Name: Bezkrwawa dieta do hodowli komarów Anopheline (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj metodę hodowli komarów Anopheles bez użycia krwi dzięki sztucznej diecie. To innowacyjne podejście wspiera rozmnażanie i produkcję jaj, eliminując etyczne ograniczenia oraz obniżając koszty badań nad malarią.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Dinorze Lopes (IHMT-NOVA Animal Facility) za wsparcie techniczne, Joanie Gomes i Anie Catarinie Alves (IHMT-NOVA Insectary Facility) za utrzymanie kolonii komarów Anopheles. Finansowane przez Fundację Billa i Melindy Gatesów (OPP1138841), Fundação para a Ciência e Tecnologia (UID/Multi/04413/201, UID/Multi/04326/2013, SFRH/BPD/89811/2012, CEECIND/00450/2017).

Myszy zostały pozyskane z domu dla zwierząt IHMT. Doświadczenia na zwierzętach prowadzono w ścisłej zgodności z portugalskim prawem i wytycznymi dotyczącymi wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych. Direção-Geral de Veterinária, Ministério da Agricultura do Desenvolvimento Rural e das Pescas, Portugalia zatwierdziła wszystkie protokoły badań (zatwierdzenia id: 023351 i 023355).
UWAGA: Wykonaj wszystkie testy karmienia w temperaturze ~26 °C.
1. Komary
<ol>
	<li>Utrzymuj komary szczepu Anopheles coluzzii (dawniej Anopheles gambiae forma M) Yaoundé w temperaturze 26 °C, wilgotności 75% w cyklu 12 godzin: 12 godzin światło: ciemność. Komary domowe stosujące standardowe warunki owadobójcze, aby zagwarantować krycie.</li>
	<li>Zbierz poczwarki komarów do małego pojemnika na wodę. Umieść pojemnik w klatce na komary, aby dorosłe komary mogły się wyłonić i połączyć w pary. Zapewnij 10% roztwór do karmienia glukozą. Trzy dni po wzejściu zbierz potrzebną liczbę komarów z klatki za pomocą aspiratora.</li>
	<li>Na dzień przed próbami karmienia usuń 10% roztwór do karmienia glukozą. 
	UWAGA: W trakcie eksperymentów wykorzystano 3 jednodniowe komary.</li>
</ol>
2. Karmienie komarów
<ol>
	<li>Przygotowanie sztucznych diet płynnych
	<ol>
		<li>Przygotuj sztuczne diety płynne w sterylnych warunkach w komorze z przepływem laminarnym. Przygotuj bogatą dietę płynną (r-liq_diet), dodając następujące składniki do początkowej diety płynnej (i-liq_diet; Zmodyfikowana pożywka Eagle'a firmy Dulbecco [wysoka zawartość glukozy z L-glutaminą], patrz tabela 1): 0,55 g/L ATP, 1 g/L cholesterolu i 200 g/l albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Dokładnie wymieszaj wszystkie składniki i przefiltruj za pomocą mikrofiltra 0,45 μm. 
		UWAGA: Nie przechowuj diet; Do każdego eksperymentu należy przygotowywać diety świeżo z roztworów podstawowych, ponieważ tracą one jakość podczas przechowywania. Składniki diet opisano w tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie krwi myszy
	<ol>
		<li>Znieczulenie 6-8 tygodniowych samic myszy CD1 (Mus musculus) ketaminą (120 mg/kg) i ksylazyną (16 mg/kg) drogą dootrzewnową.</li>
		<li>Wykonaj nakłucie serca (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), gdy mysz nie wykazuje żadnej reakcji mięśniowej w odpowiedzi na różne bodźce fizyczne (np. szczypanie palców u nóg i ogona).</li>
		<li>Krew należy pobrać za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o wymiarach 27 G x 1/2 (0,4 x 12 mm2), która zawiera 100 μl heparyny (soli sodowej) o stężeniu 1 mg/mL, aby zapobiec tworzeniu się skrzepów krwi. Utrzymywać temperaturę krwi w temperaturze 37 °C za pomocą łaźni wodnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sztuczne karmienie
	<ol>
		<li>Zbierz około 30 samic komarów z klatki za pomocą aspiratora.</li>
		<li>Przenieś samice komarów do papierowych kubków o pojemności 500 ml i przykryj drobną siatką moskitiery, aby nie mogły uciec. Zastosuj szklany podajnik podłączony do plastikowych rurek, aby utrzymać stały przepływ wody do górnej części każdej filiżanki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2). Zapewnić stały przepływ wody do cylindrycznej rurki i podajnika, tak aby temperatura wewnątrz była utrzymywana na poziomie około 37.5 °C. 
		UWAGA: Standardowe urządzenie do sztucznego karmienia szklanym dzwonem16 zostało użyte do dostarczania opracowanych diet samicom komarów.</li>
		<li>Rozciągnąć membranę z folii parafinowej w poprzek ujścia szklanego podajnika, aby pomieścić posiłek.</li>
		<li>Podgrzej i-liq_diet i r-liq_diet w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej. Nałóż 1 ml do podajnika szklanki. Karm komary przez 60 minut w ciemności i-liq_diet, r-liq_diet lub świeżą krwią myszy. Wykonać testy w temperaturze 26 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena szybkości karmienia.
	<ol>
		<li>Po sztucznym karmieniu komary należy znieczulić na zimno w temperaturze -20 °C przez 30 s. Umieść komary w schłodzonej szalce Petriego.</li>
		<li>Zapisz liczbę w pełni nabrzmiałych (<silna klasa="xfig">Rysunek 3) samic komarów. 
		UWAGA: Procent karmionych komarów jest używany jako wskaźnik sukcesu karmienia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Cechy historii życia
<ol>
	<li>Produkcja jaj i płodność
	<ol>
		<li>Przenieś w pełni nabrzmiałe samice za pomocą pędzla do indywidualnych klatek (20 cm x 20 cm x 20 cm).</li>
		<li>Utrzymuj komary w temperaturze 26 ± 1 °C, wilgotności 75% i cyklu 12 h: 12 godzin światło: ciemność z 10% glukozy ad libitum.</li>
		<li>Czterdzieści osiem godzin po karmieniu dodaj na dnie nawilżoną bibułę filtracyjną do składania jaj (ryc. 4). Policz jaja po 48 i 72 godzinach od dodania bibuły do składania jaj za pomocą ręcznej lupy. Zalej bibułę filtracyjną wodą destylowaną, aby zebrać jaja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Śmiertelność larw
	<ol>
		<li>Zbierz jajka do tacek (23 cm x 15 cm x 6 cm) wypełnionych wodą destylowaną (<silna klasa="xfig">Rysunek 5). Podczas eksperymentów utrzymuj stały poziom wody w tacach.</li>
		<li>Codziennie karm larwy około 13 mg mielonego pokarmu dla ryb na tacę. Zastosuj podobny reżim karmienia do wszystkich tacek z replikami.</li>
		<li>Codziennie usuwaj martwe poczwarki i larwy. Zakończ eksperymenty, gdy wszystkie poczwarki rozwiną się w dorosłe osobniki i policz liczbę dorosłych samców i samic.</li>
		<li>Rejestruj daty wylęgu i śmierci oraz obliczaj wskaźniki śmiertelności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>długowieczność
	<ol>
		<li>Zbierz 15 dorosłych samców i 15 dorosłych samic z pokolenia F1 z każdej grupy dietetycznej. Trzymaj samce i samice w tej samej klatce.</li>
		<li>Podawaj dorosłym 10% roztwór glukozy ad libitum. Codziennie usuwaj martwe dorosłe osoby.</li>
		<li>Utrzymuj komary w tej samej temperaturze, wilgotności, warunkach cyklu świetlnego i reżimie podawania cukru, jak opisano powyżej.</li>
		<li>Zarejestruj daty śmierci i oblicz długowieczność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar długości skrzydła
	<ol>
		<li>Znieczulenie na zimno pięciodniowych dorosłych komarów F1 (samca i samicy) z każdej grupy dietetycznej w temperaturze -20 °C przez 90 s.</li>
		<li>Pod stereoskopem delikatnie chwyć kleszczami klatkę piersiową każdego komara i umieść je brzuszną stroną do góry.</li>
		<li>Zebrać oba skrzydełka za pomocą skalpela i umieścić je na czystym szkiełku mikroskopowym zawierającym wysuszoną kroplę podłoża montażowego. Za pomocą igły 20 G dodaj dodatkowe podłoże mocujące do krawędzi szkiełka nakrywkowego i powoli opuść szkiełko nakrywkowe na skrzydełka.</li>
		<li>Zmierz długość skrzydła (<silna klasa="xfig">Rysunek 6) za pomocą stereoskopu za pomocą mikrometru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Malaria+Report%22">World Malaria Report</a>. , World Health Organization. (2016).</li>
<li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-way+regulation+of+mosquito+yolk+protein+precursor+genes+by+juvenile+hormone-%2C+ecdysone-%2C+nutrient-%2C+and+insulin-like+peptide+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways.</a> Frontiers in Physiology. 5, 103(2014).</li>
<li>Catteruccia, F., Crisanti, A., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+technologies+to+induce+sterility%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Transgenic technologies to induce sterility.</a> Malaria Journal. 8, Suppl 2 7(2009).</li>
<li>Dame, D. A., Curtis, C. F., Benedict, M. Q., Robinson, A. S., Knols, B. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+applications+of+induced+sterilisation+in+field+populations+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Historical applications of induced sterilisation in field populations of mosquitoes.</a> Malaria Journal. 8, Suppl 2 2(2009).</li>
<li>Lacroix, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+Field+Release+of+Genetically+Engineered+Sterile+Male+Aedes+aegypti+in+Malaysia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Open Field Release of Genetically Engineered Sterile Male Aedes aegypti in Malaysia.</a> PLoS One. 7, 42771(2012).</li>
<li>Lea, A. O., Knierim, J. A., Dimond, J. B., Delong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Preliminary+Note+on+Egg+Production+from+Milk-Fed+Mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ohio+Journal+of+Science%22%5BJournal%5D)">A Preliminary Note on Egg Production from Milk-Fed Mosquitoes.</a> The Ohio Journal of Science. 55, 1-21 (1955).</li>
<li>Kogan, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitute+blood+meal+for+investigating+and+maintaining+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 27, 709-712 (1990).</li>
<li>Griffith, J. S., Turner, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+with+a+blood+substitute+diet+for+the+females%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+and+Veterinary+Entomology%22%5BJournal%5D)">Culturing Culex quinquefasciatus mosquitoes with a blood substitute diet for the females.</a> Medical and Veterinary Entomology. 10, 265-268 (1996).</li>
<li>Jason Pitts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blood-free+protein+meal+supporting+oogenesis+in+the+Asian+tiger+mosquito%2C+Aedes+albopictus+%28Skuse%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">A blood-free protein meal supporting oogenesis in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus (Skuse).</a> Journal of Insect Physiology. 64, 1-6 (2014).</li>
<li>Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+serum+and+BSA%2C+but+neither+red+blood+cells+nor+hemoglobin+can+support+vitellogenesis+and+egg+production+in+the+dengue+vector+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti.</a> PeerJ. 3, 938(2015).</li>
<li>Gonzales, K. K., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Diets+for+Mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Artificial Diets for Mosquitoes.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 13 (12), 1267(2016).</li>
<li>Cosgrove, J. B., Wood, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+variations+in+a+formulated+protein+meal+on+the+fecundity+and+fertility+of+female+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+and+Veterinary+Entomology%22%5BJournal%5D)">Effects of variations in a formulated protein meal on the fecundity and fertility of female mosquitoes.</a> Medical and Veterinary Entomology. 10, 260-264 (1996).</li>
<li>Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. -H., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+cationic+amino+acid+transporters+required+for+nutritional+signalling+during+mosquito+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signalling during mosquito reproduction.</a> Journal of Experimental Biology. 209, 3071-3078 (2006).</li>
<li>Clements, A. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClements%2C+AN+%22The+biology+of+mosquitoes%3A+Development%2C+nutrition%2C+and+reproduction%22">The biology of mosquitoes: Development, nutrition, and reproduction</a>. , Chapman & Hall. New York, NY. (1992).</li>
<li>Talyuli, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+a+chemically+defined+artificial+diet+as+a+tool+to+study+Aedes+aegypti+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">The use of a chemically defined artificial diet as a tool to study Aedes aegypti physiology.</a> Journal of Insect Physiology. 83, 1-7 (2015).</li>
<li>Lopes, L. F., Abrantes, P., Silva, A. P., Dorosario, V. E., Silveira, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+yoelii%3A+The+effect+of+second+blood+meal+and+anti-sporozoite+antibodies+on+development+and+gene+expression+in+the+mosquito+vector%2C+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Plasmodium yoelii: The effect of second blood meal and anti-sporozoite antibodies on development and gene expression in the mosquito vector, Anopheles stephensi.</a> Experimental Parasitology. 115, 259-269 (2007).</li>
<li>Phasomkusolsil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+mosquito+vectors%3A+effects+of+blood+source+on+feeding%2C+survival%2C+fecundity%2C+and+egg+hatching+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vector+Ecology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of mosquito vectors: effects of blood source on feeding, survival, fecundity, and egg hatching rates.</a> Journal of Vector Ecology. 38, 38-45 (2013).</li>
<li>Gillies, M. T., De Meillon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Anophelinae+of+Africa+South+of+the+Sahara+%28Ethiopian+zoogeographical+region%29%5BTitle%5D)+AND+%22Publications+of+the+South+African+Institute+for+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">The Anophelinae of Africa South of the Sahara (Ethiopian zoogeographical region).</a> Publications of the South African Institute for Medical Research. 54, 1(1968).</li>
<li>Canavoso, L. E., Jouni, Z. E., Karnas, K. J., Pennington, J. E., Wells, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+metabolism+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Fat metabolism in insects.</a> Annual Review of Nutrition. 21, 23-46 (2001).</li>
<li>Clifton, M. E., Noriega, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fate+of+follicles+after+a+blood+meal+is+dependent+on+previtellogenic+nutrition+and+juvenile+hormone+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">The fate of follicles after a blood meal is dependent on previtellogenic nutrition and juvenile hormone in Aedes aegypti.</a> Journal of Insect Physiology. 58, 1007-1019 (2012).</li>
<li>Gonzales, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+SkitoSnack%2C+an+Artificial+Blood+Meal+Replacement+on+Aedes+aegypti+Life+History+Traits+and+Gut+Microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota.</a> Scientific Reports. 8, 11023(2018).</li>
<li>Vodovotz, Y., Zamora, R., Lieber, M. J., Luckhart, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-talk+between+nitric+oxide+and+transforming+growth+factor-beta1+in+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cross-talk between nitric oxide and transforming growth factor-beta1 in malaria.</a> Current Molecular Medicine. 4, 787-797 (2004).</li>
<li>Sumba, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daily+oviposition+patterns+of+the+African+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+Giles+%28Diptera%3A+Culicidae%29+on+different+types+of+aqueous+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Circadian+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Daily oviposition patterns of the African malaria mosquito Anopheles gambiae Giles (Diptera: Culicidae) on different types of aqueous substrates.</a> Journal of Circadian Rhythms. 2, 6(2004).</li>
<li>Baughman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+stable+blood+meal+alternative+for+rearing+Aedes+and+Anopheles+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11, 0006142(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Sukces naszej opracowanej diety bezkrwistej jest prawdopodobnie wynikiem synergicznego fizjologicznego działania wszystkich składników dodanych do i-liq_diet (bogatego w cukier, aminokwasy, witaminy i mikroelementy): BSA (źródło białka), ATP (fagostymulant) i cholesterolu (źródło lipidów). Suplementacja r-liq_diet poszczególnymi składnikami sama w sobie nie była skuteczna w stymulowaniu produkcji jaj (dane nie pokazane). Jedną z wad protokołu może być koszt niektórych składników, takich jak cholesterol. Mimo to jego obecność jest fundamentalna, ponieważ owady nie są w stanie go syntetyzować19 , a cząsteczka ta jest prekursorem hormonów ekdysteroidowych, które regulują syntezę żółtka i dojrzewanie jaj u stawonogów20. Niższe ilości cholesterolu powinny być badane w celu optymalizacji potrzebnej ilości w celu obniżenia kosztów i zwiększenia korzyści płynących ze sztucznej diety.
Kolejnym ograniczeniem metody jest to, że sztuczna dieta musi być świeżo przygotowana z roztworów podstawowych, ponieważ raz przygotowana w końcowej postaci płynnej traci jakość po przechowywaniu. W przyszłości nasza dieta może być przygotowywana w postaci suszu elektrycznego, podobnie jak SkitoSnackt, sztuczny zamiennik mączki z krwi dla komarów Aedes aegypti 21.
Oprócz dostarczania niezbędnych składników odżywczych, sztuczny posiłek musi przyciągać i stymulować samice komarów do żerowania w taki sam sposób, jak wtedy, gdy żywią się świeżą krwią kręgowców. Opisana tu sztuczna dieta bezkrwawa spowodowała 20% wzrost liczby w pełni nabrzmiałych samic komarów w porównaniu z grupą kręgowców karmionych krwią. Ta pośrednia miara atrakcyjności może być dodatkowo wyjaśniona za pomocą olfaktometrów, aby potwierdzić, że sztuczna dieta jest bardziej atrakcyjna i bardziej atrakcyjna dla komarów niż świeża krew.
Największy wpływ diety na śmiertelność larw zaobserwowano w przypadku larw pochodzących od komarów żywiących się krwią, co sugeruje, że sztuczna dieta o stabilnym składzie może przyczynić się do zmniejszenia śmiertelności i poprawy sukcesu lęgowego komarów w porównaniu ze świeżą krwią. Mniej przewidywalny wynik posiłku z krwi może wynikać z różnic w składzie gospodarza17 i obecności we krwi cząsteczek, które mogą zakłócać fizjologię komarów22. Powyższe fakty podkreślają korzyści dla wysokiej jakości hodowli komarów w diecie bezkrwawej.
Ogólnie rzecz biorąc, średnia liczba jaj składanych w naszym badaniu była niska w stosunku do tych zgłaszanych u niektórych owadów, ale średnia liczba jaj składanych w jajach była porównywalna z hodowanym w laboratorium szczepem A. gambiae karmionym ludzką krwią (22,6 ± 5,5 jaj/samicę)23. Nie zaobserwowano istotnych różnic statystycznych między naszymi grupami eksperymentalnymi karmionymi zarówno świeżą krwią, jak i sztucznymi posiłkami (Tabela 2), co sugeruje, że wdrożenie sztucznych systemów żywienia membranowego w naszej opracowanej diecie jest wystarczające do utrzymania i rozmnażania kolonii komarów Anopheles w niewoli.
Sztuczne, bezkrwawe posiłki mogą utrzymać kolonie Aedes 22, ale w przypadku komarów Anopheles są ograniczone lub nie mają żadnego skutku11. Niedawno opisano sztuczny posiłek na bazie osocza dla komarów Anopheles 24 , ale wskaźniki żerowania i potencjał reprodukcyjny były niskie. Nasze wyniki stanowią znaczny postęp w dziedzinie wiedzy naukowej (sprawdzonej przez Gonzalesa i Hansena11), ponieważ nasz sformułowany r-liq_diet miał podobną lub lepszą wydajność niż standardowa mączka z krwi kręgowców. Dalsza poprawa stabilności i kosztów magazynowania powinna poszerzyć zakres jego zastosowania.

Choroby przenoszone przez wektory dotykają kilka milionów ludzi na całym świecie i powodują miliony zgonów każdego roku. Przenoszone są przez owady zakażone mikroorganizmami chorobotwórczymi (pierwotniaki, wirusy) nabytymi, gdy żywią się krwią zakażonego żywiciela. Następnie zakażony wektor przekaże patogen nowemu gospodarzowi podczas następnego posiłku z krwi. Malaria jest najbardziej śmiertelną chorobą przenoszoną przez wektory, która jest przenoszona przez kilka różnych gatunków komarów Anopheles i dotyka 40% światowej populacji1. Pasożyt protista malarii jest odpowiedzialny za ponad 400 000 zgonów rocznie, z czego większość to dzieci poniżej 5 roku życia (Światowa Organizacja Zdrowia). Samica komara Anopheles przenosi pasożyta malarii z rodzaju Plasmodium między ludźmi a innymi zwierzętami, gdy żywi się krwią kręgowców, co jest niezbędnym krokiem do produkcji i rozwoju jaj2.
Obecne strategie zwalczania malarii i innych pojawiających się śmiertelnych chorób przenoszonych przez komary opierają się na rozwoju innowacyjnych strategii zwalczania komarów3,4,5, które obejmują wypuszczenie na wolność dużej liczby komarów hodowanych w owadach. Jednak kluczowym czynnikiem ograniczającym jest zależność od dopływu świeżej krwi w celu skutecznego wychowania i rozmnażania komarów. Zmienny skład krwi kręgowców może negatywnie wpływać na płodność komarów i przystosowanie potomstwa oraz może ograniczać niezawodność i trwałość kolonii hodowlanych w niewoli. Programy wypuszczania i zwalczania komarów wymagają systemów produkcji komarów na dużą skalę i regularnych dostaw dużych ilości krwi kręgowców. Jest to główna przeszkoda w produkcji komarów i rodzi szereg problemów etycznych związanych z wykorzystywaniem żywych zwierząt i ograniczeniami logistycznymi spowodowanymi związanymi z tym wymagającymi przepisami bezpieczeństwa. Sprawia to, że koszty utrzymania i bezpieczeństwa kolonii komarów są wysokie i stanowią wyzwanie dla zrównoważonego charakteru obecnych praktyk hodowli komarów, szczególnie w krajach o niskich dochodach, gdzie zagrożenie malarią jest znacznie większe.
Ostatnio badania koncentrowały się na rozwoju substytutów krwi, które naśladują mączkę z krwi kręgowców, ale jak dotąd osiągnięto tylko ograniczony sukces6,7,8,9. Skuteczna sztuczna dieta musi (1) wywołać pełny obrzęk samic komarów, (2) wyzwolić produkcję witellogeniny, (3) wyprodukować duże partie zdolnych do życia jaj i (4) wygenerować zdrowe potomstwo10. Ponadto sztuczne diety mają standardowy skład, a zatem są bardziej niezawodne w produkcji komarów do celów badawczych i kontrolnych. Skuteczne diety bezkrwiste zostały opracowane dla komarów Aedes (sprawdzone przez Gonzales i Hansen11), ale nie dla Anopheles spp. Istniejące sztuczne diety zawierają fagostymulant (np. ATP10), źródło białka do dojrzewania jaj6,12, węglowodany jako źródło energii i aminokwasy (aa)13, które mają fundamentalne znaczenie dla produkcji jaj i są głównym czynnikiem ograniczającym płodność komarów14. Sztuczna dieta bezkrwista musi również dostarczać cholesterolu15, co poprawia produkcję jaj. W tym miejscu opisujemy sztuczną dietę bezkrwistą dla samic komarów Anopheles i wykazujemy, że ma ona stałą i równoważną wydajność do wysokiej jakości mączki z krwi kręgowców.

<table><tbody><tr><td>Hydrat soli disodowej adenozyno5'-trifosforanu (ATP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A790G</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>MP Biomedicals</td><td>199342</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Eagle's Dulbecco (wysoka glukoza z L-glutaminą)</td><td>Lonza Bioscience</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Montaż Entellan średni</td><td>Merck</td><td>1079610100</td><td></td></tr><tr><td>Glassfeeder</td><td>Lokalny szklarz</td><td>z projektu</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna Sól sodowa</td><td>Pan Reac AppliChem</td><td>A3004,0001</td><td></td></tr><tr><td>Imalg&egrave; ne 1000</td><td>Merial, Portugalia</td><td>01MER122</td><td></td></tr><tr><td>Igła 20 G x 1" Igła 0,9 x 25 mm</td><td>Terumo Europe</td><td>NN-2025R</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6543-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer, Portugalia</td><td>7427831</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka do sterylizacji Millex-HV 0,45</td><td>Millipore</td><td>SLHVR25KS</td><td></td></tr>, <tr><td>1ml, 27 G x &frac12; " Igła 0,4 x 12 mm</td><td>Terumo Europe</td><td>BS-NIN2713</td><td></td></tr><tr><td>Teich Mix Astra Pond</td><td>Astra</td><td>4030733100957</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Płatki Złotej Rybki</td><td>Tetra</td><td>4004218742642</td><td></td></tr></tbody></table>

bezkrwawa dieta do hodowli komarów anopheline

A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes

Badania nad malarią wymagają warunków hodowli i produkcji komarów (Anopheles spp.) w niewoli na dużą skalę. Zrównoważona i niezawodna produkcja komarów jest obecnie hamowana przez dostarczanie świeżej krwi kręgowców. Alternatywy dla krwi są potrzebne do promowania skutecznych strategii zwalczania malarii i innych chorób przenoszonych przez wektory, które są przenoszone przez owady żywiące się krwią. Mając to na uwadze, opracowano sztuczne diety płynne jako substytuty świeżej krwi kręgowców. W niniejszym artykule przedstawiamy bezkrwawą, sztuczną, płynną dietę, która zapewnia tempo odżywiania podobne do krwi i naśladuje fizjologiczne efekty świeżej mączki z krwi kręgowców. Dieta indukuje dojrzewanie jajników i jaj komarów Anopheles, a także zapewnia dobrą przeżywalność larw i rozwój funkcjonalnych dorosłych osobników. Opracowana bezkrwawa dieta płynna stanowi ważny postęp w kierunku zrównoważonej hodowli komarów w niewoli i zmniejszy koszty utrzymania kolonii komarów oraz wyeliminuje potrzebę świeżej krwi kręgowców.

Wyniki opisane poniżej porównują wydajność samic komarów z rodzaju Anopheles karmionych sformułowanym, bogatym sztucznym pokarmem (r-liq_diet) oraz komarów karmionych początkową dietą płynną (i-liq_diet) lub świeżą krwią. Dietę przetestowano zgodnie ze schematem protokołu przedstawionym na Rysunku 7. Opisana tutaj dieta r-liq_diet jest częścią patentu (PCT/IB2019/052967).
Procent w pełni nasyconych samic
Liczba nasyconych samic komarów karmionych dietą r-liq_diet (89%) była istotnie wyższa niż liczba nasyconych samic karmionych krwią (56%) (Rysunek 8).
Płodność i rozrodczość
W celu oceny jakości żywieniowej diet i-liq_diet oraz r-liq_diet zastosowano wskaźniki płodności i rozrodczości samic w pierwszym cyklu gonotroficznym. Samice karmione świeżą krwią kręgowców złożyły średnio 24 ± 11 jaj, natomiast samice karmione dietą r-liq_diet złożyły średnio 25 ± 5 jaj (Tabela 2). U samic karmionych dietą i-liq_diet nie zaobserwowano składania jaj.
Śmiertelność pokolenia F1
Oceniono kondycję komórkomózgów F1 z kolonii karmionych krwią kręgowców lub dietą r-liq_diet. Odnotowano śmiertelność larw, poczwarek oraz osobników dorosłych. Zmienność (błąd standardowy średniej [SEM]) była wyższa u komarów karmionych krwią (Rysunek 9 i Tabela 2) w porównaniu do komarów karmionych dietą r-liq_diet. Pokolenie F1 komarów karmionych krwią lub dietą r-liq_diet wykazało porównywalne wskaźniki śmiertelności i przeżywalności.
Przewidywana długość życia F1
Według szacunków Center for Disease Control and Prevention dzikie dorosłe samice komarów żyją do miesiąca, lecz prawdopodobnie nie przeżywają więcej niż 1−2 tygodnie, natomiast samce żyją około tygodnia i żywią się wyłącznie nektarem oraz innymi źródłami cukrów. Zauważono, że różnice w spożyciu pokarmu przez rodziców mogą wpływać na przeżywalność potomstwa komarów17. W naszym doświadczeniu dorosłe samice i samce w grupach blood (samice 24,5 ± 6,8; samce 18,5 ± 6,9) oraz r-liq_diet (samice: 22,5 ± 8,1; samce: 11,9 ± 6,9) miały zbliżoną średnią przewidywaną długość życia (Tabela 3), a samice wykazały dłuższą żywotność w porównaniu do samców.
Wielkość ciała F1
Długość skrzydła posłużyła jako wskaźnik wielkości ciała osobników dorosłych. W porównaniu z innymi gatunkami, dorosłe osobniki Anopheles są komarami o małej lub średniej wielkości, z długością skrzydła od 2.8 do 4.4 mm18. Wielkość ciała dorosłych komarów Anopheles pokolenia F1 karmionych dietą r-liq_diet mieściła się w oczekiwanym zakresie i była zbliżona do wielkości komarów z insektarium karmionych krwią (Rysunek 10).
Analiza statystyczna
Przedstawione dane reprezentują średnią z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów (chyba że zaznaczono inaczej). Słupki błędów reprezentują SEM. W przypadku danych o rozkładzie Gaussa grupy niezależne porównywano za pomocą testu t Studenta, w przeciwnym razie zastosowano test Mann-Whitneya. Różnice między grupami karmionymi sztuczną dietą analizowano za pomocą dokładnego testu Fishera i uznano za istotne przy P ≤ 0,05.
<img alt="Sekcja myszy; konfiguracja eksperymentu naukowego; strzykawka; laboratorium; badanie anatomiczne; narzędzie badawcze." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig1a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Pobieranie krwi z myszy CD1 poprzez punkcję wewnątrzsercową. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ do filtracji próżniowej w celu oddzielenia cząsteczek, przedstawiający aparat filtracyjny i sito." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig2a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Standardowy aparat do sztucznego karmienia. Szklany karmnik zawiera r-liq_diet, którą podaje się samicom komarów z rodzaju Anopheles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie identyfikacji komarów; badanie morfologiczne; zdjęcie w zbliżeniu do badań entomologicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig03v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Komary Anopheles po sztucznym karmieniu. Od lewej do prawej: w pełni nasycona samica karmiona r-liq_diet, nienasycona samica karmiona r-liq_diet, samiec oraz w pełni nasycona samica karmiona krwią myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig03largev3.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Proces krystalizacji w układzie filtracyjnym; obraz mikroskopowy formowania się kryształów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Jaja Anopheles złożone 48 h po karmieniu samic dietą r-liq_diet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig4alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Larwy owadów w plastikowym pojemniku do obserwacji laboratoryjnych i badań nad biologią rozwoju." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Stadia larw L2, które wykluły się z jaj, zostały zebrane na papierze filtracyjnym i umieszczone w tackach z wodą destylowaną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy skrzydła owada ukazujący struktury przypominające pióra; pasek skali wskazuje 1 mm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Prawe skrzydło samicy komara Anopheles coluzzii z generacji F1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat cyklu życiowego Anopheles coluzzii; karmienie, reprodukcja, badanie śmiertelności, schemat blokowy eksperymentu z komarami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig07v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Schemat protokołu testowania sztucznej diety. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig07largev3.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza spożycia pokarmu; porównanie procentowe diet: krew, dieta r-liquid i dieta i-liquid na wykresie kołowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig08v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Tempo żerowania samic komarów karmionych dietami sztucznymi lub krwią. Gwiazdki oznaczają istotne różnice między komarami karmionymi dietami r-liquid i i-liquid a grupą kontrolną karmioną krwią. Dwustronny dokładny test Fishera: ****P ≤ 0.0001 (ryzyko względne: 0.4828, 95% przedział ufności [CL]: 0.3776 do 0.6194) dla diety r-liquid w porównaniu z krwią, *P = 0.0335 (ryzyko względne: 1.379, 95% CL: 1.044 do 1.836) dla krwi w porównaniu z dietą i-liquid. Niebieski: niekarmione; czerwony: karmione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig08largev3.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wpływ diety na cykl życiowy owadów; wykres rozrzutu; analiza % zmian; śmiertelność larw, poczwarek i osobników dorosłych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig09v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9: Wpływ sformułowanej bezkrwistej paszy na śmiertelność oraz stosunek samców do samic komarów F1 Anopheles coluzzii. Przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty, w każdym z nich wykorzystując po 30 komarów na dietę. Nieparzysty test t nie wykazał istotnych różnic między grupą karmioną krwią a grupą karmioną dietą r-liq_diet (wartości P wahały się od 0,5047 do 0,8491). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig09largev3.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie długości skrzydeł muchy; wykres słupkowy; samice, samce; dieta płynna vs krew." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig10v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 10"> 
Rysunek 10: Długość skrzydła. Do wyznaczenia długości skrzydła wykorzystano odległość od nacięcia osiowego do żyłki R4+5 z wyłączeniem szczecinek frędzlowatych. Wielkość oceniono dla 5 samic i 5 samców z każdej grupy dietetycznej (średnia ± SEM). Wartości przedstawiono jako średnia ± SEM. Kolor łososiowy: r-liq_diet; kolor czerwony: krew kręgowców. Nieparzysty test t; lewe skrzydło samicy: t = 1.300, df = 8, P = 0.2298; lewe skrzydło samca: t = 2.400, df = 8, P = 0.0432; prawe skrzydło samicy: t = 1.300, df = 8, P = 0.2298; prawe skrzydło samca: t = 2.277, df = 7, P = 0.0569. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig10largev3.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponenty</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenozynotrifosforan</td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumina surowicy bydlęcej</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Cholesterol</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorek wapnia bezwodny</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorek choliny</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-pantenotranian wapnia (witaminy B5)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glukoza bezwodna</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azotan żelaza(III) nonohydrat</td>
			<td>0.0001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas foliowy</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicyna</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-inozytol</td>
			<td>0.007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monochlorowodorek L-argininy</td>
			<td>0.084</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dwuwodowodorek L-cystyny</td>
			<td>0.063</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamina</td>
			<td>0.584</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monohydrat monochlorek L-histydyny</td>
			<td>0.042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-izoleucyna</td>
			<td>0.105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucyna</td>
			<td>0.105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monochlorowodorek L-lizyny</td>
			<td>0.146</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-metionina</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-fenyloalanina</td>
			<td>0.066</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-seryna</td>
			<td>0.042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-treonina</td>
			<td>0.095</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptofan</td>
			<td>0.016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dwuwodny dwusodowy l-tyrozynian</td>
			<td>0.104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-walina</td>
			<td>0.094</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siarczan magnezu bezwodny</td>
			<td>0.098</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niacynamid (nikotynamid)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czerwony fenol</td>
			<td>0.015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorek potasu</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monohydrochlorowodorek pyridoksyny</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sól sodowa kwasu pirogronowego</td>
			<td>0.011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ryboflawina (witaminy B2)</td>
			<td>0.0004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wodorowęglan sodu</td>
			<td>3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorek sodu</td>
			<td>6.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wodorofosforan sodu bezwodny</td>
			<td>0.109</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amonowodorek tiaminy (witaminy B1)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">*Tylko w r-liq_diet</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład diety płynnej i-liquid oraz diety płynnej r-liquid.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Całkowita liczba jaj (± SEM)</td>
			<td>Liczba jaj/samica (± SEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krew</td>
			<td>733 ± 330</td>
			<td>24 ± 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dieta-ciekła</td>
			<td>763 ± 164</td>
			<td>25 ± 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dieta i-liq</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Partie jaj produkowane przez Anopheles coluzzii samice. Dla każdej diety eksperymentalnej przeprowadzono trzy niezależne doświadczenia, wykorzystując w każdym z nich 30 samic komarów.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Samice (dni ± SEM)</td>
			<td>Samce (dni ± SEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krew</td>
			<td>24.5 ± 6.8</td>
			<td>18.5 ± 6.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r-dieta_płynna</td>
			<td>22.5 ± 8.1</td>
			<td>11.9 ± 6.9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Przewidywana długość życia F1 Anopheles komary. Długość życia komarów pokolenia F1, pochodzących od sztucznie karmionych osobników F0, oceniano poprzez rejestrację dat wylęgu i śmierci każdego komara z tej samej grupy dietetycznej (monitorowano 15 samic i 15 samców). Wyniki przedstawiono jako średnią długość życia komarów w danej grupie dietetycznej.

Przedstawiono protokół tworzenia sztucznej diety bez krwi do karmienia komarów Anopheles w niewoli. Dieta ta ma podobną wydajność do krwi kręgowców i wyzwala oogenezę i dojrzewanie jaj oraz daje zdolne do życia dorosłe potomstwo.

Bezkrwawa dieta do hodowli komarów Anopheline

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable ...

Pasożyty malarii, takie jak spotykane przez komary, odgrywają główną rolę w rozprzestrzenianiu się choroby. Do tej pory nie było możliwe hodowanie komarów malarycznych bez krwi. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, nasz protokół opisuje dietę zastępczą krwi, która jest w stanie wspierać rozmnażanie się komarów w sektorze.Stosowanie diety bezkrwawej jest bardzo korzystne w stosunku do krwi. Dieta bezkrwawa nie ma takich ograniczeń etycznych, jak stosowanie ludzkiej krwi czy zwierząt doświadczalnych. Zastępowanie zwierząt w eksperymentach jest częścią naszej polityki trzech R.Wymień, zmniejsz, udoskonal. Rezygnacja z krwi zmniejsza koszty i logistykę związaną z pobieraniem, przechowywaniem i utrzymaniem czerwonej krwi. Stosowanie sztucznych diet może ułatwić testowanie cząsteczek anty plasmodium.Do tej pory testowaliśmy nasze diety z wykorzystaniem różnych gatunków Anopheles. We wszystkich z nich dieta była dobrze nabrzmiała przez samice i pozwalała na produkcję i składanie jaj. Uważamy, że ta dieta może mieć potencjalne zastosowanie w hodowli innych gatunków komarów.Właściwie teraz testujemy go pod kątem aedesa, wektora wielu chorób, takich jak gorączka denga, wirus zika czy żółta febra. Utrzymuj komary odmiany anopheles coluzzii yaonde w pomieszczeniu o temperaturze 26 stopni Celsjusza, wilgotności 75% i w cyklu od 12 godzin do 12 godzin w ciemności. Komary domowe w standardowych warunkach insektorowych w jednej klatce, aby zagwarantować krycie.Użyj plastikowej pipety, aby zebrać poczwarki komarów do małego pojemnika na wodę. Umieść pojemnik w klatce na komary, aby dorosłe komary mogły się wyłonić i połączyć w pary. Umieść w klatce 10% roztwór do karmienia glukozą.Trzy dni po wzejściu użyj aspiratora, aby zebrać niezbędną liczbę samic z klatki do papierowego kubka. Aby odróżnić, samice są większe, a samce mają szerszą i pierzastą trąbkę. Na dzień przed karmieniem usuń 10% roztwór do karmienia glukozą.Następnego dnia przygotuj sztuczne diety płynne w sterylnych warunkach w komorze laminarnej zgodnie z rękopisem. Dodaj wszystkie składniki do plastikowej tuby. Dokładnie wymieszaj wszystkie składniki i przefiltruj za pomocą mikrofiltra 0,45 mikrona.Napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 1 mililitra wyposażoną w półcalową igłę o rozmiarze 27 100 mikrolitrami jednego miligrama na mililitr heparyny. Następnie znieczulij sześcio- do ośmiotygodniowych samic myszy CD ketaminą i ksylazyną drogą dootrzewnową. Oceń, czy mysz wykazuje jakąkolwiek reakcję mięśniową i odpowiedź na różne bodźce fizyczne.Wykonaj nakłucie serca. Następnie zbierz krew z myszy do mikroprobówki i utrzymuj krew w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Następnie zbierz około 30 samic komarów z klatki za pomocą aspiratora.Przenieś samice komarów do 500-mililitrowych papierowych kubków i przykryj drobną siatką moskitiery, aby nie mogły uciec. Rozciągnąć membranę parafilmową w poprzek ujścia szklanego podajnika, aby pomieścić mączkę. Nałóż urządzenie do sztucznego karmienia ze szklanym dzwonkiem podłączone do plastikowych rurek na górze każdej filiżanki.Zapewnij stały przepływ wody do cylindrycznej rurki i podajnika, tak aby temperatura wewnątrz była utrzymywana na poziomie około 37,5 stopnia Celsjusza. Nałóż jeden mililitr podgrzanej płynnej diety o temperaturze 37 stopni Celsjusza lub świeżej krwi myszy do szklanego karmnika. Karm komary przez 60 minut w ciemności w temperaturze 26 stopni Celsjusza.Po sztucznym karmieniu komary należy znieczulić na zimno w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 30 sekund. Następnie umieść komary na schłodzonej szalce Petriego. Zapisz liczbę w pełni nabrzmiałych samic komarów.Oddziel 30 w pełni nabrzmiałych samic i umieść je w nowej klatce. Teraz umieść nawilżoną bibułę filtracyjną na dnie każdej klatki. Utrzymuj komary w temperaturze 26 stopni Celsjusza, wilgotności 75% i w 12-godzinnym cyklu jasnej ciemności z 10% glukozy ad libitum.Po 96 godzinach i 120 godzinach od karmienia policz jaja za pomocą ręcznej lupy. Zalej bibułę filtracyjną wodą destylowaną, aby zebrać jaja do tacek wypełnionych wodą destylowaną. Codziennie karm larwy około 13 miligramami mielonego pokarmu dla ryb na tacę.Codziennie usuwaj martwe poczwarki i larwy plastikową pipetą. Kiedy wszystkie poczwarki rozwiną się w dorosłe osobniki, policz liczbę dorosłych samców i samic, zarejestruj daty wylęgu i śmierci oraz oblicz wskaźniki śmiertelności. Aby przetestować długowieczność, zbierz 15 dorosłych samców i 15 dorosłych samic z pokolenia F1 z każdej grupy dietetycznej do papierowego kubka.Nakarm dorosłych 10% roztworem glukozy ad libitum. Używaj pęsety lub szczoteczki, aby codziennie usuwać martwe osoby dorosłe. Utrzymuj komary w tej samej temperaturze, wilgotności, warunkach cyklu świetlnego i reżimie karmienia cukrem.Zarejestruj daty śmierci i oblicz długowieczność. Aby zmierzyć długość skrzydeł, znieczulenie na zimno znieczula pięciodniowe dorosłe samce i samice komarów F1 z każdej grupy dietetycznej w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 90 sekund. Pod stereoskopem delikatnie chwyć klatkę piersiową każdego komara kleszczami i umieść je brzuszną stroną do góry.Zebrać oba skrzydełka za pomocą skalpela i umieścić je na czystym szkiełku mikroskopowym zawierającym wysuszoną kroplę podłoża montażowego do dalszych pomiarów za pomocą okularu z podziałką. Zmierz długość skrzydła za pomocą stereoskopu za pomocą mikrometru. W tym badaniu porównano wydajność samic komarów Anopheles karmionych bogatą sztuczną mączką i komarów karmionych początkową dietą płynną lub posiłkiem ze świeżej krwi.Liczba nabrzmiałych samic komarów karmionych bogatą sztuczną mączką na poziomie 89% była znacznie wyższa niż liczba nabrzmiałych samic karmionych krwią na poziomie 56%Pokolenie komarów F1 karmionych krwią lub bogatym sztucznym mączką miało porównywalne wskaźniki śmiertelności i przeżycia. Zmienność była wyższa u komarów karmionych krwią w porównaniu z komarami karmionymi bogatą sztuczną mączką. Jeśli chodzi o wielkość dorosłego osobnika, komary F1 anopheles karmione bogatą sztuczną mączką mieściły się w oczekiwanym zakresie i były podobne do komarów żywionych krwią.Moim zdaniem bardzo ważne jest prawidłowe zmontowanie podajników z parafilmem, aby uniknąć jego pęknięcia. Jeśli membrana nie jest dobrze przymocowana do szklanego podajnika, możesz stracić mączkę i prawdopodobnie stracić część komarów, ponieważ mogą one zostać przykryte mączką i umrzeć. Chcielibyśmy przeprowadzić test przyciągania podwójnego wyboru, na przykład za pomocą olfaktometru, abyśmy mogli ocenić, czy nasze samice są bardziej pociągane do sztucznej diety, czy do krwi.Obecnie liofilizujemy sztuczną dietę i badamy jej stabilność w różnych temperaturach. Oprócz oczywistych ulepszeń w zakresie stabilności i przechowywania, nad którymi pracujemy, należy zbadać długoterminowe stosowanie diety w zakresie sprawności i fizjologii komarów. Uważam, że produkcja anofeles bez krwi ogromnie ułatwi badania wektorowe i wdrażanie narzędzi kontroli, które są zależne od dużej liczby komarów.

a-blood-free-diet-to-rear-anopheline-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie opornego na wirusa dengue, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom wirusowym u komarów. Niniejszy protokół ilustruje sposób badania stopnia zakażenia komarów wirusem dengue. Przedstawiono techniki namnażania wirusa w kulturze, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania miana wirusa w jelicie środkowym komara.

Protokół infekcji denga w komarach (A. aegypti) i określanie fenotypu infekcji

Niniejszy film przedstawia ogólne techniki stosowane w hodowli Anopheles gambiae w warunkach laboratoryjnych. Metody opieki nad komarami laboratoryjnymi są zaprezentowane na wszystkich etapach cyklu życiowego organizmu: od larw i poczwarek po dorosłe osobniki pobierające krew.

Protokół hodowli komarów (A. gambiae)

Aby osiągnąć supresję populacji Aedes aegypti przy użyciu systemu RIDL® (Release of Insects carrying a Dominant Lethal), konieczne jest uwolnienie dużych liczb samców komarów. Wymaga to zastosowania technik i technologii masowej hodowli w celu zapewnienia niezawodnych systemów pozwalających na uzyskanie maksymalnej liczby wysokiej jakości samców komarów.

Masowa produkcja genetycznie zmodyfikowanych Aedes aegypti do wypuszczeń w terenie w Brazylii

Źródło: Liu, X. i inni. Bakteryjny test żywienia ustnego z komarami leczonymi antybiotykami. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje wyczerpanie rodzimej mikrobioty jelitowej u komarów przy użyciu roztworu sacharozy zawierającej antybiotyki. Następnie następuje kontrolowana rekolonizacja z zawiesiną bakteryjną dostarczaną przez system odżywiania błonowego, aby ustanowić zdefiniowaną populację bakterii w jelicie komarów.

Ustanowienie określonej populacji bakterii jelitowych u dorosłych komarów

Ten film demonstruje test odżywiania krwią w celu oceny śmiertelności i płodności badanych związków o nowych sposobach działania na samice komarów. Technika ta pomaga w badaniach przesiewowych nowych klas insektycydów w celu zabicia opornej populacji komarów i kontrolowania rozprzestrzeniania się choroby.

Test żerowania komarów: metoda oceny wpływu badanego związku na śmiertelność i płodność dorosłych samic komarów

Analizy RNA-Seq stają się coraz ważniejsze dla identyfikacji molekularnych podstaw cech adaptacyjnych w organizmach niemodelowych. W tym miejscu opisano protokół identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji między komarami Aedes albopictus z diapauzą i bez diapauzy, od hodowli komarów po sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne danych RNA-Seq.

Eksperymentalny i bioinformatyczny protokół do analiz sekwencyjnych RNA diapauzy fotoperiodycznej u azjatyckiego komara tygrysiego, Aedes albopictus

Protokół został opracowany w celu zbadania wpływu epigenetycznego leku DZNep na rozwój, płodność i przeżywalność komarów.  W tym miejscu opisujemy procedury wodnej ekspozycji DZNep na niedojrzałe komary oraz ekspozycji DZNep we krwi na dorosłe komary, a także pomiar hamowania hydrolazy SAH.

Testy toksykologiczne do badania wpływu leku epigenetycznego na rozwój, płodność i przeżywalność komarów malarii

Komary Aedes aegypti zakażone Wolbachią są uwalniane do naturalnych populacji w celu zahamowania transmisji arbowirusów. Opisujemy metody hodowli Ae. aegypti z infekcjami Wolbachia w laboratorium do eksperymentów i uwolnienia w terenie, podejmując środki ostrożności w celu zminimalizowania adaptacji i selekcji laboratoryjnej.

Utrzymywanie komarów Aedes aegypti zakażonych Wolbachia

Prezentowany protokół może określić kompetencję wektorową populacji komarów Aedes aegypti dla danego wirusa, takiego jak Zika, w warunkach powstrzymywania.

Wektorowe analizy kompetencyjne komarów Aedes aegypti z wykorzystaniem wirusa Zika

Celem tego protokołu jest dostarczanie komarom Aedes aegypti pokarmów pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków z krwi za pomocą sztucznego karmnika membranowego i precyzyjne określenie ilościowe ilości spożytego posiłku.

Karmienie i ilościowe oznaczanie krwi pochodzenia zwierzęcego i sztucznych posiłków u komarów Aedes aegypti

Doustne podawanie dsRNA wytwarzanego przez bakterie, metoda dostarczania interferencji RNA (RNAi), która jest rutynowo stosowana u Caenorhabditis elegans, została tutaj z powodzeniem zastosowana u dorosłych komarów. Nasza metoda pozwala na rzetelne badania genetyki odwrotnej i badania wektorów blokujących transmisję bez użycia iniekcji.

Skuteczne doustne podawanie RNA interferencji (RNAi) dorosłym komarom z rodzaju Anopheles gambiae

Poznaj metodę hodowli komarów Anopheles bez użycia krwi dzięki sztucznej diecie. To innowacyjne podejście wspiera rozmnażanie i produkcję jaj, eliminując etyczne ograniczenia oraz obniżając koszty badań nad malarią.

Bezkrwawa dieta do hodowli komarów Anopheline

Przeglądaj więcej filmów