Name: Wytwarzanie podobnych do komór kardiomiocytów pochodzących z HiPSC i wysokiej jakości preparatów komórkowych do charakterystyki obchodzenia się z wapniem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania kardiomiocytów pochodzących z HiPSC o wysokiej czystości do badań funkcjonalnych. Ta technika umożliwia niezawodne modelowanie chorób serca i badania sygnałowania komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez AHA Scientist Development Grant 17SDG33700093 (F.S.); Mount Sinai KL2 Scholars Award for Clinical and Translational Research Career Development KL2TR001435 (FS); NIH R00 HL116645 i AHA 18TPA34170460 (CC).

Eksperymenty z użyciem kardiomiocytów dorosłych szczurów w tym badaniu zostały przeprowadzone z zatwierdzonymi protokołami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Icahn School of Medicine w Mount Sinai. Kardiomiocyty dorosłego szczura wyizolowano z serc szczurów Sprague Dawley metodą opartą na Langendorffie, jak opisano wcześniej16.
1. Przygotowanie mediów
<ol>
	<li>Przygotuj nośnik hiPSC.
	<ol>
		<li>Zrównoważyć suplement i podłoże podstawowe do temperatury pokojowej (RT). Upewnij się, że suplement całkowicie się rozmroził. Wymieszać 400 ml podłoża podstawowego i 100 ml suplementu i przefiltrować za pomocą filtra próżniowego o wielkości 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zrównoważyć do temperatury pokojowej przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj RPMI + B27.
	<ol>
		<li>Zrównoważyć suplement B27 i podłoże podstawowe (RPMI 1640) do RT. Upewnij się, że suplement całkowicie się rozmroził. Wymieszaj 490 ml podłoża podstawowego i 10 ml suplementu 50x i przefiltruj za pomocą filtra próżniowego 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zrównoważyć do temperatury pokojowej przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj insulinę RPMI + B27 (-).
	<ol>
		<li>Zrównoważyć suplement insuliny B27 (-) i podłoże podstawowe (RPMI 1640) do RT. Upewnij się, że suplement całkowicie się rozmroził. Wymieszaj 490 ml podłoża podstawowego i 10 ml suplementu 50x i przefiltruj za pomocą filtra próżniowego 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zrównoważyć do temperatury pokojowej przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj pożywkę selekcyjną (RPMI (-) glukoza + B27 + mleczan).
	<ol>
		<li>Zrównoważyć suplement witaminy B27 i podłoże podstawowe (RPMI 1640 (-) glukoza) do RT. Upewnij się, że suplement całkowicie się rozmroził. Wymieszaj 490 ml podłoża podstawowego i 10 ml suplementu 50x, dodaj 4 mM mleczanu sodu rozpuszczonego w sterylnej wodzie i przefiltruj za pomocą filtra próżniowego 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zrównoważyć do temperatury pokojowej przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj RPMI 20.
	<ol>
		<li>Zrównoważyć podłoże podstawowe (RPMI 1640) z RT. Wymieszać płodową surowicę bydlęcą (FBS) (20% stężenie końcowe) i RPMI. Przefiltrować za pomocą filtra próżniowego 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem zrównoważyć do temperatury pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować pożywkę pasażacyjną, dodając związany z Rho, zwinięty inhibitor kinazy białkowej (ROCK) (stężenie końcowe 2 μM) do pożywki hiPSC.</li>
	<li>Przygotować pożywkę D0, dodając inhibitor GSK-3, CHIR 99021 do pożywki z insuliną RPMI + B27 (-) (10 μM final).</li>
	<li>Przygotować pożywki D3 i D4, mieszając pożywki insulinowe RPMI + B27 (-) z IWR-1 (5 μM final). 
	UWAGA: Pożywki D1 i D5 składają się z insuliny RPMI + B27 (-). Media D7 składają się z RPMI + B27.</li>
	<li>Przygotować bufor blokujący (2% albuminy surowicy bydlęcej [BSA], 2% FBS, 0,05% NP-40 w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami [PBS]): W stożkowej probówce o pojemności 50 ml dodać 1 g BSA, 1 ml FBS, 49 ml PBS i 250 μl NP-40. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie płytek i szkiełek nakrywkowych z wykorzystaniem ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC)
UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki pod wysterylizowanym kapturem do hodowli tkankowej.
<ol>
	<li>Rozmrażać roztwór podstawowy matrycy z kwalifikacją hESC przez noc na lodzie w temperaturze 4 °C. Zapoznaj się z kartą specyfikacji produktu w celu określenia odpowiednich podwielokrotnych objętości, ponieważ mogą się one różnić w zależności od materiału wyjściowego. Przechowywać te podwielokrotności w temperaturze -20 °C w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>W celu użycia matrycy do powlekania płytek lub szklanych szkiełek nakrywkowych, należy najpierw rozmrozić podwielokrotność matrycy kwalifikowanej do wytworzenia komórek macierzystych w temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Podwielokrotność 24 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco: mieszanina składników odżywczych F-12 (DMEM/F:12) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Wymieszaj zimne podłoże DMEM/F:12 ze szklaną pipetą o pojemności 2 ml w celu schłodzenia powierzchni pipety.</li>
	<li>Za pomocą tej samej pipety pobrać około 500−700 μl zimnego DMEM/F:12 i wymieszać z podwielokrotnością matrycy zakwalifikowaną do hESC w samej probówce mikrowirówkowej.</li>
	<li>Po prawidłowym wymieszaniu przenieść roztwór do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej zimny DMEM/F:12 i ponownie wymieszać.</li>
	<li>W przypadku standardowej płytki 6-dołkowej dodaj 1 ml tej mieszaniny do każdego dołka. Upewnij się, że studnia jest całkowicie zakryta. Pozostawić płytki w temperaturze pokojowej pod kapturem do hodowli tkankowych na co najmniej 30 minut. W razie potrzeby przechowywać w temperaturze 4 °C bezpośrednio po posianiu przez okres do 1 tygodnia i równoważyć do temperatury pokojowej przez 30 minut przed użyciem.</li>
	<li>W celu wykorzystania płytek należy odessać matrycę i zastąpić ją odpowiednimi mediami. Zużyć natychmiast.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w sterylnym środowisku (np. w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych).</li>
	<li>Przed powlekaniem przetrzyj każde szkiełko nakrywkowe 70% etanolem. Po wyschnięciu szkiełka nakrywkowego umieść je w studzience sterylnej płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Weź 250−300 μl roztworu matrycowego z kwalifikacją hESC i ostrożnie dozuj go bezpośrednio na środek szklanego szkiełka nakrywkowego. Pozostaw szkiełka nakrywkowe w temperaturze RT pod kapturem do hodowli tkankowych na co najmniej 30 minut przed użyciem.</li>
</ol>
3. Przygotowanie małych cząsteczek
UWAGA: Rozpuść wszystkie małe cząsteczki i modulatory Wnt w DMSO, chyba że zaznaczono inaczej.
<ol>
	<li>Przygotować 10 mM porcji po 25 μl IWR-1 i CHIR 99021 i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Rozpuścić 10 mM podwielokrotności po 50 μl tiazowiwiny (inhibitora ROCK) i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
4. Konserwacja i przechodzenie iPSC
UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki pod sterylnym kapturem do hodowli tkankowej.
<ol>
	<li>Utrzymuj iPSC w standardowych płytkach 6-dołkowych i wykonuj wszystkie kroki w sterylnych warunkach. Utrzymuj komórki z 2 ml pożywki hiPSC na studzienkę. Zmieniaj nośnik co drugi dzień. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C, 6%O2, 5% CO2 . Przejdź komórki, gdy są w 70-80% zlewające się.</li>
	<li>Zrównoważyć PBS bez Ca2+ i Mg2+ do RT.</li>
	<li>Aby rozpocząć proces pasażowania, dodaj 1 ml PBS bez Ca2+ i Mg2+ do studzienki, która ma zostać przepuszczona. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 7-10 min. Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że leczenie PBS nie spowodowało całkowitej dysocjacji monowarstwy.</li>
	<li>Usuń PBS i zastąp 1 ml pożywki pasażowej. Użyj podnośnika do komórek, aby delikatnie zeskrobać i podnieść komórki z powierzchni studni.</li>
	<li>Mechanicznie zdysocjuj komórki za pomocą sterylnej szklanej pipety o pojemności 2 ml. Powtarzaj, aż komórki zostaną dobrze równomiernie zdysocjowane na małe kolonie, gdy są obserwowane pod mikroskopem.</li>
	<li>Gdy komórki zostaną wystarczająco zdysocjowane, dodaj 5 ml pożywki pasażowej, aby podzielić komórki w stosunku 1:6. Dostosuj ilość dodanego nośnika pasażowego, aby dopasować go do preferowanego współczynnika podziału.</li>
	<li>Odessać matrycę z kwalifikacją do zakażenia wirusem ESC z płytki pokrytej matrycą zakwalifikowaną do ESC i zastąpić ją 1 ml pożywki pasażującej na dołek. Dodaj 1 ml zdysocjowanych komórek do dołka.</li>
</ol>
5. Różnicowanie kardiomiocytów
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem różnicowania serca należy stosować linie hiPSC, które są dobrze ugruntowane (ponad 20 pasaży) i wykazują jednorodną morfologię.</li>
	<li>Upewnij się, że iPSC są w około 70-80% zlewne.</li>
	<li>Umyj komórki 1x w PBS bez Ca2+ i Mg2+.</li>
	<li>Dodać 2 ml pożywki D0 (krok 1.7) do dołka i przenieść komórki z powrotem do inkubatora.</li>
	<li>Po 24 godzinach zastąp 3 ml pożywki D1 na studzienkę przez 48 godzin.</li>
	<li>W 3 dniu zastąp pożywkę 2 ml pożywki D3 na studzienkę. Powtórz z podłożem D4 w 4 dniu.</li>
	<li>W 5 dniu zastąp pożywkę 3 ml pożywki D5 na studzienkę.</li>
	<li>W dniu 7 zastąp pożywkę 3 ml pożywki D7 na studzienkę i przenieś do inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i normalnym stężeniuO2 . Nośnik D7 (RPMI + B27) należy wymieniać co 2 dni.</li>
</ol>
6. Procedura wyboru i dysocjacja iPSC-CM
<ol>
	<li>Dziesięć dni przed wykonaniem pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ lub jakiejkolwiek analizy funkcjonalnej należy zastąpić pożywkę RPMI + B27 3 ml pożywki selekcyjnej na studzienkę przez 48 godzin.</li>
	<li>Zastąp pożywkę 3 ml pożywki selekcyjnej na kolejne 48 godzin.</li>
	<li>Wymień pożywkę na 2 ml pożywki RPMI + B27 na studzienkę przez 24 godziny.</li>
	<li>Pokryć standardowe płytki 6-dołkowe zgodnie z opisem w sekcji 2.</li>
	<li>Dodaj 1 ml sterylnej 0,25% trypsyny z EDTA do każdego dołka. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl mechanicznie rozdziel komórki, tak aby pojedyncze komórki były widoczne podczas obserwacji pod mikroskopem.</li>
	<li>Przenieś komórki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodaj 2 ml pożywki RPMI 20 do dołka. Wirować przez 5 minut przy 800 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce RPMI + B27. Odessać matrycę z kwalifikacją hESC z płytek i zastąpić 1 ml pożywki RPMI + B27.</li>
	<li>Używając końcówki do pipety o pojemności 1 000 ml, mechanicznie zdysocjuj osad komórek, aż roztwór stanie się jednorodny.</li>
	<li>Przenieś około 500 000 komórek do każdej studzienki. Przeniesienie do inkubatora na 24 godziny.</li>
	<li>Zastąp pożywkę 3 ml pożywki selekcyjnej na dołek przez 48 godzin.</li>
	<li>Zastąp pożywkę 3 ml RPMI + B27 na dołek. Utrzymuj komórki w pożywce D7 (RPMI + B2 zmieniając pożywkę co 2 dni, aż będą gotowe do analizy funkcjonalnej.</li>
</ol>
7. Przygotowanie iPSC-CM do cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Gdy komórki osiągną pożądany wiek i zostaną poddane selekcji metabolicznej (sekcja 6), umyj komórki PBS bez Ca2+ i Mg2+.</li>
	<li>Dodać 1 ml trypsyny 0,25% na studzienkę i inkubować przez 5-7 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odpipetować mieszaninę 5−10x końcówką P1000 w celu pojedynczej komórki i przenieść do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml RPMI 20.</li>
	<li>Wiruj komórki w temperaturze 600 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu utrwalającego (4% PFA) do osadu komórkowego. Dodawać roztwór kroplami, ciągłe, delikatne wirowanie, a następnie odstawić na lód na 15 minut.</li>
	<li>Dodaj 1,5 ml PBS. Zebrać komórki przez odwirowanie i odessać supernatant.</li>
	<li>Dla każdego eksperymentu należy uwzględnić jedną niebarwioną kontrolę na warunek fiksacji/przepuszczalności.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 500 μl roztworu blokującego (2% FBS/2% BSA w PBS z 0,1% NP-40) na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Nie usuwając roztworu blokującego, dodać przeciwciało pierwszorzędowe MLC2V/MLC2A (5 mg/ml) i inkubować 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć buforem blokującym. Zebrać komórki przez odwirowanie i odessać roztwór.</li>
	<li>Dodać przeciwciało drugorzędowe Alexa Fluor 555/488 (1:750) rozcieńczone w buforze blokującym przez 45 minut w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodaj 1,5 ml PBS. Zebrać komórki przez odwirowanie i odessać roztwór.</li>
	<li>Zawieś komórki w 250−300 μl PBS. Użyj pipety P1000, aby zdezagregować komórki.</li>
	<li>Przygotuj probówki z okrągłym dnem z nasadką sitową z nylonowej siatki o grubości 35 μm. Wstępnie zwilż sitko komórkowe 50 μl PBS i umieść probówkę na lodzie.</li>
	<li>Przenieść roztwór z rozdrobnionymi komórkami do probówek z okrągłym dnem z nasadkami sitka do komórek. Pozwól, aby roztwór komórkowy spłynął naturalnie lub w razie potrzeby postukaj dnem rurki o płaską powierzchnię, aby zapewnić całkowity drenaż i zebranie komórek do probówki. Pamiętaj, aby jak najszybciej odłożyć rurkę z powrotem na lód.</li>
	<li>Przepłucz sitko komórkowe 250 μl PBS, aby odzyskać wszelkie resztki komórek.</li>
	<li>Utrzymuj probówki na lodzie i przykryj folią aluminiową do czasu analizy cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
8. Posiewanie kardiomiocytów na szklanych szkiełkach nakrywkowych
UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki w sterylnym środowisku.
<ol>
	<li>Przygotować szklane szkiełka nakrywkowe zgodnie z opisem w krokach 2.10 i 2.11.</li>
	<li>Po wybraniu iPSC-CM i osiągnięciu pożądanego wieku wykonaj kroki 6.5−6.7, aby oddzielić iPSC-CM.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w wystarczającej ilości pożywki RPMI 20, aby uzyskać około 300 000 komórek na 250 μl.</li>
	<li>Za pomocą szklanej pipety o pojemności 2 ml mechanicznie zdysocjuj osad komórkowy, aż roztwór stanie się jednorodny.</li>
	<li>Odessać matrycę z kwalifikacją hESC ze szkiełek nakrywkowych.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 1000 μl wymieszać i pobrać 250 μl roztworu z probówki stożkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Powoli dozować 250 μl roztworu na szklane szkiełka nakrywkowe, zwracając szczególną uwagę, aby dodawać tylko do obszaru, w którym obecna jest powłoka matrycy z kwalifikacją hESC.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść do inkubatora i pozostawić na noc, uważając, aby nie potrząsnąć ani nie rozprowadzić komórek na szkiełkach nakrywkowych. Następnego ranka delikatnie dodaj 2 ml pożywki D7 (RPMI + B27) do każdego dołka z szkiełkiem nakrywkowym. Wymieniaj nośnik po 24 godzinach, a następnie co 2 dni.</li>
</ol>
9. Naprawianie komórek
<ol>
	<li>Zapewnić, że odpowiednia ilość PBS z Ca2+ i Mg2+ jest zrównoważona do 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) rozcieńczony w PBS zCa2+ i Mg2+ i wyrównać do 4 °C.</li>
	<li>Gdy iPSC-CM osiągną odpowiedni wiek, zostaną poddane selekcji metabolicznej (sekcja 6) i zostaną posiane na szkiełkach nakrywkowych (sekcja 8), przemyj komórki 3x 1 ml zimnego PBS z Ca2+ i Mg2+ na studzienkę.</li>
	<li>Dodaj 1 ml zimnego 4% PFA i pozostaw komórki w temperaturze RT pod kapturem na 15 minut.</li>
	<li>Umyj komórki zimnym PBS, aby usunąć nadmiar PFA.</li>
	<li>Dodać 2 ml PBS z Ca2+ i Mg2+ i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
10. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Usunąć PBS z komórek stałych i dodać 1 ml buforu blokującego. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć bufor blokujący i dodać pierwszorzędowe przeciwciało (5 mg/ml) rozcieńczone w buforze blokującym. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Myć 3x w PBS z Ca2+ i Mg2+ przez 5 min każdy.</li>
	<li>Dodać przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w buforze blokującym 1:1 000.</li>
	<li>Przykryj płytkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem i inkubuj przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Zachowaj folię aluminiową do kolejnych kroków.</li>
	<li>Umyć 3x w PBS z Ca2+ i Mg2+ po 5 min.</li>
	<li>Dodać wystarczającą ilość roztworu roboczego DAPI, aby całkowicie pokryć komórki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Dokładnie przemyć próbkę PBS z Ca2+ i Mg2+ w celu usunięcia nadmiaru DAPI.</li>
	<li>Weź nowe szkiełka podstawowe i dodaj kroplę nośnika montażowego w środku. Użyj zakraplacza, aby równomiernie rozprowadzić nośnik montażowy. Połóż szkiełka nakrywkowe komórkami do dołu na szkiełkach. 
	UWAGA: Ogniwa mogą być przechowywane przez 30 dni, jeśli są chronione przed światłem.</li>
</ol>
11. Ocena wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych Ca2+
<ol>
	<li>Gdy iPSC-CM osiągną wiek co najmniej 3 miesięcy, zostaną poddane selekcji metabolicznej (sekcja 6) i zostaną posiane na szkiełkach nakrywkowych, należy je poddać działaniu 2 μl Fura-2, AM (stężenie końcowe: 1 μM) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 min. 
	UWAGA: Fura-2 jest wrażliwa na światło. Wykonuj wszystkie procedury ładowania i eksperymenty w ciemności.</li>
	<li>Przygotuj system akwizycji i analizy wapnia i kurczliwości.
	<ol>
		<li>Zasil system, upewniając się, że lampa łukowa jest uruchomiona (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Umieść komorę w systemie i podłącz rurki z pompy do odpowiednich wlotów i wylotów oraz przewód elektryczny od stymulatora do komory, jak pokazano na Rysunek 1C.</li>
		<li>Napełnij rurkę perfuzyjną biegnącą przez grzałkę fluidyczną wstępnie podgrzanym roztworem Tyrode'a o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dostosuj wymiary przysłony aparatu i kadrowania, aby zminimalizować obszar tła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamontuj szklane szkiełko nakrywkowe z iPSC-CM w komorze i zamocuj.</li>
	<li>Delikatnie dodać 500 μl roztworu Tyrode'a bezpośrednio na przymocowane szklane szkiełko nakrywkowe i rozpocząć perfuzję w komorze (1,5 ml/min) roztworem Tyrode'a.</li>
	<li>Stymulacja pola iPSC-CM za pomocą stymulacji pola 1 Hz za pomocą stymulatora elektrycznego (10 V, 4 ms).</li>
	<li>Inkubować iPSC-CM w komorze ze stymulacją przez co najmniej 3-5 minut, aby komórki wypłukały barwnik Fura-2 i przystosowały się do środowiska oraz wypłukały barwnik fluorescencyjny.</li>
	<li>Dopasuj viewokienko do lewej górnej części szklanego szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie.</li>
	<li>Po zebraniu spójnego strumienia 5-10 szczytów kliknij przycisk Wstrzymaj, aby tymczasowo zatrzymać nagrywanie.</li>
	<li>Upewnij się, że ani ostrość, ani wymiary viewokienko nie uległy zmianie, przesuń stolik mikroskopu do sąsiedniego obszaru, przesuwając się w kierunku przeciwnego końca i wznów nagrywanie.</li>
	<li>Powtórz kroki 11.9 i 11.10, aby zeskanować w poprzek szkiełka nakrywkowego, początkowo przesuwając się w lewo, a następnie w dół w sposób zygzakowaty, aby pokryć cały obszar szkiełka nakrywkowego. Składa się na to 80−100 pomiarów na szkiełko nakrywkowe. 
	UWAGA: Ogranicz całkowity czas pomiaru do 10 minut, ponieważ czynniki wtórne powodują spadek stanu przejściowego Ca2+.</li>
	<li>Po uzyskaniu stanów nieustalonych Ca2+ przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy śladów fluorescencji zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Karakikes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+human+phospholamban+R14del+mutation+associated+with+cardiomyopathy+using+targeted+nucleases+and+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy.</a> Nature Communications. 6, 6955(2015).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li>
<li>Davis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+derived+from+pluripotent+stem+cells+recapitulate+electrophysiological+characteristics+of+an+overlap+syndrome+of+cardiac+sodium+channel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease.</a> Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).</li>
<li>Fatima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+ryanodine+receptor+2+dysfunction+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%3A+International+Journal+of+Experimental+Cellular+Physiology%2C+Biochemistry%2C+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).</li>
<li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+generated+from+CPVTD307H+patients+are+arrhythmogenic+in+response+to+beta-adrenergic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).</li>
<li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li>
<li>Stillitano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+susceptibility+to+drug-induced+long+QT+with+a+panel+of+subject-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cells+for+modeling+heart+disease+and+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery.</a> Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).</li>
<li>Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+stem+cells+and+cardiovascular+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery.</a> Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).</li>
<li>Youssef, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Promise+and+Challenge+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cardiovascular+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%3A+Basic+to+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications.</a> Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).</li>
<li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%3A+Insight%22%5BJournal%5D)">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12(2018).</li>
<li>Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+cues+for+the+maturation+of+metabolic%2C+electrophysiological+and+calcium+handling+properties+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%2C+Therapy%22%5BJournal%5D)">Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17(2014).</li>
<li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010(2014).</li>
<li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li>
<li>Gorski, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Cardiomyocyte+Contractility+and+Calcium+Handling+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-cardiomyocytes+influence+the+electrophysiological+maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation.</a> Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li>
<li>Patterson, A. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+fetal+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and fetal heart development.</a> Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).</li>
<li>Correia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+hypoxia+and+bioreactor+hydrodynamics+boosts+induced+pluripotent+stem+cell+differentiation+towards+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews%22%5BJournal%5D)">Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+Oxidation+Is+Indispensable+for+Survival+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li>
<li>Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+Improving+the+Maturity+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).</li>
<li>Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).</li>
<li>Hwang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparable+calcium+handling+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+by+multiple+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).</li>
<li>Scuderi, G. J., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+Engineered+Maturation+of+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50(2017).</li>
<li>Jung, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+evolution+of+functional+vs.+remodeling+signaling+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+and+induced+maturation+with+biomechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal+%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation.</a> FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczowe etapy wykorzystania ludzkich iPSC-CM jako modeli eksperymentalnych to: 1) generowanie wysokiej jakości kardiomiocytów (CM), które mogą zapewnić stałą wydajność i powtarzalne wyniki; 2) umożliwienie komórkom dojrzewania w hodowli przez co najmniej 90 dni w celu właściwej oceny ich fenotypu; 3) wykonywanie badań elektrofizjologicznych, np. pomiarów przejściowych wapnia (Ca2+), w celu zapewnienia fizjologicznie istotnej charakterystyki funkcjonalnej ludzkich iPSC-CM. Opracowaliśmy metodę różnicowania opa...

Ludzkie pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (iPSC-CMs) są atrakcyjną platformą opartą na ludziach do modelowania wielu różnych chorób serca in vitro1,2,3,4,5,6,7,8. Co więcej, iPSC-CM mogą być wykorzystywane do przewidywania reakcji pacjentów na nowe lub istniejące leki, do badań przesiewowych trafionych związków i opracowywania nowych spersonalizowanych leków9,10. Jednak pomimo znacznego postępu, podczas korzystania z iPSC-CMs11 należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń i wyzwań. W związku z tym metody mające na celu poprawę protokołów różnicowania serca, zwiększenie wydajności i dojrzewania iPSC-CMs oraz generowanie określonych podtypów kardiomiocytów (komorowych, przedsionkowych i węzłowych) były intensywnie badane i doprowadziły już do opracowania licznych strategii hodowlanych w celu pokonania tych przeszkód12,13,14,15.
Pomimo solidności tych protokołów, głównym problemem dla stosowania iPSC-CMs jest powtarzalność długich i skomplikowanych procedur w celu uzyskania wysokiej jakości kardiomiocytów, które mogą zapewnić taką samą wydajność i powtarzalne wyniki. Odtwarzalność ma kluczowe znaczenie nie tylko przy porównywaniu linii komórkowych o różnym pochodzeniu genetycznym, ale także przy powtarzaniu porównań komórkowych i molekularnych tej samej linii komórkowej. Zmienność komórek, taka jak różnice w gęstości iPSC między osobami zdrowymi, może wpływać na różnicowanie serca, powodując niską wydajność i niską jakość kardiomiocytów. Komórki te mogą być nadal wykorzystywane do przeprowadzania eksperymentów, które nie wymagają czystej populacji CM (np. podczas wykonywania pomiarów przejściowychCa2+). Rzeczywiście, podczas wykonywania analizy elektrofizjologicznej osoby niebędące CM nie będą bić, ani spontanicznie, ani pod wpływem stymulacji elektrycznej, więc łatwo będzie je wykluczyć z analizy. Jednak ze względu na niską jakość, iPSC-CM mogą wykazywać zmienione cechy elektrofizjologiczne (np. nieregularny stan przejściowyCa2+, niska amplitudaCa2+), które nie wynikają z ich składu genetycznego. Dlatego, szczególnie w przypadku stosowania iPSC-CM do modelowania choroby serca, ważne jest, aby nie mylić wyników CM niskiej jakości z fenotypem choroby. Przed przystąpieniem do badań elektrofizjologicznych wymagane są staranne badania przesiewowe i procesy wykluczania.
Ta metoda obejmuje zoptymalizowane protokoły do generowania kardiomiocytów o wysokiej czystości i jakości oraz do oceny ich funkcji poprzez wykonywanie pomiarów przejściowych Ca2+ za pomocą systemu akwizycji i analizy wapnia i kurczliwości. Technika ta jest prostym, ale skutecznym sposobem na rozróżnienie między preparatami iPSC-CM o wysokiej i niskiej wydajności oraz zapewnia bardziej fizjologicznie istotną charakterystykę ludzkich iPSC-CM.

<table><tbody><tr><td>Anty-aktyna, &alfa;-Przeciwciało mięśni gładkich, Mysz monoklonalna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5228</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 koza anty mysz</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 koza anty królik</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>B27(-) insulina Suplement</td><td>Gibco</td><td>A18956-01</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleckchem</td><td>S2924</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik jądrowy DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1X) + L-Glutamina + 15mM Hepes</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Dwustronny podnośnik komórek, płaskie ostrze i J-Hook</td><td>Celltreat</td><td>229306</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Multiwell Płytka do hodowli tkankowej, 6-dołkowa</td> 353046 <td></td><td></td><td>Corning</td></tr><tr><td>Podgrzewacz fluidyczny</td><td>Inline Instrument Live Cell</td><td>IL-H-10</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2, AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>matryca z kwalifikacją hESC</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matrigel Matrix</td></tr><tr><td>pożywka hPSC</td><td>Gibco</td><td>A33493-01</td><td>StemFlex Basal Medium</td></tr><tr><td>IWR-1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I0161</td><td></td></tr><tr><td>Komora do obrazowania żywych komórek</td><td>Instrument do żywych komórek</td><td>EC-B25</td><td></td></tr><tr><td>MLC-2A, monoklonalne przeciwciało myszy</td><td>Systemy synaptyczne</td><td>311011</td><td></td></tr><tr><td>system wapnia i kurczliwości miocytów</td><td>Ionoptix</td><td>ISW-400</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało o łańcuchu lekkim miozyny 2, poliklonalne królika (MLC2V)</td><td>Proteintech</td><td>10906-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne jednorazowe filtry Nalgene o szybkim przepływie z membraną</td> <td>PESThermoFisher</td><td>124-0045</td><td></td></tr><tr><td>PBS z wapniem i magnezem</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS bez wapnia i Magensium</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe Premium</td><td>Lab Scientific</td><td>7807</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640 (-) D-glukoza (1X)</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>L-mleczan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L7022</td><td></td></tr><tr><td>StemFlex Suplement</td><td>Gibco</td><td>A33492-01</td><td></td></tr><tr><td>Tiazovivin</td><td>Tocris</td><td>3845</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Tyrode'a</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BSS-355w</td><td>Dostosuj pH na 7,2. Dodaj 1,2 mM chlorku wapnia</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie podobnych do komór kardiomiocytów pochodzących z hipsc i wysokiej jakości preparatów komórkowych do charakterystyki obchodzenia się z wapniem

Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (iPSC-CMs) stanowią cenne źródło dla ludzi do studiowania podstawowej nauki o szlakach obchodzenia się z wapniem (Ca2+) i szlakach sygnałowych, a także wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków i testach toksyczności. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowy opis metodologii stosowanych do generowania wysokiej jakości iPSC-CM, które mogą konsekwentnie odtwarzać cechy molekularne i funkcjonalne w różnych liniach komórkowych. Dodatkowo opisano metodę pozwalającą na wiarygodną ocenę ich charakterystyki funkcjonalnej poprzez ocenę właściwości manipulacyjnychCa2+. Warunki niskiego poziomu tlenu (O2), selekcja mleczanu i wydłużony czas w hodowli wytwarzają kardiomiocyty podobne do komór o wysokiej czystości i wysokiej jakości. Podobnie jak izolowane kardiomiocyty dorosłych szczurów (ARCM), 3-miesięczne iPSC-CM wykazują wyższą amplitudę Ca2 +, szybsze tempo wychwytu zwrotnego Ca2 + (decay-tau) i dodatnią odpowiedź lusytropową na stymulację β-adrenergiczną w porównaniu z iPSC-CM 30 dnia. Strategia jest technicznie prosta, opłacalna i powtarzalna. Stanowi solidną platformę do modelowania chorób serca i badań przesiewowych leków na dużą skalę w celu zwalczania białek Ca2+.

Protokół opisany na Rysunku 1A pozwolił na uzyskanie wysoko oczyszczonych kardiomiocytów, które wraz z czasem hodowli nabierają fenotypu komór komory/fenotypu dorosłego. W ocenie przeprowadzonej za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego na izoformy łańcucha lekkiego regulacyjnego miozyny przedsionkowej i komorowej (odpowiednio MLC2A i MLC2V), większość komórek uzyskanych tym protokołem była MLC2A-dodatnia w 30. dniu po indukcji różnicowania kardiologicznego, podczas gdy ML...

Tutaj opisujemy i sprawdzamy metodę konsekwentnego generowania silnych ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych i charakteryzujemy ich funkcję. Techniki te mogą pomóc w opracowaniu mechanistycznego wglądu w szlaki sygnałowe, zapewnić platformę do badań przesiewowych leków na dużą skalę i niezawodnie modelować choroby serca.

Wytwarzanie podobnych do komór kardiomiocytów pochodzących z HiPSC i wysokiej jakości preparatów komórkowych do charakterystyki obchodzenia się z wapniem

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...

Powtarzalność jest głównym problemem podczas indukcji kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych. Za pomocą tych metod można uzyskać kardiomiocyty o wysokiej czystości i jakości z iPS w celu wykorzystania ich w badaniach funkcjonalnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosta, niezawodna, opłacalna i niezwykle skuteczna metoda uzyskiwania oczyszczonych, wysokiej jakości preparatów kardiomiocytów pochodzących z iPSC.W przypadku pasażowania komórek należy przepłukać komórki jednym mililitrem PBS bez wapnia i magnezu przez siedem do 10 minut, a następnie zastąpić PBS jednym mililitrem pożywki pasażowej. Za pomocą podnośnika do komórek delikatnie zeskrob komórki z dna studzienek i użyj sterylnej szklanej pipety o pojemności dwóch mililitrów, aby mechanicznie odłączyć komórki. Gdy komórki uniosą się w małe skupiska, jak widać pod mikroskopem, dodaj pożywkę pasażującą, aby podzielić komórki w stosunku od jednego do sześciu.Następnie odessać matrycę kwalifikowaną do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z płytki sześciodołkowej. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki pasażującej i jeden mililitr zdysocjowanych komórek do każdej studzienki i pozwól komórkom rosnąć, aż osiągną 70 do 80% zbiegu przed rozpoczęciem różnicowania serca. Co najmniej 30 minut przed odłączeniem iPSC-CM należy przetrzeć poszczególne szklane szkiełka nakrywkowe 70% etanolem i umieścić szkiełka przykrywkowe w indywidualnych dołkach sterylnej płytki sześciodołkowej.Po wyschnięciu szkiełek nakrywkowych dodać od 250 do 300 mikrolitrów roztworu matrycowego z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych bezpośrednio na środek każdego szkiełka nakrywkowego i umieścić sześciodołkową płytkę w kapturze do hodowli tkankowej. Aby zdysocjować metabolicznie wybrany iPSC-CM, dodaj jeden mililitr sterylnej 0,25% trypsyny z EDTA do każdego dołka na pięciominutową inkubację w temperaturze 35 stopni Celsjusza i użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów do mechanicznej dysocjacji komórek, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Wyciągnij komórki do sterylnej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i umyj każdą studzienkę dwoma mililitrami pożywki RPMI 20 na studzienkę.Następnie dodaj popłuczyny do probówki i osadź komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić komórki w wystarczającej objętości pożywki, aby uzyskać stężenie trzech razy 10 do piątych komórek na 250 mikrolitrów komórek. Użyj końcówki pipety o pojemności 1000 mililitrów, aby oddzielić komórki, aż roztwór będzie wydawał się jednorodny.Następnie odessać 250 mikrolitrów komórek do końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów i powoli dozować całą objętość roztworu na jeden szkiełko nakrywkowe z zarodkowymi komórkami macierzystymi człowieka. Gdy wszystkie komórki zostaną wysiane, ostrożnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na noc. Delikatnie dodając dwa mililitry pożywki D7 do każdej studzienki następnego ranka.Gdy wybrane iPSC-CM osiągną wiek co najmniej trzech miesięcy, potraktuj komórki dwoma mikrolitrami Fura-2 AM przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i włącz system analizy wapnia. Zainicjuj ArcLamp i podłącz rurki z pompy do odpowiednich wlotów i wylotów oraz przewód elektroniczny od stymulatora do komory. Umieść komorę w systemie.Napełnij rurkę ProFusion, która biegnie przez wbudowaną grzałkę fluidyczną, roztworem Tyrode podgrzanym o temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie dostosuj wymiary przysłony aparatu i kadrowania, aby zminimalizować obszar tła. Przymocuj szklane szkiełko nakrywkowe nasączone iPSC-CM do komory i delikatnie dodaj 500 mikrolitrów roztworu Tyrode'a bezpośrednio na szkiełko nakrywkowe. Zacznij nasycać komorę roztworem Tyrode'a z szybkością 1,5 mililitra na minutę i użyj stymulatora elektrycznego, aby stymulować iPC-CM za pomocą stymulacji polem 1 Hertz przy napięciu 10 V co cztery milisekundy przez trzy do pięciu minut.Gdy cały barwnik zostanie wypłukany z komory, ustaw viewokienko w lewym górnym obszarze szkiełka nakrywkowego i rozpocznij nagrywanie. Po zebraniu spójnego strumienia od pięciu do 10 pików, kliknij pauzę, aby tymczasowo zatrzymać nagrywanie i przesuń stolik mikroskopu do sąsiedniego obszaru na przeciwległy koniec szkiełka nakrywkowego przed wznowieniem nagrywania. Po zeskanowaniu przejściowości wapnia na całej powierzchni szkiełka nakrywkowego w ten sam sposób, przez okres 10 minut, przeanalizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy śladowych ilości kwiatostanu, zgodnie z instrukcjami producenta.Protokół ten generuje wysoce czyste kardiomiocyty, które z czasem nabywają w hodowli komorowy, podobny do dorosłego fenotypu. Jak oceniono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego dla przedsionkowych i komorowych izoform MLC2, większość komórek wygenerowanych przez ten protokół jest dodatnia pod względem izoformy MLC2 w 30. dniu po indukcji różnicowania serca. Podczas gdy komorowe izoformy MLC2 są wyrażane w dużych liczbach w tym samym punkcie czasowym.Wraz z wydłużaniem się czasu w hodowli obserwuje się całkowite przejście na izoformy MLC2. Dane te zostały również potwierdzone przez cytometrię przepływową określającą odsetek komórek wykazujących ekspresję markera MLC2 w przedsionkach i komorach. Amplituda wapnia jest znacznie zwiększona w iPSC-CM w 90 dniu, podobnie jak obserwowana u dorosłych CM szczurów.Ważne jest, aby pamiętać, że zanieczyszczenie komórek niezwiązanych z sercem może wpływać na funkcjonalne dojrzewanie ludzkich iPSC-CM podczas różnicowania. Ponadto, podczas rejestrowania stanów przejściowych wapnia w iPSC-CM, konieczne jest umożliwienie komórkom ustabilizowania się w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod ciągłą stymulacją przez co najmniej 200 sekund i ograniczenie zapisów do określonego okna czasowego, aby zapewnić powtarzalne wyniki. Pamiętaj, aby potwierdzić, że iPSC wykazują jednorodną morfologię i pozwolić komórkom rosnąć do 70 do 80% zbiegu przed zainicjowaniem różnicowania serca.Czysta jakość niedojrzałych kardiomiocytów pochodzących z iPS może wykazywać zmienione cechy funkcjonalne, które nie odzwierciedlają prawdziwego fenotypu, ale mogą być błędnie interpretowane jako fenotyp chory. Dlatego uzyskanie czystych i wysokiej jakości kardiomiocytów jest ważne, aby zapewnić spójne i powtarzalne wyniki.

generation-ventricular-like-hipsc-derived-cardiomyocytes-high-quality

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Obecna wiedza na temat komórkowych podstaw chorób serca opiera się głównie na badaniach na modelach zwierzęcych. W tym miejscu opisujemy i walidujemy nowatorską metodę uzyskiwania pojedynczych żywotnych kardiomiocytów z małych próbek chirurgicznych ludzkiego mięśnia sercowego komorowego. Ludzkie miocyty komorowe mogą być wykorzystywane do badań elektrofizjologicznych i testów leków.

Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych

Kilka protokołów zostało opracowanych i opisanych do izolacji różnych typów komórek serca z serca szczura. W tym miejscu opisano zoptymalizowany protokół, który pozwala na izolację wysokiej jakości głównych typów komórek serca (kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów) z jednego preparatu, zmniejszając koszty eksperymentu.

Jednoczesna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca dorosłego szczura

Tutaj prezentujemy metodę optycznego obrazowania potencjałów czynnościowych, szczególnie w indukowanych komorowo indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych. Metoda opiera się na sterowanej przez promotor ekspresji wrażliwego na napięcie białka fluorescencyjnego.

Specyficzne dla podtypu zapisy optycznego potencjału czynnościowego w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach komorowych pochodzących z komórek macierzystych

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Tutaj prezentujemy protokół do solidnego generowania i rozbudowy ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta.

Wytwarzanie i ekspansja ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta

Obecny protokół opisuje całkowicie optyczną kontrolę i obserwację wyzwalanej aktywności komórkowej w kardiomiocytach pochodzących z iPSC (iPSC-CMs) dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i testów toksyczności. Pokazano wieloparametryczną kwantyfikację wzorców fenotypowych w czasie i przestrzeni. Wykazano długoterminowe działanie leków w ciągu godzin lub sekwencyjne pomiary w ciągu kilku dni.

Wysokoprzepustowe sterowanie optyczne i rejestrowanie sygnału wapnia w kardiomiocytach pochodzących z iPSC do badań toksyczności i fenotypowych badań przesiewowych leków

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) stanowią alternatywę dla wykorzystywania zwierząt do przedklinicznych badań przesiewowych kardiotoksyczności. Ograniczeniem dla powszechnego stosowania hiPSC-CM w przedklinicznych badaniach przesiewowych toksyczności jest niedojrzały, podobny do płodu fenotyp komórek. Poniżej przedstawiono protokoły solidnego i szybkiego dojrzewania hiPSC-CM.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe kardiotoksyczności z wykorzystaniem dojrzałych, indukowanych przez człowieka monowarstw kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Prezentowany tutaj jest zestaw protokołów do generowania i kriokonserwacji sferoid serca (CS) z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, hodowanych w wysokoprzepustowym, wielowymiarowym formacie. Ten trójwymiarowy model funkcjonuje jako solidna platforma do modelowania chorób, wysokoprzepustowych badań przesiewowych i zachowuje swoją funkcjonalność po krioprezerwacji.

Generowanie, wysokoprzepustowe badania przesiewowe i biobankowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych sferoid serca pochodzących z komórek macierzystych

Tutaj opisana jest sprawdzona metoda wykonywania pomiarów kurczliwości i wapnia w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych za pomocą platformy opartej na optyce. Platforma ta umożliwia naukowcom badanie wpływu mutacji i reakcji na różne bodźce w szybki i powtarzalny sposób.

Pomiary parametrów wapnia i kurczliwości w czasie rzeczywistym w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Użycie światła do kontrolowania komórek i tkanek serca umożliwia bezkontaktową stymulację, zachowując w ten sposób naturalny stan i funkcję komórek, co czyni ją wartościowym podejściem zarówno do badań podstawowych, jak i zastosowań terapeutycznych.

Mikrofizjologiczny system serca do badania propagacjiCa2+ za pomocą niegenetycznej stymulacji optycznej

Poznaj metodę wytwarzania kardiomiocytów pochodzących z HiPSC o wysokiej czystości do badań funkcjonalnych. Ta technika umożliwia niezawodne modelowanie chorób serca i badania sygnałowania komórkowego.

Wytwarzanie podobnych do komór kardiomiocytów pochodzących z HiPSC i wysokiej jakości preparatów komórkowych do charakterystyki obchodzenia się z wapniem (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie podobnych do komór kardiomiocytów pochodzących z HiPSC i wysokiej jakości preparatów komórkowych do charakterystyki obchodzenia się z wapniem

Przeglądaj więcej filmów