Name: Obrazowanie nanoskopowe skrawków tkanek ludzkich poprzez ekspansję fizyczną i izotropową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj metodę ExPath do nanoskopowego obrazowania biomolekuł w skrawkach tkanek klinicznych poprzez fizyczną ekspansję próbek. Technika ta umożliwia badanie konfiguracji nanoskalowych bez konieczności zakupu nowego sprzętu mikroskopowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusz Faculty Start-up z Carnegie Mellon University (YZ) oraz NIH Director's New Innovator Award (DP2 OD025926-01 dla YZ).

1. Przygotowanie podstawowych odczynników i roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj składniki roztworu żelującego. 
	UWAGA: Stężenia roztworów podane są w g/ml (w/v procentach).
	<ol>
		<li>Przygotować następujące roztwory podstawowe: 38% (m/v) akrylan sodu (SA), 50% (w/v) akryloamid (AA), 2% (w/v) N,N′-metylenobisakryloamid (Bis) i 29,2% (w/v) chlorek sodu (NaCl). Rozpuść związki w wodzie podwójnie dejonizowanej (ddH2O). Należy wykorzystać kwoty w tabeli 1 jako odniesienie; Przygotowane rozwiązania można skalować w górę lub w dół w zależności od potrzeb. Na przykład, aby przygotować 10 ml 38% (w/v) roztworu SA, dodaj 1,9 g SA do butli z podziałką 10 ml i dodaj ddH2O do objętości 5 ml.</li>
		<li>Przygotować 9,4 ml roztworu monomeru o stężeniu 1,06x, jak pokazano w tabeli 1. 
		nuta: Spowoduje to stężenie 1x po dodaniu inicjatora, akceleratora i inhibitora. Monomer może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy lub w temperaturze -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.</li>
		<li>Przygotować następujące roztwory podstawowe oddzielnie w ddH2O: 0,5% (m/v) inhibitora 4-hydroksy-2,2,6,6-tetrametylopirydyno-1-oksylu (4HT), który hamuje żelowanie, aby umożliwić dyfuzję roztworu żelującego do tkanek, 10% (v/v) inicjatora tetrametyloetylenodiaminy (TEMED), który przyspiesza wytwarzanie rodników przez nadsiarczan amonu (APS) i 10% (w/v) APS, który inicjuje proces żelowania. 
		nuta: Roztwory podstawowe 4HT i TEMED można przygotować w podwielokrotnościach o pojemności 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 6 miesięcy. Stwierdzono, że APS traci skuteczność po długotrwałym przechowywaniu i najlepiej przygotowywać go w małych ilościach (<0,1 ml) bezpośrednio przed żelowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj bufor wytrawiający (50 mM Tris pH 8,0, 25 mM EDTA, 0,5% [w/v] niejonowy środek powierzchniowo czynny, 0,8 M NaCl) przez połączenie 25 ml 1 M Tris pH 8 (3,03 g zasady Tris w 25 ml ddH2O), 25 ml EDTA (0,5 M pH 8), 2,25 g niejonowego środka powierzchniowo czynnego i 23,38 g NaCl. Dodać ddH2O do całkowitej objętości 500 ml. 
	nuta: Roztwór można skalować w górę lub w dół w zależności od potrzeb i przechowywać w temperaturze 4 °C. Proteinaza K (ProK) zostanie dodana bezpośrednio przed etapem trawienia.</li>
	<li>Przygotować 20 mM roztworu cytrynianu sodu, łącząc 2,941 g cytrynianu sodu trójzasadowego dwuwodnego z 500 mlddH2O i dostosowując pH do 8,0 w temperaturze pokojowej (RT). W razie potrzeby skaluj ilość zapasów.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy kwasu 6-((akryloilo)amino)heksanowego, estru sukcynimidylowego (akryloilo-X, SE; AcX), związek kotwiący. Rozpuścić AcX w 500 μl bezwodnego dimetylosulfotlenku (DMSO) do końcowego stężenia 10 mg/ml. 
	nuta: Roztwór może być przechowywany w suchym środowisku w temperaturze -20 °C w 20 μl podwielokrotności.</li>
	<li>Jeśli nie używasz dostępnych w handlu do barwienia immunologicznego, przygotuj bufor blokujący. Użyj buforu blokującego składającego się z 5% (v/v) normalnej surowicy zwierzęcej i 0,1% (w/v) niejonowego środka powierzchniowo czynnego w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i wybierz surowicę na podstawie zwierzęcia gospodarza przeciwciał drugorzędowych. Na przykład, aby przygotować 500 ml buforu blokującego dla przeciwciał wyhodowanych u kóz, połącz 25 ml koziej surowicy, 0,45 g niejonowego środka powierzchniowo czynnego i 1x PBS do objętości 500 ml.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zarchiwizowanych i świeżo przygotowanych preparatów tkanek klinicznych dla ExPath
<ol>
	<li>Przekształć tkankę do formatu zgodnego z ExPath. Wybierz jeden z czterech następujących kroków (2.1.1−2.1.4) w zależności od sposobu przygotowania próbki: szkiełka FFPE, barwione szkiełka FFPE lub niezamocowane lub utrwalone zamrożone szkiełka tkankowe w roztworze o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). 
	UWAGA: Są one oparte na standardowych krokach odzyskiwania próbek patologicznych i nie są specyficzne dla protokołu ExPath.
	<ol>
		<li>Próbki kliniczne FFPE
		<ol>
			<li>Przygotuj 30 ml 95% etanolu, 70% etanolu i 50% etanolu. Odmierz 30 ml ksylenu, 100% etanolu i ddH2O.</li>
			<li>Umieścić szkiełko z próbką w stożkowym pojemniku o pojemności 50 ml za pomocą kleszczy i dodać 15 ml ksylenu. Zakryj probówkę i umieść ją poziomo na wytrząsarce orbitalnej z prędkością około 60 obr./min i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 3 minuty dla każdego roztworu. Powtórz z pozostałymi 15 ml ksylenu.</li>
			<li>Powtórzyć krok 2.1.1.2 ze 100% etanolem, 95% etanolem, 70% etanolem, 50% etanolem i ddH2O zamiast ksylenu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Szkiełka stałe barwione i montowane
		<ol>
			<li>Umieść szkiełko w szalce Petriego o średnicy 100 mm i przykryj ksylenem. Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą żyletki. Jeśli szkiełko nakrywkowe nie jest łatwe do usunięcia, umieść szkiełko z powrotem na ksylenie, aż szkiełko nakrywkowe się poluzuje .</li>
			<li>Przetwarzaj zgodnie z krokami dla próbek FFPE (kroki 2.1.1.1−2.1.1.3). 
			nuta: W przypadku szkiełek barwionych H&E plamy są eliminowane podczas procesu rozszerzania.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Nieutrwalone zamrożone szkiełka tkankowe w roztworze OCT
		<ol>
			<li>Utrwalić tkankę w acetonie w temperaturze -20 °C na 10 minut.</li>
			<li>Przemyć próbki 1 x roztworem PBS 3 razy przez 10 minut w temperaturze pokojowej temperatury.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wcześniej utrwalone, zamrożone kliniczne preparaty tkankowe
		<ol>
			<li>Inkubować szkiełka przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby stopić roztwór OCT.</li>
			<li>Przemyć próbkę 1 x roztworem PBS 3 razy przez 5 minut w temperaturze pokojowej temperatury.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić obróbkę cieplną w celu pobrania antygenu na wszystkich próbkach po konwersji formatu.
	<ol>
		<li>Dodać 20 mM roztworu cytrynianu (pH 8 przy wilgotności względnej) do żaroodpornego pojemnika, takiego jak słoik do barwienia szkiełek. 
		nuta: Roztworu powinno być wystarczająco dużo, aby przykryć chusteczkę zamontowaną na szkiełku podstawowym (50 ml dla standardowego słoika do barwienia szkiełek).</li>
		<li>Podgrzać roztwór cytrynianu do 100 °C w kuchence mikrofalowej i umieścić szkiełko w roztworze. Natychmiast przenieść pojemnik do komory inkubacyjnej i inkubować w temperaturze 60 °C przez 30 min. 
		nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Szkiełka można umieszczać na szalkach Petriego, przykrywać 1x PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybarwić próbkę przy użyciu standardowych protokołów barwienia immunofluorescencyjnego (IF)/immunohistochemicznego (IHC). 
	UWAGA: Specyficzne stężenia przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych oraz czas barwienia zależą od stężeń sugerowanych przez producenta lub od optymalizacji dla konkretnego eksperymentu.
	<ol>
		<li>Użyj pisaka hydrofobowego, aby narysować granicę wokół odcinka (odcinków) tkanki na szkiełku, aby zminimalizować objętość roztworu potrzebną do pokrycia tkanki. Umieść szkiełko w naczyniu wystarczająco dużym, aby zmieściło się w szkiełku. W przypadku standardowej prowadnicy 3-calowej użyj szalki Petriego o średnicy 100 mm. 
		nuta: Pióro hydrofobowe nie zakłóca polimeryzacji próbki ani procesu trawienia.</li>
		<li>Inkubować tkankę z buforem blokującym przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 2 godziny w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez noc w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania.</li>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe do pożądanego stężenia w odpowiedniej ilości przygotowanego buforu blokującego (lub innego preferowanego buforu barwiącego). Inkubować tkanki z roztworem przeciwciała pierwszorzędowego przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej lub 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C. 
		nuta: Próbki należy umieścić w nawilżonym pojemniku (takim jak szalka Petriego z wilgotną chusteczką), aby zapobiec wysychaniu tkanki. Zazwyczaj przeciwciała rozcieńcza się do 1:100−1:500 w 200−500 μl buforu, w zależności od wielkości tkanki i zastosowanego przeciwciała.</li>
		<li>Przemyć tkankę przygotowanym buforem blokującym (lub innym preferowanym buforem do mycia) 3 razy przez 10 minut w temperaturze pokojowej</li>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe (i 300 nM 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolu [DAPI] w razie potrzeby) w przygotowanym buforze blokującym (lub innym preferowanym buforze barwiącym) do stężenia około 10 μg/ml. Inkubować tkankę w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub 37 °C. 
		nuta: Czas podawania przeciwciał można dostosować w zależności od zastosowanych przeciwciał i grubości tkanki. Przeciwciała drugorzędowe zawierające barwniki cyjaninowe (Cy3, Cy5, Alexa 647) nie są zgodne z protokołem ExM po zastosowaniu polimeryzacji wstępnej. Sugerowane barwniki to Alexa 488 (zielony), Alexa 546 (pomarańczowy/czerwony) i Atto 647N lub CF633 (daleki czerwony). DAPI należy ponownie nałożyć po rozprężeniu, ponieważ jest zmywany podczas procesu rozprężania.</li>
		<li>Przemyć chusteczkę przygotowanym buforem blokującym (lub innym preferowanym buforem do mycia) 3 razy po 10 minut w temperaturze RT. 
		nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Szkiełka można umieszczać na szalkach Petriego, przykrywać 1x PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Obrazowanie fluorescencyjne należy wykonywać za pomocą konwencjonalnego mikroskopu szerokokątnego, mikroskopu konfokalnego lub innego wybranego systemu obrazowania. 
		nuta: Ten krok jest wymagany do określenia długości biologicznej za pomocą współczynnika ekspansji poprzez porównanie obrazów przed i po ekspansji. Aby ułatwić obrazowanie po ekspansji, należy wybrać łatwe do zidentyfikowania obszary zainteresowania i zebrać obrazy zarówno w małym, jak i dużym powiększeniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Polimeryzacja próbek in situ
<ol>
	<li>Inkubować próbkę w roztworze kotwiącym.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór zakotwiczający (zwykle 250 μl wystarcza do pokrycia przekroju tkanki), rozcieńczając roztwór podstawowy AcX w 1x PBS do stężenia 0,03 mg / ml dla próbek utrwalonych utrwalaczami niealdehydowymi lub 0,1 mg / ml dla próbek utrwalonych utrwalaczami aldehydowymi, które mają mniej wolnych amin dostępnych do reakcji z AcX.</li>
		<li>Umieścić szkiełko podstawowe na szalce Petriego o średnicy 100 mm i odpipetować roztwór zakotwiczający na tkance. Inkubować przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbki należy inkubować w roztworze żelującym.
	<ol>
		<li>Przygotować co najmniej 100-krotny nadmiar roztworu żelującego. Na 200 μl należy połączyć kolejno: 188 μl roztworu monomeru, 4 μl 0,5% roztworu podstawowego 4HT (rozcieńczenie 1:50, stężenie końcowe: 0,01%), 4 μl 10% roztworu podstawowego TEMED (rozcieńczenie 1:50, stężenie końcowe 0,2%) i 4 μl 10% roztworu podstawowego APS (rozcieńczenie 1:50, stężenie końcowe 0,2%). 
		nuta: Roztwór żelujący należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C, a roztwór APS należy dodawać na końcu, aby zapobiec przedwczesnemu zżelowaniu.</li>
		<li>Usunąć nadmiar roztworu z sekcji tkankowej i umieścić szkiełko na szalce Petriego o średnicy 100 mm. Dodać świeży, zimny roztwór żelujący do próbki i inkubować mieszaninę na tkance przez 30 minut w temperaturze 4 °C, aby umożliwić dyfuzję roztworu do tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonstruuj komorę na szkiełku wokół próbki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A) bez naruszania roztworu żelującego.
	<ol>
		<li>Wykonać przekładki do komory żelowania, cienko wycinając kawałki szkła nakrywkowego za pomocą noża diamentowego. 
		nuta: Aby ułatwić obrazowanie po rozprężeniu, przekładki powinny mieć grubość zbliżoną do próbki tkanki, aby zmniejszyć ilość czystego żelu nad tkanką. Szkło o numerze 1,5 może być używane do standardowych próbek klinicznych (5−10 μm). Kawałki szkła nakrywkowego można układać w stosy w celu uzyskania grubszych próbek.</li>
		<li>Zabezpiecz przekładki po obu stronach chusteczki za pomocą kropelek wody (~10 μL).</li>
		<li>Ostrożnie umieść szklaną pokrywę na szkiełku, upewniając się, że pęcherzyki powietrza nie zatrzymują się na tkance (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku (takim jak zamknięta szalka Petriego z wilgotną chusteczką) przez 2 godziny 
	nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Komora szkiełkowa może być przechowywana w szczelnie zamkniętej szalce Petriego w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Trawienie próbki
<ol>
	<li>Zdejmij pokrywę komory żelowania, delikatnie wsuwając żyletkę pod szkiełko nakrywkowe i powoli podnosząc szkiełko nakrywkowe z powierzchni żelu. Przytnij czysty żel wokół tkanki, aby zminimalizować objętość. Wytnij żel asymetrycznie, aby śledzić orientację żelu po homogenizacji, ponieważ próbka stanie się przezroczysta.
	<ol>
		<li>Przed użyciem rozcieńczyć ProK w stosunku 1:200 w buforze wytrawiającym (końcowe stężenie 4 U/ml). Przygotuj wystarczającą ilość roztworu, aby całkowicie zanurzyć żel; pojedynczy dołek z czterodołkowej płytki do hodowli komórkowej z tworzywa sztucznego wymaga co najmniej 3 ml na studzienkę.</li>
		<li>Inkubować próbkę w zamkniętym pojemniku zawierającym bufor do wytrawiania przez 3 godziny w temperaturze 60 °C. Jeśli próbka nie odczepia się od szkiełka podczas trawienia, użyj żyletki, aby delikatnie usunąć próbkę. 
		nuta: Próbkę należy całkowicie zanurzyć w buforze do wytrawiania, aby zapobiec wysychaniu próbki i umieścić w zakrytym pojemniku (małe pudełko na szkiełka, plastikowa studzienka, szalka Petriego itp.), który można uszczelnić folią.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Rozszerzanie próbki i obrazowanie
<ol>
	<li>Użyj miękkiego pędzla, aby przenieść próbkę do 1x PBS w pojemniku zgodnym z żądanym systemem obrazowania i wystarczająco dużym, aby pomieścić w pełni rozprężony żel. Upewnij się, że tkanka jest umieszczona próbką do dołu w przypadku obrazowania w systemie odwróconym lub do góry w przypadku obrazowania w systemie pionowym, aby zminimalizować odległość od obiektywu obrazowania do próbki. W razie potrzeby odwróć żel za pomocą miękkiego pędzla. 
	nuta: Można zastosować boczne oświetlenie z diody LED, aby były one widoczne w cieczy. Standardowa płytka 6-dołkowa może pomieścić próbki, które mają wstępnie rozszerzoną średnicę mniejszą niż 0,6 cm. Do obrazowania w systemie odwróconym należy użyć płytki studzienkowej ze szklanym dnem.</li>
	<li>Umyć próbki w 1 PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut. W razie potrzeby ponownie zabarwić próbkę 300 nM DAPI, ponieważ proces trawienia zmywa plamę DAPI. Usunąć PBS i zaplamić 300 nM DAPI rozcieńczonym w 1x PBS przez 20 minut w temperaturze RT, a następnie 10 minuty prać 1x PBS w temperaturze RT. 
	nuta: Próbki można przykryć 1x PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C przed przejściem do następnego etapu.</li>
	<li>Aby rozszerzyć próbki, należy wymienić PBS i przemyć nadmiarem objętości ddH2O (co najmniej 10x końcowa objętość żelu) 3−5 razy przez 10 minut każde, w temperaturze RT. 
	nuta: Po 3lub 4 myciu ekspansja próbki powinna zacząć się stabilizować. W celu przechowywania, aby zapobiec rozwojowi bakterii, ddH2O można uzupełnić 0,002%-0,01% azydkiem sodu (NaN3). W takim przypadku końcowy współczynnik rozszerzalności jest odwracalnie zmniejszany o 10%.</li>
	<li>Obrazowanie fluorescencyjne należy wykonywać za pomocą konwencjonalnego mikroskopu szerokokątnego, mikroskopu konfokalnego lub innego wybranego systemu obrazowania. 
	nuta: Aby zapobiec dryfowaniu żeli, nadmiar płynu można usunąć ze studni. Żele można również unieruchamiać 1,5−2% niskotopliwą agarozą. Przygotuj 1,5-2% (w/v) niskotopliwą agarozę w wodzie w pojemniku 2-4 razy większą od objętości roztworu. Podgrzej roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C lub w kuchence mikrofalowej przez 10-20 s, aby rozpuścić roztwór. Odpipetować rozpuszczoną agarozę wokół brzegów żelu. Po pozostawieniu agarozy do stwardnienia w temperaturze pokojowej lub 4 °C, dodać wodę do próbki, aby zapobiec odwodnieniu.</li>
</ol>

<ol><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-Field+Optical+Nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li>
<li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%3A+A+concise+guide+to+current+imaging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
<li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).</li>
<li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li>
<li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li>
<li>Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836(2018).</li>
<li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+Microscopy%3A+Protocols+for+Imaging+Proteins+and+RNA+in+Cells+and+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li>
<li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+RNA+detection+approach+with+super-resolution+capability%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), e165(2016).</li>
<li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li>
<li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li>
<li>Cipriano, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superabsorbent+hydrogels+that+are+robust+and+highly+stretchable%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable.</a> Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).</li>
<li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li>
</ol>

YZ i OB to dwaj wynalazcy, którzy złożyli wniosek o ochronę patentową i uzyskali ją w odniesieniu do podzbioru opisanych tutaj technologii (patenty amerykańskie US20190064037A1, WO2018157074A1 i WO2018157048A1).

W tym miejscu przedstawiamy protokółExPath 16, wariant proExM5 , który można zastosować do najczęstszych typów próbek biopsji klinicznych stosowanych w patologii, w tym próbek barwionych FFPE, H&E i świeżo mrożonych na szkiełkach podstawowych. Konwersja formatu, pobieranie antygenu i barwienie immunologiczne próbek są zgodne z powszechnie stosowanymi protokołami, które nie są specyficzne dla ExPath. W przeciwieństwie do oryginalnego protokołu proExM9...

Badanie molekularnej organizacji tkanek w kontekście trójwymiarowym (3D) może dostarczyć nowego zrozumienia funkcji biologicznych i rozwoju choroby. Jednak te nanoskalowe środowiska wykraczają poza możliwości rozdzielczości konwencjonalnych mikroskopów o ograniczonej dyfrakcji (200−300 nm), gdzie minimalna rozdzielczość d, d jest zdefiniowana przez d α λ/NA. Tutaj λ to długość fali światła, a NA to apertura numeryczna (NA) systemu obrazowania. Ostatnio bezpośrednia wizualizacja cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie stała się możliwa dzięki nowo opracowanym technikom obrazowania o wysokiej rozdzielczości1,2,3, w tym wymuszone zubożenie emisji (STED), mikroskopia lokalizacyjna aktywowana światłem (PALM), stochastyczna mikroskopia rekonstrukcyjna (STORM) i mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM). Chociaż te techniki obrazowania zrewolucjonizowały zrozumienie funkcji biologicznych w nanoskali, w praktyce często opierają się na drogim i/lub specjalistycznym sprzęcie i etapach przetwarzania obrazu, mogą mieć wolniejszy czas akwizycji w porównaniu z konwencjonalnym obrazowaniem optycznym, wymagają fluoroforów o określonych cechach (takich jak zdolność do przełączania zdjęć i/lub wysoka fotostabilność). Ponadto wyzwaniem pozostaje wykonywanie obrazowania 3D w superrozdzielczości na próbkach tkanek.
Mikroskopia ekspansywacyjna (ExM), po raz pierwszy wprowadzona w 2015 roku4, zapewnia alternatywny sposób obrazowania cech nanoskali (<70 nm) poprzez fizyczne rozszerzanie zachowanych próbek osadzonych w pęczniejącym hydrożelu polielektrolitowym. W tym przypadku kluczowe biomolekuły i/lub etykiety są zakotwiczone in situ w sieci polimerowej, która może być ekspandowana izotopowo po obróbce chemicznej. Ponieważ ekspansja fizyczna zwiększa całkowitą efektywną rozdzielczość, cząsteczki będące przedmiotem zainteresowania mogą być następnie rozdzielone przy użyciu konwencjonalnych systemów obrazowania z ograniczeniem dyfrakcji. Od czasu opublikowania oryginalnego protokołu, w którym niestandardowe syntetyzowane etykiety fluorescencyjne zostały zakotwiczone w sieci polimerowej4, zastosowano nowe strategie bezpośredniego zakotwiczania białek (retencja białek ExM lub proExM)5,6,7,8,9 i RNA9,10,11,12 do hydrożelu i zwiększ powiększenie fizyczne poprzez iteracyjne rozszerzanie13 lub adaptację chemii żelu8,14,15.
Tutaj prezentujemy zaadaptowaną wersję proExM, zwaną patologią ekspansji (ExPath)16, która została zoptymalizowana pod kątem formatów patologii klinicznej. Protokół przekształca próbki kliniczne, w tym utrwalone w formalinie próbki zatopione w parafinie (FFPE), barwione hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz świeżo zamrożone próbki tkanek ludzkich zamontowane na szkiełkach podstawowych, do stanu zgodnego z ExM. Białka są następnie zakotwiczane w hydrożelu i przeprowadzana jest mechaniczna homogenizacja (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)16. Dzięki 4-krotnej rozszerzalności liniowej próbek, wielokolorowe obrazy o super rozdzielczości (~70 nm) można uzyskać za pomocą konwencjonalnego mikroskopu konfokalnego o rozdzielczości zaledwie ~300 nm i można je również łączyć z innymi technikami obrazowania o wysokiej rozdzielczości.

<table><tbody><tr><td>4-hydroxy-TEMPO (4HT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>176141</td><td>Inhibitor</td></tr><tr><td>6-dołkowa szklana płytka denna (#1.5 szkło nakrywkowe)</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fischer Scientifc</td><td>A18-500</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>Acryloyl-X, SE (AcX)</td><td>Invitrogen</td><td>A20770</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Fischer Scientifc</td><td>BP160-100</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>Inicjator</td></tr> przeciwciała <tr><td>anty-ACTN4 wytwarzane u królika</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HPA001873</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało antykolagenowe IV wytwarzane u myszy</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-59814</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-wimentynowe wytwarzane w kurczaku</td><td>Abcam</td><td>ab24525</td><td></td></tr><tr><td>Długopis hydrofobowy Aqua Hold II</td><td>Urządzenie naukowe</td><td>980402</td><td></td></tr><tr><td>Matryca tkanek powszechnej choroby piersi</td><td>Abcam</td><td>ab178113</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (1 mg / ml)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td>Plama jądrowa</td></tr><tr><td>Nóż diamentowy nr 88 CM</td><td>Narzędzia ogólne</td><td>31116</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) 0,5 M</td><td>VWR</td><td>BDH7830-1</td><td></td></tr><tr><td>FFPE Próbka nerki</td><td>USBiomax</td><td>HuFPT072</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kozie anty-kurze IgY (H + L), wysoce adsorbowane krzyżowo CF488A</td><td>Biotium</td><td>20020</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciała anty-kurze IgY (H+L), wysoce zaadsorbowane krzyżowo CF633</td><td>Biotium</td><td>20121</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG (H+L) Wysoce zaadsorbowana krzyżowo Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11010</td><td></td></tr><tr><td>MAXbind Staining Medium</td><td>Active Motif</td><td>15253</td><td>Można zastąpić niekomercyjnym buforem do wybrania przez staling.</td></tr><tr><td>MAXblock Blocking Medium</td><td>Active Motif</td><td>15252</td><td>Może być zastąpiony niekomercyjnym buforem blokującym do wyboru.</td></tr><tr><td>MAXwash Washing Medium</td><td>Active Motif</td><td>15254</td><td>Można zastąpić niekomercyjnym buforem myjącym do wyboru.</td></tr><tr><td>Szkło z mikro osłoną #1 (24 mm x 60 mm)</td><td>VWR</td><td>48393 106</td><td></td></tr><tr><td>Szkło z mikro pokrywą #1.5 (24 mm x 60 mm)</td><td>VWR</td><td>48393 251</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;- Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td>Akcelerator</td></tr><tr><td>N,N&prime;-Metylenobisakryloamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7279</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica</td> <td>koziaJackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td>Do przygotowania buforu blokującego. Zależny od gospodarza zwierzęcego przeciwciał drugorzędowych.</td></tr><tr><td>Nunclon 4-dołkowe x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish</td><td>Thermo Fisher</td><td>167063</td><td>Wielodołkowe plastikowe naczynie do hodowli</td></tr><tr><td>Nunclon 6-dołkowe naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Fisher</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 15 mL&nbsp; Stożkowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 ml&nbsp; Stożkowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka</td><td></td><td></td><td></td>orbitalna</tr><tr><td>Pędzel</td><td></td><td></td><td></td>malarski</tr><tr><td>pH-metr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 10x roztwór</td><td>Fischer Scientifc</td><td>BP399-1</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa szalka Petriego (100 mm)</td><td>Fischer Scientifc</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K ( Klasa biologii molekularnej)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Fischer Scientifc</td><td>12640</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Safelock 1,5 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>3457</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Safelock 2,0 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>3459</td><td></td></tr><tr><td>Akrylan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408220</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fischer Scientifc</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Aglutynina z kiełków pszenicy znakowana CF640R</td><td>Biotium</td><td>29026</td><td></td></tr><tr><td>Ksyleny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie nanoskopowe skrawków tkanek ludzkich poprzez ekspansję fizyczną i izotropową

Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

W nowoczesnej patologii mikroskopia optyczna odgrywa ważną rolę w diagnozowaniu chorób, ujawniając mikroskopijne struktury próbek klinicznych. Jednak podstawowa granica dyfrakcji fizycznej uniemożliwia badanie anatomii w nanoskali i subtelnych zmian patologicznych przy użyciu konwencjonalnych metod obrazowania optycznego. W tym miejscu opisujemy prosty i niedrogi protokół, zwany patologią ekspansji (ExPath), do obrazowania optycznego w nanoskali typowych typów klinicznych pierwotnych próbek tkanek, w tym zarówno skrawków tkanek zamrożonych, jak i utrwalonych w formalinie (FFPE). Metoda ta omija granicę dyfrakcji optycznej poprzez chemiczne przekształcanie próbek tkanek w hybrydę tkankowo-hydrożelową i fizyczne rozszerzanie ich izotropowo w wielu skalach w czystej wodzie. W wyniku ekspansji wcześniej nierozdzielcze cząsteczki są oddzielane, dzięki czemu można je obserwować za pomocą konwencjonalnego mikroskopu optycznego.

Jeśli protokół został pomyślnie przeprowadzony (Rysunek 1), próbki po homogenizacji mechanicznej będą miały postać płaskiego i przezroczystego żelu (Rysunek 3A) i mogą zwiększyć swoją objętość 3−4,5x w wodzie (Rysunek 3B), co zapewnia efektywną rozdzielczość ~70 nm w zależności od końcowego stopnia ekspansji i zastosowanego systemu obrazowania5,16...

Obrazowanie klinicznych próbek tkanek w nanoskali może pomóc lepiej zrozumieć patogenezę choroby. Patologia ekspansji (ExPath) to wersja mikroskopii ekspansyjnej (ExM), zmodyfikowana pod kątem kompatybilności ze standardowymi klinicznymi próbkami tkanek, w celu zbadania konfiguracji biomolekuł w nanoskali przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów o ograniczonej dyfrakcji.

Obrazowanie nanoskopowe skrawków tkanek ludzkich poprzez ekspansję fizyczną i izotropową

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

Prezentujemy patologię ekspansji, w skrócie ExPath, tanią metodę obrazowania biomolekuły będącej przedmiotem zainteresowania w standardowych klinicznych skrawkach tkanki, z nanoskalową precyzją. ExPath omija granicę dyfrakcji konwencjonalnej mikroskopii świetlnej poprzez chemiczne nasycanie klinicznego przekroju tkanki hydrożelem pęczniejącym w wodzie, a następnie fizyczne i równomierne rozszerzanie traktowanych próbek około stukrotnie, co pozwala na oddzielenie i obserwację wcześniej nałożonych na siebie fluorescencyjnie znakowanych biomolekuł i obserwację za pomocą konwencjonalnego mikroskopu optycznego. ExPath umożliwia użytkownikom badanie konfiguracji biomolekuł związanych z chorobą w skali nano w próbkach tkanek bez konieczności inwestowania w nowy sprzęt do obrazowania.W ten sposób umożliwia uzyskanie nowych informacji na temat choroby i sprzyja nowej diagnozie. Metoda ta może być stosowana do szerokiej gamy typów tkanek i może być wykorzystana do uzyskania nowego wglądu w patogenezę różnych złożonych chorób, takich jak rak, choroby mózgu, choroby autoimmunologiczne i inne. Demonstracja wizualna jest ważna, aby zilustrować, jak prawidłowo wykonać krytyczne kroki, takie jak budowa komory żelowania i obchodzenie się z zżelowaną próbką przed i po mineralizacji proteinazy K.Zacznij od przekształcenia interesującej Cię tkanki na format zgodny z ExPath. Jeśli pracujesz z próbkami klinicznymi FFPE, umieść szkiełko z próbką w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodaj 15 ml zylenu. Zakryj rurkę i umieść ją poziomo na wytrząsarce orbitalnej z prędkością około 60 obr./min na trzy minuty.Powtórz pranie z kolejnymi 15 ml Zylenu. Następnie umyj szkiełko w serii rozcieńczeń etanolu, zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Jeśli pracujesz z barwionymi i zamontowanymi szkiełkami stałymi, umieść każde szkiełko w stożkowej tubie o pojemności 50 ml, a następnie przykryj je zylenem.Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą żyletki. Następnie przetrzymuj szkiełko w taki sam sposób, jak próbki kliniczne FFPE. W przypadku pracy z nieutrwalonymi zamrożonymi szkiełkami tkankowymi w roztworze OCT, utrwal tkankę w acetonie w temperaturze 20 stopni Celsjusza na dziesięć minut, a następnie umyj próbki roztworem 1X PBS trzy razy przez dziesięć minut na pranie.W przypadku przetwarzania wcześniej utrwalonych i zamrożonych próbek klinicznych, pozostaw szkiełka na dwie minuty w temperaturze pokojowej, aby stopić roztwór OTC, a następnie umyj próbkę 1X PBS trzy razy, przez pięć minut na mycie. Po konwersji formatu należy przeprowadzić pobieranie antygenu na wszystkich próbkach. Podgrzej 20-milimolowy roztwór cytrynianu do 100 stopni Celsjusza w kuchence mikrofalowej i umieść szkiełko w roztworze.Natychmiast przenieś pojemnik do komory inkubacyjnej i inkubuj go w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez trzydzieści minut. Aby zabarwić próbkę, użyj pisaka hydrofobowego, aby narysować granicę wokół sekcji tkanki na szkiełku. Umieść szkiełko na szalce Petriego, a następnie inkubuj tkankę z buforem blokującym przez godzinę w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Następnie inkubuj tkanki z roztworem przeciwciała pierwszorzędowego przez co najmniej trzy godziny w temperaturze pokojowej lub 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji przemyć tkankę trzykrotnie buforem blokującym i inkubować ją w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej lub 37 stopni Celsjusza. Powtórz płukanie z buforem blokującym, a następnie wykonaj obrazowanie fluorescencyjne przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu szerokokątnego lub innego wybranego systemu obrazowania.Przygotuj roztwór kotwiący zgodnie z instrukcjami rękopisu. Umieścić szkiełka na szalce Petriego o pojemności 100 ml, odpipetować roztwór zakotwiczający na tkankę i inkubować przez co najmniej trzy godziny w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj roztwór żelujący zgodnie z instrukcjami rękopisu.Usunąć nadmiar roztworu kotwiczącego z części tkankowej i umieścić szkiełko z powrotem na szalce Petriego. Dodać świeży zimny roztwór żelujący do próbki i inkubować mieszaninę przez trzydzieści minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby zbudować komorę na szkiełku wokół próbki, należy utworzyć przekładki, cienko wycinając kawałki szkła nakrywkowego nożem diamentowym.Zabezpiecz przekładki po obu stronach chusteczki wodą i ostrożnie umieść szklaną pokrywkę na szkiełku, uważając, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza na chusteczce. Następnie inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym środowisku przez dwie godziny. Zdejmij pokrywę komory żelowania, delikatnie wsuwając żyletkę pod szkiełko nakrywkowe i powoli podnosząc ją z powierzchni żelu.Przytnij czysty żel wokół tkanki, aby zminimalizować objętość, upewniając się, że żel jest cięty asymetrycznie, aby śledzić orientację. Rozcieńczyć proteinazę K od jednej do dwustu w buforze do wytrawiania, upewniając się, że przygotowałeś wystarczającą ilość roztworu, aby całkowicie zanurzyć żel. Następnie inkubować próbkę z roztworem w zamkniętym pojemniku przez trzy godziny w temperaturze 60 stopni Celsjusza.Jeśli próbka nie odrywa się podczas trawienia, użyj żyletki, aby delikatnie ją usunąć. Użyj miękkiego pędzla, aby przenieść próbkę do 1X PBS w pojemniku zgodnym z żądanym systemem obrazowania i wystarczająco dużym, aby pomieścić w pełni rozprężony żel. Umyj próbkę w PBS przez dziesięć minut i w razie potrzeby ponownie ją przetrzyj 300-milimolowym DAPI.Rozszerzyć próbki, przemywając próbkę nadmiarem objętości podwójnie destylowanej wody trzy do pięciu razy przez dziesięć minut na przemycie. Następnie wykonaj obrazowanie fluorescencyjne. Jeśli ten protokół zostanie przeprowadzony pomyślnie, próbki po homogenizacji mechanicznej pojawiają się jako płaski i przezroczysty żel i mogą rozszerzać się w wodzie od 3 do 4,5 razy.Próbka nerki FFPE o grubości pięciu mikrometrów została rozszerzona 4,5 razy, co dało rozdzielczość 63 nanometrów przy użyciu obiektywu 0,95 NA. Tkanka została następnie przekształcona w format zgodny z patologią ekspansji i wybarwiona przeciwciałami przeciwko alfa aktininie 4 i wimentynie, DAPI w celu wizualizacji jądrowego DNA i gluteniny pszenicy germańskiej w celu znakowania węglowodanów. Następnie wykorzystano mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do zobrazowania próbki.Tkanka nerkowa została następnie w pełni rozprężona w wodzie i ponownie zobrazowana. Pękanie, zniekształcenia i utrata oznakowanych celów mogą być wynikiem nieodpowiedniego zakotwiczenia lub homogenizacji. Normalną tkankę piersi barwioną hematoksyliną i eozyną potraktowano jako próbkę FFPE, rozszerzono, oznaczono DAPI i zobrazowano pod mikroskopem konfokalnym z wirującym dyskiem.Nieutrwalone i zamrożone plastry nerki również zostały przetworzone przy użyciu tego protokołu. Tkankę utrwalono w zimnym acetonie i wybarwiono alfa aktyniną 4, wimentyną, DAPI i gluteniną z germanu pszenicy. Podczas wykonywania tej techniki należy pamiętać, że czas etapu żelowania ma kluczowe znaczenie.Przedwczesne żelowanie może powodować zniekształcenia, ograniczać rozszerzanie się i powodować utratę cząsteczek docelowych. Po tej procedurze obrazowanie fluorescencyjne można wykonać pod mikroskopem po wytrawieniu i rozprężeniu próbki. ExPath może być szeroko stosowany zarówno w patologiach, jak i poza nimi.Ponieważ umożliwia naukowcom wizualizację subtelnych szczegółów w próbkach tkanek będących przedmiotem zainteresowania. W związku z tym może pomóc naukowcom w zdobyciu nowych informacji na temat patogenezy chorób czy mechanizmów procesów biologicznych.

nanoscopic-imaging-human-tissue-sections-via-physical-isotropic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W tym filmie opisujemy metodę zwaną patologią ekspansji, wariant mikroskopii ekspandywnej, w którym kliniczne próbki tkanek są chemicznie ekspandowane za pomocą sieci polimerowej do mikroskopowego badania struktur w nanoskali.

Patologia ekspansji: metoda obrazowania optycznego w wysokiej rozdzielczości klinicznych próbek tkanek

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Tutaj prezentujemy protokół do obrazowania sekcji ludzkiej trzustki w trzech wymiarach (3D) przy użyciu zoptymalizowanych metod pasywnego oczyszczania. Niniejszy manuskrypt demonstruje te procedury pasywnego oczyszczania optycznego, a następnie wielokrotnego barwienia immunofluorescencyjnego w celu zidentyfikowania kluczowych elementów autonomicznych i czuciowych sieci neuronowych unerwiających ludzkie wyspy trzustkowe.

Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości sieci neurowyspiowej ludzkiej trzustki

Ten protokół jest ukierunkowany na konkretne komórki w tkance do obrazowania w rozdzielczości nanoskali za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Duża liczba seryjnych odcinków materiału biologicznego zatopionego w żywicy jest najpierw obrazowana w mikroskopie świetlnym w celu identyfikacji celu, a następnie w sposób hierarchiczny w SEM.

Multimodalne hierarchiczne obrazowanie odcinków szeregowych w celu znalezienia określonych celów komórkowych w dużych objętościach

Przedstawiono protokół do wizualizacji 3D mikroskopijnych struktur tkanek za pomocą metody barwienia specyficznego dla promieniowania rentgenowskiego, przeznaczonej do rentgenowskiej tomografii komputerowej.

Obrazowanie 3D próbek tkanek miękkich przy użyciu metody barwienia specyficznego dla promieniowania rentgenowskiego i nanoskopowej tomografii komputerowej

Przedstawiamy metodę mezoskopowej rekonstrukcji całego serca myszy poprzez połączenie nowych osiągnięć w transformacji tkanek i barwieniu z rozwojem osiowo skanowanego mikroskopu świetlnego.

Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy

W erze immunoterapii nowotworów, zainteresowanie wyjaśnieniem dynamiki mikrośrodowiska guza znacznie wzrosło. Protokół ten szczegółowo opisuje technikę obrazowania spektrometrii mas w odniesieniu do etapów barwienia i obrazowania, które pozwalają na wysoce zmultipleksowaną analizę przestrzenną.

Poszerzanie wiedzy na temat mikrośrodowiska guza za pomocą obrazowania spektrometrią mas próbek tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie

Prezentowana jest tutaj nowa wersja mikroskopii ekspansyjnej (ExM), Magnify, która jest zmodyfikowana do 11-krotnej ekspansji, zachowując szeroki wachlarz klas biomolekuł i jest kompatybilna z szerokim zakresem typów tkanek. Umożliwia badanie konfiguracji biomolekuł w nanoskali przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów o ograniczonej dyfrakcji.

Uniwersalna retencja molekularna z 11-krotną mikroskopią ekspansywną

Tutaj proponujemy prosty protokół łączący metaboliczną inżynierię oligosacharydów, chemię kliknięć i mikroskopię ekspansji, który umożliwia bioobrazowanie wewnątrzkomórkowych sjalowanych N-glikoprotein z lepszą rozdzielczością przy użyciu rutynowego sprzętu mikroskopowego.

Wizualizacja sialilacji wewnątrzkomórkowej za pomocą chemii kliknięć i mikroskopii ekspansyjnej

Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół łączący metody kriofiksacji i mikroskopii ekspansyjnej (Cryo-ExM), umożliwiający obrazowanie w wysokiej rozdzielczości z zachowaniem strukturalnym dostosowanym do różnych próbek biologicznych. Próbki biologiczne są zamrażane, osadzane w polimerze puchniącym, denaturowane, rozszerzane i znakowane immunosystemowo, co umożliwia obrazowanie o nadrozdzielczości za pomocą standardowych mikroskopów świetlnych.

Mikroskopia ekspansyjna: Obrazowanie fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości za pomocą konwencjonalnego mikroskopu

Wprowadziliśmy nowatorską technikę obrazowania zwaną Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), która umożliwia bezstronne obrazowanie wszystkich komórek w próbkach mózgu na mezoskali i może być płynnie zintegrowana z procesem obrazowania taśmowej szeregowej skaningowej mikroskopii elektronowej na tej samej próbce.

Metoda optycznego obrazowania zgodna z mikroskopią skaningową do mezoskopowego mapowania mózgu w całych komórkach

Poznaj metodę ExPath do nanoskopowego obrazowania biomolekuł w skrawkach tkanek klinicznych poprzez fizyczną ekspansję próbek. Technika ta umożliwia badanie konfiguracji nanoskalowych bez konieczności zakupu nowego sprzętu mikroskopowego.

Obrazowanie nanoskopowe skrawków tkanek ludzkich poprzez ekspansję fizyczną i izotropową

Przeglądaj więcej filmów