Bezkrwawa dieta do hodowli komarów Anopheline

Pasożyty malarii, takie jak spotykane przez komary, odgrywają główną rolę w rozprzestrzenianiu się choroby. Do tej pory nie było możliwe hodowanie komarów malarycznych bez krwi. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, nasz protokół opisuje dietę zastępczą krwi, która jest w stanie wspierać rozmnażanie się komarów w sektorze.

Stosowanie diety bezkrwawej jest bardzo korzystne w stosunku do krwi. Dieta bezkrwawa nie ma takich ograniczeń etycznych, jak stosowanie ludzkiej krwi czy zwierząt doświadczalnych. Zastępowanie zwierząt w eksperymentach jest częścią naszej polityki trzech R.

Wymień, zmniejsz, udoskonal. Rezygnacja z krwi zmniejsza koszty i logistykę związaną z pobieraniem, przechowywaniem i utrzymaniem czerwonej krwi. Stosowanie sztucznych diet może ułatwić testowanie cząsteczek anty plasmodium.

Do tej pory testowaliśmy nasze diety z wykorzystaniem różnych gatunków Anopheles. We wszystkich z nich dieta była dobrze nabrzmiała przez samice i pozwalała na produkcję i składanie jaj. Uważamy, że ta dieta może mieć potencjalne zastosowanie w hodowli innych gatunków komarów.

Właściwie teraz testujemy go pod kątem aedesa, wektora wielu chorób, takich jak gorączka denga, wirus zika czy żółta febra. Utrzymuj komary odmiany anopheles coluzzii yaonde w pomieszczeniu o temperaturze 26 stopni Celsjusza, wilgotności 75% i w cyklu od 12 godzin do 12 godzin w ciemności. Komary domowe w standardowych warunkach insektorowych w jednej klatce, aby zagwarantować krycie.

Użyj plastikowej pipety, aby zebrać poczwarki komarów do małego pojemnika na wodę. Umieść pojemnik w klatce na komary, aby dorosłe komary mogły się wyłonić i połączyć w pary. Umieść w klatce 10% roztwór do karmienia glukozą.

Trzy dni po wzejściu użyj aspiratora, aby zebrać niezbędną liczbę samic z klatki do papierowego kubka. Aby odróżnić, samice są większe, a samce mają szerszą i pierzastą trąbkę. Na dzień przed karmieniem usuń 10% roztwór do karmienia glukozą.

Następnego dnia przygotuj sztuczne diety płynne w sterylnych warunkach w komorze laminarnej zgodnie z rękopisem. Dodaj wszystkie składniki do plastikowej tuby. Dokładnie wymieszaj wszystkie składniki i przefiltruj za pomocą mikrofiltra 0,45 mikrona.

Napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 1 mililitra wyposażoną w półcalową igłę o rozmiarze 27 100 mikrolitrami jednego miligrama na mililitr heparyny. Następnie znieczulij sześcio- do ośmiotygodniowych samic myszy CD ketaminą i ksylazyną drogą dootrzewnową. Oceń, czy mysz wykazuje jakąkolwiek reakcję mięśniową i odpowiedź na różne bodźce fizyczne.

Wykonaj nakłucie serca. Następnie zbierz krew z myszy do mikroprobówki i utrzymuj krew w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Następnie zbierz około 30 samic komarów z klatki za pomocą aspiratora.

Przenieś samice komarów do 500-mililitrowych papierowych kubków i przykryj drobną siatką moskitiery, aby nie mogły uciec. Rozciągnąć membranę parafilmową w poprzek ujścia szklanego podajnika, aby pomieścić mączkę. Nałóż urządzenie do sztucznego karmienia ze szklanym dzwonkiem podłączone do plastikowych rurek na górze każdej filiżanki.

Zapewnij stały przepływ wody do cylindrycznej rurki i podajnika, tak aby temperatura wewnątrz była utrzymywana na poziomie około 37,5 stopnia Celsjusza. Nałóż jeden mililitr podgrzanej płynnej diety o temperaturze 37 stopni Celsjusza lub świeżej krwi myszy do szklanego karmnika. Karm komary przez 60 minut w ciemności w temperaturze 26 stopni Celsjusza.

Po sztucznym karmieniu komary należy znieczulić na zimno w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 30 sekund. Następnie umieść komary na schłodzonej szalce Petriego. Zapisz liczbę w pełni nabrzmiałych samic komarów.

Oddziel 30 w pełni nabrzmiałych samic i umieść je w nowej klatce. Teraz umieść nawilżoną bibułę filtracyjną na dnie każdej klatki. Utrzymuj komary w temperaturze 26 stopni Celsjusza, wilgotności 75% i w 12-godzinnym cyklu jasnej ciemności z 10% glukozy ad libitum.

Po 96 godzinach i 120 godzinach od karmienia policz jaja za pomocą ręcznej lupy. Zalej bibułę filtracyjną wodą destylowaną, aby zebrać jaja do tacek wypełnionych wodą destylowaną. Codziennie karm larwy około 13 miligramami mielonego pokarmu dla ryb na tacę.

Codziennie usuwaj martwe poczwarki i larwy plastikową pipetą. Kiedy wszystkie poczwarki rozwiną się w dorosłe osobniki, policz liczbę dorosłych samców i samic, zarejestruj daty wylęgu i śmierci oraz oblicz wskaźniki śmiertelności. Aby przetestować długowieczność, zbierz 15 dorosłych samców i 15 dorosłych samic z pokolenia F1 z każdej grupy dietetycznej do papierowego kubka.

Nakarm dorosłych 10% roztworem glukozy ad libitum. Używaj pęsety lub szczoteczki, aby codziennie usuwać martwe osoby dorosłe. Utrzymuj komary w tej samej temperaturze, wilgotności, warunkach cyklu świetlnego i reżimie karmienia cukrem.

Zarejestruj daty śmierci i oblicz długowieczność. Aby zmierzyć długość skrzydeł, znieczulenie na zimno znieczula pięciodniowe dorosłe samce i samice komarów F1 z każdej grupy dietetycznej w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 90 sekund. Pod stereoskopem delikatnie chwyć klatkę piersiową każdego komara kleszczami i umieść je brzuszną stroną do góry.

Zebrać oba skrzydełka za pomocą skalpela i umieścić je na czystym szkiełku mikroskopowym zawierającym wysuszoną kroplę podłoża montażowego do dalszych pomiarów za pomocą okularu z podziałką. Zmierz długość skrzydła za pomocą stereoskopu za pomocą mikrometru. W tym badaniu porównano wydajność samic komarów Anopheles karmionych bogatą sztuczną mączką i komarów karmionych początkową dietą płynną lub posiłkiem ze świeżej krwi.

Liczba nabrzmiałych samic komarów karmionych bogatą sztuczną mączką na poziomie 89% była znacznie wyższa niż liczba nabrzmiałych samic karmionych krwią na poziomie 56%Pokolenie komarów F1 karmionych krwią lub bogatym sztucznym mączką miało porównywalne wskaźniki śmiertelności i przeżycia. Zmienność była wyższa u komarów karmionych krwią w porównaniu z komarami karmionymi bogatą sztuczną mączką. Jeśli chodzi o wielkość dorosłego osobnika, komary F1 anopheles karmione bogatą sztuczną mączką mieściły się w oczekiwanym zakresie i były podobne do komarów żywionych krwią.

Moim zdaniem bardzo ważne jest prawidłowe zmontowanie podajników z parafilmem, aby uniknąć jego pęknięcia. Jeśli membrana nie jest dobrze przymocowana do szklanego podajnika, możesz stracić mączkę i prawdopodobnie stracić część komarów, ponieważ mogą one zostać przykryte mączką i umrzeć. Chcielibyśmy przeprowadzić test przyciągania podwójnego wyboru, na przykład za pomocą olfaktometru, abyśmy mogli ocenić, czy nasze samice są bardziej pociągane do sztucznej diety, czy do krwi.

Obecnie liofilizujemy sztuczną dietę i badamy jej stabilność w różnych temperaturach. Oprócz oczywistych ulepszeń w zakresie stabilności i przechowywania, nad którymi pracujemy, należy zbadać długoterminowe stosowanie diety w zakresie sprawności i fizjologii komarów. Uważam, że produkcja anofeles bez krwi ogromnie ułatwi badania wektorowe i wdrażanie narzędzi kontroli, które są zależne od dużej liczby komarów.