Izolacja wzbogaconych egzosomami pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przenoszących czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów z embrionalnych komórek macierzystych

Nasz protokół może być wykorzystany do produkcji wysokiej jakości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami z embrionalnych komórek macierzystych, które wyrażają czynnik stymulujący układ odpornościowy, GM-CSF. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wzbogacone egzosomami przenoszące GM-CSF mogą potencjalnie służyć bezkomórkowym pęcherzykom regulatora odpornościowego, które mogą modulować odpowiedź immunologiczną. Naukowcy z podstawowym przeszkoleniem w zakresie biologii molekularnej i komórkowej powinni być w stanie łatwo to zrobić, tak jak ten protokół, ale każdy, kto wykonuje ten protokół po raz pierwszy, powinien ściśle przestrzegać wskazówek.

Ponieważ nasz protokół jest skomplikowany, wizualizacja skomplikowanych szczegółów każdego kroku pomoże innym badaczom Wygenerować FBS wolny od egzosomów, ultraodwirować żądaną objętość FBS i zebrać supernatant wolny od egzosomów. Przed posiewem trzech komórek ESD pokryj 15-centymetrowe szalki do hodowli tkankowych 0,1% żelatyny w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Usuń żelatynę przez aspirację i hodowlę trzech komórek ESD bez warstwy zasilającej komórki w trzykomórkowym pożywce ESD w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla, aż komórki osiągną 90% zbieżności.

Umyj prawie zlewające się kultury pięcioma mililitrami 0,05% trypsyny na naczynie, a następnie pięciominutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza w świeżej trypcynie. Pod koniec inkubacji wciągnąć oderwane komórki do probówki wirówkowej i dezaktywować trypsynę za pomocą pięciu mililitrów świeżej pożywki hodowlanej. Osadź komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić palety w świeżej pożywce w celu zliczenia Do pasażu, płytka pięć razy 10 do szóstej ESD trzy komórki w 15 mililitrach pożywki do hodowli komórkowej na nowych płytkach pokrytych żelatyną na trzy dni hodowli przed subkulturą komórek Aby zebrać supernatant hodowli komórkowej do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami płytka jeden razy 10 do siódmego ESD trzy komórki na 15 mililitry pożywki do hodowli komórkowych na nową płytkę pokrytą żelatyną przez trzy dni przed zebraniem supernatantów do hodowli komórkowych W celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami, najpierw osadzaj duże fragmenty komórek w supernatantach zebrane z 72-godzinnej hodowli ESD trzech komórek przez odwirowanie.

Po zebraniu supernatantu należy ultraodwirować próbki i wyrzucić supernatanty. Delikatnie przepłucz każdą paletę dwa razy jednym mililitrem PBS na pranie, aby usunąć resztki supernatantu hodowli i określić ilościowo zawartość białka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconego egzosomem za pomocą testu kwasu bicunchoninowego, zgodnie z instrukcją producenta. Następnie ponownie zawiesić pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wzbogacone egzosomami w PBS w stężeniu sześciu mikrogramów na mikrometr do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby uwidocznić pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wzbogacone w egzosom za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, utrwal od trzech do pięciu mikrogramów na mililitr pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z końcowym stężeniem 2% paraformaldehydu z siatki mikroskopu elektronowego w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Pod koniec inkubacji załadować 10 mikrolitrów utrwalonych próbek na kratki miedziane z węglową folią nośną na jedną minutę przed opróżnieniem siatek bibułą filtracyjną, pozostać w siatkach z odpowiednim roztworem barwiącym, zgodnie z protokołem producenta i za pomocą pęsety przenieść siatki na kawałek bibuły filtracyjnej, Następnie użyj transmisyjnego mikroskopu elektronowego o powiększeniu 50 000 razy, aby uzyskać obrazy z mikroskopii elektronowej, zgodnie ze standardowymi protokołami. Aby przygotować ekstrakty z całych komórek, należy zebrać trzy komórki ESD z hodowli, jak pokazano, i ponownie zawiesić zebrane komórki w PBS w celu zliczenia.

Po drugim odwirowaniu, ponownie zawiesić komórki od pięciu razy 10 do trzecich komórek na mikrolitr bufora ładującego stronę SDS zawierającego 0,5% stężenia SDS i sonikować próbki przez 10 sekund na Sonicatorze o amplitudzie 10%. Następnie podgrzewaj próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut. Aby przygotować lizaty dla pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomem, ponownie zawieś pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wzbogacone egzosomami w buforze ładującym stronę SDS zawierającym 0,5% SDS w stężeniu 1,2 mikrograma na mikrolitr i poddaj próbki sonikacji przez 10 sekund, jak pokazano, a następnie podgrzej próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut.

W przypadku analizy Western Blot załaduj 10 mikrolitrów hurtowego ekstraktu i próbek lizatu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami do indywidualnych studzienek najlepszego żelu na stronę stresu. Pod koniec serii przenieś białka na membrany PVDF i inkubuj błony z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi, które Cię interesują, a następnie wykryj ekspresję białka za pomocą ulepszonego zestawu do wykrywania chemiluminescencji, zgodnie z instrukcjami producenta. Aby ocenić ilość GM-CSF w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami, użyj zestawu Murine GM-CSF, aby pokryć płytkę ELISA przeciwciałem wychwytującym anty GM-CSF, a następnie potraktuj 0,6 mikrograma próbek pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami 100 mikrolitrami samego PBS lub PBS plus 0,05% tween 20 w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Pod koniec inkubacji dodać próbki poddane działaniu substancji do poszczególnych studzienek przygotowanej płytki ELISA na jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć odpowiednie studzienki samym PBS lub PBS plus 0,05% tween 20. Po przemyciu dodać przeciwciało detekcyjne do próbek na jedną godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej, a następnie przepłukać samym PBS lub PBS plus 0,05% między 20, jak pokazano, następnie dodać peroksydazę chrzanową Avidin do próbek na 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej, a następnie przepłukać i zmierzyć absorbancję w każdym studzienku na czytniku mikropłytek przy 450 nanometrach. Intensywność fluorescencji GFP w linii trzech komórek GM-CSF z ekspresją ESD lub w trzykomórkowej linii ESD z ekspresją pustego wektora jest znacznie wyższa niż w ich rodzicielskich odpowiednikach.

Test ELISA ujawnia, że trzy komórki ESD wykazujące ekspresję GM-CSF wytwarzają znacznie wyższe poziomy GMCSF w supernatancie hodowli komórkowej niż puste komórki kontrolne wektorów. Co więcej, ilość GM-CSF generowana przez GM-CSF eksprymujący trzy komórki ESD jest podobna do tej wytwarzanej przez fibroblasty STO eksprymujące GM-CSF. Transmisyjna mikroskopia elektronowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wyizolowanych z kultur komórkowych transdukowanych wektorowo i GM-CSF ujawnia pęcherzyki o różnych rozmiarach, które mieszczą się w oczekiwanym zakresie średnic od 30 do 100 nanometrów.

Ekspresja markerów egzosomalnych, w tym CD81, aneksyny V i flotyliny-1, jest znacznie zwiększona w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych, wyizolowanych z trzech komórek ESD w porównaniu z odpowiednimi ekstraktami hurtowymi za pomocą analizy Western blot. Co ważne, nie wykryto obecności innych subkomórkowych markerów kompartmentowych w trzech pęcherzykach zewnątrzkomórkowych pochodzących z ESD, w tym markera retikulum endoplazmatycznego, izomerazy dwusiarczkowej białka, markerów mitochondrialnych, cytochromu C i podjednostki IV kompleksu Oxphos IV oraz markera cytozolowego GAPDH. Po umyciu 0,05% tween 20 poziomy tła GM-CSF wykryte w kontrolnych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych uległy znacznemu zmniejszeniu.

W przeciwieństwie do tego, poziomy GM-CSF w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych komórek eksprymujących GM-CSF zostały znacznie zwiększone przez 20 sekund. Pozyskanie wysokiej jakości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami przenoszących GMCSF jest najważniejszym krokiem dla powodzenia tego protokołu. Naukowcy mogą przeprowadzić dodatkowe eksperymenty, takie jak badania na liniach komórkowych zależnych od GM-CSF i zwierzętach, aby ustalić, czy pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wzbogacone egzosomami opiekujące się GM-CSF mogą funkcjonować jako bezkomórkowe pęcherzyki regulatora odpornościowego.

Te wzbogacone egzosomami pęcherzyki zewnątrzkomórkowe można następnie wykorzystać do zbadania, w jaki sposób modulacja odpowiedzi immunologicznej wpływa na różne stany chorobowe.