Name: Mysi model chirurgiczny miejscowego tętniaka aorty piersiowej wywołanego elastazą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: Poznaj chirurgiczną metodę wywoływania tętniaka aorty piersiowej u myszy C57BL/6 za pomocą elastazy trzustkowej. Protokół zapewnia powtarzalne wyniki i bezpieczny dostęp do klatki piersiowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty AHA Scientist Development Grant 14SDG18730000 (M.S.), NIH K08 HL098560 (G.A.) i RO1 HL081629 (G.R.U.). Projekt ten był wspierany przez Thoracic Surgery Foundation for Research and Education (TSFRE) Research Grant (kierownik projektu: G. Ailawadi). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one poglądy NHLBI lub TSFRE. Dziękujemy Anthony'emu Herringowi i Cindy Dodson za ich wiedzę i wiedzę techniczną.

Protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Wirginijskiego (nr 3634).
1. Indukcja znieczulenia i intubacja
<ol>
	<li>Umieść samca myszy C57BL/6 w wieku 8-10 tygodni w zamkniętej komorze z ciągłym przepływem mieszaniny 5% izofluranu i tlenu przez 5 min, aż do widocznego spowolnienia oddechów. 
	UWAGA: W zależności od protokołu eksperymentalnego można zastosować różne szczepy, płcie i wiek myszy. Samice mogą być trudniejsze do intubacji ze względu na mniejszy rozmiar i w konsekwencji węższe drogi oddechowe.</li>
	<li>Przeprowadź intubację myszy zgodnie z opisem Vandivorta i wsp.13. 
	UWAGA: Etap intubacji jest najtrudniejszą częścią tego modelu, zarówno pod kątem nauki, jak i wykonania. Powyżsi autorzy w swoim materiale wideo w doskonały sposób wyjaśniają poszczególne kroki.</li>
</ol>
2. Mocowanie myszy do stołu operacyjnego
<ol>
	<li>Podłącz rurkę endotrachealną (ET), potwierdź unoszenie się klatki piersiowej i ułóż mysz w pozycji bocznej prawej. Ustaw stężenie izofluranu na około 3% i nałóż środek nawilżający do obu oczu. Respirator powinien być ustawiony tak, aby zapewnić około 200 oddechów na minutę oraz objętość tidalną 225 µL. 
	UWAGA: Toksyczność pojawia się szybko, jeśli stężenie izofluranu pozostanie na poziomie 5%. Ponieważ reakcja na izofluran jest zmienna, należy miareczkować przepływ środka anestetycznego w taki sposób, aby spontaniczne skurcze przepony występowały mniej więcej co 10-20 s, a utlenowanie wydawało się odpowiednie po oględzinach błon śluzowych i odsłoniętych tkanek.</li>
	<li>Przymocuj rurkę ET do podkładki za pomocą taśmy. Wyprostuj prawą przednią kończynę w kierunku rostralnym, tak aby łapa znajdowała się w linii z nosem, i zabezpiecz ją taśmą.</li>
	<li>Odciągnij ogon w kierunku kaudalnym, aby stworzyć linię napięcia między prawą kończyną a ogonem, co spowoduje wyprostowanie kręgosłupa. 
	UWAGA: Zabezpieczenie ogona i prawej łapy w jednej linii zapobiega zbyt głębokiemu wprowadzeniu lub wysunięciu się rurki ET.</li>
	<li>Przymocuj taśmą lewą tylną kończynę w jej naturalnej pozycji. Odsuń lewą przednią kończynę w kierunku ventralnym na zwiniętą gazę i przymocuj ją taśmą.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do operacji
<ol>
	<li>Ogolić lewy bok myszy za pomocą strzygarki elektrycznej, od lewego barku do lewego brzucha.</li>
	<li>Za pomocą aplikatora z wacikiem nanieść roztwór betadyny na miejsce operacji. Użyć nowego aplikatora z wacikiem, aby nanieść 70% etanol na miejsce operacji. Pozostawić do wyschnięcia. Założyć sterylną obłożkę.</li>
	<li>OSTRZEŻENIE: Przed kontynuacją należy upewnić się, że cały etanol całkowicie odparował, ponieważ stosowana jest elektrokoagulacja, która może spowodować zapłon etanolu.</li>
</ol>
4. Wprowadzenie do klatki piersiowej
<ol>
	<li>Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonać nacięcie boczne o długości 1 cm w połowie klatki piersiowej. Użyć ręcznego elektrokoagulatora do rozdzielenia warstw mięśniowych, aż do momentu odsłonięcia żeber.</li>
	<li>Bezpośrednio wypalić fragment żebra o szerokości 2 mm. 
	UWAGA: Podczas stosowania elektrokoagulacji żebra należy obserwować częstotliwość oddechów spontanicznych. Jeśli u myszy wystąpi skurcz przepony podczas kauteryzacji, końcówka urządzenia może wniknąć do klatki piersiowej i przebić płuco, co w tym modelu zazwyczaj kończy się śmiercią zwierzęcia.</li>
	<li>Używając zwilżonego, cienkiego aplikatora z bawełnianą końcówką w przestrzeni międzyżebrowej powyżej wypalonego fragmentu, obracać końcówką na tkance, aby przedostać się do jamy opłucnej. Umieścić w klatce piersiowej zwilżoną gąbkę o wymiarach 3 mm x 2 mm, aby wspomóc zapadnięcie się płuca. 
	UWAGA: Do kontaktu z płucem należy dopuścić wyłącznie miękkie, wilgotne gąbki, ponieważ organ ten jest niezwykle delikatny.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek przeciąć tkankę wzdłuż górnej krawędzi wypalonego żebra, aż do momentu odsłonięcia przepony.</li>
</ol>
5. Ekspozycja aorty
<ol>
	<li>Umieść rozieracze żeber i użyj ich do otwarcia nacięcia torakotomii. Ostrożnie usuń gąbkę z powierzchni płuca.</li>
	<li>Umieść zwilżoną gąbkę o wymiarach 6 mm x 4 mm tak, aby pokrywała płuco, a jej końce były skierowane w stronę rostralną i kaudalną. Umieść (szeroki, płaski) rozieracz płuc na gąbce i delikatnie przesuń go brzusznie, aż zostanie odsłonięta zstępująca aorta piersiowa.</li>
	<li>Użyj pęsety nr 7, aby oddzielić tkankę łączną i tłuszcz od aorty na odcinku około 5 mm. 
	UWAGA: W poprzek aorty mogą przebiegać małe żyły; należy unikać ich przerwania podczas preparacji (użycie powiększenia co najmniej 14x może pomóc uniknąć tego powikłania).</li>
</ol>
6. Ekspozycja na elastazę
<ol>
	<li>Nasyć gąbkę o wymiarach 0,5 mm x 1 mm 12 μL elastazy trzustkowej świni i umieść ją na odsłoniętej powierzchni aorty. 
	UWAGA: Nie dopuść do tego, aby gąbka dotknęła przeciwległego płuca.</li>
	<li>Po upływie ustalonego czasu (zazwyczaj 3-5 min) usuń gąbkę z elastazą za pomocą pęsety nr 7. Usuń retraktor płuca. Przepłucz jamę klatki piersiowej 1 mL sterylnej soli fizjologicznej. 
	UWAGA: Usuń retraktor płuca przed płukaniem solą fizjologiczną, ponieważ pozwoli to gąbce do płuc nasiąknąć i zmiękczyć, co ułatwi jej usunięcie z powierzchni płuca.</li>
	<li>Użyj zwiniętej gazy o wymiarach 2" x 2", aby wchłonąć pozostałą sól fizjologiczną z płukania. Zmniejsz stężenie izofluranu do 2%.</li>
</ol>
7. Zamknięcie klatki piersiowej
<ol>
	<li>Usuń gąbkę z płuca. Usuń tylny retraktor płuca. Usuń przedni retraktor płuca.</li>
	<li>Zastosuj 3 przerzerwane szwy niewchłanialne 6-0 w celu zbliżenia żeber; zawiąż luźny węzeł na każdym z nich, ale nie zaciśnij go. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie dotknąć płuca igłą chirurgiczną.</li>
	<li>Ponownie napowietrz płuco, zamykając rurkę odpływową w respiratorze lub szybko wtłaczając 0,5-1,0 mL powietrza przez rurkę endotrachealną (ET) za pomocą kurka trójdrożnego. 
	UWAGA: Aby uniknąć urazu ciśnieniowego (barotraumy), unikaj nadmiernego używania strzykawki z powietrzem i nie wstrzykuj więcej niż 1,0 mL powietrza.</li>
	<li>Zaciśnij szwy niewchłanialne. Zbliż warstwy mięśniowe, stosując ciągły szew wieloniciowy wchłanialny 5-0. Zmniejsz stężenie izofluranu do 1%.</li>
	<li>Zamknij skórę, stosując 7-10 przerwanych szwów niewchłanialnych 5-0. Wyłącz podawanie izofluranu (0%).</li>
</ol>
8. Regeneracja
<ol>
	<li>Podaj podskórnie 6 µg (0,02 mL zawiesiny o stężeniu 0,3 mg/mL) buprenorfiny. Usuń taśmę z prawej łapy, ogona i lewej przedniej łapy, a następnie z prawej przedniej łapy.</li>
	<li>Gdy mysz zacznie poruszać kończynami, przeprowadź ekstubację, delikatnie pociągając za ogon, aby wysunęła się rurka intubacyjna (ET). Umieść zwierzę w pozycji grzbietnej w komorze grzewczej o wysokiej zawartości tlenu. 
	UWAGA: Myszy można bezpiecznie przenieść z komory tlenowej do klatki, gdy będą w stanie samodzielnie obrócić się do normalnej pozycji stojącej. Ponadto w ciągu pierwszych 24–48 godzin po operacji należy często monitorować myszy pod kątem objawów bólu, stresu lub braku przyrostu masy ciała i w razie potrzeby podawać dodatkowe leki przeciwbólowe lub miękką karmę.</li>
</ol>
9. Odsłonięcie tętniaka aorty (procedura końcowego pobrania organów)
UWAGA: Zasadniczo pobieranie tkanek przeprowadza się w 14. dniu, ponieważ jest to okres maksymalnego rozszerzenia. Jednak w zależności od eksperymentu, procedurę pobierania można przeprowadzić w dowolnym czasie między 3. dniem a ponad 4. tygodniem.
<ol>
	<li>Przeprowadź intubację i unieruchom mysz w polu operacyjnym zgodnie z powyższym opisem (sekcje 1-3). Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej od lewego boku do centralnej części brzucha, uważając, aby nie przebić otrzewnej.</li>
	<li>Nacinaj skórę od grzbietowej części lewego boku w kierunku rostralnym do poziomu lewego barku. Następnie wykonaj nacięcie pod kątem 90° przez pachę do mostka. 
	UWAGA: Nacięcie to powinno całkowicie otaczać pierwotne nacięcie skóry.</li>
	<li>Za pomocą kauteryzatora odpreparuj płat skóry w kierunku brzusznej strony myszy, odsłaniając lewą połowę klatki piersiowej. Użyj nożyczek, aby dostać się do jamy brzusznej i naciąć wzdłuż lewego brzegu żebrowego od strony brzusznej do grzbietowej, aby odsłonić dolną powierzchnię lewej przepony. Może dojść do otwarcia najbardziej bocznej krawędzi przepony, co jest pożądanym efektem.</li>
	<li>Jeśli nie stało się to w poprzednim kroku, nacinaj przeponę na jej najbardziej bocznej krawędzi. Umieść końcówkę kauteryzatora w tym otworze i wypal przeponę od brzegu żebrowego do wyrostka mieczowatego. Używając wilgotnego aplikatora z bawełnianą końcówką o cienkim czubku, delikatnie uwolnij płuco z zrostów ze ścianą klatki piersiowej i przesuń je w kierunku przyśrodkowym. 
	UWAGA: Jeśli zrosty nie oddzielają się łatwo od ściany klatki piersiowej, użyj kauteryzatora do ich usunięcia; pomaga to uniknąć przerwania tkanki płucnej, co może spowodować silne krwawienie.</li>
	<li>Wypal wnętrze ściany klatki piersiowej od pierwszego żebra do brzegu żebrowego, grzbietowo od linii środkowej pachowej, zachowując odległość co najmniej 2 mm od aorty. Przetnij ścianę klatki piersiowej wzdłuż linii kauteryzacji. 
	UWAGA: Technika ta pozwala uniknąć krwawienia z tętnic międzyżebrowych.</li>
	<li>Przetnij wzdłuż górnej krawędzi pierwszego żebra, a następnie w kierunku ogonowym wzdłuż bocznej krawędzi mostka, usuwając lewą część klatki piersiowej. Umieść rozszerzacze na płucach i odciągnij je przyśrodkowo. Umieść rozszerzacz na przeponie i odciągnij go w kierunku ogonowym, aby odsłonić jak największy odcinek aorty.</li>
	<li>Użyj suchego aplikatora z bawełnianą końcówką, aby usunąć zrosty z tętniaka aorty i nieobjętego zmianami odcinka dystalnego. Zmierzy średnicę nieobjętego zmianami odcinka kontrolnego oraz najszerszą część tętniaka leczonego elastazą, korzystając z mikrometrii wideo. 
	UWAGA: Pomiary z mikrometrii wideo służą do obliczenia procentowego poszerzenia odcinka tętniakowego w stosunku do odcinka kontrolnego za pomocą równania 1. Wybierany jest odcinek kontrolny znajdujący się 0,5 mm dystalnie od odcinka tętniakowego 1. 
	 
	<img alt="Wzór na średnicę tętniaka; równanie, analiza różnic w pomiarach naczyniowych w badaniach medycznych." src="/files/ftp_upload/60105/60105eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">              Równanie 1 
	 </li>
	<li>Chwyć aortę kleszczykami Harmsa, tuż dystalnie od leczonego odcinka. Użyj nożyczek, aby przeciąć aortę dystalnie od kleszczyków, a następnie odpreparuj aortę od kręgosłupa. Przetnij aortę proksymalnie od leczonego odcinka i usuń aortę z tętniakiem.</li>
	<li>Używając strzykawki tuberkulinowej z igłą, wypłucz światło aorty solą fizjologiczną i przetwórz tkankę zgodnie z potrzebami.</li>
</ol>

<ol><li>Coady, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+appropriate+size+criterion+for+resection+of+thoracic+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">What is the appropriate size criterion for resection of thoracic aortic aneurysms.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 113 (3), 489-491 (1997).</li>
<li>Aggarwal, S., Qamar, A., Sharma, V., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+aortic+aneurysm%3A+A+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Clinical+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Abdominal aortic aneurysm: A comprehensive review.</a> Experimental and Clinical Cardiology. 16 (1), 11-15 (2011).</li>
<li>Bickerstaff, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thoracic+aortic+aneurysms%3A+a+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Thoracic aortic aneurysms: a population-based study.</a> Surgery. 92 (6), 1103-1108 (1982).</li>
<li>Cheng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endovascular+aortic+repair+versus+open+surgical+repair+for+descending+thoracic+aortic+disease+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+comparative+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Endovascular aortic repair versus open surgical repair for descending thoracic aortic disease a systematic review and meta-analysis of comparative studies.</a> Journal of the American College of Cardiology. 55 (10), 986-1001 (2010).</li>
<li>Walsh, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endovascular+stenting+versus+open+surgery+for+thoracic+aortic+disease%3A+systematic+review+and+meta-analysis+of+perioperative+results%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Endovascular stenting versus open surgery for thoracic aortic disease: systematic review and meta-analysis of perioperative results.</a> Journal of Vascular Surgery. 47 (5), 1094-1098 (2008).</li>
<li>Absi, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+patterns+of+gene+expression+distinguishing+ascending+aortic+aneurysms+from+abdominal+aortic+aneurysms%3A+complementary+DNA+expression+profiling+in+the+molecular+characterization+of+aortic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Altered patterns of gene expression distinguishing ascending aortic aneurysms from abdominal aortic aneurysms: complementary DNA expression profiling in the molecular characterization of aortic disease.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 126 (2), 344-357 (2003).</li>
<li>Ailawadi, G., Eliason, J. L., Upchurch, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+the+pathogenesis+of+abdominal+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Current concepts in the pathogenesis of abdominal aortic aneurysm.</a> Journal of Vascular Surgery. 38 (3), 584-588 (2003).</li>
<li>Ikonomidis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+thoracic+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">A murine model of thoracic aortic aneurysms.</a> Journal of Surgical Research. 115 (1), 157-163 (2003).</li>
<li>Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+promotes+atherosclerotic+lesions+and+aneurysms+in+apolipoprotein+E-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 105 (11), 1605-1612 (2000).</li>
<li>Trachet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascending+Aortic+Aneurysm+in+Angiotensin+II-Infused+Mice%3A+Formation%2C+Progression%2C+and+the+Role+of+Focal+Dissections%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ascending Aortic Aneurysm in Angiotensin II-Infused Mice: Formation, Progression, and the Role of Focal Dissections.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 673-681 (2016).</li>
<li>Johnston, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+interleukin-1beta+decreases+aneurysm+formation+and+progression+in+a+novel+model+of+thoracic+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Inhibition of interleukin-1beta decreases aneurysm formation and progression in a novel model of thoracic aortic aneurysms.</a> Circulation. 130 (11), Suppl 1 51-59 (2014).</li>
<li>Pope, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-6+Receptor+Inhibition+Prevents+Descending+Thoracic+Aortic+Aneurysm+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Interleukin-6 Receptor Inhibition Prevents Descending Thoracic Aortic Aneurysm Formation.</a> Annals of Thoracic Surgery. 100 (5), 1620-1626 (2015).</li>
<li>Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Improved+Method+for+Rapid+Intubation+of+the+Trachea+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53771(2016).</li>
<li>Ailawadi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonintrinsic+regional+basis+for+increased+infrarenal+aortic+MMP-9+expression+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">A nonintrinsic regional basis for increased infrarenal aortic MMP-9 expression and activity.</a> Journal of Vascular Surgery. 37 (5), 1059-1066 (2003).</li>
<li>Ruddy, J. M., Jones, J. A., Spinale, F. G., Ikonomidis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+heterogeneity+within+the+aorta%3A+relevance+to+aneurysm+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Regional heterogeneity within the aorta: relevance to aneurysm disease.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (5), 1123-1130 (2008).</li>
<li>Trigueros-Motos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryological-origin-dependent+differences+in+homeobox+expression+in+adult+aorta%3A+role+in+regional+phenotypic+variability+and+regulation+of+NF-kappaB+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryological-origin-dependent differences in homeobox expression in adult aorta: role in regional phenotypic variability and regulation of NF-kappaB activity.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1248-1256 (2013).</li>
<li>Lu, G. S. G., Davis, J. P., Schaheen, B., Downs, E., Roy, R. J., Ailawadi, G., Upchurch, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+chronic+advanced+staged+abdominal+aortic+aneurysm+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">A novel chronic advanced staged abdominal aortic aneurysm murine model.</a> Journal of Vascular Surgery. 66 (1), 232-242 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aorta piersiowa i brzuszna są komórkowo i embriologicznie różne, co ma znaczenie dla choroby tętniaka 14,15,16. Dlatego potrzebny jest specjalny model zwierzęcy do badania TAA. Chociaż inne mysie modele dTAA zostały opublikowane8, nasz model jest jedynym, który tworzy zstępujące poszerzenie aorty piersiowej, które można uznać za naprawdę tętniakowe (ponad 50% rozwarcia). Co więcej, nasz model jest stosunk...

Celem tej metody jest badanie rozwoju, patofizjologii i zmian strukturalnych w mysiej aorcie piersiowej zstępującej podczas powstawania tętniaka aorty. Nasz model oferuje powtarzalną i spójną metodę indukowania tętniaków aorty piersiowej (dTAA) u myszy, umożliwiając w ten sposób testowanie różnych inhibitorów genetycznych i farmakologicznych. Prace te mogą pomóc w identyfikacji leków i terapii genowych, które można przełożyć na realną strategię leczenia ludzi z chorobą dTAA.
dTAA powstają, gdy ściana aorty piersiowej staje się osłabiona i rozszerza się z czasem, aż osiąga krytyczną średnicę, gdy może dojść do rozdarcia lub pęknięcia. Klinicznie rzecz biorąc, dTAA może postępować w ciszy, zwiększając swój rozmiar, aż struktura ściany aorty zostanie tak zniekształcona, że w końcu zawiedzie, z katastrofalnymi konsekwencjami. Niepokojące jest to, że objawy zwykle rozwijają się dopiero wtedy, gdy tętniak osiągnął niebezpieczne rozmiary (100-150% poszerzenia) i jest narażony na wysokie ryzyko rozwarstwienia lub pęknięcia1,2. Pęknięcie dTAA jest prawie zawsze śmiertelne3, a planowa naprawa chirurgiczna wiąże się ze znaczną zachorowalnością4,5. Ponadto większość pacjentów ma rozpoznanie tętniaka aorty przez około 5 lat przed naprawą chirurgiczną6,7. To okno stanowi dogodny moment na interwencję niechirurgiczną. W związku z tym potrzebne są terapie medyczne w celu leczenia lub spowolnienia postępu dTAA, które stanowiłyby znaczący postęp w dziedzinie badań nad tętniakami. Obecnie nie ma dostępnych metod leczenia dTAA, głównie z powodu niepełnego zrozumienia patogenezy dTAA.
W ciągu ostatnich 20 lat opracowano kilka modeli zwierzęcych dTAA, ale każdy z tych modeli różnił się od naszego i nie wytwarzał solidnych tętniaków. Mysi model dTAA najbardziej podobny do naszego został opracowany przez Ikonomidis et al.8, który obejmuje bezpośrednie zastosowanie CaCl2 do przydanki aorty. Chociaż nasz model został zaadaptowany z wielu technik opracowanych przez Ikonomidis, nasz model jest wyjątkowy na trzy różne sposoby. Po pierwsze, w naszym modelu aorta jest wystawiona na działanie miejscowej elastazy przez 3-5 minut, w porównaniu do 15 minut ekspozycji na CaCl2. Po drugie, rozszerzenie aorty następuje po 2 tygodniach, w porównaniu do 16 tygodni w modelu CaCl2. Wreszcie, nasz model konsekwentnie wytwarza tętniaki o około 100% poszerzeniu, w porównaniu z poszerzeniami aorty wynoszącymi 20-30% wytwarzanymi przez aplikację CaCl2 (których nie można naprawdę uznać za tętniaki, ponieważ definiuje się je jako wzrost średnicy aorty >50%). Istnieją inne niechirurgiczne mysie modele powstawania tętniaków, takie jak mysz z nokautem Apo E, które tworzą solidne tętniaki z infuzją angiotensyny II. Jednak u tych myszy rozwijają się tętniaki aorty nadnerkowej lub piersiowej wstępującej, a nie tętniaki, szczególnie w aorcie piersiowej zstępującej9,10.
Uzasadnieniem dla tego protokołu jest posiadanie prostego, niedrogiego i odpowiedniego czasowo sposobu na badanie dTAA na mysim modelu. Model mysi daje wyjątkową okazję do wykorzystania wielu genetycznych i specyficznych dla komórek nokautów, które okazały się mieć wpływ na inne choroby naczyniowe. Użycie naszego specyficznego modelu TAA zostało dobrze przyjęte, a eksperymenty z jego wykorzystaniem zostały opublikowane w prestiżowych czasopismach11,12. Do tej pory model był używany do badania możliwych genetycznych i farmakologicznych metod leczenia, które miały znaczący wpływ na mysie modele tętniaka aorty brzusznej (AAA); jednak w miarę rozszerzania zastosowania modelu dTAA nasze laboratorium znajdujemy cele unikalne dla tworzenia dTAA, które mogą być stosowane jako terapie celowane u ludzi.
Ten model jest najbardziej odpowiedni dla laboratoriów, które mają możliwości mikrochirurgiczne na myszach. Chociaż jest to wyzwanie techniczne, może być wykonywane konsekwentnie nawet przez badaczy bez wcześniejszego doświadczenia chirurgicznego. Dla badacza bez doświadczenia w chirurgii mysiej model można opanować w około 20 sesjach operacyjnych (lub około 50 myszach). Dla badacza z wcześniejszym doświadczeniem chirurgicznym model może zostać opanowany w ciągu 5 sesji operacyjnych (około 20 myszy). Wierzymy, że dzięki wysokiej jakości wideo czas do mistrzostwa może zostać jeszcze bardziej skrócony. Po osiągnięciu biegłości zabieg można zakończyć w ciągu 35 minut w przypadku operacji i 20 minut w przypadku końcowego zbioru. Chirurdzy w naszym laboratorium mogą wykonać 10-12 pełnych operacji dziennie, przy śmiertelności operacyjnej wynoszącej 5-10%. Najczęstszą przyczyną śmiertelności jest uraz płuc po wejściu do klatki piersiowej, toksyczność znieczulająca lub zerwanie aorty podczas rozwarstwienia. Oprócz badań nad dTAA, model ten służy również jako przewodnik po bezpiecznym i łatwym dostępie do aorty piersiowej i wnęki płuc dla naukowców badających inne interwencje w klatce piersiowej.

<table><tbody><tr><td>Angiocewnik (22G)</td><td></td><td></td> Używany do <td></td></tr><tr><td>pęsety Dumont z rurką ET; Wzór #7 x2</td><td>Roboz</td><td>RS-4982</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do tkanek Graefe</td><td>Roboz</td><td>RS-5158</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Harms x2</td><td>Roboz</td><td>RS-5097</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt igły wewnątrzsercowe; Ekstra delikatny; Szczęki z węglików spiekanych; Źródło</td> światła LED KL 1500 <td>Roboz</td><td>RS-7800</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;KL 1500 Leica</td><td></td><td>150-400</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Mikroskop dyskcyjny M205A</td> Nożyczki do irysa <td>Leica</td><td>CH 94-35</td><td></td></tr>, <tr><td>11 cm, Świat z węglika wolframu</td><td>Precyzyjne instrumenty</td><td>500216-G</td><td></td></tr><tr><td>Metalowa tablica</td><td></td><td></td> z klipsem <td>Używaj z zestawem zwijacza myszy&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw zwijaczy myszy</td><td>Kent</td><td>SURGI-5001</td><td>Potrzebujesz 2 krótkich i 1 wysokiego stabilizatora</td></tr><tr><td>Wentylator myszy MiniVent Typ 845, 115 V, Zasilacz ze złączem US</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-0043</td><td>Wentylator MiniVent dla myszy (model 845), pojedyncze zwierzę, z kontrolowaną objętością</td></tr><tr><td>Sigma Aldrich</td><td>Elastase z trzustki świni</td><td>E0258-50MG</td><td>Można kupić w butelkach o różnych rozmiarach</td></tr><tr><td>Małe naczynie Zestaw kauteryzacyjny</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-00</td><td>Zaleca się używanie akumulatorów AA</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe, 10,5 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14127</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne waciki (gąbki)</td><td>Sugi</td><td>31603</td><td>Można przyciąć na wymiar</td></tr><tr><td>Platforma chirurgiczna Surgi Suite</td><td>Kent</td><td></td><td>Przymocuj do tablicy klipsów&nbsp;</td></tr><tr><td>Tech IV Isoflurane Vap</td><td>Jorgensen&nbsp; Laboratoria&nbsp;</td><td>J0561A</td><td>Waporyzator anestezjologiczny&nbsp;</td></tr></tbody></table>

mysi model chirurgiczny miejscowego tętniaka aorty piersiowej wywołanego elastazą

Murine Surgical Model of Topical Elastase Induced Descending Thoracic Aortic Aneurysm

Według Centrum Kontroli Chorób, tętniaki aorty (AA) były uważane za główną przyczynę zgonów u wszystkich ras i obu płci w latach 1999-2016. Tętniak powstaje w wyniku postępującego osłabienia i ewentualnego rozszerzenia aorty, która może pęknąć lub rozerwać się, gdy osiągnie krytyczną średnicę. Tętniaki aorty zstępującej w klatce piersiowej, zwane tętniakami aorty piersiowej zstępującej (dTAA), stanowią dużą część przypadków tętniaków w Stanach Zjednoczonych. Niekontrolowane pęknięcie dTAA jest prawie zawsze śmiertelne, a planowa naprawa ma wysoki wskaźnik zachorowalności i śmiertelności. Celem naszego modelu jest szczegółowe zbadanie dTAA, wyjaśnienie patofizjologii dTAA i poszukiwanie celów molekularnych, które zatrzymają wzrost lub zmniejszą rozmiar dTAA. Dysponując mysim modelem do precyzyjnego badania patologii klatki piersiowej, można opracować terapie celowane w celu specyficznego testowania dTAA. Metoda opiera się na umieszczeniu elastazy trzustkowej (PPE) świni bezpośrednio na zewnętrznej ścianie aorty mysiej po ekspozycji chirurgicznej. Powoduje to destrukcyjną i zapalną reakcję, która osłabia ścianę aorty i pozwala na tworzenie się tętniaków przez tygodnie lub miesiące. Chociaż modele mysie mają ograniczenia, nasz model dTAA wytwarza solidne tętniaki o przewidywalnej wielkości. Co więcej, model ten może być wykorzystany do testowania celów genetycznych i farmaceutycznych, które mogą hamować wzrost dTAA lub zapobiegać pęknięciu. U pacjentów takie interwencje mogą pomóc uniknąć pęknięcia tętniaka i trudnej interwencji chirurgicznej.

Zastosowanie naszego protokołu prowadzi do powstania wyraźnych dTAA u myszy w porównaniu z grupą kontrolną otrzymującą sól fizjologiczną. Rozwinięte TAA mają kształt wrzecionowaty i występują wyłącznie w leczonym odcinku aorty (Rysunek 1 oraz Rysunek 2)11. Rysunek 2 przedstawia przykład pomiaru mikrometrycznego wideo podczas pobierania tkanek. Korzystając z równania 1, rozszerzenie aorty w tym przykładzie wyn...

Opisujemy protokół chirurgiczny mający na celu konsekwentne wywoływanie silnych tętniaków aorty piersiowej u myszy. Zabieg polega na tym, że torakotomia lewa strona, odsłonięcie aorty piersiowej i umieszczenie gąbki nasączonej elastazą trzustkową świni na ścianie aorty.

Mysi model chirurgiczny miejscowego tętniaka aorty piersiowej wywołanego elastazą

According to the Center for Disease Control, aortic aneurysms (AAs) were considered a leading cause of death in all races and both sexes from 1999-2016. ...

Protokół ten jest w stanie wytworzyć solidne tętniaki aorty piersiowej o stałej wielkości i lokalizacji u myszy i służy jako przewodnik dla bezpiecznego dostępu do mysiej klatki piersiowej. Protokół ten jest prostą, spójną metodą wytwarzania tętniaków aorty piersiowej u myszy w rozsądnym czasie w porównaniu z innymi modelami. Po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu sedacji u ośmio- do 10-tygodniowego samca c57 black six mysz, umieść mysz w prawej bocznej pozycji odleżynowej i przyklej prawą rękę rostral tak, aby przednia łapa znajdowała się w jednej linii z nosem.Pociągnij ogon doogonowo, aby utworzyć linię napięcia między prawym ramieniem a ogonem, powodując wyprost kręgosłupa, i przyklej lewą nogę w jej naturalnej pozycji. Następnie przyklej lewe ramię brzusznie do zwiniętej gazy. Przed rozpoczęciem zabiegu za pomocą maszynki do strzyżenia należy ogolić lewy bok od lewego ramienia do lewego brzucha.Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby najpierw przeczesać pole operacyjne roztworem betadyny, a następnie 70% etanolem. Gdy skóra jest sucha, umieść sterylną serwetę na zwierzęciu. Wykonaj dwucentymetrowe nacięcie boczne w środku hemothorax i użyj ręcznej elektrokoagulacji, aby podzielić warstwy mięśni, aż żebra będą widoczne.Pod powiększeniem od 10 do 15x bezpośrednio kauteryzuj dwumilimetrową część między żebrami i użyj zwilżonego solą fizjologiczną, cienkiego aplikatora z bawełnianą końcówką w przestrzeni żeber, aby wypreparować do przestrzeni opłucnej przez wypaloną część. Umieść nasączoną solą fizjologiczną gąbkę o wymiarach trzy na dwa milimetry w klatce piersiowej, aby pomóc w zapadnięciu się płuca. Następnie użyj nożyczek, aby poszerzyć torakotomię, aż przepona będzie widoczna brzusznie, a nacięcie będzie oddalone o kilka milimetrów od mięśni przykręgosłupowych grzbietowo.Aby odsłonić aortę, umieść retraktory żeber w nacięciu torakotomii i ostrożnie usuń gąbkę z powierzchni płuca. Przykryj płuco nasączoną solą fizjologiczną gąbką o wymiarach sześć na cztery milimetry, której końce są skierowane rostralnie i doogonowo, a następnie umieść na gąbce szeroki, płaski retraktor płuc. Następnie delikatnie przesuń retraktor brzusznie, aż zstępująca aorta piersiowa zostanie odsłonięta i użyj kleszczy numer siedem, aby wyciąć około pięciomilimetrowy odcinek tkanki łącznej i tłuszczu z aorty.Aby nałożyć elastazę, najpierw za pomocą mikropipety nasącz gąbkę o wymiarach 0,5 na jeden milimetr 12 mikrolitrami elastazy trzustkowej świńskiej i umieść gąbkę na odsłoniętej powierzchni aorty. Po trzech do pięciu minutach użyj kleszczy numer siedem, aby usunąć gąbkę elastazową i wyjmij retraktor płuc. Przepłukać klatkę piersiową około pół mililitra sterylnego roztworu soli fizjologicznej.Wyjmij gąbkę do płuc i użyj zwiniętego kawałka gazy o wymiarach dwa na dwa cale, aby wchłonąć pozostały roztwór soli fizjologicznej. Usuń zwijacze żeber i ułóż żebra z trzema przerwanymi sześcioma niewchłanialnymi szwami, zawiązując luźny węzeł w każdym szwie bez wiązania szwów. Po ponownym napompowaniu płuca zawiąż szwy i ponownie przybliż warstwy mięśni za pomocą biegnącego pięcioosobowego wchłanialnego szwu plecionego.Zamknij skórę siedmioma do dziesięciu przerwanych niewchłanialnych szwów. Następnie monitoruj zwierzę aż do pełnego leżenia. W odpowiednim doświadczalnym punkcie końcowym należy użyć nożyczek, aby naciąć skórę przyśrodkowo od lewej strony do środkowego brzucha, uważając, aby nie dostać się do otrzewnej.Naciąć skórę od grzbietu lewego boku rostralnie do lewego ramienia i wykonać nacięcie pod kątem 90 stopni przez pachę do mostka. Za pomocą kauteryzacji rozetnij płat skóry w kierunku brzusznej części myszy, aby odsłonić lewy hemothorax i użyj nożyczek, aby wejść do brzucha wzdłuż lewego brzegu żebrowego od kierunku brzusznego do grzbietowego, aby odsłonić spód lewej przepony. Jeśli najbardziej boczna krawędź membrany nie otwiera się, naciąć membranę na jej najbardziej bocznej krawędzi.Umieszczając końcówkę kauteryzacji w tym otworze, kauteryzuj przeponę od brzegu żebrowego do wyrostka mieczykowatego i użyj wilgotnego, bawełnianego aplikatora z cienką końcówką, aby delikatnie uwolnić płuco od wszelkich zrostów do ściany klatki piersiowej. Upewniając się, że płuco nie przeszkadza, użyj elektrokoagulacji, aby przeciąć żebra i ścianę klatki piersiowej od brzegu żebrowego do pierwszego żebra, grzbietowo do środkowej linii pachowej, ale co najmniej dwa milimetry od aorty. Przeciąć wzdłuż górnego brzegu pierwszego żebra i odbić klatkę piersiową brzusznie, aby odsłonić hemothorax.Umieść zwijacze na płucu i pociągnij przyśrodkowo. Umieść retraktor lub gazę zwilżoną solą fizjologiczną na membranie i pociągnij doogonowo, aby odsłonić jak najwięcej aorty. Użyj suchego aplikatora z bawełnianą końcówką, aby usunąć wszelkie zrosty z tętniaka aorty i nieuszkodzonego odcinka dystalnego, a następnie użyj mikrometrii wideo, aby zmierzyć średnicę nieuszkodzonego segmentu kontrolnego i najszerszej części tętniaka leczonego elastazą.Aby pobrać aortę, chwyć naczynie kleszczami uszkadzającymi tylko dystalnie do leczonego segmentu i użyj nożyczek, aby przeciąć dystalnie do kleszczy. Wypreparuj aortę z kręgosłupa i przetnij naczynie proksymalnie do leczonego segmentu, aby usunąć tkankę tętniaka. Następnie, za pomocą strzykawki tuberkulinowej i igły, przemyć światło aorty solą fizjologiczną i przetworzyć próbkę zgodnie z zaplanowaną dalszą analizą eksperymentalną.Rozwinięte tętniaki klatki piersiowej mają kształt wrzecionowaty i występują tylko w leczonej części aorty. W tym reprezentatywnym pomiarze mikrometrycznym wideo określono rozszerzenie aorty na 130% podczas pobierania tkanki. Rzeczywiście, podczas gdy myszy leczone elastazą typu wykazują znaczny wzrost rozszerzenia aorty w trzecim, siódmym, 14 i 21 dniu po leczeniu z maksymalnym rozszerzeniem obserwowanym w dniu 14 w porównaniu z kontrolnymi myszami typu dzikiego.Analiza histologiczna ujawnia, że tętniaki typu dzikiego mają włókna elastyny, które są cienkie i rozdrobnione. Występuje również mniejsze zabarwienie komórek mięśni gładkich ze wzrostem ekspresji makrofagów i interlukiny one-beta. Mysie płuco jest niezwykle delikatne, a obrażenia są zwykle śmiertelne.Zachowaj najwyższą ostrożność przy pierwszym wejściu do klatki piersiowej i manipuluj płucami tylko za pomocą gąbek zwilżonych solą fizjologiczną. Model ten pomógł wyjaśnić rolę interlukiny one-beta i interlukiny szóstej w patogenezie tętniaków aorty piersiowej zstępującej oraz tego, w jaki sposób ich blokada może ułatwić niechirurgiczne leczenie tych tętniaków.

murine-surgical-model-topical-elastase-induced-descending-thoracic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W niniejszym filmie pokazano, jak indukować tętniaki aorty brzusznej (AAA) u myszy poprzez przejściową infuzję wewnątrznaczyniową elastazy trzustkowej pochodzenia świńskiego do odcinka podnerkowego aorty brzusznej. Model ten pozwala na uzyskanie szerokiego wglądu w patobiologię AAA dzięki dostępności licznych myszy transgenicznych i z nokautem genowym.

Wytwarzanie eksperymentalnych tętniaków aorty brzusznej u myszy z użyciem elastazy

Modyfikacje histologiczne i biochemiczne po wykluczeniu endoprzeszczepu tętniaka są nadal niejasne. Opisujemy nowy model implantacji endprzeszczepu na tętniaku myszy. Dzięki analizie skrzepliny z utrzymującym się interfejsem krążącego krwiobiegu i bez niego oraz ocenie nowych biomateriałów wewnątrznaczyniowych, model ten pomoże lepiej zrozumieć patobiologię wykluczenia tętniaka wewnątrznaczyniowego.

Nowy mysi model wewnątrznaczyniowej naprawy tętniaka aorty

Obecny protokół opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgiczną dla modelu AAA wywołanego elastazą poprzez bezpośrednie zastosowanie elastazy do przydanki podnerkowej aorty brzusznej u myszy.

Mysi model tętniaka aorty brzusznej indukowany przez okołonaczyniowe zastosowanie elastazy

Ten manuskrypt przedstawia protokół tworzenia mysiego modelu tętniaka aorty brzusznej myszy przy użyciu chlorku wapnia i elastazy, łącząc zalety poprzednich metod modelowania. Model ten można wykorzystać do badania mechanizmów patofizjologicznych leżących u podstaw tętniaków aorty brzusznej.

Mysi model tętniaka aorty brzusznej za pomocą okołoprzybytkowego nacieku chlorku wapnia i elastazy

Ten protokół opisuje metodyczne podejście chirurgiczne do modelowania zaawansowanych tętniaków aorty brzusznej u myszy poprzez kombinację bezpośredniego stosowania elastazy do aorty podnerkowej i podawania ß-aminopropionitrylu przez wodę pitną.

Zaawansowane modelowanie tętniaka aorty brzusznej u myszy poprzez połączenie miejscowej elastazy i doustnego ß-aminopropionitrylu

Niniejszy protokół opisuje standaryzowaną metodę chirurgiczną indukcji tętniaków szyjnych w modelu mysim poprzez pojedynczą operację chirurgiczną.

Model myszy powstawania tętniaka szyjnego

Protokół ten zapewnia szczegółową, krok po kroku procedurę indukcji rozwarstwienia aorty piersiowej u myszy. W szczególności obejmuje dokładne obliczenie wymaganych dawek β-aminopropionitrylu i angiotensyny II, procedurę napełniania pompy osmotycznej oraz technikę implantacji pompy osmotycznej.

Mysi model rozwarstwienia aorty piersiowej wywołanego doustną infuzją β-aminopropionitrylu i podskórnej angiotensyny II

Ten protokół zapewnia powtarzalną i niezawodną metodę wywoływania tętniaków tętnicy brzusznej (TTB) u myszy C57BL/6 przy użyciu uczulenia elastyny i przynaczynowego stosowania elastazy, jako model TTB, który obejmuje komponent uczulenia immunologicznego.

Wiarygodne stworzenie modelu tętniaka tętnicy brzusznej u myszy przy użyciu uczulenia na elastynę i peryvaskularnej elastazy

Brak mechanistycznego zrozumienia uszkodzenia niedokrwienia rdzenia kręgowego i reperfuzji utrudnił dalsze działania wspomagające zapobieganie paraplegii po operacjach aorty wysokiego ryzyka. W związku z tym konieczny jest rozwój modeli zwierzęcych. Manuskrypt ten przedstawia powtarzalne porażenie kończyn dolnych po niedrożności aorty piersiowej w modelu mysim.

Odtwarzalna paraplegia przez niedrożność aorty piersiowej w mysim modelu niedokrwienia rdzenia kręgowego

Wprowadzamy metodę chirurgiczną do wywoływania eksperymentalnego uszkodzenia niedokrwienia/reperfuzji (I/R) symulującego zawał mięśnia sercowego (MI) w modelach mysich, co pozwala na większą przejrzystość w umiejscowieniu podwiązania na lewej tętnicy zstępującej przedniej (LAD) w celu zwiększenia powtarzalności eksperymentów MI u myszy.

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego poprzez podwiązanie lewej tętnicy zstępującej przedniej

Poznaj chirurgiczną metodę wywoływania tętniaka aorty piersiowej u myszy C57BL/6 za pomocą elastazy trzustkowej. Protokół zapewnia powtarzalne wyniki i bezpieczny dostęp do klatki piersiowej.

Mysi model chirurgiczny miejscowego tętniaka aorty piersiowej wywołanego elastazą

Przeglądaj więcej filmów