Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek odpornościowych i badanie funkcjonalnego wpływu na środowisko komórkowe

Protokół ten pozwala zagwarantować dobrą izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i powiadomienie o większej liczbie białek EBDF. W porównaniu z innymi technikami izolacji, ta utrzymuje, że jest bardziej integralna i pionowa. EV są coraz częściej badane w LC, a także w stanach patologicznych.

Metodę tę można zastosować do dowolnych systemów, które wybierzemy do scharakteryzowania i badania pojazdów elektrycznych. Dla tej treści lub etyki biologicznej wymagana jest szczególna uwaga podczas iteracji EV, tak jak w przypadku wyników hodowli w poniższych eksperymentach. Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie dla umieszczenia w nim określonego sprzętu, takiego jak kolumna chromatograficzna do wykluczania wielkości domowej roboty, a także udział licznika nanocząstek i spektrometru masowego.

W zademonstrowaniu procedury pomoże Antonella Raffo-Romero, pracownica laboratorium. Zacznij od wstępnego wyizolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lub EV z pożywki kondycjonującej. Przenieść stan na pożywkę hodowlaną z kultur mikrogleju lub makrofagów do stożkowej probówki i odwirować ją w temperaturze 1 200 razy G przez 10 minut, aby osadzać komórki.

Przenieś supernatant do nowej stożkowej probówki i wiruj przez kolejne 20 minut, aby wyeliminować ciała apoptotyczne. Następnie przenieś supernatant do 10,4 mililitrowej probówki z poliwęglanu. Umieść probówkę w wirniku 70.1 TI i ultra wiruj w temperaturze 100 000 razy G przez 90 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby granulować EV.

Po odwirowaniu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach przefiltrowanego PBS o średnicy 0,2 mikrometra. Aby wyizolować EV, przygotuj domową kolumnę chromatograficzną wykluczającą rozmiar, myjąc i sterylizując szklaną kolumnę chromatograficzną i umieszczając na dnie filtr o pojemności 60 mikrolitrów. Ułóż kolumnę z usieciowaną matrycą filtracyjną z żelu agarozowego, aby utworzyć fazę stacjonarną o średnicy 0,6 centymetra i wysokości 20 centymetrów.

Następnie przepłukać fazę 50 mililitrami PBS przefiltrowanego o średnicy 0,2 mikrometra. W razie potrzeby przechowuj kolumnę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. Umieść zawieszone granulki EV na wierzchu fazy stacjonarnej i zbierz 20 sekwencyjnych frakcji po 250 mikrolitrów, kontynuując dodawanie PBS do górnej części fazy stacjonarnej.

Frakcje można przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić analizę śledzenia nanocząstek, rozcieńczyć każdą frakcję za pomocą PBS przefiltrowanego 0,2 mikrometra i zagłuszyć ją w celu wyeliminowania agregatów. Umieścić roztwór w strzykawce o pojemności jednego mililitra i umieścić go w automatycznej pompie strzykawkowej.

Następnie dostosuj ustawienia kamery do odpowiedniego poziomu wzmocnienia ekranu i poziomu kamery, a następnie kliknij Uruchom. Załadować próbkę do komory analitycznej z szybkością infuzji 1000 przez 15 sekund. Następnie zmniejsz i ustabilizuj prędkość przepływu podczas nagrywania wideo do szybkości infuzji 25 przez 15 sekund.

Uchwyć trzy kolejne 60-sekundowe filmy przedstawiające przepływ cząstek. Następnie dostosuj poziom kamery i próg wykrywania przed analizą wideo. Kliknij Ustawienia OK, aby rozpocząć analizę, a po zakończeniu kliknij Eksportuj.

Umyj system jednym mililitrem przefiltrowanego PBS o średnicy 0,2 mikrometra między każdą frakcją. W przypadku analizy mikroskopii elektronowej należy użyć filtra odśrodkowego o mocy 50 kilodaltonów, aby skoncentrować interesujące nas frakcje chromatografii wykluczania wielkości. W celu ekstrakcji białka należy wymieszać 50 mikrolitrów buforu RIPA z próbką EV przez pięć minut na lodzie.

Poddaj próbki trzykrotnej sonifikacji z mocą 500 watów i 20 kilohercami przez pięć sekund. Następnie usuń zanieczyszczenia pęcherzykowe, odwirowując w temperaturze 20 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wyizolowaniu białek należy przeprowadzić migrację białek w żelu do układania w stos z 12% żelu poliakrylowego.

Mieszaj białka w żelu z Coomassie Blue przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wytnij każdy kolorowy kawałek żelu i pokrój go na małe kawałki. Przełóż kawałki żelu przez serię kolejnych myć, zgodnie z opisem w rękopisie.

Następnie wysusz je całkowicie za pomocą koncentratora próżniowego. Po wysuszeniu przeprowadzić redukcję białka za pomocą 100 mikrolitrów 100-milimolowego wodorowęglanu amonu zawierającego 10 milimolowy ditiotreitol przez godzinę w temperaturze 56 stopni Celsjusza. Następnie wykonaj alkilowanie białek 100 mikrolitrami 100-milimolowego wodorowęglanu amonu zawierającego 50 milimolowych jodoacetamidów przez 45 minut w ciemności.

Umyj kawałki żelu zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i całkowicie wysusz je na koncentratorze próżniowym. Przeprowadź trawienie białek za pomocą 50 mikrolitrów trypsyny w 20 milimolowym wodorowęglanie amonu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia ekstrahuj strawione białka z żelu z 50 mikrolitrami 100% ACN przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie 15 minut w temperaturze pokojowej z ciągłym mieszaniem.

Następnie dwukrotnie ekstrahuj białka za pomocą 50 mikrolitrów 5% TFA w 20 milimolowym wodorowęglanie amonu, mieszając w sposób ciągły przez 20 minut. Dodaj 100 mikrolitrów ACN i kontynuuj mieszanie przez 10 minut. Następnie wysusz białka i ponownie zawieś je w 20 mikrolitrach 0,1% TFA.

Odsalić próbkę za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów z pożywką o odwróconych fazach C 18 do odsalania i zagęszczania peptydów. Następnie wymyj je za pomocą ACN i 0,1% kwasu mrówkowego. Całkowicie wysuszyć próbkę za pomocą koncentratora próżniowego i ponownie zawiesić ją w 20 mikrolitrach ACN i 0,1% kwasu mrówkowego do chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas lub LC-MS.

Załaduj strawione peptydy do urządzenia i wykonaj analizę próbki. Aby potwierdzić izolację EV, każda frakcja SCC została poddana analizie śledzenia nanocząstek. Liczba cząstek była znacznie wyższa we frakcjach piątej, szóstej i siódmej.

Frakcje te połączono w jedną próbkę 2F-EV dodatnią i porównano z frakcjami ujemnymi EV, 1F-EV ujemnymi i 3F-EV ujemnymi, przy użyciu analizy Western blot. Wyniki wykazały obecność białka szoku cieplnego 90 w próbce dodatniej EV oraz w kontroli lizatu komórkowego. Mikroskopia elektronowa próbki dodatniej EV wykazała EV w zakresie wielkości około 100 nanometrów i 400 nanometrów.

Przeprowadzono analizę proteomiczną w celu identyfikacji białek zanieczyszczeń w próbkach ujemnych EV i scharakteryzowania zawartości białek w EV. Zidentyfikowane białka porównano między próbkami 1F-EV ujemnymi i dodatnimi 2F-EV, a także między próbkami dodatnimi 2F-EV i 3F-EV ujemnymi. Korzystając z tej nieukierunkowanej metody, pula 536 białek została przesłana do bazy danych ExoCarta i doprowadziła do identyfikacji 86 białek związanych z EV.

Ponadto pula ta pozwoliła również na zidentyfikowanie interakcji białek i związanych z nimi funkcji biologicznych. Stwierdzono, że białka z próbki dodatniej EV odgrywają rolę w szlakach immunologicznych i neuroprotekcyjnych. Wpływ EV pochodzących z mikrogleju oceniano na wzrost neurytów z komórkami PC 12 i pierwotnymi neuronami szczurów.

Znaczny wzrost przyrostu zaobserwowano w przypadku pojazdów elektrycznych w porównaniu z grupą kontrolną. EV pochodzące z makrofagów oceniano pod kątem inwazji komórek glejaka. Stwierdzono, że EV upośledzają wzrost i inwazję sferoid glejaka.

Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest bardzo ostrożne odrzucenie supernatantu z etapu ultrawirowania, aby zapobiec utracie EV w tej procedurze. Opowiadamy się za podejściem na dużą skalę i nieukierunkowanym, aby skupić się na całej zawartości białka, a następnie na efekcie wertykalnym pojazdów elektrycznych. Tak więc zawartość w kwasach nukleinowych można powiązać za pomocą analizy.

Dzięki takiemu podejściu opartemu na kulturze pierwotnej jesteśmy w stanie odróżnić białka EV od wolnych białek, które nie należą do odmiany. Pozostaje więc pytanie, czy owa koagulacja jest sztuczna, czy raczej jakaś inna rzeczywista