Name: Zoptymalizowana reakcja Griessa na UV-Vis i oznaczanie prymachiny przeciwmalarskiej gołym okiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną reakcję Griessa do szybkiego oznaczania prymachiny w moczu i surowicy krwi. Ta barwnikowa metoda oferuje proste, tanie i wizualne wykrywanie leku przeciwmalarskiego bez skomplikowanego sprzętu laboratoryjnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują za Grant-Up Grant od Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Kantonie oraz projekt szkoleniowy GZUCM (2019QNPY06) dla młodzieży. Dziękujemy również Centrum Badań Medycznych Lingnan Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Kantonie za wsparcie w zakresie obiektów.

1. Synteza kolorowych Azos
<ol>
	<li>W kolbie okrągłodennej o pojemności 25 ml (RBF) rozpuścić anilinę (0,1 mmol) i bisfosforan prymachiny (45,5 mg, 0,1 mmol) w 10 ml roztworuH3PO4 (5% v/v). Umieść RBF na łaźni lodowej, dodaj do roztworu mieszadło o odpowiedniej wielkości i umieść RBF na talerzu mieszającym. 
	nuta: Do syntezy azo 3g (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2) użyj 0,2 mmol bisfosforanu prymachiny.</li>
	<li>Rozpuścić NaNO2 (6,9 mg, 0,1 mmol) w 1 ml schłodzonej wody, a następnie dodać kroplami do mieszaniny reakcyjnej. Usunąć łaźnię lodową i mieszać mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Monitorować reakcję za pomocą płytki do chromatografii cienkowarstwowej (TLC) pokrytej żelem krzemionkowym. Użyć mieszaniny dichlorometanu (DCM) i metanolu (MeOH) (obj. = 5:1) jako eluentu do TLC. Produkt azo posiada kolorowe plamki na płytce TLC, które łatwo odróżnić gołym okiem. Przerwij reakcję, gdy plamy PMQ znikną na TLC.</li>
	<li>Dostosować mieszaninę reakcyjną do pH >10 za pomocą NaOH (2 M) na łaźni lodowej. Za pomocą lejka separacyjnego o pojemności 50 ml ekstrahować mieszaninę 3 razy z 20 ml octanu etylu na każdy, połączyć i zagęścić fazę organiczną w próżni za pomocą wyparki obrotowej. 
	nuta: Przed ekstrakcją należy dostosować wartość pH roztworów reakcyjnych powyżej 10. Może to utrzymać pierwszorzędową aminę w postaci niezjonizowanej, ułatwiając w ten sposób ekstrakcję.</li>
	<li>Oczyścić pozostałości metodą chromatografii błyskawicznej z żelem krzemionkowym o odwróconych fazach pod normalnym ciśnieniem, używając MeOH/H2O jako eluentu. Wysuszyć roztwór produktu przez liofilizację, aby uzyskać pożądane produkty azowe. 
	nuta: Ta sama reakcja może być również przeprowadzona w rozcieńczonych roztworach HCl (0,2 M).</li>
</ol>
2. Pomiary UV-Vis i obliczenia teoretyczne
<ol>
	<li>Rozpuścić czysty azo (50 μM) odpowiednio w wodzie destylowanej lub w 5% roztworze H3PO4 (pH 1,1). Zapisz widma absorpcyjne UV-vis (250-700 nm) na spektrofotometrze w temperaturze pokojowej (25 °C). Eksportuj dane jako pliki .xls/.xlsx do dalszej analizy.</li>
	<li>Wykonaj wszystkie obliczenia teoretyczne dla samego PMQ i produktów azo za pomocą programu Gaussian 16. Użyj teorii funkcjonału gęstości zależnej od czasu (TD-DFT) ze zbiorem bazowym 6-31G. Uwzględnij efekty rozpuszczalnika za pomocą formalizmu polaryzacyjnego modelu kontinuum (PCM) przy użyciu wody.
	<ol>
		<li>Użyj oprogramowania (np. Chemdraw Office), aby narysować struktury, a następnie zapisz strukturę jako plik wejściowy Gaussa (.gif).</li>
		<li>Otwórz plik gif z widokiem Gaussa i kliknij przycisk Oblicz. Wybierz Konfigurację obliczeń Gaussa, Opt+Freq i stan podstawowy-DFT-B3LYP-6-31G; a następnie kliknij przycisk Prześlij. Optymalizacja geometrii spowoduje wygenerowanie pliku .log.</li>
		<li>Postępując zgodnie z powyższą procedurą, użyj widoku Gaussa, aby otworzyć ten plik dziennika. Kliknij opcję Calculate-Gaussian Calculation Setup (Ustawienia obliczeń obliczeniowych Gaussa) i wybierz opcję TD-SCF-DFT-B3LYP-6-31G-Singlet only. Następnie Prześlij. Obliczenia energetyczne wygenerują kolejny plik dziennika i plik sześcienny.</li>
		<li>Użyj widoku Gaussa, aby otworzyć plik dziennika z obliczeń energetycznych. Kliknij Wyniki-UV/Vis, aby zobaczyć przewidywaną absorpcję.</li>
		<li>Użyj widoku Gaussa, aby otworzyć plik modułu. Kliknij Wyniks i wybierz powierzchnię i kontury - Oddziaływania powierzchni i nową powierzchnię, aby wyświetlić orbity.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Porównaj wyniki zarówno pomiarów eksperymentalnych, jak i obliczeń Gaussa. Oblicz błąd procentowy między wartościami obliczonymi i zmierzonymi zgodnie z poniższym równaniem. 
	              Błąd = | (Wmax cal.-Wmaxexper.)/ Wmaxexper. | × 100% 
	gdzie Wmax cal. oznacza maksymalną długość fali absorbancji z obliczeń teoretycznych, a Wmax exper. reprezentuje długość fali z wyniku doświadczalnego.</li>
</ol>
3. Określenie PMQ
<ol>
	<li>Pomiar PMQ przy użyciu płytki 96-dołkowej (<klasa silna = "xfig">Rysunek 5)
	<ol>
		<li>Rozpuścić 4-metoksyanilinę w 0,2 M HCl w 200 mM roztworze aniliny, R1. Rozpuścić azotyn sodu w wodzie destylowanej, aby otrzymać 5 mM roztwór, R2. Przed użyciem przechowywać wszystkie roztwory w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dodać 100 μl R1 do płytki 96-dołkowej i dodać 50 μl próbki zawierającej PMQ do płytki, aby wymieszać z R1. Następnie dodaj 50 μl R2 do płytki. Wymieszać roztwory przez wielokrotne pipetowanie.</li>
		<li>Utrzymuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie zapisz absorbancję UV-vis przy 504 nm. Powtórz 3 razy dla każdego testu. Produkt azowy jest stabilny przy ekspozycji na światło w pomieszczeniu; Nie ma potrzeby trzymania płyty w ciemności.</li>
		<li>Eksportuj dane jako pliki .xls/.xlsx w celu dalszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krzywa kalibracyjna do bezpośredniego pomiaru PMQ w próbce moczu
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory PMQ przy użyciu moczu syntetycznego o stężeniach PMQ odpowiednio 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 μM.</li>
		<li>Dodać 100 μl R1 do płytki 96-dołkowej i dodać 50 μl roztworu moczu PMQ do wymieszania z R1. Następnie dodaj 50 μl R2 do powyższej mieszaniny. Wymieszać roztwory przez wielokrotne pipetowanie. Utrzymuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie zapisz absorbancję UV-vis przy 504 nm.</li>
		<li>Wygenerować krzywą kalibracyjną na podstawie absorbancji I504 i stężeń PMQ. Użyj wartości ze studzienek bez PMQ jako ślepej próby i odejmij puste wartości ze wszystkich testów przed przetworzeniem danych.</li>
		<li>Wykonaj dopasowanie liniowe, aby wygenerować równania liniowe jako Y = aX+b, gdzie Y jest intensywnością absorbancji przy 504 nm, X jest stężeniem PMQ, a a jest nachyleniem, a b jest punktem przecięcia z osią y linii liniowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krzywa kalibracyjna do bezpośredniego pomiaru PMQ w próbce surowicy ludzkiej
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory PMQ przy użyciu ludzkiej surowicy o stężeniach PMQ odpowiednio 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, μM.</li>
		<li>Dodaj 100 μl R1 do 96-dołkowej płytki i dodaj 50 μl roztworu surowicy PMQ do wymieszania z R1. Dodać 50 μl R2 do powyższej mieszaniny i wymieszać roztwory przez wielokrotne pipetowanie. Utrzymuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie zapisz absorbancję UV-vis przy 504 nm. Wyeksportuj dane jako plik .xls/.xlsx w celu dalszej analizy.</li>
		<li>Wygenerować krzywą kalibracyjną na podstawie absorbancji I504 i stężeń PMQ. Użyj wartości ze studzienek bez PMQ jako ślepej próby i odejmij puste wartości ze wszystkich testów przed przetworzeniem danych.</li>
		<li>Wykonaj dopasowanie liniowe, aby wygenerować równania liniowe jako Y = aX+b, gdzie Y jest intensywnością absorbancji przy 504 nm, X jest stężeniem PMQ, a a jest nachyleniem, a b jest punktem przecięcia z osią y linii liniowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja PMQ z surowicy
	<ol>
		<li>Dodaj pewną ilość PMQ do ludzkiej surowicy, aby zasymulować surowicę zawierającą PMQ. W przypadku ekstrakcji PMQ dodać 6 ml mieszaniny octanu etylu/heksanu (7:1 v/v) do 2 ml surowicy zawierającej PMQ w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Dodać 100 μl roztworu wodorotlenku sodu (2 M) do systemu ekstrakcyjnego. Delikatnie potrząśnij rurką za pomocą miksera wirowego przez 30 sekund. Zebrać warstwę organiczną i zagęścić ją za pomocą wyparki obrotowej pod próżnią.</li>
		<li>Ponownie rozpuścić pozostałość w 200 μl wody destylowanej i usunąć nierozpuszczalne składniki lipidowe przez filtrację przez membranę w kształcie dysku o wielkości porów 220 nm. Użyj końcowego rozwiązania do testu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczyć PMQ z surowicy z ekstrakcją
	<ol>
		<li>Wykonaj kroki 3.2 lub 3.3, aby wygenerować krzywą kalibracyjną dla PMQ w wodzie destylowanej. Wyekstrahuj PMQ z surowicy zawierającej PMQ zgodnie z krokiem 3.4.</li>
		<li>Dodać 100 μl R1 i 50 μl roztworu PMQ do płytki 96-dołkowej. Dodać 50 μl R2 do powyższej mieszaniny i wymieszać roztwory przez wielokrotne pipetowanie.</li>
		<li>Przechowywać płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut i rejestrować absorbancję UV-vis przy 504 nm. Użyj studzienek z R1 i R2, ale bez PMQ jako elementów sterujących. Eksportuj dane jako pliki .xls/.xlsx do dalszej analizy.</li>
		<li>Odejmij wartości kontrolne od wartości absorbancji I504 dla każdego badania, a następnie użyj wyniku do obliczeń stężenia zgodnie z równaniem wykładziny z krzywej kalibracyjnej. 
		nuta: Granicę wykrywalności (LOD) dla PMQ we wszystkich przypadkach można obliczyć zgodnie z metodą standardową22. Obliczenia oparto na funkcji kalibracyjnej: LOD = 3,3 × SD/b, gdzie SD jest odchyleniem standardowym ślepej próby, a b jest nachyleniem linii regresji</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fernando, D., Rodrigo, C., Rajapakse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primaquine+in+vivax+malaria%3A+an+update+and+review+on+management+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+Journal%22%5BJournal%5D)">Primaquine in vivax malaria: an update and review on management issues.</a> Malar Journal. 10, 351(2011).</li>
<li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+Artemisinin-Piperaquine+Mass+Drug+Administration+With+or+Without+Primaquine+Dramatically+Reduces+Malaria+in+a+Highly+Endemic+Region+of+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Large-scale Artemisinin-Piperaquine Mass Drug Administration With or Without Primaquine Dramatically Reduces Malaria in a Highly Endemic Region of Africa.</a> Clinical Infectious Diseases. 67 (11), 1670-1676 (2018).</li>
<li>Pavic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primaquine+hybrids+as+promising+antimycobacterial+and+antimalarial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Primaquine hybrids as promising antimycobacterial and antimalarial agents.</a> European Journal of Medical Chemistry. 143, 769-779 (2018).</li>
<li>McQueen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization%2C+and+cellular+localization+of+a+fluorescent+probe+of+the+antimalarial+8-aminoquinoline+primaquine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization, and cellular localization of a fluorescent probe of the antimalarial 8-aminoquinoline primaquine.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27 (20), 4597-4600 (2017).</li>
<li>Ashley, E. A., Recht, J., White, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primaquine%3A+the+risks+and+the+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Primaquine: the risks and the benefits.</a> Malaria Journal. 13 (1), 418(2014).</li>
<li>Watson, J., Taylor, W. R., Menard, D., Kheng, S., White, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+primaquine-induced+haemolysis+in+G6PD+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Modelling primaquine-induced haemolysis in G6PD deficiency.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Beutler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency%3A+a+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: a historical perspective.</a> Blood. 111 (1), 16-24 (2008).</li>
<li>Endoh, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatographic+determination+of+pamaquine%2C+primaquine+and+carboxy+primaquine+in+calf+plasma+using+electrochemical+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Biomedical+Sciences+and+Applications%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatographic determination of pamaquine, primaquine and carboxy primaquine in calf plasma using electrochemical detection.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 579 (1), 123-129 (1992).</li>
<li>Dua, V. K., Kar, P. K., Sarin, R., Sharma, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatographic+determination+of+primaquine+and+carboxyprimaquine+concentrations+in+plasma+and+blood+cells+in+Plasmodium+vivax+malaria+cases+following+chronic+dosage+with+primaquine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Biomedical+Applications%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatographic determination of primaquine and carboxyprimaquine concentrations in plasma and blood cells in Plasmodium vivax malaria cases following chronic dosage with primaquine.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Applications. 675 (1), 93-98 (1996).</li>
<li>Miranda, T. A., Silva, P. H. R., Pianetti, G. A., César, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantitation+of+chloroquine+and+primaquine+by+UPLC-DAD+and+comparison+with+a+HPLC-DAD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantitation of chloroquine and primaquine by UPLC-DAD and comparison with a HPLC-DAD method.</a> Malaria Journal. 14, 29(2015).</li>
<li>Tatsuno, M., Nishikawa, M., Katagi, M., Tsuchihashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+illicit+drugs+in+human+urine+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Analytical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of illicit drugs in human urine by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Analytical Toxicology. 20 (5), 281-286 (1996).</li>
<li>Erni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+high-performance+liquid+chromatography+in+the+pharmaceutical+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Use of high-performance liquid chromatography in the pharmaceutical industry.</a> Journal of Chromatography A. 507, 141-149 (1990).</li>
<li>Tsikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nitrite+and+nitrate+in+biological+fluids+by+assays+based+on+the+Griess+reaction%3A+Appraisal+of+the+Griess+reaction+in+the+l-arginine%2Fnitric+oxide+area+of+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Analysis of nitrite and nitrate in biological fluids by assays based on the Griess reaction: Appraisal of the Griess reaction in the l-arginine/nitric oxide area of research.</a> Journal of Chromatography B. 851 (1), 51-70 (2007).</li>
<li>Zurcher, D. M., Adhia, Y. J., Romero, J. D., McNeil, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifying+a+known+gelator+scaffold+for+nitrite+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Modifying a known gelator scaffold for nitrite detection.</a> Chemical Communications. 50 (58), 7813-7816 (2014).</li>
<li>Kunduru, K. R., Basu, A., Tsah, T., Domb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+with+pendant+diazo-coupling+functionality+for+colorimetric+detection+of+nitrates%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Polymer with pendant diazo-coupling functionality for colorimetric detection of nitrates.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 21-26 (2017).</li>
<li>Li, D., Ma, Y., Duan, H., Deng, W., Li, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Griess+reaction-based+paper+strip+for+colorimetric%2Ffluorescent%2FSERS+triple+sensing+of+nitrite%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Griess reaction-based paper strip for colorimetric/fluorescent/SERS triple sensing of nitrite.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 389-398 (2018).</li>
<li>Deng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+colorimetric+detection+of+hydroxyl+radicals+based+on+a+modified+Griess+test%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for colorimetric detection of hydroxyl radicals based on a modified Griess test.</a> Talanta. 195, 152-157 (2019).</li>
<li>Pang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photo-responsive+macroscopic+switch+constructed+using+a+chiral+azo-calix%5B4%5Darene+functionalized+silicon+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">A photo-responsive macroscopic switch constructed using a chiral azo-calix[4]arene functionalized silicon surface.</a> Chemical Communications (Camb). 54 (24), 2978-2981 (2018).</li>
<li>Kaur, N., Dhaka, G., Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+naked-eye+ratiometric+and+colorimetric+receptor+for+anions+based+on+azo+dye+featuring+with+benzimidazole+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Letters%22%5BJournal%5D)">Simple naked-eye ratiometric and colorimetric receptor for anions based on azo dye featuring with benzimidazole unit.</a> Tetrahedron Letters. 56 (9), 1162-1165 (2015).</li>
<li>Liu, F., Lou, J., Hristov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-Ray+responsive+nanoparticles+with+triggered+release+of+nitrite%2C+a+precursor+of+reactive+nitrogen+species%2C+for+enhanced+cancer+radiosensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">X-Ray responsive nanoparticles with triggered release of nitrite, a precursor of reactive nitrogen species, for enhanced cancer radiosensitization.</a> Nanoscale. 9 (38), 14627-14634 (2017).</li>
<li>Deng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+Griess+reaction+on+the+important+anti-malarial+drug+primaquine+and+its+application+for+drug+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">An unexpected Griess reaction on the important anti-malarial drug primaquine and its application for drug determination.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 171, 8-14 (2019).</li>
<li>Shrivastava, A., Gupta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+determination+of+limit+of+detection+and+limit+of+quantitation+of+the+analytical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Chronicles+of+Young+Scientists%22%5BJournal%5D)">Methods for the determination of limit of detection and limit of quantitation of the analytical methods.</a> Chronicles of Young Scientists. 2 (1), 21-25 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Opisaliśmy metodę kolorymetryczną do wygodnej kwantyfikacji PMQ. Jest to potencjalnie najprostsza i najbardziej opłacalna obecnie metoda. Co ważniejsze, metoda ta umożliwia pomiar PMQ gołym okiem bez użycia jakiegokolwiek sprzętu.
Zoptymalizowana reakcja Griessa do wykrywania PMQ może wygenerować azo o czerwonym kolorze o maksymalnej absorpcji przy 504 nm. Potencjalny wpływ absorpcji endogennych biomolekuł przez promieniowanie UV-vis jest ograniczony, co sprawia, że metoda ta jest obiecująca d...

PMQ jest jednym z najważniejszych leków przeciwmalarycznych, działa nie tylko jako schizontocyd tkankowy, aby zapobiec nawrotom, ale także jako gametocycyd przerywający przenoszenie choroby1,2,3,4. Hemoliza wewnątrznaczyniowa jest jednym z niepokojących skutków ubocznych PMQ, który staje się niezwykle poważny u osób z niedoborem G6PD. Wiadomo, że choroba genetyczna G6PD występuje na całym świecie z częstością genów od 3 do 30% na obszarach endemicznych malarii. Nasilenie osłabienia PMQ zależy od stopnia niedoboru G6PD, a także dawki i czasu trwania ekspozycji na PMQ5,6. Aby zmniejszyć ryzyko, Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zaleciła pojedynczą niską dawkę (0,25 mg zasady/kg) PMQ w leczeniu malarii. Jest to jednak nadal wyzwaniem ze względu na różnice w wrażliwości pacjentów na leki5,7. Monitorowanie dawki jest konieczne w celu oceny farmakokinetyki po podaniu PMQ, co może mieć wpływ na dostosowanie dawki w celu uzyskania skutecznego leczenia o ograniczonej toksyczności.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest najczęściej używaną techniką do klinicznego oznaczania PMQ. Endoh i wsp. opisali system HPLC z detektorem UV do oznaczania ilościowego PMQ w surowicy przy użyciu kolumny z żelem polimerowym C-188. W ich układzie białka surowicy najpierw wytrącono acetonitrylem, a następnie oddzielono PMQ w supernatancie w celu HPLC. Krzywa kalibracyjna była liniowa w zakresie stężeń od 0,01-1,0 μg/mL8. Inna metoda oparta na HPLC z odwróconymi fazami z detekcją UV przy 254 nm została opisana do oznaczania ilościowego PMQ i jego głównych metabolitów9. Krzywa kalibracyjna dla PMQ była liniowa w zakresie 0,025-100 μg/ml. Do separacji PMQ użyto dodatkowej ekstrakcji ciecz-ciecz z mieszaniną heksanu i octanu etylu jako fazy organicznej z procentowym odzyskiem osiągniętym do 89%9. Niedawno Miranda i wsp. opracowali metodę UPLC z detekcją UV przy 260 nm do analizy PMQ w postaci tabletek z granicą wykrywalności na poziomie 3 μg/ml10.
Chociaż metody HPLC wykazują obiecującą czułość w określaniu leków, a czułość może być jeszcze większa, jeśli HPLC jest wyposażona w spektrometr masowy, nadal istnieją pewne wady. Bezpośrednie pomiary leków w płynach biologicznych są zwykle niedostępne za pomocą HPLC, ponieważ wiele biomolekuł może mieć duży wpływ na analizę. Wymagane są dodatkowe ekstrakcje w celu usunięcia cząsteczek endogennych przed analizą HPLC11,12. Co więcej, detekcja PMQ za pomocą detektora HPLC-UV jest zwykle wykonywana przy maksymalnej długości fali absorpcyjnej (260 nm).; jednak w płynach biologicznych znajduje się wiele cząsteczek endogennych o silnej absorbancji przy 260 nm (np. aminokwasy, witaminy, kwasy nukleinowe i pigmenty urochromowe), zakłócając w ten sposób wykrywanie PMQ UV. Istnieje potrzeba opracowania prostych i opłacalnych metod oznaczania PMQ o rozsądnej czułości i selektywności.
Reakcja Griessa została po raz pierwszy przedstawiona w 1879 roku jako test kolorymetryczny do wykrywania azotynów13,14,15,16. Ostatnio reakcja ta została szeroko zbadana w celu wykrycia nie tylko azotynów, ale także innych biologicznie istotnych cząsteczek17,18,19,20. Wcześniej informowaliśmy o pierwszym systematycznym badaniu nieoczekiwanej reakcji Griessa na PMQ (<silna klasa="xfig">Ryc. 1). W tym systemie PMQ jest w stanie tworzyć kolorowe azos w połączeniu z podstawionymi anilinami w obecności jonów azotynowych w warunkach kwaśnych. Odkryliśmy ponadto, że kolor azosów zmieniał się od żółtego do niebieskiego przy zwiększaniu efektu oddawania elektronów przez podstawnik na aniliny21. Oparta na absorpcji UV-vis metoda kolorymetryczna do oznaczania ilościowego PMQ została opracowana w wyniku zoptymalizowanej reakcji między 4-metoksyaniliną a PMQ. Metoda ta wykazała ogromny potencjał w zakresie czułego i selektywnego wykrywania PMQ w płynach istotnych z punktu widzenia biologii. W tym miejscu staramy się opisać szczegółowe procedury oznaczania PMQ w oparciu o tę strategię kolorymetryczną.

<table><tbody><tr><td>4-metoksyanilina</td><td>Aladyn</td><td>K1709027</td><td></td></tr><tr><td>2,4-dimetoksyanilina</td><td>Heowns</td><td>10154207</td><td></td></tr><tr><td>3,4-dimetoksyaniliny</td><td>Bidepharm</td><td>BD21914</td><td></td></tr><tr><td>4-metylaniliny</td><td>Adamas-beta</td><td>P1414526</td><td></td></tr><tr><td>4-nitroanilina</td><td>Macklin</td><td>C10191447</td><td></td></tr><tr><td>96-dołków, płaski</td><td>Botton Labserv</td><td></td><td></td>310109008</tr><tr><td>Gaussian@16 oprogramowanie</td><td>Gaussian, Inc</td><td></td><td>Wersja:x86-64 SSE4_2 enabled/Linux</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>GCRF</td><td>20180902</td><td></td></tr><tr><td>szkic Marvina (oprogramowanie)</td><td>CHEMAXON</td><td></td><td>wydanie bezpłatne: 15.6.29</td></tr><tr><td>Kwas fosforowy</td><td>Macklin</td><td>C10112815</td><td></td></tr><tr><td>Primachina bisifosforan</td><td>3A Chemikalia</td><td></td><td></td>CEBK200054</tr><tr><td>Azotyn sodu</td><td>Alfa Aesar</td><td>5006K18R</td><td></td></tr><tr><td>Sulfonamidy</td><td>TCI(szanghaj)</td><td>GCPLO-BP</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan LUX Czytnik płytek</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Dostarczany z oprogramowaniem SkanIt 4.1</td></tr></tbody></table>

zoptymalizowana reakcja griessa na uv-vis i oznaczanie prymachiny przeciwmalarskiej gołym okiem

Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine

Primachina (PMQ), ważny lek przeciwmalaryczny, został zarekomendowany przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) do leczenia zagrażających życiu infekcji wywołanych przez P. vivax i ovale. Jednak PMQ ma niepożądane działania niepożądane, które prowadzą do ostrej hemolizy u pacjentów z niedoborem dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PD). Istnieje potrzeba opracowania prostych i niezawodnych metod oznaczania PMQ w celu monitorowania dawkowania. Na początku 2019 r. informowaliśmy o podejściu UV-Vis i gołym okiem do kwantyfikacji kolorymetrycznej PMQ. Detekcja opierała się na reakcji podobnej do Griessa między PMQ a anilinami, które mogą wytwarzać kolorowe produkty azowe. Granica wykrywalności dla bezpośredniego pomiaru PMQ w moczu syntetycznym mieści się w zakresie nanomolowym. Co więcej, metoda ta wykazała duży potencjał w zakresie oznaczania ilościowego PMQ z próbek surowicy ludzkiej w klinicznie istotnych stężeniach. W tym protokole opiszemy szczegóły techniczne dotyczące syntezy i charakterystyki barwionych produktów azowych, przygotowania odczynnika oraz procedur oznaczania PMQ.

Aby zoptymalizować warunki reakcji (Rysunek 2), do sprzęgania z PMQ za pomocą reakcji Griessa wykorzystano różne aniliny. Uzyskano szereg związków azowych o różnych barwach. Stwierdzono, że aniliny z podstawnikiem donującym elektrony mogą powodować przesunięcie czerwone w widmie absorpcyjnym UV-vis. Obliczenia teoretyczne przeprowadzono z wykorzystaniem teorii funkcjonału gęstości zależnej od czasu (TD-DFT). Jak przedstawiono na Rysunku 2A, wynik obliczeń był zg...

Ten protokół opisuje nowatorską metodę kolorymetryczną do wykrywania prymachiny przeciwmalarycznej (PMQ) w syntetycznych moczach i surowicach ludzkich.

Zoptymalizowana reakcja Griessa na UV-Vis i oznaczanie prymachiny przeciwmalarskiej gołym okiem

Primaquine (PMQ), an important anti-malarial drug, has been recommended by the World Health Organization (WHO) for the treatment of life-threatening ...

Prymachina jest dobrze znanym lekiem przeciwmalarycznym. Oznaczenie prymachiny w płynach biologicznych jest często wymagane do oceny farmakokinetyki. Obecnie główne techniki oznaczania prymachiny opierają się na HPLC.Procedury HPLC mogą być dość skomplikowane i czasochłonne. Tak więc ta metoda oferuje prosty sposób na szybkie wykrycie prymachiny. Ta metoda Griessa jest potencjalnie najprostszym i najbardziej opłacalnym sposobem oznaczania ilościowego prymachiny.Co więcej, metoda ta może oferować możliwości wykrywania prymachiny gołym okiem bez konieczności stosowania jakiegokolwiek sprzętu. Oprócz próbek surowicy i moczu, metoda ta może być również stosowana do ilościowego oznaczania prymachiny w preparatach farmaceutycznych, na przykład oznaczania prymachiny w tabletkach w celu kontroli jakości produkcji. Procedurę zademonstrują panna Wu Yalan i Wu Shengjun, dwoje doktorantów z mojego laboratorium.Zacznij od rozpuszczenia 0,1 milimola aniliny i bifosforanu prymachiny w 10 mililitrach 5% roztworu kwasu fosforowego w 25-mililitrowej brązowej kolbie dolnej. Umieścić kolbę w łaźni lodowej i dodać mieszadło. Następnie umieść kąpiel lodową na talerzu mieszającym.Rozpuścić 6,9 miligrama

optimized-griess-reaction-for-uv-vis-naked-eye-determination-anti

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film demonstruje test fagocytozy oparty na cytometrii przepływowej, obejmujący znakowane i opsonizowane erytrocyty zakażone Plasmodium falciparum przez monocyty. Cytometria przepływowa identyfikuje fluorescencję w monocytach, potwierdzając pomyślną identyfikację opsonizowanych erytrocytów poprzez fagocytozę.

Test do ilościowego określania fagocytozy erytrocytów zakażonych pasożytami za pośrednictwem przeciwciał

Film demonstruje test komórkowy do wykrywania anty-akwaporyny-4 immunoglobuliny G za pomocą biochipa zawierającego komórki nietransfekowane i transfekowane komórki wyrażające akwaporynę-4. Metoda ta ma zastosowanie w diagnostyce zaburzeń ze spektrum zapalenia nerwu wzrokowego, potwierdzonych silną zieloną fluorescencją na biochipie.

Test do wykrywania immunoglobuliny G antyakwaporyny-4 w surowicy

Pomiar funkcji przeciwciał jest kluczem do zrozumienia odporności na malarię Plasmodium falciparum. Metoda ta opisuje oczyszczanie żywotnych merozoitów i pomiar fagocytozy zależnej od opsonizacji za pomocą cytometrii przepływowej.

Wysokowydajne oczyszczanie merozoitów Plasmodium falciparum do stosowania w testach przeciwciał opsonizujących

Ekspresja białek malarycznych w systemach komórkowych pozostaje wyzwaniem. Pokazujemy dwuetapowe i jednoetapowe systemy ekspresji komórkowej IVT (translacja in vitro) do ekspresji rekombinowanych białek rhoptrii malarii z komórek HeLa. Do oczyszczania białek rhoptrii używamy systemu oczyszczania opartego na powinowactwie do żywicy Ni.

Oparte na HeLa systemy ekspresji bezkomórkowej do ekspresji białek Plasmodium Rhoptry

Solidne odczynniki do wykrywania stają się coraz bardziej niezbędne do opracowania nowych narzędzi diagnostycznych malarii. Zaprojektowano sondę irydową(III), która emituje długotrwały sygnał luminescencyjny w obecności bogatego w histydynę biomarkera białka malarii. Wykrywanie białka zarówno w roztworze, jak i unieruchomionego na cząstce magnetycznej zapewnia elastyczność w zastosowaniu.

Sonda luminescencyjna Iridium(III) do wykrywania biomarkera białka malarii Histidine Rich Protein-II

Współinfekcja człowieka jest trudna do odtworzenia in vitro. Jednak ludzkie pasożyty malarii mogą być łatwo hodowane in vitro, podobnie jak świeżo wyizolowane ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej naturalnie zakażone wirusem HIV. Stanowi to doskonały model do badania wczesnych odpowiedzi immunologicznych na pasożyty malarii w kontekście współzakażenia wirusem HIV.

Model in vitro do pomiaru odpowiedzi immunologicznej na malarię w kontekście współzakażenia wirusem HIV

W tym manuskrypcie przedstawiono metody periodatowego utleniania i sieciowania aldehydu glutarowego do kowalencyjnego unieruchamiania przeciwciał na krążkach papierowych. Oceniano aktywność wiązania unieruchomionych przeciwciał. Na podstawie tych wyników zastosowano metodę sieciowania aldehydu glutarowego w celu opracowania nowatorskiego, opartego na papierze testu immunologicznego do wykrywania immunoglobuliny G (IgG).

Kowalencyjne wiązanie przeciwciał z krążkami papieru celulozowego i ich zastosowania w kolorymetrycznych testach immunologicznych gołym okiem

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania i oznaczania ilościowego Plasmodium falciparum w zakażonych czerwonych krwinkach wodnych za pomocą spektrometru podczerwonego o całkowitym odbiciu i wielowymiarowej analizy danych.

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Plasmodium falciparum w wodnych krwinkach czerwonych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z osłabionym całkowitym odbiciem i wieloczynnikowej analizy danych

Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie instrukcji, jak mierzyć zdolność przeciwciał obecnych w surowicach lub osoczu osób, naturalnie narażonych na zakażenie Plasmodium falciparum, do opsonizacji i indukowania fagocytozy erytrocytów zakażonych pasożytami (IE).

Pomiar naturalnie nabytych przeciwciał indukujących fagocytozę przeciwko pasożytom Plasmodium falciparum za pomocą testu opartego na cytometrii przepływowej

Opisujemy jednocząsteczkowe podejście do pomiarów powinowactwa antygenu i przeciwciała za pomocą fotometrii masowej (MP). Protokół oparty na MP jest szybki, dokładny, wykorzystuje bardzo małą ilość materiału i nie wymaga modyfikacji białek.

Szybkie oznaczanie powinowactwa przeciwciało-antygen za pomocą fotometrii masowej

Ten protokół opisuje test immunoenzymatyczny do wykrywania sporozoitów gruczołów ślinowych u komarów. Wykorzystując łatwo dostępne przeciwciała monoklonalne, metoda umożliwia ekonomiczne, wysokoprzepustowe wykrywanie komarów przenoszących Plasmodium falciparum lub Plasmodium vivax. Metoda ta nadaje się do badań nad przenoszeniem malarii, w tym do badań wektorowych.

Wykrywanie sporozoitów Plasmodium u komarów Anopheles za pomocą testu immunoenzymatycznego

Poznaj zoptymalizowaną reakcję Griessa do szybkiego oznaczania prymachiny w moczu i surowicy krwi. Ta barwnikowa metoda oferuje proste, tanie i wizualne wykrywanie leku przeciwmalarskiego bez skomplikowanego sprzętu laboratoryjnego.

Zoptymalizowana reakcja Griessa na UV-Vis i oznaczanie prymachiny przeciwmalarskiej gołym okiem

Przeglądaj więcej filmów