Wytwarzanie podobnych do komór kardiomiocytów pochodzących z HiPSC i wysokiej jakości preparatów komórkowych do charakterystyki obchodzenia się z wapniem

Powtarzalność jest głównym problemem podczas indukcji kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych. Za pomocą tych metod można uzyskać kardiomiocyty o wysokiej czystości i jakości z iPS w celu wykorzystania ich w badaniach funkcjonalnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosta, niezawodna, opłacalna i niezwykle skuteczna metoda uzyskiwania oczyszczonych, wysokiej jakości preparatów kardiomiocytów pochodzących z iPSC.

W przypadku pasażowania komórek należy przepłukać komórki jednym mililitrem PBS bez wapnia i magnezu przez siedem do 10 minut, a następnie zastąpić PBS jednym mililitrem pożywki pasażowej. Za pomocą podnośnika do komórek delikatnie zeskrob komórki z dna studzienek i użyj sterylnej szklanej pipety o pojemności dwóch mililitrów, aby mechanicznie odłączyć komórki. Gdy komórki uniosą się w małe skupiska, jak widać pod mikroskopem, dodaj pożywkę pasażującą, aby podzielić komórki w stosunku od jednego do sześciu.

Następnie odessać matrycę kwalifikowaną do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z płytki sześciodołkowej. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki pasażującej i jeden mililitr zdysocjowanych komórek do każdej studzienki i pozwól komórkom rosnąć, aż osiągną 70 do 80% zbiegu przed rozpoczęciem różnicowania serca. Co najmniej 30 minut przed odłączeniem iPSC-CM należy przetrzeć poszczególne szklane szkiełka nakrywkowe 70% etanolem i umieścić szkiełka przykrywkowe w indywidualnych dołkach sterylnej płytki sześciodołkowej.

Po wyschnięciu szkiełek nakrywkowych dodać od 250 do 300 mikrolitrów roztworu matrycowego z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych bezpośrednio na środek każdego szkiełka nakrywkowego i umieścić sześciodołkową płytkę w kapturze do hodowli tkankowej. Aby zdysocjować metabolicznie wybrany iPSC-CM, dodaj jeden mililitr sterylnej 0,25% trypsyny z EDTA do każdego dołka na pięciominutową inkubację w temperaturze 35 stopni Celsjusza i użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów do mechanicznej dysocjacji komórek, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Wyciągnij komórki do sterylnej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i umyj każdą studzienkę dwoma mililitrami pożywki RPMI 20 na studzienkę.

Następnie dodaj popłuczyny do probówki i osadź komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić komórki w wystarczającej objętości pożywki, aby uzyskać stężenie trzech razy 10 do piątych komórek na 250 mikrolitrów komórek. Użyj końcówki pipety o pojemności 1000 mililitrów, aby oddzielić komórki, aż roztwór będzie wydawał się jednorodny.

Następnie odessać 250 mikrolitrów komórek do końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów i powoli dozować całą objętość roztworu na jeden szkiełko nakrywkowe z zarodkowymi komórkami macierzystymi człowieka. Gdy wszystkie komórki zostaną wysiane, ostrożnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na noc. Delikatnie dodając dwa mililitry pożywki D7 do każdej studzienki następnego ranka.

Gdy wybrane iPSC-CM osiągną wiek co najmniej trzech miesięcy, potraktuj komórki dwoma mikrolitrami Fura-2 AM przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i włącz system analizy wapnia. Zainicjuj ArcLamp i podłącz rurki z pompy do odpowiednich wlotów i wylotów oraz przewód elektroniczny od stymulatora do komory. Umieść komorę w systemie.

Napełnij rurkę ProFusion, która biegnie przez wbudowaną grzałkę fluidyczną, roztworem Tyrode podgrzanym o temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie dostosuj wymiary przysłony aparatu i kadrowania, aby zminimalizować obszar tła. Przymocuj szklane szkiełko nakrywkowe nasączone iPSC-CM do komory i delikatnie dodaj 500 mikrolitrów roztworu Tyrode'a bezpośrednio na szkiełko nakrywkowe. Zacznij nasycać komorę roztworem Tyrode'a z szybkością 1,5 mililitra na minutę i użyj stymulatora elektrycznego, aby stymulować iPC-CM za pomocą stymulacji polem 1 Hertz przy napięciu 10 V co cztery milisekundy przez trzy do pięciu minut.

Gdy cały barwnik zostanie wypłukany z komory, ustaw viewokienko w lewym górnym obszarze szkiełka nakrywkowego i rozpocznij nagrywanie. Po zebraniu spójnego strumienia od pięciu do 10 pików, kliknij pauzę, aby tymczasowo zatrzymać nagrywanie i przesuń stolik mikroskopu do sąsiedniego obszaru na przeciwległy koniec szkiełka nakrywkowego przed wznowieniem nagrywania. Po zeskanowaniu przejściowości wapnia na całej powierzchni szkiełka nakrywkowego w ten sam sposób, przez okres 10 minut, przeanalizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy śladowych ilości kwiatostanu, zgodnie z instrukcjami producenta.

Protokół ten generuje wysoce czyste kardiomiocyty, które z czasem nabywają w hodowli komorowy, podobny do dorosłego fenotypu. Jak oceniono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego dla przedsionkowych i komorowych izoform MLC2, większość komórek wygenerowanych przez ten protokół jest dodatnia pod względem izoformy MLC2 w 30. dniu po indukcji różnicowania serca. Podczas gdy komorowe izoformy MLC2 są wyrażane w dużych liczbach w tym samym punkcie czasowym.

Wraz z wydłużaniem się czasu w hodowli obserwuje się całkowite przejście na izoformy MLC2. Dane te zostały również potwierdzone przez cytometrię przepływową określającą odsetek komórek wykazujących ekspresję markera MLC2 w przedsionkach i komorach. Amplituda wapnia jest znacznie zwiększona w iPSC-CM w 90 dniu, podobnie jak obserwowana u dorosłych CM szczurów.

Ważne jest, aby pamiętać, że zanieczyszczenie komórek niezwiązanych z sercem może wpływać na funkcjonalne dojrzewanie ludzkich iPSC-CM podczas różnicowania. Ponadto, podczas rejestrowania stanów przejściowych wapnia w iPSC-CM, konieczne jest umożliwienie komórkom ustabilizowania się w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod ciągłą stymulacją przez co najmniej 200 sekund i ograniczenie zapisów do określonego okna czasowego, aby zapewnić powtarzalne wyniki. Pamiętaj, aby potwierdzić, że iPSC wykazują jednorodną morfologię i pozwolić komórkom rosnąć do 70 do 80% zbiegu przed zainicjowaniem różnicowania serca.

Czysta jakość niedojrzałych kardiomiocytów pochodzących z iPS może wykazywać zmienione cechy funkcjonalne, które nie odzwierciedlają prawdziwego fenotypu, ale mogą być błędnie interpretowane jako fenotyp chory. Dlatego uzyskanie czystych i wysokiej jakości kardiomiocytów jest ważne, aby zapewnić spójne i powtarzalne wyniki.