Name: Pomiar aktywności chitynazy w próbkach biologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę pomiaru aktywności chitynazy w płynach biologicznych, takich jak płyn z płuc lub surowica krwi. Technika ta umożliwia monitorowanie skuteczności leczenia chorób, np. choroby Gaucher.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało wsparte nagrodami American Lung Association i American Thoracic Society dla LS. Autorzy serdecznie dziękują dr Jackowi Eliasowi i dr Chun Geun Lee za dostarczenie transgenicznych szczepów myszy.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym przez IACUC protokołem w Yale University School of Medicine.
1. Pobieranie próbek myszy
<ol>
	<li>Znieczulenie
	<ol>
		<li>Znieczulenie myszy za pomocą ketaminy i ksylazyny (100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie próbek krwi
	<ol>
		<li>Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.</li>
		<li>Chirurgicznie otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić serce.</li>
		<li>Wprowadzić igłę o sile 26,5 G do lewej komory i pobrać krew do strzykawki. 
		nuta: Zazwyczaj około 0,5-1 ml krwi można pobrać od zdrowej myszy o wadze 20-25 g.</li>
		<li>Krew należy zebrać do probówek z heparyną w celu pobrania osocza lub probówek bez heparyny w celu pobrania surowicy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobranie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL)
	<ol>
		<li>Aby zebrać BAL, wykonaj pionowe nacięcie na szyi, aby odsłonić tchawicę.</li>
		<li>Osłonić tchawicę cewnikiem 22 G i mocno zabezpieczyć ją za pomocą sznurka, aby zapobiec wyciekowi z nosa myszy.</li>
		<li>Powoli wstrzyknąć dwie porcje sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, 0,75 ml każdy) do płuc przez tchawicę i pobrać z powrotem.</li>
		<li>Zebrać podwielokrotności i przechowywać na lodzie do dalszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie próbek biologicznych.
	<ol>
		<li>Próbka krwi: Świeża (osocze) lub po pozostawieniu do koagulacji przez 4 godziny (surowica), odwirować przy 600 x g przez 10 minut. Weź supernatant i albo zamroź do przechowywania, albo użyj do eksperymentu.</li>
		<li>BAL: Odwirować próbkę o masie 350 x g przez 5 minut. Weź supernatant i albo zamroź do przechowywania, albo użyj do eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test chitynazy
UWAGA: Nauka stojąca za testem jest stosunkowo prosta. Niefluorescencyjny substrat jest rozszczepiany przez enzymatycznie aktywną chitynazę w celu wytworzenia produktu fluorescencyjnego, który jest następnie mierzony jako pośredni marker aktywności chitynazy. Chitynazy w próbkach rozkładają substrat 4-metylolumbelliferyl-D-N, N'-diacetylochitomitobiozę obecną w 1x buforze McIlvaina. Uwalniana jest cząsteczka fluorescencyjna 4-metylolumbelliferyl. Mierząc całkowitą fluorescencję każdego dołka, uzyskujemy dokładny pomiar aktywnej chitynazy w każdej próbce. Ponieważ rozkład chityny przez chitynazę jest reakcją hydrolityczną, bufor zatrzymujący, mieszanina 0,3 M glicyny i NaOH (12,0 g / l przy pH 10,6), kończy rozkład chityny, tworząc środowisko, które jest zbyt podstawowe, aby enzym mógł funkcjonować.
<ol>
	<li>Przygotuj podłoża, wzorce i roztwory.
	<ol>
		<li>Przygotuj bufor McIlvain. McIlvain Buffer składa się z 0,1 M cytrynianu i 0,2 M fosforanu o pH 5,2. Rozcieńczyć w stosunku 1:1 dla 1x bufor McIlvain.</li>
		<li>Rozpuścić zarówno 4-metylombliferyl-D-N, N'-diacetylochitobiozę, jak i 4-metyloubelliferyl ß-D-N, N', n"-triacetylochitotriozę w 1x Bufor McIlvaina do stężenia 500 μM każdy. 
		nuta: Roztwór podstawowy może być przechowywany w temperaturze -20 °C do dalszego wykorzystania; Najlepiej przechowywać w podwielokrotnościach.</li>
		<li>Rozpuścić wzorzec 4-metylomelufloryronu do stężenia 0,1 mM w buforze zatrzymującym (mieszanina 0,3 M glicyny i NaOH (12,0 g/l przy pH 10,6)) w celu uzyskania roztworu podstawowego krzywej wzorcowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utwórz i unietrzymuj na płytach roztwór roboczy.
	<ol>
		<li>Połącz 1x Bufor McIlvaina i chitynowy substrat 4-metylolumbelliferyl-D-N, N'-diacetylochitobiozę, aby stworzyć roztwór roboczy. Na każde 10 próbek zmieszać 100 μl substratu z 2,17 ml 1x buforu McIlvain. Patrz Tabela 1 w celu uzyskania dodatkowych obliczeń opartych na wielkości próby. 
		nuta: Do próbek ludzkich należy użyć 4-metyloambiliferylu ß-D-N, N', N"-triacetylochitotriozy. Chociaż oba substraty mogą być rozszczepiane przez enzymy ludzkie lub mysie, zostały one przypisane do próbek ludzkich lub mysich na podstawie efektywności rozszczepienia6.</li>
		<li>Odpipetować 95 μl roztworu roboczego do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj próbki biologiczne do roztworu roboczego.
	<ol>
		<li>Następnie dodać 5 μl badanej próbki (krew/BAL/lizat tkankowy/inny płyn biologiczny) do każdej studzienki.</li>
		<li>Wymieszaj próbkę z roztworem roboczym, aby uzyskać najdokładniejsze i najbardziej wiarygodne wyniki. 
		nuta: Próbki należy badać w duplikatach/trzech egzemplarzach, zwracając szczególną uwagę na potencjalne efekty krawędziowe. Wszystkie próbki powinny być wstępnie podgrzane, aby zminimalizować efekt krawędzi. Ponieważ test obejmuje reakcję między chitynazami w próbce a substratem w roztworze roboczym, najlepiej jest pracować stosunkowo szybko, aby zminimalizować różnicę czasu między posiewem pierwszej próbki a posiewem ostatniej próbki. Zalecana jest pipeta wielokanałowa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>Przykryj talerz i krótko wstrząśnij (5 s).</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Pozwala to na zaprowadzenie reakcji enzymatycznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj krzywą standardową.
	<ol>
		<li>Podczas inkubacji próbek należy przygotować seryjne rozcieńczenie 4-metylulumbelliferonu, standardu często stosowanego we fluorymetrycznym oznaczaniu aktywności enzymu.</li>
		<li>Rozcieńczyć podstawowy roztwór wzorcowy w buforze zatrzymującym do stężenia 5 μM.</li>
		<li>Wykonać serię rozcieńczeń, jak wskazano w Tabeli 2. Dodaj składniki we wskazanej ilości i dobrze wymieszaj. 
		nuta: Krzywa standardowa pomaga zapewnić, że mierzone próbki mieszczą się w zakresie liniowym krzywej standardowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję za pomocą buforu zatrzymującego.
	<ol>
		<li>Dodać 200 μl buforu zatrzymującego do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uporządkuj standardy.
	<ol>
		<li>Dodać 300 μl każdego wzorca na studzienkę w dwóch egzemplarzach na tej samej płytce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odczytać płytkę za pomocą czytnika fluorometrycznego.
	<ol>
		<li>Odczytaj płytkę przy wzbudzeniu 360 nm i emisji 455 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Odejmij puste miejsca
	<ol>
		<li>Uśrednić wartości zduplikowanych roztworów wzorcowych, które nie zawierają 4-metylolumbelliferonu. Odejmij tę wartość od wszystkich innych zarejestrowanych wartości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Weź średnią z replik technicznych i wykreśl standardy. 
	<ol>
		<li>Uśrednij dwa odczyty dla każdego stężenia i wyświetl wykres średniego odczytu według stężenia. 
		nuta: Wynikowy wykres powinien wyglądać liniowo i mieć wartość R2 bliską 1. Jeśli tak się nie stanie, może być konieczne ponowne wykonanie norm i ponowne odczytanie tabliczki w celu zapewnienia jakości analizy danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustandaryzuj wartości odczytu.
	<ol>
		<li>Utwórz linię najlepiej dopasowaną dla wykreślanych danych standardów. Podzielić odczyty próbek przez nachylenie linii o najlepszym dopasowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Porównaj wartości z grupy kontrolnej i grupy zmiennych.
	<ol>
		<li>Użyj testu t lub ANOVA dla więcej niż dwóch grup, aby określić, czy różnica między grupami jest statystycznie istotna. Wartości będą przyjmowane w jednostkach nmol/mL·h.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinases%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chitinases: An update.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).</li>
<li>Sharma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+Role+of+Chitotriosidase+during+Lung+Infection+with+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).</li>
<li>Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chitotriosidase+%28chitinase+1%29+under+normal+and+disease+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Epithelial+Biology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions.</a> Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/</a> 1-9 (2012).</li>
<li>Lee, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Chitin+and+Chitinase%2FChitinase-Like+Proteins+in+Inflammation%2C+Tissue+Remodeling%2C+and+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury.</a> Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).</li>
<li>Jeuniaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase%3A+An+Addition+to+the+List+of+Hydrolases+in+the+Digestive+Tract+of+Vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates.</a> Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).</li>
<li>Boot, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Novel+Acidic+Mammalian+Chitinase+Distinct+from+Chitotriosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).</li>
<li>Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+Deficiency%3A+A+Mutation+Update+in+an+African+Population%5BTitle%5D)+AND+%22JIMD+Reports%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population.</a> JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).</li>
<li>Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+CHI3L-1+and+CHIT-1+Expression+in+Differentiated+and+Polarized+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages.</a> Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).</li>
<li>Wiesner, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitin+Recognition+via+Chitotriosidase+Promotes+Pathologic+Type-2+Helper+T+Cell+Responses+to+Cryptococcal+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701(2015).</li>
<li>Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+Effects+of+Chitotriosidase+Enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+Research%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme.</a> Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).</li>
<li>Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+sensitive+and+easy+colorimetric+assay+for+chitinase+and+cellulase+activity+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection.</a> Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).</li>
<li>Schales, O., Schales, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+for+the+determination+of+glucose+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Fed+Clin+Res%22%5BJournal%5D)">Simple method for the determination of glucose in blood.</a> Proc Am Fed Clin Res. 2, Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623</a> 78(1945).</li>
<li>Zarei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Chitinase+with+Antifungal+Activity+from+a+Native+Serratia+Marcescens+B4A%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+Mammalian+Chitinase+in+Asthmatic+Th2+Inflammation+and+IL-13+Pathway+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation.</a> Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).</li>
<li>Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+elevation+of+plasma+chitotriosidase+activity.+A+novel+hallmark+of+Gaucher+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).</li>
<li>Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+activity+in+colostrum+from+African+and+Caucasian+women%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).</li>
<li>Maddens, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase-like+Proteins+are+Candidate+Biomarkers+for+Sepsis-induced+Acute+Kidney+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury.</a> Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).</li>
<li>Hector, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase+activation+in+patients+with+fungus-associated+cystic+fibrosis+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).</li>
<li>Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chitotriosidase+is+expressed+in+the+eye+and+lacrimal+gland+and+has+an+antimicrobial+spectrum+different+from+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme.</a> Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).</li>
<li>Kim, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMCase+is+a+crucial+regulator+of+type+2+immune+responses+to+inhaled+house+dust+mites%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).</li>
<li>Olkhovych, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+activity+as+additional+biomarker+in+the+diagnosis+of+lysosomal+storage+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ukrainian+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases.</a> Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).</li>
<li>Bouayadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease%3A+An+Underdiagnosed+Pathology+in+the+Eastern+Moroccan+Population%5BTitle%5D)+AND+%22eJIFCC%22%5BJournal%5D)">Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population.</a> eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).</li>
<li>Tasci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+serum+chitotriosidase+activity+in+early+treatment+of+patients+with+active+tuberculosis+and+a+negative+sputum+smear%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutics+and+Clinical+Risk+Management%22%5BJournal%5D)">Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).</li>
<li>Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+chitotriosidase+activity+in+acute+Plasmodium+falciparum+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria.</a> Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).</li>
<li>Kitamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase+inhibition+promotes+atherosclerosis+in+hyperlipidemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice.</a> American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).</li>
<li>Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Chitinases+and+Chitinase-Like+Proteins+as+Indicators+for+Infl+Ammation+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Insights%22%5BJournal%5D)">Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer.</a> Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).</li>
</ol>

Aktywność chitynazy stała się ważnym biomarkerem do przewidywania ciężkości choroby, postępu choroby, skuteczności terapeutycznej i obecności określonych patogenów18. Chociaż wiele z długo postulowanych teorii na temat roli chitynaz nie zostało udowodnionych eksperymentalnie19, nowe badania dostarczyły ważnych informacji na temat roli chitynaz i białek podobnych do chitynaz w różnych chorobach 2,9,20<sup ...

Chityna jest drugim najobficiej występującym polisacharydem na ziemi po celulozie, służąc jako główny składnik strukturalny różnych organizmów, w tym egzoszkieletu owadów, grzybów, drożdży i glonów; niektóre kręgowce mają również chitynę1. Chitynazy to rodzina enzymów, które są zdolne do rozkładania chityny i są wysoce konserwatywne w trakcie ewolucji u gatunków od bakterii po ssaki2,3. Oprócz chitynaz, ssaki mają również białka podobne do chitynaz, które są podobne do chitynaz pod względem zdolności do wiązania chityny, ale różnią się tym, że brakuje im enzymatycznej zdolności do rozszczepiania chityny4.
Chociaż chityna i chitynazy były badane od dawna - z badaniami sięgającymi początku XX wieku - główny nacisk położono na ich rolę u owadów i innych bezkręgowców. W rzeczywistości dopiero w latach 60. XX wieku odkryto, że kręgowce w ogóle mają chitynazy. Korzystając z testu opartego na chitobizie, wykazano, że chitynazy znajdują się w przewodzie pokarmowym wielu kręgowców, w tym jaszczurek i kosów – obserwacja ta przypuszczalnie jest spowodowana spożyciem organizmów zawierających chitynę, takich jak owady5.
Ssaki mają dwie enzymatycznie aktywne formy chitynazy: kwaśną chitynazę ssaków (AMCase; znaną również jako CHIT2 i CHIA) oraz chitotriozydazę (CHIT1)4. Oba te białka są zdolne do hydrolizy chityny. Jednak CHIT1 jest bardziej aktywny enzymatycznie u ludzi, gdzie prawie cała aktywność chitynazy pochodzi z CHIT1. 4 U myszy zarówno Chit1, jak i AMCase prawie w równym stopniu przyczyniają się do ogólnej aktywności chitynazy6. Z drugiej strony, białka podobne do chitynazy nie mają aktywności chitynazy.
Chit1 jest głównie wydzielany przez makrofagi i często uważany jest za odpowiedź immunologiczną na patogeny zawierające chitynę7. Wykazano również, że enzym ten bierze udział w dojrzewaniu monocytów zarówno do podtypów makrofagów M1, jak i M2, nawet bez obecności substratu chityna8. Co więcej, może być również zaangażowany w dojrzewanie innych komórek odpornościowych, w tym komórek pomocniczych T typu 2 (Th2) i eozynofili - jak wykazano w przypadku kryptokokowej infekcji płuc9. Badania te wskazują na złożoną rolę chitynaz w układzie odpornościowym.
W ostatnich latach stwierdzono, że poziomy Chit1 służą jako ważny biomarker postępu dla ponad 40 różnych chorób ludzkich, w tym lizosomalnych chorób spichrzeniowych, chorób zakaźnych, chorób układu oddechowego, chorób endokrynologicznych, chorób sercowo-naczyniowych, chorób neurologicznych i innych (recenzowane10). W wielu z tych chorób poziomy Chit1 są silnym predyktorem ciężkości choroby i skuteczności terapeutycznej10.
Ponieważ chitynazy zyskały reputację jako biomarker dla wielu schorzeń, w tym choroby Gauchera, opracowano narzędzia i testy, które ułatwiają testowanie obecności chitynazy. Starsze metody obejmują procedurę Schalesa, protokół zaadaptowany z badania stężenia glukozy we krwi, oraz metodę kwasu 3,5 dinitrosalicylowego (DNS). Jednak te metody są często wrażliwe na czas i trudne technicznie11. Procedura dla obu tych testów wymaga redukcji nieorganicznych utleniaczy, na przykład żelazocyjanku w przypadku procedury Schalesa, powodując zmianę koloru, którą można zmierzyć tylko spektrofotometrycznie. Dodatkowo, oba testy obejmują etap podgrzewania lub gotowania, który jest zarówno czasochłonny, jak i niezbędny do rozwinięcia koloru12,13.
Tutaj opisano szybki i prosty test fluorymetryczny do określania poziomu chitynazy w próbkach ssaków14,15. Dwie z użytych tu próbek to płyny z płukania surowicy i oskrzelowo-pęcherzyków płucnych (BAL); Aktywność chitynazy została również zmierzona w próbkach mleka matki i moczu, a technikę tę można przeprowadzić w tego typu próbkach, a także w każdym innym płynie biologicznym16,17.

<table><tbody><tr><td>4-metylolumbelliferon</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td>Standard: powszechnie stosowany w testach fluorometrycznych do oznaczania aktywności enzymatycznej</td></tr><tr><td>4MU-GlcNAc2</td><td>Sigma</td><td>M9763</td><td>fluorescencyjny substrat chitynazy do stosowania w próbkach mysich</td></tr><tr><td>4MU-GlcNAc3</td><td>Sigma</td><td>M5639</td><td>fluorescencyjny substrat chitynazy do stosowania w próbkach ludzkich</td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy - monohydrat</td><td></td><td></td><td>do stosowania w McIlvain Buffer</td></tr><tr><td>Glycine</td><td></td><td></td><td>do stosowania w Stop Buffer w stężeniu 0,3 M</td></tr><tr><td>Na2HPO4xH2O</td><td></td><td></td><td>do stosowania w McIlvain Buffer</td></tr><tr><td>NaOH</td><td></td><td></td><td>do stosowania w Stop Buffer w stężeniu 12 g/L</td></tr><tr><td>Płytka wizyjna: Niesterylna, nieobrobiona płytka 96-dołkowa</td><td>4titude</td><td>4ti-0224</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar aktywności chitynazy w próbkach biologicznych

Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

Chitynazy to enzymy, które rozszczepiają chitynę. Nawet przy braku chityny ssaki mają znaczne ilości chitynaz obecnych w organizmie, w tym na początku badania. Dokładna rola chitynazy nie jest znana, jednak uważa się, że odgrywa ona ważną rolę w trawieniu i obronie gospodarza odpowiednio przed żywnością i patogenami zawierającymi chitynę. Ostatnie prace, w tym nasze, wykazały ważną rolę chitynazy i białek chitynazopodobnych w odporności gospodarza i chorobach alergicznych. Co ważne, aktywność chitynazy służy jako ważne biomarkery ciężkości choroby w szerokim zakresie chorób, w tym w chorobach zapalnych typu 2, takich jak astma i zwłóknienie płuc. Podobnie pacjenci z zaburzeniami genetycznymi, takimi jak choroba Gauchera, mają znacznie podwyższony poziom chitynazy, który nie tylko koreluje z ciężkością choroby, ale także służy jako wiarygodny biomarker skuteczności terapeutycznej. Przedstawiony tutaj protokół opisuje prosty, szybki i nieskomplikowany sposób pomiaru aktywności chitynazy w próbkach BAL lub surowicy myszy i może być szeroko dostosowany do ludzi i innych organizmów modelowych ze względu na wysoce konserwatywny charakter enzymów.

Przedstawione tutaj wyniki pochodzą z badania mierzącego aktywność chitynazy w próbkach surowicy i BAL myszy typu dzikiego (C57BL/6) oraz myszy transgenicznych Chit1 (na tle C57BL/6), które wykazują nadekspresję genu Chit1 pod promotorem doksycyliny. Nasze dane wykazują, że zarówno w próbkach surowicy, jak i BAL stwierdzono aktywność chitynazy w wartościach bazowych wynoszących odpowiednio 698,2 ± 189,9 nmol/mL·h oraz 485,7 ± 14 nmol/ml·h. Nadekspresja genu Chit1 przy zastosowaniu doksycyliny w wodzie pitnej przez 4 tygo...

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda pomiaru aktywności chitynazy w płynach biologicznych, takich jak płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe lub surowica.

Pomiar aktywności chitynazy w próbkach biologicznych

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

Metoda ta pozwala na skuteczniejsze określenie ilościowe aktywności chitynazy w próbkach biologicznych. Wykazano, że aktywność chitynazy służy jako dobry marker do diagnozy i skuteczności terapeutycznej w wielu stanach i chorobach. Wcześniejsze metody pomiaru aktywności chitynazy były często czasochłonne i trudne do wykonania, a oba te problemy zostały rozwiązane za pomocą pokazanego tutaj testu.Technika ta pomoże wykorzystać potencjał chitynaz jako markera diagnostycznego i terapeutycznego, ułatwiając pomiar aktywności chitynazy; na przykład może być stosowany do monitorowania leczenia choroby Gauchera, ponieważ wykazano, że aktywność chitynazy zmniejsza się podczas skutecznego leczenia. Zacznij od przygotowania substratów, wzorców i roztworów do testu. Przygotuj 1x bufor McIlvaina zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i użyj go do rozcieńczenia substratów chitynowych do 500 mikromolów każdy.Rozpuścić 4-metyloumbililoron, wzorzec, do stężenia 0,1 milimola w buforze zatrzymującym, aby utworzyć roztwór podstawowy o krzywej wzorcowej. Na każde 10 próbek wymieszaj 2,17 mililitra 1x buforu McIlvain ze 100 mikrolitrami substratu chitynowego, aby utworzyć roztwór roboczy, a następnie pipetować 95 mikrolitrów roztworu roboczego do każdego dołka 96-dołkowej płytki. Dodać pięć mikrolitrów badanej próbki do każdej studzienki i wymieszać ją z roztworem roboczym.Przykryj płytkę i potrząsaj nią przez pięć sekund, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby umożliwić zajście reakcji enzymatycznej. W międzyczasie rozcieńczyć roztwór podstawowy 4-metylulumbelliferonu, aby uzyskać pięciomikromolowy roboczy roztwór wzorcowy i utworzyć krzywą wzorcową, przygotowując serię rozcieńczeń zgodnie z manuskryptem. Zacznij od stężenia pięciu mikromoli i dobrze wymieszaj każde rozcieńczenie.Po inkubacji dodać 200 mikrolitrów buforu zatrzymującego do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję. Dodaj 300-mikrolitrowe duplikaty każdego wzorca do tej samej płytki, a następnie odczytaj płytkę przy wzbudzeniu 360 nanometrów i emisji 455 nanometrów. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do pomiaru aktywności chitynazy w płukaniu oskrzelowo-pęcherzykowym i płynie surowicy typu dzikiego oraz u myszy transgenicznych z nadekspresją chitotriozydazy.Test potwierdza, że nadekspresja genu CHIT-1 u myszy powoduje zwiększoną aktywność chitynazy. Do oznaczenia chitynazy na podstawie fluorescencji próbek wykorzystano krzywą wzorcową. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać przy pierwszej próbie zastosowania protokołu, jest dodanie próbek tak szybko i skutecznie, jak to możliwe, przy jednoczesnym dokładnym wymieszaniu.Na początku korzystne może być wykonanie mniejszej liczby próbek w serii, aby zapewnić dokładność pomiarów, ze względu na krótszy okres inkubacji.

measurement-of-chitinase-activity-in-biological-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy niskokosztową, wysokoprzepustową metodę przesiewania aktywności endoglukanazy grzybowej w E. coli. Metoda opiera się na prostym wizualnym odczycie degradacji substratu, nie wymaga oczyszczania enzymu i jest wysoce skalowalna. Umożliwia to szybkie przesiewanie dużych bibliotek wariantów enzymatycznych.

Wysokoprzepustowy screening aktywności grzybowej endoglukanazy w Escherichia coli

Ten film demonstruje test do badania enzymów skutecznych w degradacji złożonych polisacharydów w biomasie roślinnej przy użyciu nierozpuszczalnej biomasy chromogenicznej lub ICB. Enzymy hydrolizują ICB w celu uwolnienia rozpuszczalnych oligosacharydów związanych z barwnikiem, a aktywność enzymu ocenia się za pomocą analizy kolorymetrycznej produktu reakcji.

Badania przesiewowe nierozpuszczalnych enzymów chromogennych na bazie biomasy: test oceniający aktywność degradacji enzymów rozkładających biomasę roślinną

Ten film pokazuje pomiar in vitro aktywności enzymu dla α-galaktozydazy A i kwaśnej α-glukozydazy w próbkach używających syntetycznych substratów 4-metylulumbelliferylu.

Pomiar in vitro aktywności enzymów α-galaktozydazy A i kwaśnej α-glukozydazy

Tutaj prezentujemy protokoły do szybkiego badania i charakteryzowania enzymów pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Test dyfuzji mikroszkiełkowej i test uwalniania barwnika wykorzystują docelowe substraty bakteryjne do jakościowej i ilościowej oceny aktywności enzymatycznej.

Testy jakościowe i ilościowe do wykrywania i charakterystyki białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych

Opisano wysokoprzepustowy test do badań przesiewowych enzymów. Ten multipleksowany, gotowy do użycia zestaw testowy składa się z wstępnie wybranych substratów Chromogennego Polymeru Hydrogelu (CPH) i złożonych Inierozpuszczalnych wC hromogennych substratach ioB (ICB). Enzymy docelowe to endoenzymy i proteazy rozkładające polisacharydy.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe enzymów rozkładających węglowodany przy użyciu nowatorskich zestawów do oznaczania nierozpuszczalnych substratów chromogennych

Opisujemy podstawowy protokół ilościowego oznaczania aktywności ATPazy in vitro. Protokół ten można zoptymalizować w oparciu o poziom aktywności i wymagania dla danej oczyszczonej ATPazy.

Pomiar aktywności ATPazy in vitro w celu charakterystyki enzymatycznej

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny zmodyfikowanych histonów z pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecypitowane DNA jest następnie wykorzystywane do ilościowego PCR w celu zbadania obfitości i lokalizacji modyfikacji potranslacyjnych histonów w całym genomie.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) modyfikacji histonów z Saccharomyces cerevisiae

Opisujemy zmodyfikowaną metodę opartą na agarze, zaprojektowaną do ilościowego określenia przeciwgrzybiczego działania produktów pochodzenia roślinnego. Za pomocą tego protokołu można ocenić zarówno lotny, jak i nielotny wkład w aktywność przeciwgrzybiczą. Ponadto skuteczność przeciwko grzybom można zmierzyć na kluczowych etapach rozwoju w jednym zestawie eksperymentalnym.

Pomiar lotnej i nielotnej aktywności przeciwgrzybiczej produktów kontroli biologicznej

Ten protokół opisuje metodę uzyskiwania danych ilościowych na temat przeciwgrzybiczej aktywności peptydów i innych związków, takich jak małocząsteczkowe środki przeciwgrzybicze, przeciwko Candida albicans. Wykorzystanie gęstości optycznej zamiast liczenia jednostek tworzących kolonie w celu ilościowego określenia zahamowania wzrostu oszczędza czas i zasoby.

Kwantyfikacja aktywności przeciwgrzybiczej peptydów przeciwko Candida albicans

W tym artykule przedstawiono znormalizowane metody ekotoksykologiczne do oceny biomarkerów u neotropikalnych gatunków bezogonowych. W szczególności w artykule tym szczegółowo opisano kilka metodologii w różnych skalach oceny ekotoksykologicznej, takich jak poziom genetyczny, komórkowo-histologiczny, biochemiczny, morfologiczny i indywidualny.

Metodologie ekotoksykologiczne do oceny biomarkerów w różnych skalach u anuranów neotropikalnych

Poznaj uproszczoną metodę pomiaru aktywności chitynazy w płynach biologicznych, takich jak płyn z płuc lub surowica krwi. Technika ta umożliwia monitorowanie skuteczności leczenia chorób, np. choroby Gaucher.

Pomiar aktywności chitynazy w próbkach biologicznych

Przeglądaj więcej filmów