Obrazowanie nanoskopowe skrawków tkanek ludzkich poprzez ekspansję fizyczną i izotropową

Prezentujemy patologię ekspansji, w skrócie ExPath, tanią metodę obrazowania biomolekuły będącej przedmiotem zainteresowania w standardowych klinicznych skrawkach tkanki, z nanoskalową precyzją. ExPath omija granicę dyfrakcji konwencjonalnej mikroskopii świetlnej poprzez chemiczne nasycanie klinicznego przekroju tkanki hydrożelem pęczniejącym w wodzie, a następnie fizyczne i równomierne rozszerzanie traktowanych próbek około stukrotnie, co pozwala na oddzielenie i obserwację wcześniej nałożonych na siebie fluorescencyjnie znakowanych biomolekuł i obserwację za pomocą konwencjonalnego mikroskopu optycznego. ExPath umożliwia użytkownikom badanie konfiguracji biomolekuł związanych z chorobą w skali nano w próbkach tkanek bez konieczności inwestowania w nowy sprzęt do obrazowania.

W ten sposób umożliwia uzyskanie nowych informacji na temat choroby i sprzyja nowej diagnozie. Metoda ta może być stosowana do szerokiej gamy typów tkanek i może być wykorzystana do uzyskania nowego wglądu w patogenezę różnych złożonych chorób, takich jak rak, choroby mózgu, choroby autoimmunologiczne i inne. Demonstracja wizualna jest ważna, aby zilustrować, jak prawidłowo wykonać krytyczne kroki, takie jak budowa komory żelowania i obchodzenie się z zżelowaną próbką przed i po mineralizacji proteinazy K.

Zacznij od przekształcenia interesującej Cię tkanki na format zgodny z ExPath. Jeśli pracujesz z próbkami klinicznymi FFPE, umieść szkiełko z próbką w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodaj 15 ml zylenu. Zakryj rurkę i umieść ją poziomo na wytrząsarce orbitalnej z prędkością około 60 obr./min na trzy minuty.

Powtórz pranie z kolejnymi 15 ml Zylenu. Następnie umyj szkiełko w serii rozcieńczeń etanolu, zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Jeśli pracujesz z barwionymi i zamontowanymi szkiełkami stałymi, umieść każde szkiełko w stożkowej tubie o pojemności 50 ml, a następnie przykryj je zylenem.

Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą żyletki. Następnie przetrzymuj szkiełko w taki sam sposób, jak próbki kliniczne FFPE. W przypadku pracy z nieutrwalonymi zamrożonymi szkiełkami tkankowymi w roztworze OCT, utrwal tkankę w acetonie w temperaturze 20 stopni Celsjusza na dziesięć minut, a następnie umyj próbki roztworem 1X PBS trzy razy przez dziesięć minut na pranie.

W przypadku przetwarzania wcześniej utrwalonych i zamrożonych próbek klinicznych, pozostaw szkiełka na dwie minuty w temperaturze pokojowej, aby stopić roztwór OTC, a następnie umyj próbkę 1X PBS trzy razy, przez pięć minut na mycie. Po konwersji formatu należy przeprowadzić pobieranie antygenu na wszystkich próbkach. Podgrzej 20-milimolowy roztwór cytrynianu do 100 stopni Celsjusza w kuchence mikrofalowej i umieść szkiełko w roztworze.

Natychmiast przenieś pojemnik do komory inkubacyjnej i inkubuj go w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez trzydzieści minut. Aby zabarwić próbkę, użyj pisaka hydrofobowego, aby narysować granicę wokół sekcji tkanki na szkiełku. Umieść szkiełko na szalce Petriego, a następnie inkubuj tkankę z buforem blokującym przez godzinę w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Następnie inkubuj tkanki z roztworem przeciwciała pierwszorzędowego przez co najmniej trzy godziny w temperaturze pokojowej lub 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji przemyć tkankę trzykrotnie buforem blokującym i inkubować ją w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej lub 37 stopni Celsjusza. Powtórz płukanie z buforem blokującym, a następnie wykonaj obrazowanie fluorescencyjne przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu szerokokątnego lub innego wybranego systemu obrazowania.

Przygotuj roztwór kotwiący zgodnie z instrukcjami rękopisu. Umieścić szkiełka na szalce Petriego o pojemności 100 ml, odpipetować roztwór zakotwiczający na tkankę i inkubować przez co najmniej trzy godziny w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj roztwór żelujący zgodnie z instrukcjami rękopisu.

Usunąć nadmiar roztworu kotwiczącego z części tkankowej i umieścić szkiełko z powrotem na szalce Petriego. Dodać świeży zimny roztwór żelujący do próbki i inkubować mieszaninę przez trzydzieści minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby zbudować komorę na szkiełku wokół próbki, należy utworzyć przekładki, cienko wycinając kawałki szkła nakrywkowego nożem diamentowym.

Zabezpiecz przekładki po obu stronach chusteczki wodą i ostrożnie umieść szklaną pokrywkę na szkiełku, uważając, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza na chusteczce. Następnie inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym środowisku przez dwie godziny. Zdejmij pokrywę komory żelowania, delikatnie wsuwając żyletkę pod szkiełko nakrywkowe i powoli podnosząc ją z powierzchni żelu.

Przytnij czysty żel wokół tkanki, aby zminimalizować objętość, upewniając się, że żel jest cięty asymetrycznie, aby śledzić orientację. Rozcieńczyć proteinazę K od jednej do dwustu w buforze do wytrawiania, upewniając się, że przygotowałeś wystarczającą ilość roztworu, aby całkowicie zanurzyć żel. Następnie inkubować próbkę z roztworem w zamkniętym pojemniku przez trzy godziny w temperaturze 60 stopni Celsjusza.

Jeśli próbka nie odrywa się podczas trawienia, użyj żyletki, aby delikatnie ją usunąć. Użyj miękkiego pędzla, aby przenieść próbkę do 1X PBS w pojemniku zgodnym z żądanym systemem obrazowania i wystarczająco dużym, aby pomieścić w pełni rozprężony żel. Umyj próbkę w PBS przez dziesięć minut i w razie potrzeby ponownie ją przetrzyj 300-milimolowym DAPI.

Rozszerzyć próbki, przemywając próbkę nadmiarem objętości podwójnie destylowanej wody trzy do pięciu razy przez dziesięć minut na przemycie. Następnie wykonaj obrazowanie fluorescencyjne. Jeśli ten protokół zostanie przeprowadzony pomyślnie, próbki po homogenizacji mechanicznej pojawiają się jako płaski i przezroczysty żel i mogą rozszerzać się w wodzie od 3 do 4,5 razy.

Próbka nerki FFPE o grubości pięciu mikrometrów została rozszerzona 4,5 razy, co dało rozdzielczość 63 nanometrów przy użyciu obiektywu 0,95 NA. Tkanka została następnie przekształcona w format zgodny z patologią ekspansji i wybarwiona przeciwciałami przeciwko alfa aktininie 4 i wimentynie, DAPI w celu wizualizacji jądrowego DNA i gluteniny pszenicy germańskiej w celu znakowania węglowodanów. Następnie wykorzystano mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do zobrazowania próbki.

Tkanka nerkowa została następnie w pełni rozprężona w wodzie i ponownie zobrazowana. Pękanie, zniekształcenia i utrata oznakowanych celów mogą być wynikiem nieodpowiedniego zakotwiczenia lub homogenizacji. Normalną tkankę piersi barwioną hematoksyliną i eozyną potraktowano jako próbkę FFPE, rozszerzono, oznaczono DAPI i zobrazowano pod mikroskopem konfokalnym z wirującym dyskiem.

Nieutrwalone i zamrożone plastry nerki również zostały przetworzone przy użyciu tego protokołu. Tkankę utrwalono w zimnym acetonie i wybarwiono alfa aktyniną 4, wimentyną, DAPI i gluteniną z germanu pszenicy. Podczas wykonywania tej techniki należy pamiętać, że czas etapu żelowania ma kluczowe znaczenie.

Przedwczesne żelowanie może powodować zniekształcenia, ograniczać rozszerzanie się i powodować utratę cząsteczek docelowych. Po tej procedurze obrazowanie fluorescencyjne można wykonać pod mikroskopem po wytrawieniu i rozprężeniu próbki. ExPath może być szeroko stosowany zarówno w patologiach, jak i poza nimi.

Ponieważ umożliwia naukowcom wizualizację subtelnych szczegółów w próbkach tkanek będących przedmiotem zainteresowania. W związku z tym może pomóc naukowcom w zdobyciu nowych informacji na temat patogenezy chorób czy mechanizmów procesów biologicznych.