Name: Test punktowy świetlny do analizy fototaksji larw Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Poznaj test punktowy świetlny do analizy fototaksji larw Drosophila. Ta metoda pozwala śledzić zachowania unikania światła i badanie podstaw neurologicznych odpowiedzi sensorycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca jest wspierana przez chińską fundację nauk przyrodniczych (31671074) oraz fundusze na badania podstawowe dla uniwersytetów prowincji Zhejiang (2019XZZX003-12).

1. Przygotowanie larw Drosophila
<ol>
	<li>Przygotuj standardowe podłoże składające się z gotowanej mąki kukurydzianej (73 g), agaru (5,6 g), śruty sojowej (10 g), drożdży (17,3 g), syropu (76 ml) i wody (1000 ml).</li>
	<li>Wyhoduj wszystkie muchy w temperaturze 25 °C na standardowym podłożu w pomieszczeniu o cyklu 12 h/12 h światło/ciemność.</li>
</ol>
2. Przygotowanie płytek agarowych
<ol>
	<li>Przygotować 1,0% roztwór agaru. Odważyć 3 g agaru w zlewce o pojemności 500 ml z wagą, a następnie dodać 300 ml wody destylowanej. Umieść papier foliowy na wyłączniku, aby zapobiec parowaniu wody. Podgrzej zlewkę w kuchence mikrofalowej do wrzenia.</li>
	<li>Wyjmij zlewkę i dobrze wymieszaj szklaną pałeczką, a następnie podgrzej w kuchence mikrofalowej, aż się zagotuje. Powtarzaj, aż płyn stanie się całkowicie przezroczysty i płynny. 
	UWAGA: Końcowy gorący roztwór agaru powinien być wolny od pęcherzyków powietrza; W przeciwnym razie wlanie agaru do płytki spowoduje nierówną i wgniecioną powierzchnię płytki agarowej, co wpłynie na późniejsze badania zachowania larw. Stężenie roztworu agaru nie powinno być ani zbyt wysokie, ani zbyt niskie. Jeśli stężenie jest zbyt wysokie, rozproszone odbicie światła na płytce agarowej będzie silne i rozmaże granicę światło/ciemność. Jeśli stężenie jest zbyt niskie, larwy pozostawią ślady na talerzu. Oba te błędy utrudnią przetwarzanie wideo w późniejszym czasie.</li>
	<li>Powoli wlewać gorący roztwór agaru na szalkę Petriego (średnica 15 cm), aż dno zostanie równomiernie pokryte warstwą agaru (o grubości ~4 mm) i schłodzić w temperaturze pokojowej (RT), aż roztwór agaru zestali się.</li>
	<li>Płytka agarowa powinna być używana, gdy jest świeżo przygotowana. Jeśli tak nie jest, wylej warstwę wody na powierzchnię i przechowuj ją w lodówce w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
</ol>
3. Konfiguracja systemu stymulacji wzrokowej
<ol>
	<li>Wybierz źródło światła LED: skolimowane niebieskie światło LED o długości fali 470 nm lub ciepłe białe światło. 
	UWAGA: Źródło światła można zastąpić światłem LED o dowolnej innej długości fali. W tym eksperymencie jako przykład użyto niebieskiej diody LED światła.</li>
	<li>Zwiń gruby kawałek folii aluminiowej lub czarnego kartonu (upewnij się, że jest nieprzezroczysty), aby utworzyć otwarty cylinder o długości 12 cm i średnicy podobnej do średnicy niebieskiej diody LED o średnicy 3 cm. Niech górny koniec cylindra zakrywa przedni koniec diody LED z niebieskim światłem. Przykryj dolny koniec czarnym kartonem z małym okrągłym otworem (o średnicy 0,5 cm) pośrodku. Na tym polega konfiguracja systemu źródła światła.</li>
	<li>Przymocuj przygotowane źródło światła do żelaznej ramy za pomocą klipsa, upewniając się, że dioda LED wystaje w dół w kierunku biurka. Lekko przechyl cylinder. Kąt między płaszczyzną cylindra a płaszczyzną pionową wynosi około 10° (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Podłącz niebieską diodę LED 470 nm do wtyczki "LED1" sterownika LED o dużej mocy. Włącz sterownik, przekręć pokrętło w prawym górnym rogu sterownika, aby wybrać kanał 470 nm, a następnie kliknij LED. Następnie, gdy na ekranie pojawi się "√", na pulpicie pojawi się niebieska plama światła. 
	UWAGA: Jeśli z cylindra oprócz małego okrągłego otworu przecieka światło, zaleca się użycie czarnej taśmy na nieszczelnych częściach, aby upewnić się, że tylko otwór może przepuszczać światło.</li>
	<li>Kliknij OK i obróć pokrętło, aby wyregulować intensywność światła. Obróć pokrętło na wyższe natężenie światła 50 mA. Zmierz i zapisz widmo światła za pomocą spektrometru.</li>
	<li>Przesuwaj położenie źródła światła w górę i w dół, aby wyregulować średnicę plamki świetlnej do 2 cm. Pulpit powinien być, aby uzyskać lepszy efekt kontrastu.</li>
	<li>Obróć pokrętło, aby wybrać natężenie światła zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi. Użyj kompaktowej konsoli miernika mocy ze standardowym czujnikiem mocy fotodiody, aby zmierzyć maksymalną i minimalną moc światła w miejscu, zapisz ją, zmierz trzy razy i przyjmij wartość średnią. 
	UWAGA: Zaleca się użycie czujnika mocy fotodiody do pomiaru natężenia światła dla światła o określonej długości fali oraz użycie czujnika mocy cieplnej do pomiaru natężenia światła dla światła białego.</li>
	<li>Oblicz natężenie światła w plamce świetlnej, dzieląc zmierzoną moc światła przez obszar czujnika. 
	UWAGA: Dla example, jeśli zmierzona moc światła w kroku 2.6 wynosi 20 pW, a powierzchnia czujnika wynosi 0.81 mm2, natężenie światła wynosi 24.69 pW/mm2 (dzieląc 20 pW przez 0.81 mm2).</li>
</ol>
4. Konfiguracja systemu obrazowania
<ol>
	<li>Zaciśnij kamerę internetową o wysokiej rozdzielczości za pomocą żelaznego klipsa, około 10 cm nad punktem świetlnym na pulpicie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Dostosuj orientację obiektywu aparatu w kierunku pulpitu. Podłącz aparat do komputera za pomocą interfejsu USB.</li>
	<li>Umieść płytkę agarową na pulpicie tuż pod aparatem.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie "Amcap9.22" na komputerze z systemem Windows 7, a punkt świetlny zostanie automatycznie pokazany w oknie AMcap. Przesuń kamerę lekko w lewo lub w prawo, aby upewnić się, że plamka światła znajduje się blisko środka okna. Upewnij się, że kamera nie blokuje ścieżki światła. Plamka świetlna powinna być kompletna i okrągła. 
	UWAGA: Oprogramowanie można znaleźć pod adresem http://amcap.en.softonic.com/.</li>
	<li>Zamocuj filtr pasmowo-przepustowy 850 nm ± 3 nm za pomocą klipsa na 5-7 mm tuż pod kamerą. 
	UWAGA: Średnica filtra wynosi około 2,5 cm, a obiektyw aparatu ma średnicę mniejszą niż 1 cm, dzięki czemu filtr może pokryć pole widzenia aparatu. Gdy filtr znajduje się pod kamerą, plamka światła nie powinna być widoczna w oknie AMcap.</li>
	<li>Umieść trzy diody LED generujące światło podczerwone (centralna długość fali = 850 nm) równomiernie wokół płytki agarowej. Każda dioda LED powinna znajdować się w odległości około 5 cm od krawędzi płytki agarowej, a czoło soczewki diody LED powinno być ustawione pod kątem 70° w dół w kierunku płytki agarowej. Podłącz diody LED do zasilania za pomocą konwertera AC-DC. 
	UWAGA: Lepiej jest ustalić pozycje i kąty diod LED światła podczerwonego, aby zapewnić spójność jasności pola w różnych próbach eksperymentalnych i ułatwić późniejsze przetwarzanie wideo.</li>
	<li>Umieść czarną tablicę między komputerem a urządzeniem. Ustaw jasność ekranu komputera, aby światło ekranu komputera nie wpływało na eksperyment. 
	UWAGA: Utrzymuj ciemne otoczenie podczas pomiaru długości fali lub intensywności światła.</li>
</ol>
5. Ustawianie parametrów obrazowania
<ol>
	<li>Z menu oprogramowania AMcap wybierz Opcje | Urządzenie wideo | Format przechwytywania i ustaw rozmiar przechwyconego wideo w pikselach na 800 x 600 i liczbę klatek na sekundę na 60 kl./s.</li>
	<li>Wyjmij filtr spod kamery, umieść linijkę pod kamerą i dostosuj ostrość kamery, aby linia skali była wyraźna i równoległa do szerokości pola widzenia wideo.</li>
	<li>Kliknij opcję Przechwyć | Ustawiać | Przechwytywanie wideo, aby wybrać ścieżkę zapisu, kliknij przycisk Rozpocznij nagrywanie, nagraj rzeczywistą odległość odpowiadającą 600 pikselom i oblicz stosunek każdego piksela do rzeczywistej odległości.</li>
</ol>
6. Nagrywanie wideo zachowania unikającego światła
<ol>
	<li>Utrzymuj temperaturę 25,5 °C przez wszystkie eksperymenty. W razie potrzeby kontroluj temperaturę w pomieszczeniu za pomocą klimatyzatora. Utrzymuj wilgotność na stałym poziomie 60% za pomocą nawilżacza.</li>
	<li>Obejrzyj krótki film przedstawiający pozycję punktu świetlnego o nazwie "lightarea1". Następnie przesuń filtr 850 nm ± 3 nm z powrotem, aby zakryć obiektyw aparatu. 
	UWAGA: Podczas nagrywania zachowania larw obiektyw kamery jest pokryty filtrem 850 nm ± 3 nm, dzięki czemu plamka świetlna nie jest widoczna na filmie. Plamę świetlną można zrekonstruować na filmach z larwami, a później za pomocą Matlaba. Nie zmieniaj położenia kamery i unikaj zmiany stosunku każdego piksela do rzeczywistej odległości zmierzonej w kroku 4.3.</li>
	<li>Włącz światło (tj. światło w pomieszczeniu) z dala od urządzenia eksperymentalnego. Zmniejsz światło tak nisko, jak to możliwe, o ile larwy są wyraźnie widoczne oczami. Wyjmij larwy z pożywki hodowlanej łyżką, delikatnie wybierz larwę w trzecim stadium rozwojowym i umyj ją do czysta wodą destylowaną. Uważaj, aby myć larwy pojedynczo, aby uniknąć zakłóceń spowodowanych głodem. Pojedynczy eksperyment wymaga co najmniej 20 larw.</li>
	<li>Przenieś larwę na środek płytki agarowej umieszczonej pod kamerą w kroku 3.3. Delikatnie usuń nadmiar wody z larwy za pomocą pędzla lub użyj bibuły, aby usunąć wodę z larwy, aby zapobiec odbijaniu się światła pod soczewką. Wyłącz światło w pomieszczeniu i pozwól larwie zaaklimatyzować się przez 2 minuty w ciemnym otoczeniu.</li>
	<li>Włącz światło LED, aby wygenerować światło podczerwone i delikatnie przeczesz larwę do środka płytki. Kiedy larwa zacznie czołgać się prosto, obróć płytkę, aby larwa skierowała się w stronę jasnego punktu. Upewnij się, że czołga się od samego początku, w przeciwnym razie może nie uzyskać dostępu do punktu świetlnego.</li>
	<li>Kliknij opcję Przechwyć | Ustawiać | Przechwytywanie wideo, aby wybrać ścieżkę zapisu, a następnie kliknij Rozpocznij nagrywanie, aby nagrywać. Pozwól larwie czołgać się w kierunku punktu świetlnego, wejdź do punktu świetlnego, a następnie opuść punkt świetlny, aż znajdzie się prawie poza polem widzenia. Kliknij przycisk Zatrzymaj nagrywanie. Jeśli larwa odwróci się od jasnego punktu, zanim się zbliży, bezpośrednio kliknij Zatrzymaj nagrywanie.</li>
	<li>Odsuń filtr od aparatu. Nagraj krótki film przedstawiający położenie plamki świetlnej o nazwie "lightarea2" i porównaj ją z pozycją "lightarea1", aby upewnić się, że pozycja punktu świetlnego nie zostanie zmieniona. Jeśli zaobserwuje się oczywistą zmianę położenia, odrzuć dane.</li>
</ol>
7. Analiza danych
<ol>
	<li>Użyj SOS17, aby wyodrębnić kontury ciała i parametry ruchu zwierząt z filmów za pomocą metod przetwarzania obrazu, jak opisano wcześniej17. 
	UWAGA: Parametry takie jak headSpeed (prędkość głowy larwy), tailSpeed (prędkość ogona larwy), midSpeed (prędkość środka larwy linii szkieletu) i cmSpeed (prędkość środka ciężkości larwy) zostały użyte do pomiaru prędkości ruchu larwy. Parametry, takie jak headTheta (kąt między liniami head-midpoint i midpoint-tail) oraz headOmega (zmieniająca się prędkość headTheta) zostały wykorzystane do pomiaru zgięcia ciała larw i prędkości kątowej zginania.</li>
</ol>

<ol><li>Grossfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geographic+distribution+and+light-dependent+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669(1971).</li>
<li>Godoy-Herrera, R. C. L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behaviour+of+Drosophila+melanogaster+larvae+during+pupation%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation.</a> Animal Behaviour. 37, (1989).</li>
<li>Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+behavior%3A+modulation+of+locomotion+by+light+in+the+Drosophila+melanogaster+larva+requires+genetically+distinct+visual+system+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions.</a> Journal of Neuroscience. 19, 3337(1999).</li>
<li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293(2005).</li>
<li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> Journal of Neuroscience. 31, 6527(2011).</li>
<li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+light%3A+photobehavior+in+fruit+fly+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends in Neurosciences. 35, (2012).</li>
<li>Kane, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+structure+of+Drosophila+larva+phototaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868(2013).</li>
<li>Humberg, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedicated+photoreceptor+pathways+in+Drosophila+larvae+mediate+navigation+by+processing+either+spatial+or+temporal+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications.+9%22%5BJournal%5D)">Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues.</a> Nature Communications. 9. 1260, (2018).</li>
<li>Gong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+pairs+of+neurons+in+the+central+brain+control+Drosophila+innate+light+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference.</a> Science. 330, (2010).</li>
<li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341, 1113(2013).</li>
<li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+disinhibitory+mechanism+biases+Drosophila+innate+light+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li>
<li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Neuronal+Pathway+that+Commands+Deceleration+in+Drosophila+Larval+Light-Avoidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin.+Feb%22%5BJournal%5D)">A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance.</a> Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).</li>
<li>Larderet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+Drosophila+larval+visual+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Organization of the Drosophila larval visual circuit.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> Journal of Neurogenetics. 10, (1995).</li>
<li>Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+preference+assay+to+study+innate+and+circadian+regulated+photobehavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237(2013).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921(2010).</li>
<li>Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+tracking+of+animal+posture+and+movement+during+exploration+and+sensory+orientation+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors.</a> PLoS ONE. 7, e41642(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten przedstawia test plamki świetlnej w celu zbadania zdolności larw Drosophila do ucieczki ze światła. Test ten umożliwia śledzenie zachowania larw przed wejściem, podczas spotkania i po opuszczeniu jasnego punktu. Szczegóły ruchu larw mogą być rejestrowane i analizowane. Test plamki świetlnej jest bardzo prosty i ma dużą praktyczność. Koszt całego urządzenia nie jest wysoki. W eksperymencie jako źródło światła wykorzystano światło LED. W razie potrzeby można go zastąpić źródłami światła o różnych dług...

Larwy Drosophila melanogaster wykazują wyraźne zachowanie unikające światła podczas fazy poszukiwania pożywienia. Fototaksja larw Drosophila była przedmiotem badań, zwłaszcza w ciągu ostatnich 50 lat1,2,3,4,5,6,7,8. W ostatnich latach, pomimo faktu, że 1) zidentyfikowano wiele neuronów pośredniczących w unikaniu światła larw4,5,9,10,11,12 oraz 2) ustalono kompletny konektom układu wzrokowego larw w rozdzielczości synaps13, mechanizmy neuronalne leżące u podstaw fototaksji larw pozostają w dużej mierze niejasne.
Do badania fototaksji larw użyto wielu testów behawioralnych. Można je w dużej mierze podzielić na dwie klasy: jedną obejmującą przestrzenne gradienty światła, a drugą obejmującą czasowe gradienty światła. W przypadku testów przestrzennego gradientu światła arena jest podzielona na równą liczbę sekcji w świetle i ciemności. Arena może być podzielona na jasne i ciemne połowy2,4 lub jasne i ciemne ćwiartki14,15, lub nawet może być podzielona na naprzemienne jasne i ciemne kwadraty, jak na szachownicy7. Zwykle płytki agarowe są używane do przestrzennego oznaczania gradientu światła, ale można również użyć probówek, które są podzielone na naprzemienne jasne i ciemne sekcje10,14.
W starszej wersji testów, oświetlenie światłem zazwyczaj pochodzi spod larw. Jednak oświetlenie w nowszych wersjach w dużej mierze pochodzi z góry, ponieważ oczy larw (np. narządy Bolwiga, które są wrażliwe na niskie lub średnie natężenie światła16) są zawarte w nieprzezroczystym szkielecie głowy i gardła z otworami skierowanymi ku górnemu przodowi. To sprawia, że larwy są bardziej wrażliwe na światło z góry z przodu niż z dołu z tyłu kierunków7. W przypadku testów czasowego gradientu światła natężenie światła jest przestrzennie jednolite na arenie, ale intensywność zmienia się w czasie. Oprócz czasowego światła o fali prostokątnej (tj. włączonego/wyłączonego lub silnego/słabego światła3,7), używane jest również światło zmieniające się w czasie, które jest zgodne z liniowym wzrostem intensywności8 do pomiaru wrażliwości larw na czasowo zmieniający się bodziec świetlny.
Trzecim rodzajem testu fototaksji jest kierunkowa nawigacja po krajobrazie świetlnym, która polega na oświetleniu z góry pod kątem 45°7. Przed pracą Kane'a i wsp.7, w testach fototaksji larw larw obliczano tylko zgrubne parametry, takie jak liczba larw w jasnych i ciemnych obszarach, częstotliwość skręcania i długość szlaku. Od czasu pracy tej samej grupy, z analizą zapisu wideo o wysokiej rozdzielczości czasowej dla fototaksji larw, przeanalizowano szczegółową dynamikę ruchu larw podczas fototaksji (tj. prędkości chwilowe różnych części ciała larwy, kierunek kursu, kąt skrętu i odpowiadającą mu prędkość kątową) 7. W ten sposób udało się odkryć więcej szczegółów na temat zachowania larw w fototaksji. W tych testach larwy są badane w grupach, aby nie wykluczyć skutków grupowych.
Ten protokół wprowadza test plamki świetlnej do badania reakcji behawioralnych larw na indywidualną stymulację światłem. Główny układ eksperymentalny składa się z systemu stymulacji wzrokowej i systemu obrazowania opartego na świetle podczerwonym. W systemie stymulacji wizualnej źródło światła LED generuje okrągłą plamkę świetlną o średnicy 2 cm na płytce agarowej, na której badana jest larwa. Natężenie światła można regulować za pomocą sterownika LED. System obrazowania zawiera kamerę na podczerwień, która rejestruje zachowanie larwy, a także trzy diody LED podczerwieni 850 nm, które zapewniają oświetlenie kamery. Obiektyw kamery jest pokryty filtrem pasmowo-przepustowym 850 nm, który blokuje światło z systemu stymulacji wizualnej przed wejściem do kamery, podczas gdy światło podczerwone może dostać się do kamery. W ten sposób zapobiega się interferencji stymulacji wzrokowej z obrazowaniem. W tym teście rejestrowane i analizowane są szczegóły behawioralne szybkich reakcji poszczególnych larw w okresie, w tym przed, w trakcie i po wejściu w światło.

<table><tbody><tr><td>850 nm &plusmn; 3 nm LED generujące światło podczerwone</td><td>Thorlabs, USA Czujniki</td> kompatybilne z <td>PM100A</td><td>: fotodioda i termiczna Zakres mocy optycznej: 100 pW do 200 W Dostępny zakres długości fali czujnika: 185 nm-25 &mu; m Częstotliwość odświeżania wyświetlacza: 20 Hz Przepustowość: DC-100 kHz Zakres czujnika fotodiodyb: 50 nA-5 mA Zakres czujnika termoelektrycznegob: 1 mV-1 V</td></tr><tr><td>Konwerter AC na DC</td><td>Thorlabs, USA</td><td>S120VC</td><td>Rozmiar przysłony: &Oslash; 9,5 mm Zakres długości fali: 200-1100 nm Zakres mocy: 50 nW-50 mW Typ detektora: Fotodioda Si (rozszerzona UV) Liniowość: &plusmn; 0,5% Niepewność pomiaru: &plusmn; 3% (440-980 nm), &plusmn; 5% (280-439 nm), &plusmn; 7% (200-279 nm, 981-1100 nm)</td></tr> <tr><td>filtr pasmowo-przepustowy</td><td>Thorlabs, USA</td><td>DC2100</td><td>LED Zakres prądu: 0-2 A Rozdzielczość prądu LED: 1 mA Dokładność prądu LED: &plusmn; 20 mA LED Napięcie przewodzenia: 24 V Zakres częstotliwości modulacji: 0-100 kHz Modulacja fali sinusoidalnej : Dowolna</td></tr><tr><td>kolimowana dioda LED światło niebieskie&nbsp;</td><td>ELP, Chiny</td><td>USBFHD01M</td><td>Max. Rozdzielczość: 1920X1080 F6.0 mm Czujnik: 1/2.7" CMOS OV2710</td></tr><tr><td>Kompaktowa konsola miernika mocy&nbsp;</td><td>Ocean Optics, USA</td><td>USB2000+(RAD)</td><td>Wymiary: 89,1 mm x 63,3 mm x 34,4 mm Waga: 190 g Detektor: Sony ILX511B (2048-elementowa liniowa matryca krzemowa CCD) Zakres długości fali: 200-850 nm Czas integracji: 1 ms &ndash; 65 sekund (typowo 20 sekund) Zakres dynamiki: 8,5 x 10^7 (system); 1300:1 dla pojedynczej akwizycji Stosunek sygnału do szumu: 250:1 (pełny sygnał) Ciemny szum: 50 RMS zlicza Krata: 2 (250 &ndash; 800 nm) Szczelina: SLIT-50 Soczewka do zbierania detektorów: L2 Sortowanie zamówień: OFLV-200-850 Rozdzielczość optyczna: ~2,0 nm FWHM Światło rozproszone: < 0,05% przy 600 nm; < 0,10% przy 435 nm Złącze światłowodowe: SMA 905 do 0,22 jednożyłowy światłowód o dużej mocy SMA 905 do 0,22</td></tr><tr><td>Sterownik LED</td> o dużej mocy <td>Minhongshi, Chiny</td><td>MHS-48XY</td><td>Napięcie robocze: DC12V Centralna długość fali: kamera internetowa o wysokiej rozdzielczości 850nm</td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs, USA</td><td>MWWHL4</td><td>Kolor: Ciepły biały Skorelowana temperatura barwowa: 3000 K Prąd testowy dla typowej mocy LED: 1000 mA Maksymalny prąd (CW): 1000 mA Szerokość pasma (FWHM): N/A Moc elektryczna: 3000 mW Kąt widzenia (pełny kąt): 120? Rozmiar emitera: 1 mm x 1 mm Typowa żywotność: >50 000 h Temperatura pracy (bez kondensacji): od 0 do 40 stopni C Temperatura przechowywania: -40 do 70 &deg; C Grupa ryzyka: RG1 &ndash; Dioda LED niskiego ryzyka</td></tr><tr><td>Ciepła biel</td><td>Mega-9, Chiny</td><td>BP850 / 22K</td><td>&Oslash; 25,4 (+ 0 ~ -0,1) mm Szerokość pasma: 22 i plusmn; 3nm Szczytowa przepuszczalność: 80% Centralna długość fali: 850nm i plusmn; 3nm&nbsp;</td></tr><tr><td>Spektrometr&nbsp;</td><td>Noel Danjou</td><td>Amcap9.22</td><td>AMCap&nbsp; to aplikacja do robienia zdjęć i nagrywania filmów z zaawansowanymi funkcjami podglądu i nagrywania. Jest to aplikacja klasyczna przeznaczona dla komputerów z systemem Windows 7 SP1 lub nowszym. Większość&nbsp; Wideo dla systemu Windows i&nbsp; Obsługiwane są urządzenia zgodne z DirectShow, niezależnie od tego, czy są to tanie kamery internetowe, czy zaawansowane karty do przechwytywania wideo.</td></tr><tr><td>Standardowy czujnik mocy fotodiody&nbsp;</td><td>Super Dragon, Chiny</td><td>YGY-122000</td><td>Wejście: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Wyjście: DC 12V 2A</td></tr><tr><td>Czujnik mocy cieplnej&nbsp;</td><td>Thorlabs, USA</td><td>M470L3-C1</td><td>Kolor: Niebieski Nominalna długość fali: 470 nm Szerokość pasma (FWHM): 25 nm Maksymalny prąd (CW): 1000 mA Napięcie przewodzenia: 3,2 V Moc elektryczna (maks.): 3200 mW Rozmiar emitera: 1 mm x 1 mm Typowa żywotność: 100 000 h Temperatura pracy (bez kondensacji): 0 do 40 &deg; C Temperatura przechowywania: -40 do 70 &deg; C Grupa ryzykab: RG2 &ndash; Grupa umiarkowanego ryzyka</td></tr><tr><td>Czujnik mocy cieplnej&nbsp;</td><td>Thorlabs, USA</td><td>S401C</td><td>Zakres długości fali: 190 nm-20 &mu; m Zakres mocy optycznej: 10 &mu; W-1 W(3 Wb) Rozmiar przysłony wejściowej: &Oslash; 10 mm Aktywny obszar detektora: 10 mm x 10 mm Maksymalna gęstość mocy optycznej: 500 W/cm2 (śr.) Liniowość: &plusmn; 0,5 %</td></tr></tbody></table>

test punktowy świetlny do analizy fototaksji larw drosophila

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Larwy Drosophila melanogaster wykazują wyraźne zachowanie unikające światła podczas fazy poszukiwania pożywienia. Fototaksja larw Drosophila może być wykorzystana jako model do badania zachowań unikających zwierząt. Protokół ten wprowadza test plamki świetlnej w celu zbadania zachowania fototaktycznego larw. Zestaw eksperymentalny składa się z dwóch głównych części: systemu stymulacji wizualnej, który generuje plamkę świetlną, oraz systemu obrazowania opartego na świetle podczerwonym, który rejestruje proces unikania światła przez larwy. Test ten umożliwia śledzenie zachowania larwy przed wejściem, podczas spotkania i po opuszczeniu punktu świetlnego. Szczegóły ruchu larw, w tym zwalnianie, pauza, zarzucanie głowy i obracanie się, mogą być rejestrowane i analizowane za pomocą tej metody.

Zgodnie z protokołem, w celu zbadania zachowania unikania światła u larw trzeciego stadium, hodowanych w temperaturze 25 °C na standardowej pożywce w pomieszczeniu z 12-godzinnym cyklem światło/ciemność, zastosowano test plamki świetlnej. Pojedynczą larwę w1118 poddano badaniu w teście plamki świetlnej w temperaturze 25,5 °C. Średnie natężenie światła plamki generowanej przez diodę LED o długości fali 460 nm wynosiło 0,59 µW/cm2. Cały proces wchodzenia i wychodzenia larwy z plamki świetlnej...

Ten protokół wprowadza test plamki świetlnej do zbadania fototaktycznego zachowania larw Drosophila. W tym teście plamka świetlna jest generowana jako stymulacja światłem, a proces unikania światła larwalnego jest rejestrowany przez system obrazowania oparty na świetle podczerwonym.

Test punktowy świetlny do analizy fototaksji larw Drosophila

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Korzystając z testu plamki świetlnej, można śledzić zachowanie larw przed, w trakcie i po wejściu do obszaru światła, co pozwala na analizę szczegółów ruchu larw. Ten test jest prosty i łatwy do wykonania. Reakcja na światło jest testowana tylko raz, dzięki czemu można wykluczyć ewentualny efekt adaptacji światła.Aby przygotować płytki agarowe, powoli i równomiernie przykryj spód 15-centymetrowej szalki Petriego warstwą gorącego 1% agaru o grubości około czterech milimetrów. Pozostaw płytkę do ostygnięcia w temperaturze pokojowej, aż agar zastygnie. Aby skonfigurować system stymulacji wizualnej, przypnij przygotowane źródło światła LED do żelaznej ramy, uważając, aby światło wystawało w dół w kierunku pulpitu.Lekko przechyl cylinder, aż kąt między płaszczyzną cylindra a płaszczyzną pionową wyniesie około 10 stopni. Podłącz niebieską diodę LED o długości 470 nanometrów do jednej wtyczki diody LED LED o dużej mocy i włącz sterownik. Obróć pokrętło w prawym górnym rogu sterownika, aby wybrać kanał 470 nanometrów i kliknij LED.Gdy na ekranie pojawi się czek, na pulpicie pojawi się niebieska plama światła. Kliknij OK i obróć pokrętło, aby wyregulować intensywność światła. Przesuwaj poło

light-spot-based-assay-for-analysis-of-drosophila-larval-phototaxis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym artykule wideo opisujemy nową metodę umożliwiającą tworzenie gradientów substancji zapachowych o stabilnych i kontrolowalnych geometriach. Krótko ilustrujemy, w jaki sposób gradienty te mogą być wykorzystane do wykrywania wad węchu (całkowitej i częściowej anosmii) oraz do badania bardziej subtelnych cech zachowań chemotaktycznych.

Wysokorozdzielczy pomiar zachowań sterowanych węchem u larw Drosophila

Drosophila melanogaster to genetycznie i behawioralnie podatny system modelowy, który od ponad wieku jest wykorzystywany do zrozumienia molekularnych i komórkowych podstaw wielu ważnych procesów biologicznych 1. Drosophila została szeroko wykorzystana w celu uzyskania wglądu w genetyczne podstawy zachowania much.

Metody oceny zachowania Drosophila

Larwy Drosophila są wrażliwe na światło i reagują na zmiany w otaczającym świetle. Ten film opisuje test, który testuje ich zdolność do unikania światła, zwany testem plamki świetlnej. Prezentowany protokół pokazuje, jak skonfigurować test z niebieską diodą LED i pokazuje, jak rejestrować zachowanie zwierzęcia w odpowiedzi na spotkanie ze światłem.

Test plamki świetlnej: metoda badania zachowania fototaktycznego Drosophila

Tutaj opisujemy test preferencji jasno-ciemnej dla larw Drosophila. Test ten dostarcza informacji na temat wrodzonej i okołodobowej regulacji wykrywania światła i przetwarzania fotozachowania.

Test preferencji świetlnej w celu zbadania wrodzonego i okołodobowego regulowanego fotozachowania u larw Drosophila

W tym artykule wideo opisujemy zautomatyzowany test do pomiaru wpływu głodu lub sytości na zależne od węchu zachowanie związane z poszukiwaniem pokarmu u dorosłej muszki owocowej Drosophila melanogaster.

Test pojedynczej muchy na zachowania żerowe u Drosophila

Ten raport opisuje metodę pomiaru aktywności larw Drosophila za pomocą TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Urządzenie wykorzystuje wiązki podczerwieni do wykrywania ruchów do 16 pojedynczych zwierząt. Dane mogą być analizowane w celu przedstawienia parametrów ruchu, w tym szybkości i pozycji zwierząt w komorach testowych.

Pomiar aktywności larw w monitorze aktywności Drosophila

Ten protokół opisuje test o wysokiej przepustowości do testowania preferencji składania jaj przez Drosophila melanogaster w rozdzielczości pojedynczego zwierzęcia.  Ten test zapewnia prostą, wydajną i skalowalną platformę do identyfikacji genów i składników obwodów, które kontrolują prosty proces podejmowania decyzji.

Wysokoprzepustowy test do badania preferencji składania jaj u poszczególnych Drosophila melanogaster

Ten protokół analizuje zachowanie nawigacyjne larwy Drosophila w odpowiedzi na jednoczesną optogenetyczną stymulację jej neuronów węchowych. Światło o długości fali 630 nm służy do aktywacji pojedynczych neuronów węchowych wyrażających rodopsynę z przesuniętym ku czerwieni kanałem. Ruch larw jest jednocześnie śledzony, rejestrowany cyfrowo i analizowany za pomocą specjalnie napisanego oprogramowania.

Śledzenie zachowań larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację neuronów węchowych

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Ten artykuł przedstawia metody manipulacji optogenetycznej u Drosophila melanogaster, wykorzystując CsChrimson i GtACR2 do aktywacji i wyciszania określonych neuronów. Opisano cztery eksperymenty wykorzystujące optogenetykę do badania zachowań termotaktycznych i smakowych, dostarczając wglądu w podstawowe mechanizmy neuronalne rządzące tymi procesami.

Testy behawioralne do optogenetycznej manipulacji obwodami neuronalnymi u Drosophila melanogaster

Protokół przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej poprzez kwantyfikację dysfunkcji lokomotorycznej jako alternatywę dla tradycyjnych modeli ssaków. Ma na celu ocenę neurotoksycznego wpływu związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu.

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

Poznaj test punktowy świetlny do analizy fototaksji larw Drosophila. Ta metoda pozwala śledzić zachowania unikania światła i badanie podstaw neurologicznych odpowiedzi sensorycznych.

Test punktowy świetlny do analizy fototaksji larw Drosophila

Przeglądaj więcej filmów