Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek odpornościowych i badanie funkcjonalnego wpływu na środowisko komórkowe
2 czerwca 2020
Niniejszy raport podkreśla chronologiczne wymagania dotyczące izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od mikrogleju lub makrofagów krwi. EV pochodzące z mikrogleju oceniano jako regulatory wzrostu neurytów, podczas gdy EV pochodzące z makrofagów krwi badano w kontroli inwazji komórek glejaka C6 w testach in vitro. Celem jest lepsze zrozumienie tych funkcji EV jako mediatorów immunologicznych w określonych mikrośrodowiskach.
Protokół ten pozwala zagwarantować dobrą izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i powiadomienie o większej liczbie białek EBDF. W porównaniu z innymi technikami izolacji, ta utrzymuje, że jest bardziej integralna i pionowa. EV są coraz częściej badane w LC, a także w stanach patologicznych.
Metodę tę można zastosować do dowolnych systemów, które wybierzemy do scharakteryzowania i badania pojazdów elektrycznych. Dla tej treści lub etyki biologicznej wymagana jest szczególna uwaga podczas iteracji EV, tak jak w przypadku wyników hodowli w poniższych eksperymentach. Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie dla umieszczenia w nim określonego sprzętu, takiego jak kolumna chromatograficzna do wykluczania wielkości domowej roboty, a także udział licznika nanocząstek i spektrometru masowego.
W zademonstrowaniu procedury pomoże Antonella Raffo-Romero, pracownica laboratorium. Zacznij od wstępnego wyizolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lub EV z pożywki kondycjonującej. Przenieść stan na pożywkę hodowlaną z kultur mikrogleju lub makrofagów do stożkowej probówki i odwirować ją w temperaturze 1 200 razy G przez 10 minut, aby osadzać komórki.
Przenieś supernatant do nowej stożkowej probówki i wiruj przez kolejne 20 minut, aby wyeliminować ciała apoptotyczne. Następnie przenieś supernatant do 10,4 mililitrowej probówki z poliwęglanu. Umieść probówkę w wirniku 70.1 TI i ultra wiruj w temperaturze 100 000 razy G przez 90 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby granulować EV.
Po odwirowaniu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach przefiltrowanego PBS o średnicy 0,2 mikrometra. Aby wyizolować EV, przygotuj domową kolumnę chromatograficzną wykluczającą rozmiar, myjąc i sterylizując szklaną kolumnę chromatograficzną i umieszczając na dnie filtr o pojemności 60 mikrolitrów. Ułóż kolumnę z usieciowaną matrycą filtracyjną z żelu agarozowego, aby utworzyć fazę stacjonarną o średnicy 0,6 centymetra i wysokości 20 centymetrów.
Następnie przepłukać fazę 50 mililitrami PBS przefiltrowanego o średnicy 0,2 mikrometra. W razie potrzeby przechowuj kolumnę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. Umieść zawieszone granulki EV na wierzchu fazy stacjonarnej i zbierz 20 sekwencyjnych frakcji po 250 mikrolitrów, kontynuując dodawanie PBS do górnej części fazy stacjonarnej.
Frakcje można przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić analizę śledzenia nanocząstek, rozcieńczyć każdą frakcję za pomocą PBS przefiltrowanego 0,2 mikrometra i zagłuszyć ją w celu wyeliminowania agregatów. Umieścić roztwór w strzykawce o pojemności jednego mililitra i umieścić go w automatycznej pompie strzykawkowej.
Następnie dostosuj ustawienia kamery do odpowiedniego poziomu wzmocnienia ekranu i poziomu kamery, a następnie kliknij Uruchom. Załadować próbkę do komory analitycznej z szybkością infuzji 1000 przez 15 sekund. Następnie zmniejsz i ustabilizuj prędkość przepływu podczas nagrywania wideo do szybkości infuzji 25 przez 15 sekund.
Uchwyć trzy kolejne 60-sekundowe filmy przedstawiające przepływ cząstek. Następnie dostosuj poziom kamery i próg wykrywania przed analizą wideo. Kliknij Ustawienia OK, aby rozpocząć analizę, a po zakończeniu kliknij Eksportuj.
Umyj system jednym mililitrem przefiltrowanego PBS o średnicy 0,2 mikrometra między każdą frakcją. W przypadku analizy mikroskopii elektronowej należy użyć filtra odśrodkowego o mocy 50 kilodaltonów, aby skoncentrować interesujące nas frakcje chromatografii wykluczania wielkości. W celu ekstrakcji białka należy wymieszać 50 mikrolitrów buforu RIPA z próbką EV przez pięć minut na lodzie.
Poddaj próbki trzykrotnej sonifikacji z mocą 500 watów i 20 kilohercami przez pięć sekund. Następnie usuń zanieczyszczenia pęcherzykowe, odwirowując w temperaturze 20 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wyizolowaniu białek należy przeprowadzić migrację białek w żelu do układania w stos z 12% żelu poliakrylowego.
Mieszaj białka w żelu z Coomassie Blue przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wytnij każdy kolorowy kawałek żelu i pokrój go na małe kawałki. Przełóż kawałki żelu przez serię kolejnych myć, zgodnie z opisem w rękopisie.
Następnie wysusz je całkowicie za pomocą koncentratora próżniowego. Po wysuszeniu przeprowadzić redukcję białka za pomocą 100 mikrolitrów 100-milimolowego wodorowęglanu amonu zawierającego 10 milimolowy ditiotreitol przez godzinę w temperaturze 56 stopni Celsjusza. Następnie wykonaj alkilowanie białek 100 mikrolitrami 100-milimolowego wodorowęglanu amonu zawierającego 50 milimolowych jodoacetamidów przez 45 minut w ciemności.
Umyj kawałki żelu zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i całkowicie wysusz je na koncentratorze próżniowym. Przeprowadź trawienie białek za pomocą 50 mikrolitrów trypsyny w 20 milimolowym wodorowęglanie amonu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia ekstrahuj strawione białka z żelu z 50 mikrolitrami 100% ACN przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie 15 minut w temperaturze pokojowej z ciągłym mieszaniem.
Następnie dwukrotnie ekstrahuj białka za pomocą 50 mikrolitrów 5% TFA w 20 milimolowym wodorowęglanie amonu, mieszając w sposób ciągły przez 20 minut. Dodaj 100 mikrolitrów ACN i kontynuuj mieszanie przez 10 minut. Następnie wysusz białka i ponownie zawieś je w 20 mikrolitrach 0,1% TFA.
Odsalić próbkę za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów z pożywką o odwróconych fazach C 18 do odsalania i zagęszczania peptydów. Następnie wymyj je za pomocą ACN i 0,1% kwasu mrówkowego. Całkowicie wysuszyć próbkę za pomocą koncentratora próżniowego i ponownie zawiesić ją w 20 mikrolitrach ACN i 0,1% kwasu mrówkowego do chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas lub LC-MS.
Załaduj strawione peptydy do urządzenia i wykonaj analizę próbki. Aby potwierdzić izolację EV, każda frakcja SCC została poddana analizie śledzenia nanocząstek. Liczba cząstek była znacznie wyższa we frakcjach piątej, szóstej i siódmej.
Frakcje te połączono w jedną próbkę 2F-EV dodatnią i porównano z frakcjami ujemnymi EV, 1F-EV ujemnymi i 3F-EV ujemnymi, przy użyciu analizy Western blot. Wyniki wykazały obecność białka szoku cieplnego 90 w próbce dodatniej EV oraz w kontroli lizatu komórkowego. Mikroskopia elektronowa próbki dodatniej EV wykazała EV w zakresie wielkości około 100 nanometrów i 400 nanometrów.
Przeprowadzono analizę proteomiczną w celu identyfikacji białek zanieczyszczeń w próbkach ujemnych EV i scharakteryzowania zawartości białek w EV. Zidentyfikowane białka porównano między próbkami 1F-EV ujemnymi i dodatnimi 2F-EV, a także między próbkami dodatnimi 2F-EV i 3F-EV ujemnymi. Korzystając z tej nieukierunkowanej metody, pula 536 białek została przesłana do bazy danych ExoCarta i doprowadziła do identyfikacji 86 białek związanych z EV.
Ponadto pula ta pozwoliła również na zidentyfikowanie interakcji białek i związanych z nimi funkcji biologicznych. Stwierdzono, że białka z próbki dodatniej EV odgrywają rolę w szlakach immunologicznych i neuroprotekcyjnych. Wpływ EV pochodzących z mikrogleju oceniano na wzrost neurytów z komórkami PC 12 i pierwotnymi neuronami szczurów.
Znaczny wzrost przyrostu zaobserwowano w przypadku pojazdów elektrycznych w porównaniu z grupą kontrolną. EV pochodzące z makrofagów oceniano pod kątem inwazji komórek glejaka. Stwierdzono, że EV upośledzają wzrost i inwazję sferoid glejaka.
Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest bardzo ostrożne odrzucenie supernatantu z etapu ultrawirowania, aby zapobiec utracie EV w tej procedurze. Opowiadamy się za podejściem na dużą skalę i nieukierunkowanym, aby skupić się na całej zawartości białka, a następnie na efekcie wertykalnym pojazdów elektrycznych. Tak więc zawartość w kwasach nukleinowych można powiązać za pomocą analizy.
Dzięki takiemu podejściu opartemu na kulturze pierwotnej jesteśmy w stanie odróżnić białka EV od wolnych białek, które nie należą do odmiany. Pozostaje więc pytanie, czy owa koagulacja jest sztuczna, czy raczej jakaś inna rzeczywista
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie szczegółowo opisuje protokoły izolacji pozakomórkowych wezykuł (EVs) z mikrogleju i makrofagów krwi, podkreślając ich role w regulacji wzrostu neurytów i kontroli inwazji komórek glialu. Wyniki mają na celu zwiększenie naszego zrozumienia funkcji EV jako mediatorów odpornościowych w określonych mikrośrodowiskach.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Immunologia
Tło
- Pozakomórkowe wezykuły (EVs) odgrywają znaczącą rolę w komunikacji komórkowej.
- Mikroglej i makrofagi są kluczowymi komórkami odpornościowymi w ośrodkowym układzie nerwowym.
- Rozumienie, jak EV wpływają na funkcje neuronowe, może dostarczyć wglądu w interakcje neuronowo-immunologiczne.
- Obecne techniki izolacji EV mogą wpływać na integralność i aktywność wezykułów.
Cel badania
- Ocenienie EV pochodzących z mikrogleju i makrofagów krwi w różnych kontekstach biologicznych.
- Ocenienie wpływu tych EV na wzrost neurytów i zachowanie komórek glistokadziaka.
- Ustanowienie wiarygodnych protokołów izolacji EV, które zapewniają integralność biologiczną.
Stosowane metody
- Główną metodą jest hodowlania komórek z kolejnymi etapy wirowania w celu izolowywania EV z uodparnionych mediów.
- Analiza śledzenia nanocząstek i techniki Western blot są wykorzystywane do charakteryzacji EV.
- Szczegóły obejmują ultrawirowanie, chromatografię ekluksji rozmiarowej i metody ekstrakcji białka.
- Uważa się na zachowanie etyki biologicznej podczas obsługi EV.
Główne wyniki
- Znacznie wyższe liczby cząstek obserwowano w określonych frakcjach wzbogaconych w EV.
- Analiza Western blot potwierdziła obecność białek związanych ze stresem sercowym w próbkach pozytywnych na EV.
- Mikroskopia elektronowa określiła zakres wielkości izolowanych EV, co wskazuje na sukces metod izolacji.
Wnioski
- Opracowany protokół izolacji EV z mikrogleju i makrofagów może poprawić badania nad procesami neurorozwojowymi pośredniczonymi odpornościowo.
- Badanie zapewnia ramy dla przyszłych badań nad rolą EV w różnych kontekstach biologicznych.
- Rozumienie funkcyjnych implikacji tych EV może wpłynąć na strategie terapeutyczne w chorobach neurologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolation and functional characterization of immune cell-derived extracellular vesicles (EVs) enable mechanistic de-risking in neuroimmunology and oncology target validation. This approach supports predictive confidence in therapeutic vesicle design by linking EV protein signatures to neurite outgrowth and glioma invasion phenotypes. The protocol provides a scalable, reproducible workflow for evaluating EV-mediated immune functions in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microglial and macrophage EV protein signatures as biomarkers for immune-mediated pathway modulation.
- Operational Value: Provides standardized isolation via ultracentrifugation and size-exclusion chromatography to ensure EV integrity for functional assays.
- Predictive Value: Supports target de-risking by correlating EV-enriched proteins (e.g., HSP90) with functional outcomes in neurite outgrowth and glioma spheroid invasion models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative nanoparticle tracking data from SEC fractions to standardize EV yield and purity across batches.
- Operational Value: Enables functional readouts in neurite outgrowth (PC12/primary neurons) and glioma invasion (C6 spheroids) assays for immune mediator screening.
- Assay Readiness: Pooled EV-positive fractions (5-7) provide consistent material for downstream proteomic and functional validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease-relevant EV functions in neurite outgrowth (neuroprotection) and glioma invasion (anti-tumor immune modulation).
- Translational Continuity: Links EV protein cargo to immune and neuroprotective pathways, supporting biomarker-aligned mechanistic studies.
- Preclinical Model Utility: Uses primary neurons and glioma spheroids to evaluate EV effects in physiologically relevant culture systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven evaluation of immune cell EVs as modulators of neuronal and cancer cell phenotypes, supporting lead identification through functional de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of EV-mediated immune signaling in CNS and tumor microenvironments via isolated vesicle functional assays.
- Screening: Delivers standardized, quantification-ready EV preparations for high-content phenotypic screening in neurite outgrowth and invasion models.
- Analytics: Generates nanoparticle tracking, Western blot, and proteomic data to quantify EV yield, validate markers (e.g., HSP90), and characterize functional protein cargo.
- Translational Research: Connects EV protein signatures to pathway-level effects in neurite outgrowth and glioma invasion, enabling risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation and characterization platform applicable to multiple immune cell types and disease contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of immune cell EV functions in neurite outgrowth and glioma invasion models.
- Operational Value: Standardized isolation via ultracentrifugation and SEC ensures reproducibility and scalability across labs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking EV protein signatures to phenotypic outcomes in disease-relevant systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutic vesicle candidates based on functional immune mediator validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, ultracentrifugation, and size-exclusion chromatography for EV isolation.
- Dependent on nanoparticle tracking analyzers, Western blot systems, and mass spectrometry for EV characterization.
- Necessitates cross-team standardization of EV fractionation and pooling (e.g., fractions 5-7) for reproducible functional assays.
- Adaptation to primary microglia, macrophages, or other immune cells requires validation of EV yield and functional activity.
- Practical limitation: EV integrity depends on careful supernatant removal post-ultracentrifugation to prevent loss of vesicle yield.
