Name: Izolacja wzbogaconych egzosomami pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przenoszących czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów z embrionalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Poznaj metodę izolacji wzbogaconych egzosomami pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z komórek macierzystych embrionalnych zawierających czynnik GM-CSF. Protokół umożliwia uzyskanie wysokiej jakości wykazów immunomodulacyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Panu Arkadiuszowi Ślusarczykowi i Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) za pozyskanie obrazów z transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Praca ta była częściowo wspierana przez granty z NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 and CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) oraz Free to Breathe Research Grant (KWA).

1. Hodowla komórek ES-D3
<ol>
	<li>Aby wytworzyć wolną od egzosomów płodową surowicę bydlęcą (FBS), należy załadować FBS do ultrawirówki i odwirować przy 100 000 x g przez 16 godzin w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu zbierz supernatant surowicy jako FBS wolny od egzosomów w celu hodowli mysiej linii komórkowej ESC ES-D3 i uzyskania EV wzbogaconych w egzosomy.</li>
	<li>Przed posiewem komórek ES-D3 pokryj 15 cm szalki do kultur tkankowych żelatyną (0,1%) w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Postępując zgodnie z wcześniej opisanym protokołem16, hoduj komórki ES-D3 bez warstwy zasilającej w pokrytych żelatyną 15 cm naczyniach do hodowli tkankowych. Pożywka do hodowli komórkowych ES-D3 składa się z DMEM, FBS wolnego od egzosomów (15%), aminokwasów endogennych (0,1 mM), L-glutaminy (2 mM), β-merkaptoetanolu (0,1 mM), penicyliny (50 jednostek/ml), streptomycyny (50 μg/ml) i czynnika hamującego białaczkę (LIF; 100 jednostek/ml). Hodowla komórek ES-D3 w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 .</li>
	<li>Gdy komórki ES-D3 osiągną około 90% zbieżności w 15-centymetrowych szalkach do hodowli tkankowej, należy usunąć pożywkę przez aspirację. Umyj komórki za pomocą trypsyny (5 ml; 0,05%). Dodać trypsynę (5 ml) do potraw i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Zbierz komórki z naczyń.</li>
	<li>Dodaj świeżą pożywkę hodowlaną (5 ml) do pobranych komórek, aby dezaktywować trypsynę. Odwirować komórki przy sile 390 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki na świeżym podłożu i określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>W przypadku komórek pasażujących należy umieścić komórki ES-D3 (5 x 106) w pokrytym żelatyną (0,1%) naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 15 cm ze świeżą pożywką (15 ml) i hodować przez 3 dni przed subkulturacją komórek.</li>
	<li>Aby zebrać supernatant do hodowli komórkowej do izolacji EV wzbogaconych w egzosomy, połóż komórki ES-D3 (1 x 107) w pokrytym żelatyną (0,1%) 15 cm naczyniu do hodowli tkankowych ze świeżą pożywką (15 ml) przez 3 dni przed pobraniem supernatantu do hodowli komórkowych.</li>
</ol>
2. Generowanie plazmidu ekspresji GM-CSF
UWAGA: Wygeneruj plazmid transfekcyjny pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP do nadekspresji GM-CSF w komórkach ES-D3. W tym plazmidzie ekspresja mysiego cDNA GM-CSF wraz z białkiem markerowym humanizowanym Renilla reniformis GFP (hrGFP) jest napędzana przez promotor ludzkiego czynnika wydłużenia łańcucha polipeptydowego 1α (EF1α) 17,18.
<ol>
	<li>Wygeneruj szkielet wektora.
	<ol>
		<li>Trawić plazmid pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 μg DNA) za pomocą enzymu restrykcyjnego EcoRI (100 jednostek) w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w celu wytworzenia dwóch fragmentów DNA: szkieletu wektora (6,0 kb) i insertu FD3ER (2,5 kb).</li>
		<li>Przenieść 50% strawionego plazmidowego DNA (10 μg) do jednej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i traktować fosfatazą alkaliczną (20 jednostek) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Rozpuścić zarówno nieleczone, jak i odfosforylowane DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (2%).</li>
		<li>Oczyść fragmenty DNA szkieletu wektora (6,0 kb) za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA. Podczas gdy nieleczony szkielet wektora będzie służył jako pusty wektor (pEF1α-IRES-hrGFP), zdefosforylowany szkielet wektora zostanie wykorzystany do wytworzenia plazmidu eksprymującego GM-CSF (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wygeneruj wstawkę cDNA GM-CSF.
	<ol>
		<li>Trawić plazmid pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 μg) za pomocą enzymu restrykcyjnego EcoRI (100 jednostek) w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w celu wytworzenia dwóch fragmentów DNA: szkieletu wektora (6,5 kb) i mysiej insercji cDNA GM-CSF (474 pz).</li>
		<li>Rozpuścić strawione DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (2%). Oczyść mysi fragment cDNA GM-CSF (474 pz) za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wygeneruj plazmidy ekspresji.
	<ol>
		<li>Przygotuj 2 reakcje ligacji (całkowita objętość 10 μl) za pomocą zestawu do ligacji DNA.
		<ol>
			<li>Aby wygenerować pusty wektor pEF1α-IRES-hrGFP, należy podwiązać nieleczony szkielet wektora z kroku 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng).</li>
			<li>Aby wygenerować pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP, należy podwiązać następujące fragmenty DNA: (1) zdefosforylowany szkielet wektorowy z kroku 2.1.3 (6,0 kb; 500 ng) i (2) fragment cDNA mGM-CSF wygenerowany w kroku 2.2.2 (474 pz; 200 ng).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Związać w temperaturze 25 °C przez 5 minut. Przekształć zligowane DNA w komórki E. coli kompetentne DH5α. Przekształcone komórki E. coli należy umieścić na płytkach LB-agar zawierających karbenicylinę (50 μg/ml).</li>
		<li>Oczyść plazmidy z pojedynczych kolonii E. coli za pomocą zestawu do izolacji DNA. Zweryfikuj tożsamość plazmidów za pomocą sekwencjonowania DNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Generowanie komórek ES-D3 z nadekspresją GM-CSF
UWAGA: Transfekcja komórek ES-D3 plazmidem pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP w celu nadekspresji GM-CS. Kotransfekcja plazmidu pBabe-Neo do komórek ES-D3, aby ułatwić wybór stabilnie transfekowanych komórek18,20.
<ol>
	<li>Transfekcja plazmidów do komórek ES-D3.
	<ol>
		<li>Umieść komórki ES-D3 (1,4 x 106) w pokrytym żelatyną (0,1%) 10 cm naczyniu do hodowli tkankowej z pożywką (10 ml) do transfekcji. Hodowla komórek ES-D3 posiana w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Przygotować dwie mieszaniny plazmidów w probówkach mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, kontrola wektorowa) z pBabe-Neo (4 μg) i (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, z ekspresją GM-CSF) z pBabe-Neo (4 μg). Przeprowadzić transfekcję za pomocą zestawu do transfekcji zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Dodać pożywkę do transfekcji (1 ml) i odczynnik do transfekcji (64 μl) do każdej probówki zawierającej mieszaniny plazmidów i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Dodać mieszaniny transfekcji do odpowiednich 10 cm szalek komórek ES-D3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 godzin.</li>
		<li>Zastąp pożywkę w 10 cm naczyniach świeżą pożywką hodowlaną (10 ml). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generuj masowe populacje stabilnie transfekowanych komórek ES-D3.
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę z transfekowanych komórek ES-D3. Umyj komórki trypsyną (2 ml; 0,05%). Dodać trypsynę (2 ml) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Przenieś komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodaj 2 ml świeżej pożywki hodowlanej, aby zneutralizować trypsynę. Wirować przy 390 x g przez 5 min.</li>
		<li>Zawiesić transfekowane komórki w świeżej pożywce hodowlanej (10 ml). Oceń intensywność fluorescencji GFP w transfekowanych komórkach ES-D3 za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Przenieść transfekowane komórki do dwóch 10 cm szalek zawierających świeżą pożywkę hodowlaną (10 ml). Dodaj neomycynę (0,5 mg/ml), aby wyeliminować nietransfekowane komórki.</li>
		<li>Kontynuować hodowlę transfekowanych komórek w pożywce hodowlanej zawierającej neomycynę (0,5 mg/ml). Gdy transfekowany ES-D3 osiągnie 90% konfluencji, ponownie przenieś komórki do 15-centymetrowych szalek do hodowli tkankowej. Powtarzaj procedurę przez 2 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generuj klony stabilnie transfekowanych komórek ES-D3.
	<ol>
		<li>Po wygenerowaniu dużych populacji stabilnie transfekowanych komórek ES-D3, zbierz komórki jak poprzednio. Określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Odwirować komórki przy sile 390 x g przez 5 minut. Zawiesić komórki (1 x 10 7 komórek/ml) w świeżej pożywce hodowlanej.</li>
		<li>Przefiltruj komórki przez sterylne sitko o wielkości 40 μm. Oczyść ogniwa ES-D3 z dodatnim GFP za pomocą FACS, zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Umieścić pojedynczą posortowaną komórkę ES-D3 w jednym dołku pokrytej żelatyną (0,1%) 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej rodzicielskie komórki ES-D3 (1 x 103) w pożywce wolnej od neomycyny (200 μL). Współhodowla transfekowanych komórek ES-D3 z ich nietransfekowanymi odpowiednikami rodzicielskimi zapewnia, że stabilnie transfekowane pojedyncze komórki ES-D3 przetrwają i namnażają się jako pojedynczy klon.</li>
		<li>Hoduj komórki przez 48 godzin, a następnie dodaj neomycynę (0,5 mg / ml) do 96-dołkowych płytek w celu wyeliminowania nietransfekowanych rodzicielskich komórek ES-D3.</li>
		<li>Kontynuuj hodowlę komórek ES-D3 GFP-dodatnich na 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej z pożywką zawierającą neomycynę (0,5 mg / ml) przez 1 tydzień. Przenieś klonalne linie komórkowe ES-D3 do pokrytych żelatyną (0,1%) 6 cm naczyń do hodowli tkankowej z pożywką (5 ml) zawierającą neomycynę (0,5 mg / ml) przez 1 tydzień.</li>
		<li>Określ intensywność fluorescencji GFP w każdym z transfekowanych klonów komórek ES-D3 za pomocą FACS, zgodnie z protokołem producenta. Wybierz klony ES-D3 wykazujące ekspresję GM-CSF lub pusty wektor o wysokim poziomie zielonej fluorescencji.</li>
		<li>Określ ilości GM-CSF wydzielane przez komórki ES-D3 za pomocą mysiego zestawu ELISA GM-CSF, zgodnie z protokołem producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami
<ol>
	<li>Hodować komórki ES-D3 (1 x 107) w 15 cm szalkach do hodowli tkankowej przez 72 godziny w temperaturze 37 °C. Zebrać supernatant hodowli komórkowej. Zebrany supernatant przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia w celu zachowania integralności egzosomalnej.</li>
	<li>Odwirować supernatant kultur komórkowych przy 5 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C za pomocą wirówki w celu osadzenia dużych fragmentów komórek.</li>
	<li>Zebrać supernatant i odwirować przy 100 000 x g przez 90 minut w temperaturze 4 °C za pomocą ultrawirówki.</li>
	<li>Usunąć supernatant. Delikatnie przepłukać każdą osadkę dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS; 1 ml) w celu usunięcia pozostałości supernatantu hodowli.</li>
	<li>Ponownie zawieś każdą granulkę w PBS. Określ ilościowo EV wzbogacone w egzosomy na podstawie ich zawartości białka5.
	<ol>
		<li>Zmierz stężenie białka EV wzbogaconych w egzosomy za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA). Oczekiwana wydajność EV wzbogaconych egzosomami z komórek ES-D3 wynosi około 4 μg białka/ml supernatantu do hodowli komórkowych. Zawiesić EV wzbogacone w egzosomy w PBS (stężenie białka: ~6 μg/μL). Przechowuj EV wzbogacone w egzosomy w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej
UWAGA: Zbadaj skład i strukturę EV wzbogaconych egzosomami wyizolowanych z ESC za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)5.
<ol>
	<li>Utrwal EV wzbogacone w egzosomy (3-5 μg/μL) końcowym stężeniem 2% paraformaldehydu klasy EM w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Załadować utrwalone próbki (10 μl) na miedziane siatki z węglową folią nośną. Próbki należy inkubować z kratkami miedzianymi przez 1 minutę, a następnie osuszyć siatki bibułą filtracyjną.</li>
	<li>Zabarwić kratki roztworem barwiącym zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Przenieś siatki na kawałek bibuły filtracyjnej za pomocą pęsety. Pozostaw kratki do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rejestruj obrazy z mikroskopii elektronowej za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (powiększenie 50 000x), zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
6. Ocena pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami za pomocą analizy western blot
<ol>
	<li>Przygotuj ekstrakty z całych komórek.
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę z komórek ES-D3 hodowanych w 15 cm szalkach. Umyj komórki trypsyną (5 ml; 0,05%). Dodaj trypsynę (5 ml) do komórek. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Zbierz komórki i dodaj świeżą pożywkę hodowlaną (5 ml), aby zneutralizować trypsynę. Odwirować komórki przy sile 390 x g przez 5 minut. Ponownie zawieś komórki w PBS.</li>
		<li>Określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Ponownie odwirować komórki przy 390 x g przez 5 minut. Ponownie zawieś komórki w buforze ładującym SDS-PAGE zawierającym 0,5% SDS (5 000 komórek/μL).</li>
		<li>Sonikować próbki przez 10 s za pomocą sonikatora o amplitudzie 10% (moc: 500 W; częstotliwość ultradźwiękowa: 20 kHz). Podgrzewać próbki w temperaturze 100 °C przez 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj lizaty EV wzbogaconych egzosomami.
	<ol>
		<li>Zawiesić EV wzbogacone w egzosomy w buforze ładującym SDS-PAGE zawierającym 0,5% SDS w stężeniu 1,2 μg/μL.</li>
		<li>Sonikować próbki przez 10 s za pomocą sonikatora o amplitudzie 10% (moc: 500 W; częstotliwość ultradźwiękowa: 20 kHz). Podgrzewać próbki w temperaturze 100 °C przez 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie białek za pomocą Western blot.
	<ol>
		<li>Załaduj ekstrakty z całych komórek (10 μl; 5 000 komórek/μl) i lizaty EV wzbogacone egzosomami (10 μl; 1,2 μg/μL) do każdej studzienki żelu Bis-Tris PAGE (4-20%). Przenieś białka na membrany z polifluorku winylidenu (PVDF).</li>
		<li>Inkubować błony z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi. Rozcieńczyć przeciwciała (w stężeniach wskazanych poniżej) w buforze bibułkowym zawierającym PBS, Tween-20 (0,2%) i odtłuszczone mleko w proszku (10% w/v).
		<ol>
			<li>Należy stosować następujące przeciwciała pierwszorzędowe: anty-aneksyna V (200 ng / ml), anty-CD81 (50 ng / ml), anty-flotylina-1 (200 ng / ml), anty-cytochrom c (100 ng / ml), izomeraza dwusiarczku przeciwbiałkowego (200 ng / ml), anty-GAPDH (33 ng / ml) i anty-Oxphos COX IV-podjednostka IV (600 ng / ml).</li>
			<li>Należy stosować następujące przeciwciała drugorzędowe: anty-królicze IgG sprzężone z peroksydazą (20 ng / ml) i kozie przeciwciała anty-mysie sprzężone z peroksydazą (20 ng / ml).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykrywaj białka za pomocą ulepszonego zestawu do wykrywania chemiluminescencji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Określanie stężeń GM-CSF w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami za pomocą testu ELISA
UWAGA: Oceń ilości GM-CSF w EV wzbogaconych egzosomami za pomocą testu ELISA za pomocą zestawu do mysiego GM-CSF, zgodnie z protokołem producenta z pewnymi modyfikacjami.
<ol>
	<li>Pokryj płytkę ELISA przeciwciałem wychwytującym. Traktuj EV wzbogacone egzosomami (0,6 μg) w samym PBS lub PBS + 0,05% Tween-20 (100 μL) w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodać próbki poddane działaniu substancji do powlekanej płytki ELISA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Umyj płytkę samym PBS lub PBS + 0,05% Tween-20.</li>
	<li>Dodaj przeciwciało wykrywające do próbek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Umyj płytkę samym PBS lub PBS + 0,05% Tween-20. Dodać Avidin-HRP do próbek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Umyj płytkę samym PBS lub PBS + 0,05% Tween-20.</li>
	<li>Określić stężenia GM-CSF w EV wzbogaconych egzosomami, mierząc absorbancję przy 450 nm na czytniku mikropłytek.</li>
</ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Sakthiswary, R., Raymond, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapy+in+neurodegenerative+diseases%3A+From+principles+to+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice.</a> Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).</li>
<li>Liu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+restore+function+in+infarcted+hearts+of+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).</li>
<li>Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapy+for+type+1+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).</li>
<li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).</li>
<li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).</li>
<li>Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+Presentation+by+Extracellular+Vesicles+from+Professional+Antigen-Presenting+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells.</a> Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).</li>
<li>Kunigelis, K. E., Graner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dichotomy+of+Tumor+Exosomes+%28TEX%29+in+Cancer+Immunity%3A+Is+It+All+in+the+ConTEXt%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt?</a> Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).</li>
<li>Becher, B., Tugues, S., Greter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF%3A+From+Growth+Factor+to+Central+Mediator+of+Tissue+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation.</a> Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).</li>
<li>Conti, L., Gessani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+in+the+generation+of+dendritic+cells+from+human+blood+monocyte+precursors%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances.</a> Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).</li>
<li>Higano, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+data+from+2+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled%2C+phase+3+trials+of+active+cellular+immunotherapy+with+sipuleucel-T+in+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer.</a> Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).</li>
<li>Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+GM-CSF-based+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy.</a> Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).</li>
<li>Dranoff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+irradiated+tumor+cells+engineered+to+secrete+murine+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+potent%2C+specific%2C+and+long-lasting+anti-tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).</li>
<li>Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTremml%2C+G+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22">Current Protocols in Stem Cell Biology</a>. , (2008).</li>
<li>Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+fluorescence+intensity+and+protein+expression+in+HeLa+cells+stably+transfected+with+hrGFP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP.</a> Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).</li>
<li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+of+hrGFP+by+mouse+embryonic+stem+cells%3A+promoter+activity+in+the+undifferentiated+state+and+during+dopaminergic+neural+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation.</a> Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).</li>
<li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+embryonic+stem+cells+protects+against+lung+cancer%3A+is+a+broad-spectrum+prophylactic+vaccine+against+cancer+possible%3F%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible?</a> PLoS One. 7 (7), e42289(2012).</li>
<li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent%3A+primary+neurons%2C+siRNA%2C+and+high-throughput+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThery%2C+C+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , (2006).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+for+Immunoregulation+and+Therapeutic+Intervention+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer.</a> Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).</li>
<li>Bunggulawa, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+the+use+of+exosomes+as+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems.</a> Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81(2018).</li>
<li>Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proviral+silencing+in+embryonic+cells+is+regulated+by+Yin+Yang+1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1.</a> Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).</li>
<li>Dranoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF-based+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">GM-CSF-based cancer vaccines.</a> Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).</li>
<li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Feeder+Cell+Types+on+Culture+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development+and+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro.</a> Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).</li>
<li>Lin, S., Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+culturing+mouse+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).</li>
<li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+from+GM-CSF+expressing+embryonic+stem+cells+are+an+effective+prophylactic+vaccine+for+cancer+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22OncoImmunology%22%5BJournal%5D)">Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention.</a> OncoImmunology. 8 (3), 1561119(2019).</li>
</ol>

Kavitha Yaddanapudi, Chi Li i John W. Eaton złożyli w USA wniosek patentowy "Kompozycje zawierające zmodyfikowane egzosomy pochodzące z embrionalnych komórek macierzystych i metody ich wykorzystania".

Badanie to pokazuje wysoce wydajną metodę wytwarzania EV wzbogaconych w egzosomy przenoszących białko immunostymulujące GM-CSF, które można wykorzystać do badania immunomodulacyjnego działania EV wzbogaconych w egzosomy. Kilka badań sugeruje, że egzosomy wykazują funkcje immunoregulacyjne i przeciwnowotworowe22. Tak więc egzosomy z ESC wyrażające GM-CSF mogą również posiadać aktywność biologiczną, która reguluje odpowiedź immunologiczną. W tym protokole egzogenny mysi GM-CSF ulegał stabilnej nadek...

ESC pochodzą ze stadium blastocysty zarodka preimplantacyjnego1. Jako pluripotencjalne komórki macierzyste, ESC mają zdolność do samoodnawiania się i różnicowania w dowolny typ komórki embrionalnej. Ze względu na swój niezwykły potencjał rozwojowy i długoterminową zdolność do proliferacji, ESC są niezwykle cenne dla badań biomedycznych1. Obecne wysiłki badawcze w dużej mierze koncentrują się na potencjale terapeutycznym ESC w przypadku różnych głównych zaburzeń patologicznych, w tym cukrzycy, chorób serca i chorób neurodegeneracyjnych2,3,4.
Komórki ssaków, w tym ESC, są znane z tego, że uwalniają pęcherzyki o różnych rozmiarach do środowiska zewnątrzkomórkowego, a te EV posiadają wiele fizjologicznych i patologicznych funkcji ze względu na ich rolę w komunikacji międzykomórkowej5. Wśród różnych podtypów EV, egzosomy to małe pęcherzyki błonowe uwalniane z różnych typów komórek do przestrzeni zewnątrzkomórkowej po fuzji pośrednich przedziałów endocytarnych, ciał wielopęcherzykowych (MVB), z błoną plazmatyczną6. Doniesiono, że egzosomy pośredniczą w komunikacji międzykomórkowej i są krytycznie zaangażowane w wiele procesów (pato)fizjologicznych7,8. Egzosomy dziedziczą niektóre funkcje biologiczne po własnych komórkach rodzicielskich, ponieważ egzosomy zawierają materiały biologiczne pozyskane z cytozolu, w tym białka i kwasy nukleinowe. W ten sposób powiązane antygeny lub czynniki stymulujące odpowiedź immunologiczną specyficzną dla danej choroby są zamknięte w egzosomach z określonych typów komórek9. Utorowało to drogę do badań klinicznych badających egzosomy pochodzące z nowotworów jako szczepionkę przeciwnowotworową10.
GM-CSF to cytokina wydzielana przez różne typy komórek odpornościowych11. Pojawiające się dowody wskazują, że GM-CSF aktywuje i reguluje układ odpornościowy oraz odgrywa istotną rolę w procesie prezentacji antygenu12. Na przykład raport kliniczny sugeruje, że GM-CSF stymuluje odpowiedź immunologiczną na nowotwory jako adiuwant szczepionki 13. W badaniach klinicznych zbadano kilka strategii immunoterapii nowotworów opartych na GM-CSF w celu wykorzystania silnej aktywności immunostymulującej GM-CSF14. Wśród nich szczepionka przeciwnowotworowa złożona z napromieniowanych komórek nowotworowych wydzielających GM-CSF okazała się obiecująca u pacjentów z zaawansowanym czerniakiem, indukując komórkowe i humoralne odpowiedzi przeciwnowotworowe, a następnie martwicę w guzach z przerzutami15.
Ponieważ egzosomy pochodzące z ESC mają podobną aktywność biologiczną jak oryginalne ESC, być może egzosomy z ESC przenoszące GM-CSF mogłyby funkcjonować jako bezkomórkowe pęcherzyki regulujące odpowiedź immunologiczną. W artykule opisano szczegółową metodę wytwarzania wysokiej jakości EV wzbogaconych w egzosomy z ESC eksprymujących GM-CSF. Te wzbogacone egzosomami EV mogą potencjalnie służyć jako pęcherzyki regulujące układ odpornościowy w celu modulowania odpowiedzi immunologicznej.

<table><tbody><tr><td>Fosforan alkaliczny, Jelito cielęcia</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td>Defosforylujący plazmid DNA</td></tr><tr><td>anty-aneksyna V mAb</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>klon H-3, sc-74438</td><td>Western blot, RRID:AB_1118989</td></tr><tr><td>anty-CD81 mAb</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>klon B-11, sc-166029</td><td>Western blot, RRID:AB_2275892</td></tr><tr><td>antycytochrom c mAb</td><td>Santa Cruz Biotechnologiczny</td><td>klon A-8, sc-13156</td><td>Western blot, RRID:AB_627385</td></tr><tr><td>anty-Flotillin-1 mAb</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>klon C-2; sc-74566</td><td>Western blot, RRID:AB_2106563</td></tr><tr><td>anty-GAPDH pAb</td><td>Rockland</td><td>600-401-A33S</td><td>Western blot, RRID:AB_11182910</td></tr><tr><td>anty-mysia IgG, koza, sprzężona z peroksydazą</td><td>Thermo Fisher</td><td>31430</td><td>Western blot, RRID:AB_228307</td></tr><tr><td>anty-Oxphos COX IV-subunit IV mAb</td><td>Thermo Fisher</td><td>klon 20E8C12 A21348</td><td>Western blot, RRID:AB_221509</td></tr><tr><td>izomeraza dwusiarczkowa przeciwbiałkowa (PDI) pAb</td><td>Enzo</td><td>ADI-SPA-890</td><td>Western blot, RRID:AB_10616242</td></tr><tr><td>anty-królicza IgG, koza, sprzężona z peroksydazą</td><td>Thermo Fisher</td><td>31460</td><td>Western blot, RRID:AB_228341</td></tr><tr><td>Test BCA (kwas bicinchoninowy)</td><td>Thermo Fisher</td><td>23223</td><td>Oznaczanie stężeń białek</td></tr><tr><td>Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%</td><td>Genscript</td><td>M42015</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Karbenicylina, sól disodowa</td><td>Thermo Fisher</td><td>10177012</td><td>Wybór kolonii E. coli</td></tr><tr><td>Wirówka, Avanti J-26 XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Wirowanie wolnoobrotowe</td></tr><tr><td>Wirnik wirówki, JA-10</td><td>Beckman Redlica</td><td>09U1597</td> Butelka wirówki <td>do wirowania z niską</td></tr><tr><td>prędkością, Nalgene PPCO</td><td>Thermo Fisher</td><td>3120-0500PK</td><td>Wirowanie o niskiej prędkości</td></tr><tr><td>Siatki Cu z folią węglową</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>FF200-Cu</td><td>Akwizycja obrazów z mikroskopii elektronowej</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101</td><td>Trawienie plazmidu DNA</td></tr><tr><td>Zwiększona chemiluminescencja system detekcji</td><td>Thermo Fisher</td><td>32106</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy FACScalibur</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Badanie poziomów GFP komórek ES-D3</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu ATCC</td><td>SCRR-30-2020</td><td>Pożywka dla komórek ES-D3</td></tr><tr><td>Sterylne sitka komórkowe Fisherbrand; Rozmiar oczek: 40 i mu; m</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-363-547</td><td>Komory filtrujące ES-D3 do sortowania FACS</td></tr><tr><td>Żelatyna (0,1%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>ES006B</td><td>Zestaw do hodowli komórek ES-D3</td></tr><tr><td>GM-CSF Zestaw ELISA</td><td>Thermo Fisher</td><td>88733422</td><td>Oznaczanie stężeń GM-CSF</td></tr><tr><td>KnockOut Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>10-829-018</td><td>Pożywka dla komórek ES-D3</td></tr><tr><td>Czynnik hamujący białaczkę</td><td>Thermo Fisher</td><td>ESG1106</td><td>Pożywka dla komórek ES-D3</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>VWR</td><td>VWRL0131-0100</td><td>Pożywka dla komórek ES-D3</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td>Transfekcja komórek ES-D3</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek, PowerWave XS</td><td>BioTek</td><td></td><td>Oznaczanie stężeń GM-CSF</td></tr><tr><td>Szybki sortownik komórek MoFlo XDP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Izolowanie pojedynczych klonów komórek ES-D3</td></tr><tr><td>NEB 5-alfa Kompetentny E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2988J</td><td>Generowanie plazmidu ekspresji GM-CSF</td></tr><tr><td>Neomycyna</td><td>Thermo Fisher</td><td>10-131-035</td><td>Wybór klonów ES-D3</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Thermo Fisher</td><td>SH3023801</td><td>Podłoże do komórek ES-D3</td></tr><tr><td>Beztłuszczowe mleko w proszku</td><td>Thermo Fisher</td><td>NC9022655</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowane podłoże surowicy</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td>Transfekcja komórek ES-D3</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15710</td><td>Pozyskiwanie obrazów z mikroskopii elektronowej</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>VWR</td><td>sc45000-652</td><td>Pożywka dla komórek ES-D3</td></tr><tr><td>Plazmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP</td><td>Addgene</td><td>37270</td><td>Generowanie ekspresji GM-CSF</td></tr><tr><td>plazmidowe błony PVDF</td><td>Millipore</td><td>EMD IPVH00010</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>Generowanie plazmidu ekspresji GM-CSF</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick (50)</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>Generowanie plazmidu ekspresji GM-CSF</td></tr><tr><td>Zestaw do szybkiej ligacji</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>Generowanie plazmidu ekspresyjnego GM-CSF</td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>Hitachi</td><td>HT7700</td><td>Akwizycja obrazów z mikroskopii elektronowej</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>VWR</td><td>45000-660</td><td>Hodowla komórek ES-D3</td></tr><tr><td>Ultrawirówka, OptimaTM L-100 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>High wirowanie z prędkością</td></tr><tr><td>Wirnik ultrawirówki, 45Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>09U4454</td><td>Wirowanie z dużą prędkością</td></tr><tr><td>Butelka z poliwęglanu do ultrawirówki</td><td>Beckman Coulter</td><td>355622</td><td>Wirowanie z dużą prędkością</td></tr><tr><td>Roztwór barwiący UranyLess</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>22409</td><td>Pozyskiwanie obrazów z mikroskopii elektronowej</td></tr></tbody></table>

izolacja wzbogaconych egzosomami pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przenoszących czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów z embrionalnych komórek macierzystych

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Embrionalne komórki macierzyste (ESC) to pluripotencjalne komórki macierzyste zdolne do samoodnawiania się i różnicowania we wszystkie typy komórek embrionalnych. Podobnie jak wiele innych typów komórek, ESC uwalniają małe pęcherzyki błonowe, takie jak egzosomy, do środowiska zewnątrzkomórkowego. Egzosomy służą jako niezbędne mediatory komunikacji międzykomórkowej i odgrywają podstawową rolę w wielu procesach (pato)fizjologicznych. Czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) działa jako cytokina modulująca odpowiedź immunologiczną. Obecność GM-CSF w egzosomach może potencjalnie zwiększyć ich funkcję immunologiczno-regulacyjną. W tym przypadku GM-CSF ulegał stabilnej nadekspresji w mysiej linii komórkowej ESC ES-D3. Opracowano protokół izolowania wysokiej jakości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) wzbogaconych egzosomami z komórek ES-D3 z nadekspresją GM-CSF. Wyizolowane EV wzbogacone egzosomami charakteryzowały się różnorodnymi podejściami eksperymentalnymi. Co ważne, stwierdzono, że znaczne ilości GM-CSF są obecne w EV wzbogaconych w egzosomy. Ogólnie rzecz biorąc, EV wzbogacone w egzosomy GM-CSF z ESC mogą funkcjonować jako pęcherzyki bezkomórkowe, aby wywierać swoje działania immunoregulacyjne.

GM-CSF jest nadmiernie ekspresowany w mysich ESCs. 
Aby uzyskać stabilną nadekspresję GM-CSF w komórkach ES-D3, cDNA mysiego GM-CSF sklonowano do wektora transfekcyjnego w celu stworzenia wektora ekspresyjnego pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (Rycina 1A). Nadekspresję GM-CSF w komórkach ES-D3 osiągnięto poprzez transfekcję, przy czym około 20% przejściowo transfekowanych komórek ES-D3 było dodatnich pod kątem GFP. Klony komórkowe ...

To badanie opisuje metodę izolowania z embrionalnych komórek macierzystych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami przenoszących czynniki stymulujące tworzenie kolonii granulocytów makrofagów granulocytów.

Izolacja wzbogaconych egzosomami pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przenoszących czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów z embrionalnych komórek macierzystych

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Nasz protokół może być wykorzystany do produkcji wysokiej jakości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami z embrionalnych komórek macierzystych, które wyrażają czynnik stymulujący układ odpornościowy, GM-CSF. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wzbogacone egzosomami przenoszące GM-CSF mogą potencjalnie służyć bezkomórkowym pęcherzykom regulatora odpornościowego, które mogą modulować odpowiedź immunologiczną. Naukowcy z podstawowym przeszkoleniem w zakresie biologii molekularnej i komórkowej powinni być w stanie łatwo to zrobić, tak jak ten protokół, ale każdy, kto wykonuje ten protokół po raz pierwszy, powinien ściśle przestrzegać wskazówek.Ponieważ nasz protokół jest skomplikowany, wizualizacja skomplikowanych szczegółów każdego kroku pomoże innym badaczom Wygenerować FBS wolny od egzosomów, ultraodwirować żądaną objętość FBS i zebrać supernatant wolny od egzosomów. Przed posiewem trzech komórek ESD pokryj 15-centymetrowe szalki do hodowli tkankowych 0,1% żelatyny w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Usuń żelatynę przez aspirację i hodowlę trzech komórek ESD bez warstwy zasilającej komórki w trzykomórkowym pożywce ESD w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla, aż komórki osiągną 90% zbieżności.Umyj prawie zlewające się kultury pięcioma mililitrami 0,05% trypsyny na naczynie, a następnie pięciominutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza w świeżej trypcynie. Pod koniec inkubacji wciągnąć oderwane komórki do probówki wirówkowej i dezaktywować trypsynę za pomocą pięciu mililitrów świeżej pożywki hodowlanej. Osadź komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić palety w świeżej pożywce w celu zliczenia Do pasażu, płytka pięć razy 10 do szóstej ESD trzy komórki w 15 mililitrach pożywki do hodowli komórkowej na nowych płytkach pokrytych żelatyną na trzy dni hodowli przed subkulturą komórek Aby zebrać supernatant hodowli komórkowej do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami płytka jeden razy 10 do siódmego ESD trzy komórki na 15 mililitry pożywki do hodowli komórkowych na nową płytkę pokrytą żelatyną przez trzy dni przed zebraniem supernatantów do hodowli komórkowych W celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami, najpierw osadzaj duże fragmenty komórek w supernatantach zebrane z 72-godzinnej hodowli ESD trzech komórek przez odwirowanie.Po zebraniu supernatantu należy ultraodwirować próbki i wyrzucić supernatanty. Delikatnie przepłucz każdą paletę dwa razy jednym mililitrem PBS na pranie, aby usunąć resztki supernatantu hodowli i określić ilościowo zawartość białka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconego egzosomem za pomocą testu kwasu bicunchoninowego, zgodnie z instrukcją producenta. Następnie ponownie zawiesić pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wzbogacone egzosomami w PBS w stężeniu sześciu mikrogramów na mikrometr do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Aby uwidocznić pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wzbogacone w egzosom za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, utrwal od trzech do pięciu mikrogramów na mililitr pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z końcowym stężeniem 2% paraformaldehydu z siatki mikroskopu elektronowego w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Pod koniec inkubacji załadować 10 mikrolitrów utrwalonych próbek na kratki miedziane z węglową folią nośną na jedną minutę przed opróżnieniem siatek bibułą filtracyjną, pozostać w siatkach z odpowiednim roztworem barwiącym, zgodnie z protokołem producenta i za pomocą pęsety przenieść siatki na kawałek bibuły filtracyjnej, Następnie użyj transmisyjnego mikroskopu elektronowego o powiększeniu 50 000 razy, aby uzyskać obrazy z mikroskopii elektronowej, zgodnie ze standardowymi protokołami. Aby przygotować ekstrakty z całych komórek, należy zebrać trzy komórki ESD z hodowli, jak pokazano, i ponownie zawiesić zebrane komórki w PBS w celu zliczenia.Po drugim odwirowaniu, ponownie zawiesić komórki od pięciu razy 10 do trzecich komórek na mikrolitr bufora ładującego stronę SDS zawierającego 0,5% stężenia SDS i sonikować próbki przez 10 sekund na Sonicatorze o amplitudzie 10%. Następnie podgrzewaj próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut. Aby przygotować lizaty dla pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomem, ponownie zawieś pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wzbogacone egzosomami w buforze ładującym stronę SDS zawierającym 0,5% SDS w stężeniu 1,2 mikrograma na mikrolitr i poddaj próbki sonikacji przez 10 sekund, jak pokazano, a następnie podgrzej próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut.W przypadku analizy Western Blot załaduj 10 mikrolitrów hurtowego ekstraktu i próbek lizatu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami do indywidualnych studzienek najlepszego żelu na stronę stresu. Pod koniec serii przenieś białka na membrany PVDF i inkubuj błony z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi, które Cię interesują, a następnie wykryj ekspresję białka za pomocą ulepszonego zestawu do wykrywania chemiluminescencji, zgodnie z instrukcjami producenta. Aby ocenić ilość GM-CSF w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami, użyj zestawu Murine GM-CSF, aby pokryć płytkę ELISA przeciwciałem wychwytującym anty GM-CSF, a następnie potraktuj 0,6 mikrograma próbek pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami 100 mikrolitrami samego PBS lub PBS plus 0,05% tween 20 w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Pod koniec inkubacji dodać próbki poddane działaniu substancji do poszczególnych studzienek przygotowanej płytki ELISA na jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć odpowiednie studzienki samym PBS lub PBS plus 0,05% tween 20. Po przemyciu dodać przeciwciało detekcyjne do próbek na jedną godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej, a następnie przepłukać samym PBS lub PBS plus 0,05% między 20, jak pokazano, następnie dodać peroksydazę chrzanową Avidin do próbek na 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej, a następnie przepłukać i zmierzyć absorbancję w każdym studzienku na czytniku mikropłytek przy 450 nanometrach. Intensywność fluorescencji GFP w linii trzech komórek GM-CSF z ekspresją ESD lub w trzykomórkowej linii ESD z ekspresją pustego wektora jest znacznie wyższa niż w ich rodzicielskich odpowiednikach.Test ELISA ujawnia, że trzy komórki ESD wykazujące ekspresję GM-CSF wytwarzają znacznie wyższe poziomy GMCSF w supernatancie hodowli komórkowej niż puste komórki kontrolne wektorów. Co więcej, ilość GM-CSF generowana przez GM-CSF eksprymujący trzy komórki ESD jest podobna do tej wytwarzanej przez fibroblasty STO eksprymujące GM-CSF. Transmisyjna mikroskopia elektronowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wyizolowanych z kultur komórkowych transdukowanych wektorowo i GM-CSF ujawnia pęcherzyki o różnych rozmiarach, które mieszczą się w oczekiwanym zakresie średnic od 30 do 100 nanometrów.Ekspresja markerów egzosomalnych, w tym CD81, aneksyny V i flotyliny-1, jest znacznie zwiększona w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych, wyizolowanych z trzech komórek ESD w porównaniu z odpowiednimi ekstraktami hurtowymi za pomocą analizy Western blot. Co ważne, nie wykryto obecności innych subkomórkowych markerów kompartmentowych w trzech pęcherzykach zewnątrzkomórkowych pochodzących z ESD, w tym markera retikulum endoplazmatycznego, izomerazy dwusiarczkowej białka, markerów mitochondrialnych, cytochromu C i podjednostki IV kompleksu Oxphos IV oraz markera cytozolowego GAPDH. Po umyciu 0,05% tween 20 poziomy tła GM-CSF wykryte w kontrolnych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych uległy znacznemu zmniejszeniu.W przeciwieństwie do tego, poziomy GM-CSF w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych komórek eksprymujących GM-CSF zostały znacznie zwiększone przez 20 sekund. Pozyskanie wysokiej jakości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami przenoszących GMCSF jest najważniejszym krokiem dla powodzenia tego protokołu. Naukowcy mogą przeprowadzić dodatkowe eksperymenty, takie jak badania na liniach komórkowych zależnych od GM-CSF i zwierzętach, aby ustalić, czy pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wzbogacone egzosomami opiekujące się GM-CSF mogą funkcjonować jako bezkomórkowe pęcherzyki regulatora odpornościowego.Te wzbogacone egzosomami pęcherzyki zewnątrzkomórkowe można następnie wykorzystać do zbadania, w jaki sposób modulacja odpowiedzi immunologicznej wpływa na różne stany chorobowe.

isolation-exosome-enriched-extracellular-vesicles-carrying

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje metodę opartą na chromatografii wykluczania wielkości (SEC) do izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lub EV pochodzących z komórek odpornościowych mózgu - mikrogleju. EV działają jak ładunek molekularny, dostarczając mediatory, które regulują odpowiedź immunologiczną. W związku z tym wyizolowane EV mogą być wykorzystane jako model in vitro do badania wzajemnych oddziaływań mikrogleju i neuronów podczas neuronalnej odpowiedzi immunologicznej.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z mikrogleju oparta na SEC: technika izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek hodowlanych kondycjonowanych mikroglejem

Ten protokół pokazuje, jak oczyszczać zewnątrzkomórkowe mikroRNA z pożywek do hodowli komórkowych w celu budowy małych bibliotek RNA i sekwencjonowania nowej generacji. Opisano różne punkty kontrolne kontroli jakości, aby umożliwić czytelnikom zrozumienie, czego można się spodziewać podczas pracy z próbkami o niskim poziomie wejściowym, takimi jak exRNA.

Izolowanie, sekwencjonowanie i analiza zewnątrzkomórkowych mikroRNA z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Ten protokół ilustruje 1) izolację i hodowlę pierwotnych fibroblastów z mięśnia brzuchatego łydki dorosłej myszy, a także 2) oczyszczanie i charakterystykę egzosomów za pomocą różnicowej metody ultrawirowania w połączeniu z gradientami gęstości sacharozy, a następnie analizami western blot.

Izolacja i charakterystyka egzosomów z fibroblastów mięśni szkieletowych

Aplikacja egzosomów to nowe narzędzie do opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. Ustanawiamy protokół izolacji egzosomów o wysokiej czystości, aby wyizolować egzosomy z nowo zidentyfikowanych komórek macierzystych zwanych CB-SC do badań mechanistycznych. Zajmujemy się również wspólną hodowlą egzosomów pochodzących z CB-SC z ludzkimi monocytami, co prowadzi do ich różnicowania w fenotypowo odrębne makrofagi.

Różnicowanie monocytów w fenotypowo odrębne makrofagi po leczeniu egzosomami pochodzącymi z ludzkich komórek macierzystych krwi pępowinowej (CB-SC)

Protokół tutaj pokazuje, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą być odpowiednio oddzielone od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

Ten protokół pokazuje, jak izolować małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pępowiny (hUC-MSC-sEVs) za pomocą prostego laboratoryjnego ustawienia. Rozkład wielkości, stężenie białka, markery sEVs i morfologia izolowanych hUC-MSC-sEVs są charakteryzowane odpowiednio za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, testu białka BCA, western blot i transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Prosta metoda filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Obecny protokół opisuje wirowanie różnicowe w celu izolowania i charakteryzowania reprezentatywnych EV (egzosomów i mikropęcherzyków) z hodowanych ludzkich MSC. W tym artykule wyjaśniono również dalsze zastosowania tych pojazdów elektrycznych.

Izolacja, charakterystyka i zastosowanie terapeutyczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z hodowanych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy metodę szybkiej homogenizacji wspomaganą separacją magnetyczną do produkcji na dużą skalę nanopęcherzyków pochodzących z endosomów jako nowy typ egzosomów naśladujących (EM), które mają to samo pochodzenie biologiczne i podobną strukturę, morfologię i skład białkowy natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV).

Metoda szybkiej homogenizacji wspomagana separacją magnetyczną do produkcji pęcherzyków pochodzących z endosomów na dużą skalę

Obecność nowotworowych komórek macierzystych (CSC) w mięsakach kostnych została ostatnio powiązana z ich patogenezą. W artykule przedstawiono izolację CSCs z pierwotnych kultur komórkowych uzyskanych z ludzkich biopsji konwencjonalnego kostniakomięsaka (OS) z wykorzystaniem zdolności CSC do wzrostu w warunkach niezakaźnych.

Ustanowienie hodowli nowotworowych komórek macierzystych z ludzkiego konwencjonalnego kostniakomięsaka

Tutaj opisujemy modele ksenoprzeszczepu danio pręgowanego za pomocą dwóch różnych miejsc iniekcji, tj. przestrzeni perivitelinowej i kanału Cuviera, aby zbadać inwazyjne zachowanie i ocenić potencjał wewnątrznaczyniowy i wynaczynieniowy ludzkich komórek raka piersi, odpowiednio.

Inwazyjne zachowanie ludzkich komórek raka piersi u embrionalnego danio pręgowanego

Poznaj metodę izolacji wzbogaconych egzosomami pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z komórek macierzystych embrionalnych zawierających czynnik GM-CSF. Protokół umożliwia uzyskanie wysokiej jakości wykazów immunomodulacyjnych.

Izolacja wzbogaconych egzosomami pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przenoszących czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów z embrionalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja wzbogaconych egzosomami pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przenoszących czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów z embrionalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów