliona komórek na miskę i utrzymanie ich w standardowej pożywce wzrostowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Gdy komórki są gotowe do użycia, odessać pożywkę z płytek i umyć je pięciomilimetrowym sterylnym PBS. Umieść płytkę na lodzie i dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy uzupełnionego zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Następnie użyj skrobaka do komórek, aby delikatnie zeskrobać komórki z dna płytki do pożywki do lizy.

Alternatywnie, zbierz komórki przez trypsynizację i dodaj jeden mililitr trypsyny-EDTA do płytki, upewniając się, że komórki są pokryte. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut, aby umożliwić im odłączenie się od płytki, a następnie dodaj dwa mililitry wstępnie podgrzanej pożywki, aby zatrzymać trypsynizację. Odwirować komórki w temperaturze 150 razy G przez 10 minut i odessać supernatant.

Następnie umyj komórki PBS i wiruj przez kolejne 10 minut. Odessać supernatant i dodać 500 mikrolitrów buforu do lizy. Odwirować komórki lizy w temperaturze 15000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, a następnie przenieść supernatanty do świeżej probówki i wyrzucić osad.

Gdy będziesz gotowy do użycia zebranych wątrób myszy, homogenizuj 75 miligramów świeżych lub pękniętych zamrożonych fragmentów w jednym mililitrze lodowatego buforu do lizy. Uruchom homogenizator zgodnie ze wskazówkami zawartymi w manuskrypcie. Po homogenizacji tkanek odwirować próbki w temperaturze 15000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.

Przenieść supernatant do świeżej probówki i wyrzucić osad. Przygotuj kulki glutationowe, dodając jeden mililitr zdejonizowanej wody do 70 miligramów kulek i odtwarzając je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po spęcznieniu umyj kulki trzykrotnie 10 mililitrami wody dejonizowanej lub PBS, odwirowując przy 300 razy G przez pięć minut po każdym myciu.

Po praniu ponownie zawiesić kulki w jednym mililitrze PBS, aby uzyskać 50% zawiesiny dla każdej próbki przy 100 mikrogramach GST-SUBEs lub kontroli GST do 100 mikrolitrów zawiesiny kulek glutationu i 500 mikrolitrów PBS. Inkubować mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny podczas obracania, a następnie odzyskać kulki przez odwirowanie w temperaturze 300 razy G przez pięć minut i ponownie zawiesić je w PBS. Weź 10% wcześniej przygotowanego lizatu komórkowego i rozcieńcz go w równej objętości 3X wrzącego buforu.

Dodać 450 mikrolitrów oczyszczonego lizatu do 100 mikrolitrów zawiesiny z kulek glutationu. Inkubuj lizat z kulkami w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny, powoli obracając się. Po inkubacji wirować kulki z prędkością 300 razy G przez pięć minut i zebrać supernatant do analizy.

Przenieś 10% całkowitej objętości do oddzielnej probówki i dodaj równą objętość 3X wrzącego buforu. Umyj pozostałą próbkę trzy razy, dodając jeden mililitr lodowatego PBS z 05%Tween 20 i obracając ją w temperaturze 300 razy G i czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę. Ostrożnie odessać supernatant, upewniając się, że nie pozostał żaden płyn.

Następnie eluować próbkę za pomocą 15 mikrolitrów 3-krotnie wrzącego buforu i 15 mikrolitrów buforu do lizy. Przeprowadź analizę western blot zgodnie ze wskazówkami rękopisu. W przypadku wykonywania spektrometrii mas należy odsolić peptydy za pomocą mikrokolumn C18 z końcówką etapową i ponownie zawiesić je w 0,1% kwasie mrówkowym przed analizą.

Załaduj próbki do systemu LC-MS i przeanalizuj je w trzech egzemplarzach. Kontynuuj identyfikację białek i obliczanie obfitości za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Wykonaj analizę statystyczną zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.

Protokół ten został wykorzystany do wyizolowania białek SUMOylowanych u myszy z niedoborem N-metylotransferazy glicyny, który powoduje spontaniczny rozwój raka wątroby i ich dzikich rodzeństwa. Barwienie Puckiem S przeprowadzono na frakcjach wejściowych, przepływowych i ZWIĄZANYCH z testem ściąganym SUBEs. Analiza Western blot LKB1 wychwyconego za pomocą SUBE pokazuje, że poziomy SUMOylacji LKB1 są zwiększone w guzach wątroby.

Ludzkie komórki wątrobiaka i nieprzekształcone komórki nabłonka wątroby wykorzystano do zbadania zdolności pułapki SUMO do interakcji z naturalnie SUMOylowanymi białkami. Po pierwsze, konwencjonalne barwienie białek wykorzystano do wizualizacji całego materiału wychwyconego za pomocą SUBE. Następnie spektrometria mas wykazała, że 742 białka zostały wzbogacone w próbce SUBEs komórki wątroby, a 577 zostało wzbogaconych w próbce SUBEs nieprzekształconej komórki nabłonka wątroby.

Podczas wykonywania eksperymentów z SUBE ważne jest, aby utrzymywać komórki i tkanki na lodzie i dodawać określone mililitry do buforu do lizy w celu utrzymania czystości SUMOylated. Po wizualizacji proteomu SUMOylowanego za pomocą SUBE, możemy znaleźć charakterystykę za pomocą analizy western blot lub spektrometrii mas. Zastosowanie SUBE do izolacji i charakterystyki proteomu SUMOylowanego w tkankach raka wątroby i komórkach wątrobiaka toruje drogę do zbadania roli modyfikacji potranslacyjnych SUMO w raku wątroby, które mogą stanowić potencjalny mechanizm terapeutyczny.