Wizualizacja morfologii astrocytów za pomocą jonoforezy Lucyfera Yellow

Metoda ta może być wykorzystana do ułatwienia wizualizacji bardzo drobnych procesów astrocytów w celu oceny interakcji neuronalnych astrocytów w synapsie podczas choroby i stanów stacjonarnych. Technika ta może być również zastosowana w dowolnym modelu myszy, populacji komórek lub regionie mózgu. Aby przygotować ostrą elektrodę o odpowiednim oporze, należy pociągnąć elektrodę jednocylindrową ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem na ściągaczu do mikropipet.

Przechowuj wyciągnięte elektrody w zamkniętym pojemniku, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu do końcówek i trzymaj elektrody podniesione od dołu pudełka, aby zapobiec pękaniu końcówek. Aby napełnić elektrodę roztworem żółtego barwnika lucyfera, umieść elektrodę w pozycji pionowej z końcówką skierowaną w dół i odpipetuj od jednego do dwóch mikrolitrów żółtego roztworu lucyfera z tyłu elektrody. Odczekaj od pięciu do 10 minut, aż roztwór przesunie się do końcówki poprzez działanie kapilarne, a następnie delikatnie zabezpiecz wypełnioną elektrodę w uchwycie elektrody podłączonym do manipulatora ze srebrnym drutem uchwytu elektrody stykającym się z żółtym lucyferem wewnątrz elektrody.

W teście wyrzutu barwnika delikatnie umieść lekko utrwalony plasterek mózgu w szklanym naczyniu z dnem wypełnionym 0,1 molowym PBS w temperaturze pokojowej i przytrzymaj plasterek na miejscu za pomocą platynowej harfy z nylonowymi strunami. Podłącz elektrodę do źródła napięcia i umieść elektrodę masową w kąpieli zawierającej wycinek mózgu. Przesuń obiektyw mikroskopu konfokalnego na obszar mózgu zainteresowania i opuść elektrodę do roztworu za pomocą soczewki zanurzeniowej 10X, przesuwając elektrodę do środka pola widzenia.

Przy oświetleniu w jasnym polu dokładnie zbadaj elektrodę za pomocą soczewki zanurzonej w wodzie 40X, aby upewnić się, że elektroda jest czysta i bez zanieczyszczeń lub pęcherzyków. Przełącz się na konfokalną laserową mikroskopię skaningową z laserem 488 nm. Włącz stymulator przy napięciu 12 woltów, aby przetestować wyrzut barwnika.

Wokół końcówki elektrody powinna być widoczna duża chmura barwnika fluorescencyjnego. Następnie, w jasnym polu, powoli opuść elektrodę w kierunku warstwy, zatrzymując się tuż nad powierzchnią. Aby wypełnić interesujący astrocyt jonoforezą, użyj kontrastu różnicowego interferencji w podczerwieni, aby zidentyfikować astrocyty z wydłużonymi owalnymi somatami o średnicy około 10 mikrometrów, 40 do 50 mikrometrów poniżej powierzchni warstwy.

Jest to warstwa promienista hipokampa znajdująca się bezpośrednio pod piramidalną warstwą komórkową. Gdy poruszamy się po tkance, możemy zobaczyć naczynia krwionośne, neurony, astrocyty i inne typy komórek. Po wybraniu astrocytu przesuń komórkę na środek pola widzenia i powoli opuść końcówkę elektrody do wycinka, poruszając się po tkance, aż elektroda znajdzie się na tej samej płaszczyźnie co ciało komórki.

Gdy ciało komórki astrocytu jest wyraźnie widoczne i zarysowane, powoli i delikatnie przesuwaj elektrodę do przodu, przesuwając elektrodę, aż końcówka przebije somę komórki. Powoli przesuwaj ostrość obiektywu w górę iw dół, aby zauważyć, czy elektroda znajduje się wewnątrz somy. Gdy końcówka elektrody znajdzie się wewnątrz ogniwa, włącz stymulator przy napięciu od 0,5 do jednego wolta, aby w sposób ciągły wyrzucać prąd do ogniwa.

Za pomocą mikroskopu konfokalnego obserwuj film ogniwa, zwiększając zoom cyfrowy, aby uwidocznić szczegóły ogniwa i upewnić się, że końcówka elektrody jest widoczna wewnątrz ogniwa, jeśli to konieczne. Odczekaj około 15 minut, aż drobniejsze gałęzie i procesy pojawią się zdefiniowane, zanim wyłączysz napięcie i delikatnie wyjmiesz końcówkę elektrody z ogniwa. Aby zobrazować wypełnioną komórkę, odczekaj od 15 do 20 minut, aż komórka powróci do swojej pierwotnej postaci, zanim dostosujesz ustawienie w mikroskopie konfokalnym, aby upewnić się, że drobniejsze gałęzie i procesy wydają się być zdefiniowane pod obiektywem 40X.

Ustaw stos Z z krokiem o rozmiarze 0,3 mikrometra, przesuwając obiektyw podczas obrazowania, aż nie będzie sygnału z komórki i ustaw ten krok jako górny. Następnie przesuń obiektyw w dół, skupiając się na komórce, aż nie będzie sygnału i ustaw ten krok jako dół. Po zakończeniu obrazowania sprawdź, czy elektroda nie została wyrzucona.

Jeśli pojawi się duża chmura barwnika, elektroda może być użyta do następnego plasterka. W przeciwnym razie wymień elektrodę. Generując projekcję maksymalnej intensywności, można zaobserwować szczegółowy widok struktury astrocytu w jego domenie.

Czterokrotne powiększenie astrocytu ujawnia projekcję maksymalnej intensywności jednej głównej gałęzi, kilku gałęzi wtórnych oraz rozmieszczenie otaczających gałęzi i listków. Tutaj pokazany jest oryginalny obraz astrocytu CA1. Ciało komórki, główne gałęzie, procesy i objętość terytorium zamkniętego przez astrocyt są rekonstruowane na tych kolejnych obrazach.

Po wykonaniu rekonstrukcji określono ilościowo objętość somy, całej komórki i terytorium. I policzono liczbę głównych oddziałów. Jako białko cytoszkieletu, które znakuje pośrednie włókna astrocytów, ulega ekspresji w somie komórki, głównych gałęziach i niektórych wtórnych gałęziach astrocytów, ale nie w drobniejszych gałęziach i procesach.

W tej reprezentatywnej analizie nie stwierdzono istotnych różnic w liczbie gałęzi pierwotnych oznaczonych kwaśnym białkiem fibrylarnym gleju i tych uwidocznionych żółtym lucyferem. Co więcej, obszar i objętość komórki astrocytu znakowane kwaśnym białkiem fibrylarnym gleju były znacznie mniejsze niż obszar i objętość wizualizowane za pomocą żółtego lucyfera, co pokazuje, że kwaśne białko fibrylarne gleju jest wiarygodnym markerem do znakowania głównych gałęzi, ale nie jest przydatne do określania ogólnej powierzchni lub objętości komórki. Ilość barwnika uwalnianego z końcówki elektrody zależy od rezystancji elektrody, która musi być wystarczająco wysoka, aby umożliwić wyrzucanie stałego strumienia barwnika.

Przyszłe badania mogą badać różne składniki struktury astrocytów za pomocą mikroskopii świetlnej o wysokiej rozdzielczości lub analizy immunohistochemicznej ekspresji określonych białek w strukturze astrocytów.