Name: Wykrywanie gigantycznych jednopłytkowych pęcherzyków hybrydowych przez elektroformację i pomiar ich właściwości mechanicznych za pomocą aspiracji mikropipetami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Naucz się mierzyć właściwości mechaniczne błon pęcherzyków lipidowych metodą aspiracji mikropipetą. Technika ta pozwala ocenić elastyczność i stabilność membran w pojedynczych eksperymentach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują ANR za wsparcie finansowe (ANR Sysa).

1. Wykonywanie mikropipet
UWAGA: W tym przypadku niezbędne są mikropipety o średnicy wewnętrznej od 6 do 12 µm i długości zwężenia około 3-4 mm. Szczegółowa metoda wykonania mikropipety została opisana poniżej.
<ol>
	<li>Umieść kapilarę z borokrzemianowego szkła w uchwycie wyciągacza i przymocuj jeden z końców, dokręcając pokrętło.</li>
	<li>Ostrożnie przesuń szkło przez otwory z boku komory grzejnej.</li>
	<li>Dokręć pokrętło zaciskowe po drugiej stronie.</li>
	<li>Kontroluj rozmiar końcówki oraz długość stożka, aby uzyskać pożądane parametry. W tym celu zoptymalizuj parametry techniczne, takie jak temperatura grzania, siła wyciągania (pull), prędkość (velocity), opóźnienie (delay) i ciśnienie (pressure). Poniżej znajduje się przykład użytego programu: 
	Temperatura (Heat): 50 °C 
	Wyciąganie (Pull): 10 (Zakres urządzenia: 0-25 w jednostkach arbitralnych) 
	Prędkość (Velocity): 30 (Zakres: 0-25 w jednostkach arbitralnych) 
	Opóźnienie (Delay): 1 (Zakres: 0-25 w jednostkach arbitralnych) 
	Ciśnienie (Pressure): 50 (Zakres: 0-9 w jednostkach arbitralnych)</li>
	<li>Kliknij PULL, aby wykonać czynności zdefiniowane w programie. Kapilara zostanie wówczas rozdzielona na dwie mikropipety, których wymiary należy dopasować za pomocą mikrokuźni.</li>
	<li>Włóż mikropipetę do metalowego uchwytu pipet w mikrokuźni (patrz Rysunek 1). Używając obiektywu 10x, dostosuj stół mikroskopu i manipulator pipety (ruch pionowy i poziomy), aż końcówka pipety znajdzie się blisko powierzchni szklanej kuleczki.</li>
	<li>Naciśnij przełącznik nożny, aby stopić szklaną kuleczkę. Obniż końcówkę i doprowadź do kontaktu z roztopionym szkłem. Roztopione szkło wpłynie do pipety dzięki zjawisku kapilarnemu. Odczekaj kilka sekund, aż poziom roztopionego szkła osiągnie odpowiednią wysokość, jak pokazano na wstawce do Rysunku 1.</li>
	<li>Zatrzymaj grzanie, zdejmując nacisk z przełącznika nożnego, i szybko odsunij końcówkę za pomocą pionowego manipulatora pipety, aby uzyskać ostre przełamanie.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 1.7 i 1.8, aż zostanie uzyskana pożądana średnica (6 do 12 µm). 
	UWAGA: Aby zwiększyć dokładność pomiaru średnicy, w ostatnim kroku należy użyć obiektywu 32x wyposażonego w siatkę pomiarową.</li>
</ol>
2. Powlekanie końcówek pipet BSA (albuminą surowiczą bydlęcą)
<ol>
	<li>Przygotowanie 0,1 M roztworu glukozy zawierającego 1% masowo BSA w czystej wodzie.
	<ol>
		<li>Odważenie 180 mg proszku glukozy, umieszczenie go w 15 mL polipropylenowej probówce stożkowej i dopełnienie do 10 mL czystą wodą.</li>
		<li>Dodanie 0,1 g proszku BSA i delikatne mieszanie za pomocą rotacyjnego mieszadła do probówek aż do całkowitego rozpuszczenia (około 4 h).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobrać roztwór za pomocą jednorazowej strzykawki Luer 10 mL z igłą. Po napełnieniu usunąć igłę i założyć filtr z octanu celulozy 0,2 μm. Napełnić kilka polipropylenowych probówek do mikrocentryfugi (1,5 mL), które posłużą do zanurzenia końcówki.</li>
	<li>Umieścić kapilary pionowo w uchwytach. Obniżyć uchwyt i zanurzyć końcówkę w roztworze glukozy/BSA na noc. Roztwór powinien podnieść się na wysokość około 1 cm w wyniku działania kapilarnego.</li>
	<li>Wyjąć końcówkę pipety z roztworu glukozy/BSA. Przygotować 5 mL 0,1 M roztworu glukozy (rozpuścić 90 mg proszku glukozy w 5 mL czystej wody) i przefiltrować przez filtr z octanu celulozy 0,2 μm.</li>
	<li>Napełnić pipetę roztworem glukozy, używając szklanej strzykawki 50 µL wyposażonej w elastyczną kapilarę z topionej krzemionki. Następnie usunąć cały roztwór glukozy poprzez wciągnięcie go z powrotem i odrzucić (Rycina 2). Powtórzyć ten krok kilka razy, aby usunąć niezwiązaną BSA.</li>
</ol>
3. Tworzenie GUV i GHUV metodą elektroformowania
UWAGA: Elektroformowanie jest powszechnie stosowaną techniką opracowaną przez Angelovą9. Poniżej opisano procedury przygotowania komory do elektroformowania, nanoszenia filmu lipidowego lub polimerowego (lub obu dla GHUVs (Giant Hybrid Unilamellar Vesicles)) oraz hydratacji filmu w zmiennym polu elektrycznym. Opisano również procedurę zbierania otrzymanych GUV.
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów amfifila, sacharozy i glukozy
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór amfifila o stężeniu 1 mg/mL. Odważyć 10 mg amfifila i rozpuścić w 10 mL chloroformu. Przechowywać roztwór w szczelnie zamkniętych fiolkach, aby zapobiec odparowaniu rozpuszczalnika.</li>
		<li>Przygotować roztwór zapasowy 1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolaminy-N-(lissaminy rhodaminy B sulfonylowej) (DOPE-Rhod) o stężeniu 1 mg/mL w chloroformie.</li>
		<li>Dodać 10 µL roztworu fluorescencyjnego lipidu do roztworu amfifila. Przechowywać roztwory w szczelnie zamkniętych fiolkach, aby zapobiec odparowaniu rozpuszczalnika.</li>
		<li>Przygotować roztwory sacharozy i glukozy o stężeniu 0,1 M. Odważyć odpowiednio 342 mg sacharozy i 180 mg glukozy, a następnie rozpuścić je w 10 mL czystej wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komory elektroformowania 
	UWAGA: Do budowy urządzenia do elektroformowania można użyć różnych materiałów przewodzących (np. drutów platynowych10, igieł ze stali nierdzewnej1). Komora do elektroformowania składa się z dwóch szkiełek ITO oddzielonych gumową przekładką w kształcie pierścienia O-ring, która została przecięta z jednej strony w celu utworzenia otworu. Szkiełka są połączone z generatorem napięcia za pomocą dwóch przewodów elektrycznych (Rysunek 3 i Rysunek 4A).
	<ol>
		<li>Oczyścić szkiełka ITO rozpuszczalnikiem organicznym (np. chloroformem). Zidentyfikować powierzchnię przewodzącą za pomocą omomierza.</li>
		<li>Przymocować przewody elektryczne po stronie przewodzącej za pomocą taśmy klejącej.</li>
		<li>Nakładanie roztworu amfifila
		<ol>
			<li>Zanurzyć kapilarę w roztworze, aż poziom cieczy podniesie się w wyniku działania kapilarnego, i pobrać około 5 μL roztworu.</li>
			<li>Przystawić kapilarę do środka szklanej płytki ITO i delikatnie rozprowadzić roztwór. Odczekać 10 sekund, aby zapewnić całkowite odparowanie rozpuszczalnika (Rysunek 4A).</li>
			<li>Powtórzyć tę procedurę 3 razy dla każdej strony.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Nałożyć warstwę smaru bezsilikonowego po obu stronach otwartej przekładki O-ring. Umieścić go wokół obszaru nakładania roztworu. Położyć przewodzącą stronę drugiej szklanej płytki ITO na górze przekładki.</li>
		<li>Umieścić komorę do elektroformowania w próżni na 3 godziny, aby usunąć wszelkie ślady rozpuszczalnika organicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura elektroformowania
	<ol>
		<li>Podłączyć przewody elektryczne do generatora.</li>
		<li>Ustawić generator według następujących parametrów: 
		Napięcie sinusoidalne zmienne 
		Częstotliwość: 10 Hz 
		Amplituda: 2 Vpeak-to-peak 
		UWAGA: Dla każdego układu należy dobrać optymalną częstotliwość i czas trwania przyłożonego napięcia.</li>
		<li>Upewnić się, że napięcie jest przyłożone przed wstrzyknięciem roztworu do komory.</li>
		<li>Wstrzyknąć 1 mL roztworu za pomocą strzykawki z igłą o średnicy wewnętrznej 0,8 mm, aby wypełnić komorę. Usunąć ewentualne pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Pozostawić komorę pod przyłożonym napięciem i częstotliwością przez 75 min (Rysunek 4B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbiór GUV
	<ol>
		<li>Wyłączyć generator.</li>
		<li>Za pomocą strzykawki 1 mL z igłą o średnicy wewnętrznej 0,8 mm odessać niewielką część roztworu, aby wytworzyć pęcherzyk powietrza wewnątrz komory. Lekko przechylić komorę, aby pęcherzyk poruszał się w jej wnętrzu. Może to pomóc w oddzieleniu GUV od powierzchni ITO (Rysunek 4C).</li>
		<li>Odessać cały roztwór i przenieść go do plastikowej probówki o pojemności 1 mL.</li>
		<li>Usunąć przewody i oczyścić szkiełka ITO rozpuszczalnikami organicznymi (najpierw toluenem, potem chloroformem).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Konfiguracja mikromanipulacji
UWAGA: Zasada aspiracji mikropipetą polega na zassaniu pojedynczego pęcherzyka przez szklaną mikropipetę poprzez wytworzenie podciśnienia. Długość „języka” wewnątrz pipety jest mierzona jako funkcja ciśnienia ssania. Powlekanie pipety BSA, opisane wcześniej, jest niezbędne, aby zapobiec lub zminimalizować jakąkolwiek adhezję między błonami pęcherzyków a pipetą.
Protokół został przedstawiony poniżej.
<ol>
	<li>Połączenie pipety z rezerwuarem wypełnionym wodą 
	UWAGA: Zbiornik wypełniony wodą oraz mikrometr są przymocowane do płytki przesuwnej. Licznik cyfrowy z głowicą mikrometryczną umożliwia przemieszczanie urządzenia w pionie w zakresie od 0 do 2,5 cm z dokładnością do 1 µmPrzesunięcie wzdłuż aluminiowej szyny optycznej jest możliwe na długości do 1 metra. Silikonowa rurka łączy zbiornik z uchwytem kapilary (Rysunek 5A).
	<ol>
		<li>Napełnić zbiornik czystą wodą. Podłączyć jednorazową strzykawkę o pojemności 5 ml do metalnego uchwytu kapilary. poprzez przewody silikonowe i aspirator w celu stworzenia przepływu wody ze zbiornika do uchwytu.</li>
		<li>Lekko dotknąć probówki, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Jednocześnie podnieść zbiornik z wodą, aby wytworzyć nadciśnienie. Strzykawka 5 ml pozostaje przymocowana do uchwytu.</li>
		<li>Po etapach powlekania i czyszczenia opisanych wcześniej (patrz krok 2), należy napełnić kapilarę roztworem glukozy, aż do momentu utworzenia się kropli na jej końcu. Należy wyjąć rurkę strzykawki z metalnego uchwytu, aby wywołać niewielki przepływ wody na jej końcu.</li>
		<li>Odwrócić kapilarę do góry nogami i połączyć kroplę glukozy z przepływem wody z uchwytu. Przymocować kapilarę i uchwyt, skręcając je ze sobą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawienie pipety 
	UWAGA: Podczas tej operacji zbiornik z wodą pozostaje umieszczony na aluminiowej szynie w celu utrzymania nadciśnienia.
	<ol>
		<li>Należy wziąć wykonany samodzielnie aluminiowy stolik wyposażony w dwa szkiełka przedmiotowe (wcześniej oczyszczone etanolem) i przykleić je za pomocą smaru próżniowego po obu stronach. Zamontować go na stoliku mikroskopu i utworzyć menisk między dwoma szkiełkami, używając strzykawki o pojemności 1 ml zawierającej 0,1 M glukozy, jak pokazano w Rysunek 5B,C.</li>
		<li>Umieść pipetę wraz z uchwytem na jednostce napędowej mikromanipulatora i dokręć pokrętło mocujące.</li>
		<li>Użyj joysticka panelu sterowania w trybie grubym, aby opuścić mikropipetę w pobliże menisku glukozy. W trybie precyzyjnym dostosuj pozycję końcówki tak, aby znajdowała się ona w centrum menisku.</li>
		<li>Zanurz końcówkę w glukozie na kilka minut, aby oczyścić jej powierzchnię zewnętrzną i wewnętrzną (dzięki utrzymaniu nadciśnienia przepływ wody wypłucze wewnętrzną powierzchnię pipety, usuwając niepowleczone BSA).</li>
		<li>Zapisz pozycję końcówki na klawiaturze mikromanipulatora i wycofaj ją z menisku.</li>
		<li>Usuń menisk glukozy i zastąp go nowym. Odsącz 2 μL GUV w 0,1 M sacharozie przy użyciu 20 μL mikropipetę i zanurz ją w świeżym menisku glukozy. Obserwuj w trybie DIC (kontrast różnicowy interferencyjny) GUV-y znajdujące się na dnie, co wynika z różnicy gęstości między sacharozą (znajdującą się głównie wewnątrz GUV-ów) a glukozą (znajdującą się głównie na zewnątrz GUV-ów).</li>
		<li>Gdy pęcherzyki są lekko odpompowane, ponownie włóż pipetę ssącą i ustaw ostrość na jej końcówkę. Ustaw wysokość H0 zbiornika z wodą, dla którego ciśnienie wynosi prawie 0. W tym celu należy wykorzystać małe pęcherzyki lub cząstki naturalnie występujące w roztworze i regulować wysokość zbiornika z wodą do momentu zatrzymania ruchu tych cząstek.</li>
		<li>W tym momencie należy otoczyć menisk olejem mineralnym, aby zapobiec parowaniu wody, patrz Rycina 5D. 
		UWAGA: Temperatura w pomieszczeniu powinna być utrzymywana w zakresie 20-22 °C poprzez zastosowanie klimatyzacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksperyment z aspiracją mikropipetą
	<ol>
		<li>Obniżyć końcówkę pipety (6-12 µm o średnicy) i wytworzyć niewielkie podciśnienie (-1 cm), aby odessać pęcherzyk (15-30 µm o średnicy). Membrana wybranej pęcherzyka powinna lekko fluktuować i nie może wykazywać żadnych widocznych defektów (brak wypustek lub filamentów) (Rycina 6).</li>
		<li>Za pomocą mikromanipulatora podnieś pipetę na wyższy poziom, aby odizolować aspirowany pęcherzyk od pozostałych pęcherzyków, i utrzymuj tę pozycję przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
		<li>Wstępnie naprężyć pęcherzyk, obniżając wypełniony wodą zbiornik do poziomu około -10 cm, a następnie zmniejszyć ciśnienie, aby powróciło do wartości początkowej (-1 cm). Powtórzyć ten krok kilkakrotnie w celu usunięcia nadmiaru błony oraz niewielkich defektów błony.</li>
		<li>Z wysokości -0,5 cm, określonej przez położenie zbiornika z wodą, powoli zmniejszać ciśnienie ssania za pomocą mikrometru, aż do osiągnięcia stanu, w którym membrana zacznie fluktuować. Następnie zwiększyć ciśnienie, aby wyraźnie zwizualizować język wierzchołku o znacznej długości projekcji (kilka mikrometrów). 
		UWAGA: Najniższe przyłożone ciśnienie (P0), która pozwala na wciągnięcie najmniejszej długości wypustki błonowej (L0) zdefiniuje punkt odniesienia α0 (Rysunek 7A). Wszystkie punkty krzywej będą mierzone zgodnie z tym punktem odniesienia (ΔL = L-L0 oraz ΔP = P-P0).</li>
		<li>Stopniowo zwiększaj ciśnienie ssania za pomocą mikrometru, aż do osiągnięcia wartości 0,5–0,8 mN/m. Po każdym kroku odczekaj 5 s i wykonaj zdjęcie języczka. Procedura ta przy niskim napięciu umożliwia wyznaczenie modułu giętności.</li>
		<li>Stopniowo zwiększaj ciśnienie ssania od 0,5 mN/m aż do napięcia krytycznego, regulując wysokość wypełnionego wodą naczynia przesuwnego na szynie (w zakresie od -2 do -50 cm) (Rycina 7B-D). Na podstawie tego eksperymentu w reżimie wysokiego napięcia zmierzone zostaną moduł ściśliwości powierzchniowej, napięcie lizy oraz odkształcenie lizy.</li>
		<li>Rozciągnij około 15–20 pęcherzyków, aby uzyskać istotne statystycznie wyniki. Każdy eksperyment z aspiracją za pomocą mikropipety trwa od 7 do 10 minut. Przeprowadź analizę obrazu przy użyciu oprogramowania LASAF w celu zmierzenia długości projekcji języczka, średnicy pęcherzyków oraz promienia kapilary.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar modułu sprężystości przy zginaniu, modułu ściśliwości powierzchniowej, napięcia lizy i odkształcenia lizy
	<ol>
		<li>Aby uzyskać dostęp do tych parametrów, należy zastosować formalizm opracowany przez E. Evansa12Oblicz ciśnienie ssania przyłożone do membrany, korzystając z równania 1: 
		Δ P = ρwg (h−h0) (1) 
		gdzie g to przyspieszenie grawitacyjne (9,8 m∙s−2), ρW tej chwili nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia. Proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski. czy gęstość wody (ρ = 1 g∙cm−3), h jest położeniem zbiornika wody i h0 jest pozycją początkową, w której ciśnienie wynosi zero.</li>
		<li>Oblicz napięcie błony na podstawie równania Laplace'a: 
		<img alt="Równanie stabilności płynów, σ= ΔP/2 [RP/(1-(RP/Rv))]; wzór do analizy stanu równowagi." src="/files/ftp_upload/60199/60199eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> (2) 
		gdzie ΔP jest ciśnieniem ssania w mikropipecie, Rp oraz Rv odpowiednio promienie mikropipety i pęcherzyka (na zewnątrz mikropipety). Odkształcenie powierzchniowe (α) błony definiuje się jako: 
		<img alt="Wzór na współczynnik absorpcji, α=(A-A0)/A0, równanie w kontekście analizy naukowej." src="/files/ftp_upload/60199/60199eq2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2"> (3) 
		<img alt="Schemat równowagi statycznej z równaniami ΣFx=0, MA=0, obrazujący zasady równowagi sił." src="/files/ftp_upload/60199/60199eq3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3"> będąc polem powierzchni błony pęcherzyka przy niższym ciśnieniu ssania.</li>
		<li>Oblicz α na podstawie przyrostu długości projekcji ΔL pęcherzyka wewnątrz końcówki kapilary zgodnie z równaniem 412: 
		<img alt="Wzór równowagi statycznej, α=1/2(Rp/Rv)^2(1-Rp/Rv)ΔL/Rp, równanie symboliczne dla pojęć fizycznych." src="/files/ftp_upload/60199/60199eq4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 4"> (4)</li>
		<li>W reżimie bardzo niskiego napięcia dominuje wygładzanie termicznych fal zgięć, co wpływa na pozorną ekspansję. Narysuj wykres ln(σ) kontra α. Przy niskich wartościach σ (zazwyczaj 0,01–0,5 mN.m−1 13), co daje linię prostą, której nachylenie jest powiązane z modułem giętkości, Kb (pierwszy wyraz równania 5)14: 
		<img alt="Równanie równowagi statycznej; α=kT/8πKb ln(1+A0σ/24πKb)+σ/Kσ; wzór fizyczny." src="/files/ftp_upload/60199/60199eq5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 5"> (5) 
		UWAGA: Przy wysokim napięciu (&gt; 0,5 mN.m−1), fluktuacje błony są całkowicie stłumione, a powierzchnia błony zwiększa się w wyniku zwiększenia odstępów między cząsteczkami. W tym reżimie dominuje drugi człon równania 5, co pozwala na wyznaczenie modułu ściśliwości powierzchniowej Ka (Rysunek 8 i Rysunek 9).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+univalent+ions+across+the+lamellae+of+swollen+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids.</a> Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).</li>
<li>Discher, D. E., Eisenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polymer vesicles.</a> Science. 297 (5583), 967-973 (2002).</li>
<li>Hammer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymersomes%3A+vesicles+from+block+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Polymersomes: vesicles from block copolymers.</a> Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).</li>
<li>Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+polymer%2Flipid+vesicles%3A+state+of+the+art+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives.</a> Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).</li>
<li>Schulz, M., Binder, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+Hybrid+Lipid%2FPolymer+Vesicles+as+a+Novel+Membrane+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform.</a> Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).</li>
<li>Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+fluctuations+of+large+quasi-spherical+bimolecular+phospholipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+De+Physique%22%5BJournal%5D)">Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles.</a> Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).</li>
<li>Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+the+field+of+bending+rigidity+measurements+on+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).</li>
<li>Rodríguez-García, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymersomes%3A+smart+vesicles+of+tunable+rigidity+and+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability.</a> Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).</li>
<li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+electroformation%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discussions+of+the+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Liposome electroformation.</a> Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).</li>
<li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+properties+of+giant+polymer+and+lipid+vesicles+obtained+by+electroformation+and+pva+gel-assisted+hydration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+A%3A+Physicochemical+and+Engineering+Aspects%22%5BJournal%5D)">Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).</li>
<li>Pereno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroformation+of+Giant+Unilamellar+Vesicles+on+Stainless+Steel+Electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+omega%22%5BJournal%5D)">Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes.</a> ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).</li>
<li>Evans, E., Rawicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropy-driven+tension+and+bending+elasticity+in+condensed-fluid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes.</a> Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).</li>
<li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+phase+separation+at+the+micron+scale+and+nanoscale+in+giant+polymer%2Flipid+hybrid+unilamellar+vesicles+%28GHUVs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs).</a> Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).</li>
<li>Helfrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+properties+of+lipid+bilayers%3A+theory+and+possible+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Naturforsch+C%22%5BJournal%5D)">Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments.</a> Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).</li>
<li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+block+copolymers+and+phospholipids+to+form+giant+hybrid+unilamellar+vesicles+%28GHUVs%29+does+not+systematically+lead+to+%26%2334%3Bintermediate%27%27+membrane+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to &#34;intermediate'' membrane properties.</a> Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).</li>
<li>Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material+Studies+of+Lipid+Vesicles+in+the+L%CE%B1+and+L%CE%B1-Gel+Coexistence+Regimes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes.</a> Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).</li>
<li>Longo, M. L., Ly, H. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLongo%2C+ML+%22Methods+in+Membrane+Lipids%22">Methods in Membrane Lipids</a>. Dopico, A. M. , Humana Press. 421-437 (2007).</li>
<li>Chen, D., Santore, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+copolymer-phospholipid+vesicles%3A+phase+separation+resembling+mixed+phospholipid+lamellae%2C+but+with+mechanical+stability+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control.</a> Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).</li>
<li>Mabrouk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+material+properties+of+giant+liquid+crystal+polymersomes%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes.</a> Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).</li>
<li>Henriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+behavior+of+membranes+with+sterols%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Universal behavior of membranes with sterols.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).</li>
<li>Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+Tension+Effect+of+Ethanol+on+Lipid+Bilayer+Rigidity%2C+Stability%2C+and+Area%2FMolecule%3A%E2%80%89+A+Micropipet+Aspiration+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule:  A Micropipet Aspiration Approach.</a> Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).</li>
<li>Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Bilayer+Thickness+on+Membrane+Bending+Rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity.</a> Langmuir. 20, 540-543 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Powłoka mikropipety jest jednym z kluczowych punktów umożliwiających uzyskanie wiarygodnych pomiarów. Należy zapobiegać przywieraniu pęcherzyka do mikropipety, a w literaturze 17,18,19,20,21 powszechnie stosuje się powlekanie BSA, β-kazeiną lub surfasilem. Rzadko wspomina się o szczegółach procedury powlekania.
Rozpuszczanie BSA pow...

Gigantyczne pęcherzyki uzyskane z fosfolipidów (liposomów) są szeroko stosowane od lat siedemdziesiątych jako podstawowy model błony komórkowej1. Pod koniec lat dziewięćdziesiątych XX wieku morfologie pęcherzykowe uzyskane w wyniku samoorganizacji kopolimerów, nazwane polimeromami w odniesieniu do ich analogów lipidowych2,3, szybko pojawiły się jako interesująca alternatywa dla liposomów, które mają słabą stabilność mechaniczną i słabą modułową funkcjonalność chemiczną. Jednak ich biomimetyczny charakter komórek jest raczej ograniczony w porównaniu z liposomami, ponieważ te ostatnie składają się z fosfolipidów, głównego składnika błony komórkowej. Co więcej, ich niska przepuszczalność błony może stanowić problem w niektórych zastosowaniach, takich jak dostarczanie leków, gdzie wymagana jest kontrolowana dyfuzja gatunków przez membranę. Ostatnio powiązanie fosfolipidów z kopolimerami blokowymi w celu zaprojektowania hybrydowych pęcherzyków i błon polimerowo-lipidowych jest przedmiotem coraz większej liczby badań4,5. Główną ideą jest zaprojektowanie jednostek, które synergistycznie łączą zalety każdego składnika (biofunkcjonalność i przepuszczalność dwuwarstw lipidowych ze stabilnością mechaniczną i wszechstronnością chemiczną membran polimerowych), które można wykorzystać w różnych zastosowaniach: kontrolowane i ukierunkowane dostarczanie leków, rozpoznawanie biomolekularne w biosensorach do diagnozy, funkcjonalne błony dla sztucznych komórek, rozwój mikro-/nano-reaktorów inspirowanych biologią.
Obecnie różne środowiska naukowe (biochemicy, chemicy, biofizycy, fizykochemicy, biolodzy) są coraz bardziej zainteresowane rozwojem bardziej zaawansowanego modelu błony komórkowej. Tutaj naszym celem jest przedstawienie, tak szczegółowo, jak to tylko możliwe, istniejących metodologii (elektroformacja, aspiracja mikropipet) w celu uzyskania i scharakteryzowania właściwości mechanicznych gigantycznych pęcherzyków oraz najnowszych "zaawansowanych" modeli błon komórkowych, które są hybrydowymi lipidowymi pęcherzykami gigantycznymi4,5.
Celem tych metod jest uzyskanie wiarygodnego pomiaru obszaru ściśliwości i modułów zginania membrany, jak również ich naprężenia lizy i odkształcenia. Jedną z najpowszechniejszych technik pomiaru sztywności zginania gigantycznego pęcherzyka jest analiza fluktuacji6,7, oparta na bezpośredniej obserwacji mikroskopu wideo; Wymaga to jednak dużych widocznych fluktuacji błony i nie jest systematycznie uzyskiwane na grubych membranach (np. polimeromach). Moduł ściśliwości powierzchni można wyznaczyć doświadczalnie za pomocą techniki Langmuira Blodgetta, ale najczęściej na monowarstwie8. Technika aspiracji mikropipet pozwala na pomiar obu modułów na dwuwarstwie tworzącej gigantyczny pęcherzyk jednowarstwowy (GUV) w jednym eksperymencie.
Poniższa metoda jest odpowiednia dla wszystkich amfifilowych cząsteczek lub makrocząsteczek zdolnych do tworzenia dwuwarstw, a co za tym idzie, pęcherzyków przez elektroformację. Wymaga to płynnego charakteru dwuwarstwy w temperaturze elektroformacji.

<table><tbody><tr><td>Wymagany sprzęt i materiały do projektowania mikropipet</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td>średnica zewnętrzna i wewnętrzna odpowiednio 1 mm i 0,58 mm.</td></tr><tr><td>Zainstalowany filament</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>FB255B</td><td>2,5 mm * 2,5 mm Pudełko z filamentem</td></tr><tr><td>Płonący / brązowy ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>NARISHGE Co.</td><td>MF-900</td><td>wyposażony w dwa obiektywy (10x i 32x)</td></tr><tr><td>Materiały do powlekania końcówek pipet BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej frakcji V (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10735078001</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa strzykawka 1 ml Luer Tip</td><td>Codan</td><td>62.1612</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa strzykawka 10 ml Luer Tip</td><td>Codan</td><td>626616</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa strzykawka 5 ml Luer Tip</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy filtr z celulozy octanowej</td><td>Cluzeau Info Labo</td><td>L5003SPA</td><td>Wielkość porów: 0,22 i mikro; m, średnica: 25mm</td></tr><tr><td>Elastyczne rurki kapilarne ze stopionej krzemionki</td><td>Polymicro Technologies.</td><td>TSP530660</td><td>Średnica wewnętrzna 536 i mikro; m, Średnica zewnętrzna 660 i mikro; </td></tr> m,Strzykawka <tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>500 i mikro; L luer Lock GAZSZCZELNA</td><td>Hamilton Seringe Company</td><td>1750</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik rotacyjny probówek</td><td>Labinco</td><td>28210109</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulation Zestaw</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowa szyna optyczna, 1000 mm Długość, gwinty M4, seria X48</td><td>Newport</td> Tłumiony stół optyczny Newport <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Służy jako podpora mikroskopu w celu zapobiegania wibracjom zewnętrznym.</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP 2</td><td>Moduł (jednostka silnikowa do ruchu X, Y i Z) jest montowany na mikroskopie odwróconym za pomocą adaptera.</td></tr><tr><td>Mikrometr</td><td>Mitutoyo Corporation</td><td>350-354-10</td><td>Digimatic LCD Głowica mikrometryczna 25,4 mm Zakres 0,001 mm</td></tr><tr><td>Zbiornik na wodę z pleksi (100 ml)</td><td>Domowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>odwrócony mikroskop konfokalny TCS SP5 (DMI6000) wyposażony w skaner rezonansowy i obiektyw do zanurzenia w wodzie (HCX APO L 40x/0,80 WU-V-I).</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X48 Rail Carrier o długości 80 mm, z gwintem 1/4-20, 8-32 i 4-40</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiały do przygotowania roztworu sacharozy i amfifilu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/2oleoyl1palmitoylsnglycero3phosphocholine760082685331611" target="_blank"> 2-Oleoilo-1-palmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina</a></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>22711.244</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatydyloetanoloamina-N-(lisamina rodamina B sulfonyl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>810146C</td><td>Rodamina tagowane lipid</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Elektroformacja konfiguracja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &mikro; L szklane kapilarne pierścienie</td><td>pierścieniowe Hirschmann</td><td>9600110</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa strzykawka 1 ml Luer Tip</td><td>Codan</td><td>62.1612</td><td></td></tr><tr><td>H Smar</td><td>Apiezon</td><td>Apiezon H Smar</td><td>Smar bezsilikonowy</td></tr><tr><td>Szkiełka szklane powlekane tlenkiem indu i cyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>703184</td><td></td></tr><tr><td>Igła</td><td>Terumo</td><td>AN2138R1</td><td>0,8 x 38 mm</td></tr><tr><td>Ohmmeter (Multimetr)</td><td>Voltcraft</td><td>VC140</td><td></td></tr><tr><td>Toluen</td><td>VWR</td><td>28676.297</td><td></td></tr><tr><td>Generator napięcia</td><td>Keysight</td><td>33210A</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie gigantycznych jednopłytkowych pęcherzyków hybrydowych przez elektroformację i pomiar ich właściwości mechanicznych za pomocą aspiracji mikropipetami

Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

Gigantyczne pęcherzyki uzyskane z fosfolipidów i kopolimerów mogą być wykorzystywane w różnych zastosowaniach: kontrolowane i ukierunkowane dostarczanie leków, rozpoznawanie biomolekularne w biosensorach do diagnozy, funkcjonalne błony dla sztucznych komórek oraz rozwój inspirowanych biologicznie mikro/nano-reaktorów. We wszystkich tych zastosowaniach charakterystyka ich właściwości membranowych ma fundamentalne znaczenie. Wśród istniejących technik charakteryzacji, aspiracja mikropipet, zapoczątkowana przez E. Evansa, umożliwia pomiar właściwości mechanicznych membrany, takich jak moduł ściśliwości powierzchniowej, moduł zginania oraz naprężenie i odkształcenie podczas lizy. W tym miejscu przedstawiamy wszystkie metodologie i szczegółowe procedury uzyskiwania gigantycznych pęcherzyków z cienkiej warstwy lipidu lub kopolimeru (lub obu), produkcję i obróbkę powierzchniową mikropipet oraz procedurę aspiracji prowadzącą do pomiaru wszystkich wcześniej wymienionych parametrów.

Z wykorzystaniem powyższego protokołu zbadano różne syntetyczne wielkie pęcherzyki jednowarstwowe (GUV), otrzymane z fosfolipidu: 2-oleoylo-1-palmitoylo-sn-glicerylo-3-fosfocholiny (POPC), trójblokowego kopolimeru: poli(tert-etylenowe)-b-poli(dimetylosiloksanowe)-b-poli(tert-etylenowe) (PEO12-b-PDMS43-b-PEO12) wytworzonego w poprzednim badaniu13, oraz kopolimeru dwublokowego poli(dimetylo...

Celem protokołu jest wiarygodny pomiar właściwości mechanicznych membrany gigantycznych pęcherzyków za pomocą aspiracji mikropipet.

Wykrywanie gigantycznych jednopłytkowych pęcherzyków hybrydowych przez elektroformację i pomiar ich właściwości mechanicznych za pomocą aspiracji mikropipetami

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular ...

Protokół ten ułatwia wiarygodny pomiar właściwości mechanicznych membrany syntetycznych i rzeczywistych polimerowych pęcherzyków lipidowych przy użyciu techniki aspiracji mikropipet. Jest to jedyna technika, która pozwala na ocenę elastyczności i niestabilności membrany w celu oceny elastyczności i niestabilności w pojedynczych eksperymentach. Protokół ten obejmuje szereg procedur, od przygotowania pęcherzyków po ocenę mechaniczną.Bardzo ważne jest, aby uzbroić się w cierpliwość i rozwiązywać wszelkie problemy techniczne w miarę ich pojawiania się. Wizualizacja tych technik ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, jak prawidłowo traktować powierzchnię kapilary i jak wykonać obowiązkowy krok naprężenia wstępnego. Pokazanie pęcherzyka bez wad.Procedurę zademonstruje Martin Fauquignon, doktorant z laboratorium pracującego nad rozwojem hybrydowych polimerowych pęcherzyków lipidowych. Przed rozpoczęciem zabiegu należy umieścić zimne szklane kapilary mikropipet pionowo w uchwytach. I opuść uchwyty, aż końcówki zostaną zanurzone na noc w świeżo przygotowanym roztworze albuminy surowicy bydlęcej z glukozą.Następnego ranka roztwór powinien wznieść się o około jeden centymetr w głąb końcówek poprzez działanie kapilarne. Za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 500 mikrolitrów, wyposażonej w elastyczną kapilę ze stopionej krzemionki, napełnij każdą pipetę roztworem glukozy. Następnie odessać roztwór z każdej pipety, a następnie kilkakrotnie napełnić pipety świeżym roztworem glukozy, aż cała surowica zostanie usunięta.Aby przygotować komorę do elektroformacji, należy najpierw oczyścić szkiełka ITO odpowiednim rozpuszczalnikiem organicznym i zidentyfikować powierzchnię przewodzącą za pomocą omomierza. Przymocuj przewody elektryczne po przewodzącej stronie każdego szkiełka za pomocą taśmy klejącej. Zanurz jedną kapilę w roztworze ampiwialnym, aż około 5 mikrolitrów roztworu zostanie zebranych przez działanie kapilarne.Umieść obciążoną kapilarnę w kontakcie ze środkiem jednej szklanej płytki ITO i delikatnie rozprowadź roztwór na szkiełku. Gdy rozpuszczalnik całkowicie odparuje, nałóż roztwór jeszcze dwa razy, jak pokazano. przed dodaniem warstwy smaru bezsilikonowego po obu stronach otwartej przekładki O-ringu wokół obszaru osadzania.Następnie umieść przewodzącą powierzchnię drugiej szklanej płytki ITO na górze przekładki i umieść komorę elektroformacyjną pod próżnią na 3 godziny, aby usunąć wszelkie ślady rozpuszczalnika organicznego. W celu elektroformacji gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych podłącz przewody elektryczne do generatora. Ustaw częstotliwość generatora na 10 Hz, a amplitudę na 2 wolty, od szczytu do szczytu.Po ustawieniu napięcia użyj strzykawki wyposażonej w igłę o średnicy wewnętrznej 0,8 milimetra, aby wstrzyknąć jeden mililitr 0,1 molowego roztworu sacharozy do komory i pozostawić komorę pod przyłożonym napięciem i częstotliwością na 75 minut. Pod koniec elektroformacji wyłącz generator. I użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby zassać niewielką objętość roztworu, aż w komorze wytworzy się pęcherzyk powietrza.Lekko przechyl komorę, aby przesunąć bańkę do komory i pomóc pęcherzykom oderwać się od powierzchni szkiełka. I odessać całą objętość roztworu do strzykawki. Następnie przenieś roztwór pęcherzyków do jednomililitrowej plastikowej tubki.Aby ustawić materiały do mikromanipulacji, zassać, aby wytworzyć przepływ wody, zbiornik czystej wody, do jednego uchwytu. I lekko stuknij, podnosząc zbiornik, aby wyeliminować wszelkie pęcherzyki powietrza i wytworzyć nadciśnienie. Napełnij kapilarnę pokrytą surowicą świeżym roztworem glukozy, aż na końcu utworzy się kropla.Wyjmij rurkę strzykawki z metalowego uchwytu, aby wytworzyć niewielki przepływ wody na końcu uchwytu, i obróć kapilę do góry nogami, aby połączyć kroplę glukozy ze strumieniem wody. Następnie skręć ze sobą kapilę i uchwyt. Aby ustawić pipetę, sklej dwie szklane szkiełka z wykonanego na zamówienie aluminiowego stolika za pomocą smaru próżniowego.I zainstaluj szkiełka na stoliku mikroskopu. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra uformuj menisk między dwoma szkiełkami z 0,1 molowym glukozą. Umieść pipetę i jej uchwyt na jednostce silnikowej mikromanipulatora.Dokręć clamppokrętło i użyj joysticka panelu sterowania w trybie zgrubnym. Opuść mikropipetę w pobliżu menisku glukozy. Użyj trybu precyzyjnego, aby dostosować położenie końcówki do środka łąkotki.Zanurz końcówkę w glukozie, aby wyczyścić jej zewnętrzną i wewnętrzną powierzchnię. Po kilku minutach usuń kapilatę z łąkotki i zastąp glukozę świeżą łąkotką. Odessać dwa mikrolitry gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych w 0,1 molowej sacharozy do 20-mililitrowej końcówki mikropipety.Wprowadź pęcherzyki do łąkotki. Użyj mikroskopu, aby obserwować pęcherzyki na dnie komory szkiełka. Gdy pęcherzyki zostaną lekko opróżnione, ponownie włóż pipetę ssącą i skup się na końcówce pipety.Następnie ustaw wysokość bazową zbiornika na wodę na ciśnienie, przy którym ruch cząstek zostaje zatrzymany. Otocz łąkotkę olejem mineralnym, aby zapobiec parowaniu. Aby przeprowadzić eksperyment aspiracji mikropipet, opuść końcówkę pipety do menisku.Stwórz niewielką ilość ciśnienia ssania, aby zassać pęcherzyk. Błona wybranego pęcherzyka powinna nieznacznie się wahać i nie powinna wykazywać żadnych widocznych defektów. Użyj mikromanipulatora, aby podnieść pipetę na wyższy poziom, aby odizolować zasysany pęcherzyk od innych pęcherzyków.Obniż zbiornik na wodę do około 10 centymetrów, aby wstępnie naprężyć pęcherzyk przed podniesieniem zbiornika, aby przywrócić ciśnienie do wartości początkowej. Od wysokości 0,5 centymetra powoli zmniejszaj ciśnienie ssania, aż zostanie osiągnięte ciśnienie, przy którym membrana ulega wahaniom. Następnie zwiększ nacisk, aby wyraźnie uwidocznić język w końcówce, długość projekcji wynoszącą kilka mikronów.Aby określić moduł zginania, zwiększaj ciśnienie ssania, krok po kroku, o jeden mikrometr. Aż do osiągnięcia 0,5 do 0,8 miliniutona na metr. Czekanie pięć sekund i robienie zdjęcia języka po każdym kroku.Aby określić obszar, moduł ściśliwości oraz napięcie i odkształcenie lizy, kontynuuj zwiększanie ciśnienia ssania od 0,5 miliniutona na metr, aż do osiągnięcia napięcia zrywającego. W tym reprezentatywnym eksperymencie obszarowy moduł ściśliwości i odkształcenie lityczne dla POPC były całkowicie zgodne z tym, czego oczekiwano w literaturze. W tej tabeli można zaobserwować typowe wartości dla otrzymanych polimeromów.Należy pamiętać, że wytrzymałość membrany uzyskanej z kopolimerów diblokowych jest znacznie większa niż tych uzyskanych z kopolimeru triblokowego. Co ciekawe, przy użyciu kopolimeru diblokowego możliwe jest uzyskanie gigantycznych hybrydowych pęcherzyków polimeru lipidowego Unilamilar, które wykazują większą wytrzymałość niż ta mierzona dla liposomów. Protokół ten może być pomocny w pomiarze pęcherzyka za pomocą pipety, na przykład w celu zmierzenia przepuszczalności membrany przez wstrząs azmatyczny.Pamiętaj, aby wykonać każdy krok z rygorem i precyzją, zwłaszcza podczas ustawiania połączenia z trybuną. Technika ta została wykorzystana do zrozumienia fizycznego pochodzenia rozszczepienia błonowego poprzez pomiar napięcia linii na głównych granicach w zmodyfikowanych pęcherzykach.

obtention-giant-unilamellar-hybrid-vesicles-electroformation

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Przekształcanie funkcjonalnych białek błonowych w gigantyczne liposomy o określonym składzie jest potężnym podejściem w połączeniu z elektrofizjologią patch-clamp. Jednak konwencjonalna produkcja gigantycznych liposomów może być niezgodna ze stabilnością białka.  Opisujemy protokoły wytwarzania gigantycznych liposomów z czystych lipidów lub małych liposomów zawierających kanały jonowe.

Preparat liposomów olbrzymich do obrazowania i elektrofizjologii patch-clamp

Mikroprzepływowe natryskiwanie dwuwarstwy lipidowej na granicy kropelek zapewnia niezawodny sposób generowania pęcherzyków z kontrolą nad asymetrią błony, włączeniem białek transbłonowych i enkapsulacją materiału. Technika ta może być stosowana do badania różnych systemów biologicznych, w których pożądane są biomolekuły podzielone na przedziały.

Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego

Rekonstytucja białka transbłonowego, KvAP, w gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUVs) jest demonstrowana dla dwóch metod odwodnienia i ponownego nawodnienia — elektroformacji i pęcznienia wspomaganego żelem. W obu metodach małe jednowarstwowe pęcherzyki zawierające białko są łączone ze sobą, tworząc GUV, które można następnie badać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i elektrofizjologii patch-clamp.

Rekonstytucja białka transbłonowego, kanału jonowego bramkowanego napięciem, KvAP, w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych do badań mikroskopowych i patch clamp

Opisujemy protokół przygotowania dwuwarstw lipidowych i jego charakterystyki za pomocą mikroskopii sił atomowych i spektroskopii sił.

Obrazowanie mikroskopii sił atomowych i spektroskopia sił podpartych dwuwarstw lipidowych

Eksperymenty na oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV) często zaniedbują fizjologiczne warunki roztworu. W pracy przedstawiono podejścia do badania wpływu buforu o wysokim zasoleniu na separację faz ciecz-ciecz w naładowanych wieloskładnikowych GUV w funkcji asymetrii i temperatury roztworu transmembranowego.

Zachowanie fazowe naładowanych pęcherzyków w symetrycznych i asymetrycznych warunkach roztworu monitorowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Wiele białek w sensie komórkowym i indukuje krzywiznę błony. Opisujemy metodę wyciągania nanorurek błonowych z pęcherzyków lipidowych w celu zbadania interakcji białek lub dowolnej cząsteczki aktywnej pod kątem krzywizny z zakrzywionymi błonami in vitro.

Wyciąganie nanorurek membranowych z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych

Prezentujemy technikę bezdotykowej mikromanipulacji pęcherzykami, wykorzystując zlokalizowane gradienty jonów wapnia. Mikroiniekcja roztworu jonów wapnia w pobliżu gigantycznego pęcherzyka lipidowego jest wykorzystywana do przebudowy błony lipidowej, w wyniku czego powstają wypukłości rurki błonowe.

Przebudowa błony gigantycznych pęcherzyków w odpowiedzi na zlokalizowane gradienty jonów wapnia

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Ten artykuł przedstawia metodę przygotowywania złożonych wielowarstwowo-jednowarstwowych pęcherzyków (cGUVs) o strukturze pęcherzyka w pęcherzyku, z dostosowaną przewodnością elektryczną w regionach wewnętrznym, pierścieniowym i zewnętrznym. Elektroformacja syntetyzuje proste GUV, które są przekształcane w stomatocyty i cGUV za pomocą wstrząsu osmotycznego, zapewniając wartościowy model do badania biofizyki komórek z jądrami.

Synteza złożonych gigantycznych jednowarstwowych pęcherzyków: Biomimetyczny model komórek z jądrem

Ten przewodnik dla początkujących przedstawia ogólny protokół przygotowania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV) metodą przenoszenia kropel, omawiając krytyczne etapy i dostarczając informacji, które pomogą w możliwych korektach wymaganych dla różnych zastosowań, w tym biologii syntetycznej i mikrorobotyki.

Wykorzystanie metody przenoszenia kropelek w celu niezawodnego przygotowania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych

Naucz się mierzyć właściwości mechaniczne błon pęcherzyków lipidowych metodą aspiracji mikropipetą. Technika ta pozwala ocenić elastyczność i stabilność membran w pojedynczych eksperymentach.

Wykrywanie gigantycznych jednopłytkowych pęcherzyków hybrydowych przez elektroformację i pomiar ich właściwości mechanicznych za pomocą aspiracji mikropipetami (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie gigantycznych jednopłytkowych pęcherzyków hybrydowych przez elektroformację i pomiar ich właściwości mechanicznych za pomocą aspiracji mikropipetami

Przeglądaj więcej filmów