Name: Standaryzacja nieletalnej metody charakterystyki stanu rozrodczego i rozwoju larwalnego małży słodkowodnych (Bivalvia: Unionida) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Poznaj nieletalną metodę pobierania próbek z skrzeli samic małży słodkowodnych i charakteryzowania larw. Technika ta wspiera ochronę zagrożonych gatunków z rodzin Hyriidae, Margaritiferidae i Unionidae.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować źródłom finansowania: U.S. Fish and Wildlife Service oraz U.S. Geological Survey. Specjalne podziękowania dla Andrew Hartzoga i Sandry Pursifull za zorganizowanie ekip terenowych i zbieranie danych, a także dla Lauren Patterson i Chrisa Andersona za ich cenny wkład w rozwój baz danych. Chcielibyśmy również podziękować wszystkim, którzy pomogli w terenie i laboratorium, w tym Sherry Bostick, Markowi Cantrellowi, Sahale Casebolt, Jordanowi Holcombowi, Howardowi Jelksowi, Gary'emu Mahonowi, Johnowi McLeodowi, Kyle'owi Moonowi, Cayli Morningstar, Emmie Pistole, Mattowi Rowe'owi, Channingowi St. Aubinowi i Jimowi Williamsowi. Jakiekolwiek użycie nazw handlowych, firm lub produktów służy wyłącznie celom opisowym i nie oznacza poparcia ze strony rządu Stanów Zjednoczonych.

1. Zbieranie ciężarnych samic
UWAGA: W celu uzyskania wytycznych dotyczących prawidłowego badania terenu próbkowania pod kątem występowania gatunków zagrożonych lub narażonych na wyginięcie, należy odnieść się do protokołu badań małży słodkowodnych (Freshwater Mussel Survey Protocol) Służby Ryb i Dzikiej Przyrody33. Przed rozpoczęciem zbierania w terenie gatunków chronionych należy uzyskać odpowiednie pozwolenia federalne, a w przypadku wszystkich występujących gatunków – pozwolenia stanowe.
<ol>
	<li>Zebrać żywe małże z terenu, stosując metody dotykowo-wzrokowe (krok 1.2), lub wykorzystać okazy zakonserwowane z muzeum (krok 1.3). 
	UWAGA: Ważne jest, aby po zebraniu utrzymywać żywe małże w chłodzie i wilgoci, aby zapobiec ich wysychaniu i zmniejszyć stres; istotne jest również minimalne manipulowanie małżami w stanie grawidności, aby uniknąć przedwczesnego uwolnienia zawartości skrzeli przez samice34.</li>
	<li>Ocenić grawidność samic poprzez inspekcję wzrokową podczas zbioru (np. obecność przynęty płaszcza, konglutinatów itp.) lub poprzez inspekcję wzrokową po zbiorze (np. delikatne rozchylenie skrzydeł muszli na tyle, aby zajrzeć do środka i sprawdzić, czy skrzela są rozdęte, patrz Rysunek 1). 
	UWAGA: Gatunki różnią się sposobem inkubacji glochidiów w skrzelach torbielowatych; czasami tylko dwa zewnętrzne skrzela (ektobranchus), tylko dwa wewnętrzne skrzela (endobranchus) lub wszystkie cztery skrzela (tetragenous) pełnią funkcję torby inkubacyjnej17. Protokół można w tym miejscu przerwać, a grawidne samice przetransportować do laboratorium w celu pobrania próbek skrzeli.</li>
</ol>
<img alt="Proces renowacji małży; dłonie sprawdzające stan muszli małży w ramach badania terenowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60244/60244fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Delikatne otwieranie osobników.Aby sprawdzić stan zapłodnienia żywej małży, należy delikatnie rozchylić małżowiny kciukami (A) lub ostrożnie użyć wziernika bądź szczypiec odwróconych, aby otworzyć małżowiny (B). Należy zapoznać się z krokiem 2.3 protokołu w celu poznania środków ostrożności związanych z tą metodą. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60244/60244fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="3">
	<li>Przeprowadź inspekcję wizualną zakonserwowanych okazów, otwierając małże i badając skrzela, aby ustalić, czy dany osobnik jest ciążną samicą (Rysunek 2).</li>
</ol>
<img alt="Schemat anatomii małży, z zaznaczonymi strukturami wewnętrznymi, stosowany w analizach badań biologicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60244/60244fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Sposób identyfikacji ciążnej samicy. Skrzela marsupialne samicy małża wydają się nadmuchane, gdy samica jest ciążna i wysiaduje potomstwo. Zdjęcia A i C przedstawiają skrzela z perspektywy bocznej, natomiast zdjęcia B i D przedstawiają widok brzuszny skrzeli. Czerwone ramki obrysowują skrzela, aby podkreślić różnice między samicą ciążną (A/B) a nieciążną (C/D) małża Lampsilis straminea. Całkowita długość osobników wynosi 79 mm (A/B) oraz 88 mm (C/D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60244/60244fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
2. Pobieranie próbek zawartości skrzeli
UWAGA: Niniejszy protokół można dostosować w zależności od tego, czy pobieranie próbek odbywa się z żywych małży w terenie i laboratorium, czy z okazów utrwalonych.
<ol>
	<li>Przygotować plastikową probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL zawierającą około 1 mL sterylnej wody, jeśli zawartość skrzeli zostanie oceniona w ciągu 24 h od ekstrakcji35, lub etanolu (EtOH), jeśli ocena próbki nie może nastąpić w ciągu 24 h od pobrania lub jeśli zawartość skrzeli pochodzi z okazu muzealnego konserwowanego w EtOH. W przypadku przeznaczenia glochidi do obrazowania za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) należy użyć 70% EtOH, a jeśli glochidie będą wykorzystane do testów genetycznych, należy użyć nienasyconego 95% EtOH36.</li>
	<li>Zdjąć papierowe opakowanie z jednej sterylnej igły 20 G ze ściętą końcówką osadzonej na strzykawce 10 mL. Odkręcić zatyczkę, aby odsłonić igłę, i przygotować plastikową probówkę 1.5 mL do pobrania zawartości skrzeli. Wcisnąć tłok strzykawki do końca, tak aby czarny zatwór znajdował się na linii 0 mL/cc. 
	UWAGA: Przy każdym pobieraniu zawartości skrzeli należy używać sterylnej strzykawki. Używaną strzykawkę można wysterylizować w terenie, zanurzając końcówkę w 10% roztworze wybielacza, a następnie płucząc strzykawkę poprzez napełnienie jej 1 mL sterylnej wody i cofnięcie tłoka do 0 mL/cc, a na koniec osuszając strzykawkę czystą szmatką.</li>
	<li>Ująć ciążną samicę i delikatnie rozsunąć dwie małżowiny, używając opuszek kciuków. 
	OSTRZEŻENIE: Należy uważać, aby nie zranić zwierzęcia. Zbyt szerokie lub zbyt szybkie otwarcie małżowin może nadmiernie rozciągnąć mięśnie przymknijne i doprowadzić do śmierci osobnika. Szczególnie narażone na tym etapie są okazy o cienkich skorupach (np. gatunki z rodzajów Anodonta, Leptodea, Utterbackia itp.) oraz osobniki młode. Gwałtowne obchodzenie się z gatunkami o delikatnych skorupach może spowodować ich pęknięcie i śmierć zwierzęcia. W niektórych przypadkach ściskanie zwierząt o cienkich skorupach od przedniego i tylnego brzegu małżowiny, przy jednoczesnym patrzeniu na powierzchnię brzuszną, spowoduje ugięcie się i lekkie uchylenie skorupy, co pozwoli na zaobserwowanie skrzeli lub rozsunięcie małżowin bez uszkodzenia delikatnego brzegu skorupy. 
	UWAGA: W tym kroku można posiłkować się narzędziami, jednak mogą one doprowadzić do śmierci zwierzęcia, jeśli nie będą używane ostrożnie, dlatego należy ich unikać tak często, jak to możliwe. Na przykład można użyć wziernika lub zmodyfikowanych szczypiec odwróconych, aby pomóc w otwarciu osobnika, a klin może posłużyć do podtrzymania otwartych małżowin. Instrumenty te mogą być zbędne, jeśli dostępna jest druga osoba do pomocy (tj. jedna osoba trzyma zwierzę w pozycji otwartej, podczas gdy druga operuje strzykawką w celu ekstrakcji). Uszkodzenie lub oddzielenie tkanki płaszcza od periostrakonu może spowodować deformacje wzrostu i śmierć37; dlatego kluczowe jest unikanie przerwania połączenia między tkanką płaszcza a zewnętrznym brzegiem skorupy.</li>
	<li>Używając końcówki igły strzykawki, delikatnie przebić pojedynczą rurkę wodną nadmuchanego skrzela marsupialnego. Następnie, wykorzystując ściętą końcówkę igły, delikatnie wyssać zawartość skrzeli. 
	UWAGA: Zawartość skrzeli ma zazwyczaj mleczno-białą konsystencję, która powinna być widoczna na ściętej końcówce igły.
	<ol>
		<li>Przenieść zawartość strzykawki bezpośrednio do szalki Petriego, jeśli mikroskop jest pod ręką. W przeciwnym razie przechowywać zawartość w plastikowej probówce do mikrocentryfugi 1.5 mL z odpowiednim płynem (patrz krok 2.1) do późniejszej oceny. 
		UWAGA: Należy zminimalizować zaburzenia i manipulowanie próbkami glochidi podczas transportu, aby uniknąć ich uszkodzenia i zmniejszenia żywotności32,35.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisać informacje dotyczące identyfikacji rodzaju i gatunku, stanu ciążności, długości samicy (mm), dane zbieracza i kontakt, stan, hrabstwo, dorzecze, konkretną lokalizację pobrania, szerokość i długość geograficzną, unikalny identyfikator próbki skrzeli, unikalny identyfikator miejsca badania oraz datę pobrania zawartości skrzeli (Rycina 3). Należy nanieść unikalny identyfikator na każdym naczyniu zbiorczym, aby zapewnić dokładność rekordów danych podczas transportu.
	<ol>
		<li>Zrobić zdjęcie zewnętrznej prawej małżowiny małża w celu weryfikacji tożsamości, dołączając do zdjęcia probówkę z widocznym, czytelnym unikalnym identyfikatorem. Opcjonalnie można zebrać inne parametry abiotyczne i biotyczne, aby uzupełnić informacje o środowisku i społeczności, w której znaleziono małża (sugestie znajdują się na Rycynie 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Arkusz danych dotyczących ciąży małży USGS, tabela badawcza do rejestracji płci, gatunku i danych środowiskowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60244/60244fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przykład terenowego arkusza danych dotyczących ciąży. Dokładne raportowanie danych jest niezbędne, jeśli pobierana jest próbka skrzeli w celu uzyskania wiarygodnych informacji. Jest to przykład arkusza terenowego z minimalnym zestawem pól oraz dodatkowymi parametrami abiotycznymi, które należy zebrać wraz z każdą próbką skrzeli. Bardziej szczegółowe informacje znajdują się w kroku 4.1 protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60244/60244fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
3. Laboratoryjna ocena zawartości skrzeli
<ol>
	<li>Jeśli zawartość skrzeli znajduje się w probówce 1,5 mL, należy przenieść ją do szalki Petriego i wypełnić dno szalki wodą. Delikatnie zakręcić szalką Petriego, aby zebrać zawartość w jej centrum, co pozwoli na uzyskanie bardziej skoncentrowanego obrazu próbki. 
	UWAGA: Jeśli zawartość skrzeli przylega do ścianek probówki, może być konieczne przepłukanie probówki 1,5 mL za pomocą butelki z rozpylaczem lub pipety transferowej wypełnionej wodą.</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego pod mikroskopem stereoskopowym w celu oceny próbki. Jeśli to możliwe, należy wykonać zdjęcie próbki skrzeli pod mikroskopem i opisać je unikalnym identyfikatorem danej próbki.
	<ol>
		<li>Zarejestrować wyniki dotyczące tego, jakie stadia rozwojowe występują w każdej próbce skrzeli. Jako pomoc w charakterystyce każdego stadium rozwojowego należy wykorzystać Rysunek 4. W niektórych przypadkach samice mogą inkubować larwy na wielu stadiach rozwojowych; dlatego należy zgłosić każde stadium rozwojowe zaobserwowane w danej próbce (np. „EGG/DG/IMG/FDG”). Po ocenie zakonserwowanych glochidii należy przejść do sekcji 4. Jeśli zidentyfikowano w pełni rozwinięte glochidie, a do konserwacji nie użyto EtOH, należy przejść do kroku 3.3. 
		UWAGA: EGG – masy jaj; DG – rozwijające się glochidie; IMG – niedojrzałe glochidie; FDG – w pełni rozwinięte glochidie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Koncepcja równowagi statycznej na obrazie mikroskopowym; analiza strukturalna nasion; schemat; pokazana skala." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60244/60244fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Przedstawienia różnych stadiów rozwoju glochidiów w skrzela marsupialne.(A) Agregaty jaj (EGG) posiadają błonę, która powoduje ich skupianie się. Wewnątrz każdej błony jajowej znajduje się nieprzezroczysta sferyczna masa różnicujących się komórek. Nieprzezroczysta sfera może podzielić się na wiele mas sferycznych podczas wczesnego podziału komórkowego, jednak nadal należy ją zapisywać jako EGG, dopóki nie zostanie zaobserwowany wyraźny kształt dwudławkowy. (B) Niedojrzałe glochidia (IMG) mają wyraźną masę w kształcie dwudławkowym zawartą w błonie jajowej. (C) Rozwijające się glochidia (DG) mają wyraźny kształt dwudławkowy, brak błony jajowej oraz nieuporządkowaną tkankę wewnątrz, często o rozmytym wyglądzie. Rozwijające się glochidia (DG) nie reagują na ekspozycję na NaCl i podczas zapisywania danych są klasyfikowane jako „DG(T)”. (D) W pełni rozwinięte glochidia (FDG) mają charakterystyczny kształt dwudławkowy oraz wyraźną tkankę mięśnia przywodziciela, która umożliwia zamykanie się glochidiów. W pełni rozwinięte glochidia (FDG) są często obserwowane jako dwie otwarte muszle po utrwaleniu. Dwie otwarte muszle zazwyczaj gwałtownie się zamykają lub otwierają i zamykają pod wpływem NaCl i są klasyfikowane jako „FDG(T)”. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60244/60244fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="3">
	<li>Przeprowadź test z chlorkiem sodu (NaCl), aby dalej ocenić żywotność w pełni rozwiniętych glochidiów, dodając kryształ NaCl do jednej z kropel próbki skrzeli35. Żywe glochidia zareagują na NaCl, zamykając swoje zastawki z pozycji otwartej. Podczas zapisywania danych, glochidia przebadane solą należy oznaczać symbolem „(T)” na końcu nazwy. 
	UWAGA: W pełni rozwinięte glochidia mogą również aktywnie otwierać i zamykać zastawki bez kontaktu z NaCl.</li>
</ol>
4. Raportowanie do bazy danych
<ol>
	<li>Wejdź na stronę FMGA (http://arcg.is/089uee), która została opracowana przy użyciu programów online38,39,40. Strona FMGA zawiera link do formularza wprowadzania danych w wersji desktopowej oraz możliwość pobrania aplikacji na urządzenia mobilne. Aplikacja mobilna umożliwia wprowadzanie danych w terenie oraz automatyczną georeferencję41. 
	UWAGA: Kalendarz ciążności oraz inne grafiki związane z cyklem życiowym gatunków małż słodkowodnych można znaleźć również na panelu sterowania (Dashboard) FMGA.
	<ol>
		<li>Użyj aplikacji mobilnej lub strony desktopowej, aby zapisać wyniki w formularzu wprowadzania danych, korzystając z menu rozwijanych i pól tekstowych. W przypadku dużych, istniejących już zbiorów danych, skontaktuj się z autorami w celu uzyskania arkusza szablonu. Wprowadź zapisane dane w odpowiednich kolumnach, pamiętając, że każdy wpis, czyli wiersz w arkuszu, reprezentuje obserwacje próbki skrzeli jednego ciężarnego osobnika.</li>
		<li>Prześlij wyniki; zostaną one dodane do bazy danych FMGA po weryfikacji przez administratora, który może skontaktować się z osobą pobierającą próbki w celu uzyskania dodatkowych szczegółów lub zdjęć. 
		UWAGA: Po zweryfikowaniu i zestawieniu danych w bazie FMGA wszystkie kalendarze ciążności oraz inne interaktywne grafiki wyświetlane na panelu sterowania FMGA zostaną zaktualizowane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Znaczenie
Ochrona zagrożonych gatunków zależy od udanej rekrutacji w istniejących populacjach. W niektórych przypadkach może być konieczne sztuczne rozmnażanie w celu zwiększenia rekrutacji tych zagrożonych populacji. Wymaga to od naukowców informowania o czasie czynnego rozrodu każdego gatunku i ewentualnego stosowania różnych metodologii lub praktyk zarządzania w celu złagodzenia wpływu na rekrutację. Ze względu na to, że jesteśmy zagrożoną grupą organizmów, niezwykle ważne jest ustanowienie ustandaryzowanego i nieśmiercionośnego podejścia do badania nawyków reprodukcyjnych oraz zapewnienie platformy, na której można gromadzić i wizualizować dane w celu informowania społeczności naukowej o najbardziej aktualnych dostępnych informacjach. Badanie to zapewnia protokół krok po kroku, aby zapewnić podjęcie środków ostrożności, a zawartość skrzeli może być odpowiednio pobrana i oceniona z samic małży. Protokół ten został przetestowany pod kątem skutków śmiertelnych i nieletalnych, co pozwoliło badaczom i menedżerom na odpowiedzialne wdrożenie tej metodologii. Opracowaliśmy również zestaw narzędzi i aplikacji do zarządzania bazami danych, aby ułatwić kompilację informacji o ciężarze na publicznie dostępnym, przyjaznym dla użytkownika pulpicie nawigacyjnym. Badania nad epidemiologią, morfologią glochidii, historią życia, filogenetyką, rozmnażaniem i translokacjami mogą przynieść korzyści i wykorzystać to repozytorium informacji o ciężarności czasowej dla wszystkich gatunków małży słodkowodnych.
Samo to badanie potwierdziło wcześniejsze wyniki badań dotyczących nawyków reprodukcyjnych niektórych gatunków, ale także ujawniło nowe informacje na temat innych. Chociaż V. vibex został zebrany w mniejszej liczbie niż V. lienosa, podobieństwa między nimi można znaleźć na podstawie danych dotyczących grawitacji. Wydaje się, że oba gatunki Villosa wysiadują w pełni rozwinięte glochidia przez dużą część roku, co charakteryzuje je jako zimujący lęg. Jest to zgodne z wcześniejszymi badaniami na innych gatunkach Villosa 43,44,45. Wyniki tego badania sugerują, że H. australis można znaleźć w stanie ciężarnym od października i zimującym do czerwca, z wyjątkiem tego, że w grudniu nie stwierdzono żadnych schwytanych osobników. Wcześniej opublikowane badanie zidentyfikowało kongener H. altilis z okresem ciąży wynoszącym cztery miesiące, od marca do czerwca, 46,47. Odkrycie to ilustruje dłuższy okres ciąży niż wcześniej sądzono i ogólnie grupuje H. australis jako zimujący lęg. Ponieważ H. altilis i H. australis są gatunkami chronionymi federalnie, różne okresy lęgowe mogą mieć wpływ na decyzje dotyczące zarządzania w celu lepszej ochrony populacji w okresie aktywności reprodukcyjnej. Elliptio pullata stwierdzono w ciężarze EGG dopiero w maju i czerwcu, co odpowiada ich charakterystyce jako gatunku tachytycznego o bardzo krótkim okresie lęgowym 24,48,49,50. Ponieważ dane na temat gatunków Elliptio są opracowywane przy użyciu tego protokołu, szczegółowe informacje mogą sprawić, że wysiłki terenowe będą bardziej efektywne, gdy ukierunkowane są pewne etapy rozwoju glochidii, ponieważ glochidia występuje tylko przez kilka miesięcy w roku. Wnioskowanie na podstawie innych gatunków o mniejszych rozmiarach próby jest ograniczone, ale w miarę kompilowania danych do bazy danych, większe rozmiary próbek dadzą wgląd w zwyczaje reprodukcyjne dodatkowych gatunków małży.
Uwagi proceduralne
Wiadomo, że małże słodkowodne i ich glochidia są podatne na stresory antropogeniczne10,35. Podczas kontroli grawitacji zawory małży mogą nie być łatwe do otwarcia, a nieostrożne forsowanie zaworów może spowodować niezamierzone obrażenia i spowodować stres lub śmiertelność. Niektóre gatunki o delikatnych skorupach (np. Anodonta, Leptodea, Utterbackia itp.) i mniejsze osobniki mogą mieć bardzo delikatne muszle i słabe mięśnie przywodzicieli, które mogą się łatwo łamać i rozdzierać. Pobieranie próbek skrzelowych można uznać za czynnik stresogenny, jeśli obchodzenie się z nimi nie odbywa się w sposób odpowiedzialny i ostrożny. Poprzednie badanie wykazało, że obchodzenie się z małżami i narażenie ich z powietrza w okresie aktywności rozrodczej może powodować różne stresy fizjologiczne, w tym przedwczesne uwalnianie zawartości skrzeli34. Jednak badanie wykorzystujące podobną metodologię, jak opisana tutaj, wykazało, że obchodzenie się z ciężarnymi samicami małży podczas pobierania próbek skrzeli nie przerwało obecnego lęgu ani nie spowodowało przedwczesnego uwolnienia zarówno u krótko-, jak i długoterminowych gatunków lęgowych16. Ponadto podczas tego protokołu należy użyć sterylnej strzykawki, aby zapobiec niezamierzonej infekcji lub zanieczyszczeniu krzyżowemu podczas nakłuwania skrzeli wielu osób. Ponadto glochidia są delikatne, a lęgi mogą dojrzewać i być zestresowane, ale nie wydalane. Dojrzała glochidia w złym stanie zdrowia może spowodować, że mniej osób zareaguje na testy soli35. Dokonując rozróżnienia między DG(T) i FDG(T), ważne jest, aby przeprowadzić test soli na dużej próbie, sporządzić notatki na temat obserwacji, aby dokładnie zidentyfikować różnice między DG i FDG glochidia przy użyciu opisów zawartych w tym badaniu. Przy zachowaniu odpowiedniej ostrożności minimalny stres wywołany tą procedurą może pozwolić samicom małży na kontynuowanie wylęgu w naturalny sposób i zmniejszyć wpływ na rekrutację w populacji.
Dodatkowe dane mogą być rejestrowane w celu uzupełnienia bazy danych i zapewnienia szerokiego kontekstu dla zwyczajów rozrodczych małży słodkowodnych. Zaobserwowano, że niektóre gatunki (np. gatunki Fusconaia) mają skrzela o różnych kolorach w zależności od etapu rozwoju glochidii51. Podczas wstępnej kontroli ciężaru samicy opis koloru skrzeli może zostać włączony do zgłaszanych danych, aby umożliwić przeprowadzenie przyszłych badań. Również w tym momencie protokołu naukowcy mogą zauważyć, czy wylęgająca się samica została znaleziona w wylęgającej się glochidii w dwóch zewnętrznych skrzelach (ectobranchus), dwóch wewnętrznych skrzelach (endobranchus), czy we wszystkich czterech skrzelach (tetragennych)17. Informacje te mogą zostać dodane do FMGA i pomóc w wypełnieniu luk w danych dotyczących wylęgu dla każdego badanego gatunku. Warunki środowiskowe, w szczególności temperaturę wody, mogą być zbierane i rejestrowane w terenie w celu bardziej kompleksowej obserwacji stanu grawitacji i czasu występowania gatunków w różnych zakresach równoleżnikowych. Badania pokazują, że parametry środowiskowe, takie jak temperatura, fotoperiod, natężenie przepływu i dostępność pokarmu, mogą indukować zdarzenia reprodukcyjne u małży słodkowodnych 52,53,54,55,56. Dodatkowe pola mogą być dodawane do bazy danych w miarę ich składania, aby wspierać przyszłe badania nad czynnikami abiotycznymi wpływającymi na grawitację. Modyfikacja chwytania-znaku-ponownego chwytania, wzorowana na naszym badaniu, może być również dodana do tego protokołu, co pozwoliłoby naukowcom monitorować nawyki reprodukcyjne określonego małża i ujawnić informacje o wielu lęgach rocznie.
Dokładność informacji w FMGA zależy od źródła. Na przykład błędna identyfikacja małży słodkowodnych jest powszechna ze względu na to, że wiele gatunków ma podobne cechy zewnętrzne, które utrudniają rozróżnienie gatunków57. Próbka skrzeli od błędnie zidentyfikowanego osobnika może powodować zamieszanie i fałszywe informacje na temat okresu lęgowego gatunku. Jeśli pobierana jest próbka skrzeli, należy zrobić zdjęcia wnętrza obu zaworów (jeśli dana osoba nie żyje), na zewnątrz prawej zastawki oraz umbo (zawias, w którym łączą się dwie zastawki) i przesłać je wraz z danymi dotyczącymi grawitacji za pośrednictwem strony komputerowej lub aplikacji mobilnej. Mile widziane są również zdjęcia zawartości skrzeli. W formularzach zgłoszeniowych znajduje się rozwijane menu, w którym zbieracz może wskazać swój poziom pewności co do identyfikacji gatunków. Zanim zapis zostanie zatwierdzony, informacje te zostaną wzięte pod uwagę podczas sprawdzania identyfikacji kolektora pod kątem prawdopodobnego rozkładu itp. Ze względu na wysoki stopień wewnątrzgatunkowej zmienności morfologicznej u gatunków Unionidae, zachęca się do pobierania próbek tkanek i może być konieczne w celu ułatwienia identyfikacji molekularnej.
Implikacje na przyszłość
Jako metoda nieśmiercionośna, protokół ten może być stosowany zarówno do gatunków pospolitych, jak i zagrożonych. Kalendarze grawitacji dla zagrożonych gatunków mogą pomóc osobom zarządzającym ochroną przyrody zaangażowanym w prawodawstwo dotyczące zagrożonych gatunków i planowanie odbudowy, dostarczając informacji na temat okresów, w których gatunki są aktywne reprodukcyjnie. Agencje stanowe i federalne, które zarządzają zagrożonymi gatunkami, mogą lepiej doradzać w przydzielaniu zezwoleń na okresy, w których gatunek nie jest wrażliwy i nie rozmnaża się, a nawet ograniczyć odławianie ryb żywicielskich w czasie, gdy małże wysiadują w pełni rozwinięte glochidia. Ponadto badania terenowe mogą być ukierunkowane na gatunki w okresach nierozrodczych, aby zminimalizować wpływ na procesy rekrutacji. Publicznie dostępna baza danych FMGA stanowi narzędzie dla badaczy i kadry kierowniczej w celu uzyskania ważnych informacji na temat rozrodu dowolnych docelowych gatunków małży słodkowodnych. Baza danych uwypukli również luki w danych, zachęcając do dalszych badań nad specyficznymi dla danego gatunku wzorcami lęgowymi. Ponieważ zrozumienie wzorca reprodukcyjnego gatunku pozwala na podejmowanie odpowiednich decyzji dotyczących zarządzania, mamy nadzieję, że nasz protokół i baza danych ułatwią przyszłe badania, ochronę i odbudowę małży słodkowodnych.

Przetrwanie populacji w systemach słodkowodnych zależy od powodzenia reprodukcji i rekrutacji. W przypadku organizmów pasożytniczych identyfikacja zawiłości cyklu życiowego (np. etapów rozwoju larw i strategii przyciągania żywiciela) może dać wgląd w nawyki reprodukcyjne organizmu i krytyczne procesy, które wpływają na rekrutację. Takie informacje stają się ważne, gdy gatunki są zagrożone i potrzebna jest skuteczna rekrutacja do utrzymania pozostałych populacji lub jeśli odbudowa wymaga użycia rozmnażania w niewoli w celu odtworzenia wymarłych populacji.
Małże słodkowodne (Bivalvia: Unionida) są uważane za jedną z najbardziej zagrożonych grup organizmów na świecie, a zestawienie specyficznych dla danego gatunku nawyków reprodukcyjnych mogłoby pomóc w wysiłkach badawczych1,2,3,4,5. Z ponad 800 obecnie uznanymi gatunkami rozmieszczonymi na całym świecie, małże słodkowodne mają punkty największej różnorodności w Ameryce Północnej i Południowej oraz południowo-wschodniej Azji, ale podstawowe informacje o historii życia są nieznane dla wielu gatunków2,5,6,7. Rodziny w tym rzędzie charakteryzują się pasożytniczymi stadiami larwalnymi, które przechodzą metamorfozę w wolno żyjące młode osobniki podczas przyczepiania do żywiciela7,8. Ten unikalny etap historii życia przyczynia się do różnorodności biologicznej w systemach słodkowodnych, które obecnie znajdują się w kryzysie9. Wysoki poziom zagrożenia można przypisać wielu zagrożeniom antropogenicznym, w tym zanieczyszczeniu dróg wodnych, zmianom i niszczeniu siedlisk, zmniejszeniu liczebności i różnorodności ryb żywicielskich oraz wprowadzeniu gatunków inwazyjnych1,10. Jako filtry bentosowe, małże zakopują się w podłożu i są podatne na zanieczyszczenia i zanieczyszczenia, które spływają do zlewni11. Odbudowa gatunków małży jest istotna, ponieważ zapewniają one szeroką gamę usług ekosystemowych, w tym sekwestrację dwutlenku węgla, źródło pożywienia i oczyszczanie wody przez filtrowanie przez karmienie11. Ponadto stwierdzono, że małże wskazują na zdrowie ekosystemu, promują różnorodność biologiczną, a co za tym idzie, zwiększają odporność ekosystemu12.
Wiele badań nad małżami słodkowodnymi skupiało się na badaniu wymagań wczesnej historii życia, aby lepiej informować o ocenie stanu gatunków i strategiach zarządzania. Rodziny małży słodkowodnych istotne dla tego badania (np. Hyriidae, Margaritiferidae, Unionidae) mają unikalną strategię historii życia, w której samice wysiadują larwy (glochidia) w skrzelach torbaczy8. Za pomocą różnych strategii samica omułka wydala dojrzałe glochidia ze skrzeli torbaczy, aby pasożytować na żywicielu kręgowców za pomocą glochidia13. Badania nad rozwojem gałki żółtej w obrębie skrzeli zostały zmodyfikowane na podstawie techniki wykorzystującej strzykawki podskórne do pobierania próbek płynu gonadowego z żywych małży i oceny produkcji gamet14,15,16. Gdy naukowcy zweryfikowali tę nieśmiertelną metodologię pobierania próbek gonad, została ona zaadaptowana do pobierania próbek skrzeli torbaczy w celu oceny rozwoju czerwiu15,16. Rozwój lęgu może być wykorzystany do rozszyfrowania powiązań filogenetycznych, ponieważ niektóre gatunki małży mogą wysiadywać glochidia tylko w dwóch zewnętrznych skrzelach (ectobranchus), tylko w dwóch wewnętrznych skrzelach (endobranchus) lub we wszystkich czterech skrzelach (tetrabranchus), ale ta cecha nie jest znana dla każdego gatunku17. Wzorce lęgowe były wcześniej używane do klasyfikowania gatunków małży według tego, czy samice małży wysiadują glochidię zimą (brazytyczny), czy przez krótki okres w lecie (tachytyczny)18. Nadmierne zimowanie lęgów małży zostało potwierdzone badaniem cyklu rozrodczego Anodonta19. Jednak podstawowa biologia reprodukcyjna była badana dokładniej przez lata i odkryła, że ta dychotomia jest ogólnym uogólnieniem, a okresy lęgowe niektórych gatunków są znacznie bardziej złożone, niż pierwotnie zakładano20,21. Na przykład zaobserwowano gatunki z rodzaju Hyridella (rodzina Hyriidae), Glebula i Elliptio (rodzina Unionidae) z ponad trzema lęgami w sezonie lęgowym22,23,24. Złożoność nawyków reprodukcyjnych specyficznych dla gatunku, a czasem nawet dla populacji20, doprowadziła do luki w wiedzy na temat czasu i czasu trwania lęgu oraz liczby lęgów, które samica małża może wyprodukować.
Chociaż strzykawki podskórne były używane do ekstrakcji zawartości skrzeli, raportowanie wyników jest skomplikowane ze względu na brak standaryzacji zapewniającej porównywalne wyniki we wszystkich badaniach. Wcześniej u Unionidae zidentyfikowano cztery etapy rozwojowe glochidii (tj. jajo, zarodek, niedojrzały, w pełni rozwinięty) ale nie zostały one przyjęte do standardowej procedury16,25,26. Inne badania z udziałem przedstawicieli Margaritiferidae zastąpiły klasyfikację "niedojrzałych glochidii" klasyfikacją "rozwijających się glochidii", co prowadzi do potencjalnego zamieszania27,28. Brak spójności w charakterystyce różnych etapów rozwoju larwalnego sprawił, że wielu badaczy ogólnie opisuje samice lęgowe jako "ciężarne", co nie obejmuje zawiłości rozwoju larw. Badania historii życia przeprowadzające próby z rybami żywicielami priorytetowo potraktowały zapotrzebowanie na ciężarne samice z w pełni rozwiniętymi glochidiami, ale informacje te są rozproszone w opublikowanej i nieopublikowanej literaturze29,30. Obecnie brakuje danych na temat nawyków reprodukcyjnych wielu gatunków małży, w tym czasu przejścia między jajem, niedojrzałymi glochidiami i w pełni rozwiniętymi glochidiami gotowymi do przyczepienia się do żywicieli. W przypadku większości gatunków nie jest jasne, jak długo samice wysiadują glochidię i jak szybko w pełni rozwijają się zapłodnione jaja. Luki w wiedzy są często większe w przypadku gatunków budzących obawy o ochronę, co stwarza potrzebę ustandaryzowanej metody ekstrakcji zawartości skrzeli, która została przetestowana pod kątem skutków nieśmiertelnych i może być promowana w społeczności naukowej w celu uzupełnienia głównych metodologii gromadzenia danych, nie stanowiąc zagrożenia dla chronionych populacji24,31,32.
To badanie miało trzy cele: 1) sformalizować technikę pobierania próbek skrzeli i przetestować ją pod kątem śmiertelnych i nieśmiertelnych skutków dla samic małży in situ, 2) scharakteryzować różne etapy rozwoju glochidialnego i opisać znormalizowaną metodę identyfikacji i raportowania różnych stadiów larwalnych, oraz 3) stworzyć publiczne repozytorium dla zebranych danych. Badania terenowe, długoterminowe projekty monitoringu i kolekcje muzealne stanowią szansę na wdrożenie opisanego tu protokołu i zebranie dodatkowych danych dla szerszego grona zainteresowań. Sformalizowany protokół zawiera wizualizacje i opisy postaci w celu rozróżnienia każdego etapu rozwoju larw. Poprzez standaryzację kategorii, zebrane wyniki można porównać między wszystkimi występowaniami i gatunkami. Po zebraniu danych wszystkie mogą zostać przesłane do Almanachu Grawitacji Małży Słodkowodnych (FMGA), który jest bazą danych zawierającą informacje o grawitacji zebrane przy użyciu tego protokołu. Produkt końcowy do przechowywania i kompilowania wszystkich zebranych informacji o grawitacji zapewni narzędzie badawcze, które ułatwi przyszłe badania, ochronę i wysiłki związane z odzyskiwaniem. Włączenie tej metodologii do różnych projektów dotyczących omułków i przedłożenie danych do FMGA poszerzyłoby zakres wiedzy na temat stanu ciężkości gatunków małży w ciągu roku. Ze względu na to, że jest to grupa organizmów wysoce zagrożonych, protokół ten i wynikająca z niego baza danych na temat zwyczajów reprodukcyjnych małży słodkowodnych mają zasadnicze znaczenie dla zrozumienia dynamiki populacji i ułatwienia ochrony tych gatunków.

<table><tbody><tr><td>Probówki wirówkowe zatrzaskowe 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td>Probówki zatrzaskowe są ważne w terenie, aby luźna nakrętka nie została zgubiona.</td></tr><tr><td>Igła 20 G na jednorazowej strzykawce 10 ml</td><td>Exelint International</td><td>26255</td><td>sterylna jednorazowa strzykawka 10 ml z igłą Model: 10 ml końcówka Luer Lock W / 20G X 1 1/2 "</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>długopis do znakowania</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-379-4</td><td>Tego właśnie użyliśmy, ale wystarczy każdy marker, który może pisać na małych plastikowych rurkach. Ten jest dość etanolowy i wodoodporny.</td></tr><tr><td>Etanol klasy molekularnej</td><td>dowolny</td><td></td><td>dowolny Potrzebne do zachowania zawartości skrzeli. Niedenaturowane 95% jest potrzebne do prac genetycznych, 70% jest potrzebne do prac związanych z obrazowaniem SEM.</td></tr><tr><td>Papier</td><td></td><td></td><td>dowolny Potrzebne do zapisania informacji o pobranych próbkach.</td></tr><tr><td>Długopis/ołówek</td><td>dowolny</td><td></td><td>Jeśli jesteś w terenie, lepiej pisać ołówkiem na wodoodpornym papierze, aby się nie rozmazywał. Jeśli jesteś w muzeum/laboratorium, każde przybory do pisania są w porządku.</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>DWK Nauki Przyrodnicze (Kimble)</td><td>23000-9050</td><td>To jest to, czego używaliśmy, ale każda dostępna szalka Petriego jest w porządku. Przyjemniej jest mieć wyższe ściany na wypadek, gdyby zużyto zbyt dużo wody.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>dowolny</td><td></td><td>dowolny potrzebny do testu NaCl na reaktywne glochidie. Zachowane próbki tego nie wymagają.</td></tr><tr><td>Wziernik</td><td>dowolny</td><td></td><td>Potrzebne tylko wtedy, gdy potrzebujesz pomocy w otwieraniu zaworów żywego małża.</td></tr><tr><td>Sterylna woda</td><td></td><td>dowolna</td><td>Dodano do próbek skrzelowych, które należy ocenić pod kątem reaktywności w ciągu 24 godzin od pobrania.</td></tr><tr><td>Super klej</td><td>Gorilla</td><td>Gorilla super glue gel</td><td>Służy do nakładania znaczników i jest potrzebny tylko w przypadku przeprowadzania badania przechwytywania, znakowania i ponownego przechwytywania.</td></tr><tr><td>Tags:</td><td>Hallprint</td>, <td>FPN 8x4</td>: <td>Potrzebne tylko w przypadku przeprowadzania badania przechwytywania, znakowania i ponownego przechwytywania.</td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Thermo Scientific Samco</td><td>225</td><td>To jest to, czego używamy, ale każda pipeta transferowa lub butelka ze spryskiwaczem ma zastosowanie.</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>dowolna</td><td></td><td>Potrzebne do przenoszenia kryształów NaCl do testu soli. Zachowane próbki tego nie wymagają.</td></tr><tr><td>Wodoodporny papier</td><td>RainWriter</td><td>dowolny</td><td>Potrzebny tylko do wykonywania prac w terenie. Pozwala to na rejestrowanie informacji o każdej pojedynczej zawartości skrzeli, z której pobierana jest zawartość.</td></tr><tr><td>Drewniany pick</td><td></td><td></td><td>dowolny Potrzebny tylko wtedy, gdy potrzebujesz pomocy w otwieraniu zaworów żywego małża.</td></tr></tbody></table>

standaryzacja nieletalnej metody charakterystyki stanu rozrodczego i rozwoju larwalnego małży słodkowodnych (bivalvia: unionida)

Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels (Bivalvia: Unionida)

Aktywne monitorowanie czasu, rozwoju i wzorców reprodukcyjnych zagrożonych gatunków jest kluczowe przy zarządzaniu odbudową populacji. Małże słodkowodne są jednymi z najbardziej zagrożonych organizmów na świecie, ale w przypadku wielu gatunków nadal brakuje informacji na temat wczesnego rozwoju larw (glochidiów) i okresów lęgowych. Wcześniejsze badania koncentrowały się na złożonym etapie historii życia, kiedy samice małży są gotowe do pasożytowania na rybach żywicielach, ale niewiele badań koncentrowało się na okresie lęgowym i czasie rozwoju larw. Opisany tutaj protokół pozwala naukowcom na nieśmiertelną ocenę stanu ciężkości samic małży. Wyniki tego badania pokazują, że metoda ta nie wpływa na zdolność samic małży do pozostawania w ciężarze lub ponownego stawania się ciężarem po pobraniu próbek. Zaletą tej metody może być jej stosowanie w przypadku gatunków zagrożonych wyginięciem lub zagrożonych wyginięciem lub innych populacji o wysokim stopniu ochrony. Protokół ten może być dostosowany do stosowania zarówno na osobnikach zakonserwowanych, jak i żywych i został przetestowany na różnych gatunkach małży. Udostępniona baza danych jest repozytorium szerokich informacji na temat czasu powstawania nawyków reprodukcyjnych i ułatwi przyszłe badania, ochronę i wysiłki na rzecz odbudowy małży słodkowodnych.

Protokół ten został zastosowany podczas badania metodą odłowu, znakowania i ponownego odłowu, w ramach którego monitorowano populację małży słodkowodnych na odcinku 750 m2 potoku Bruce Creek (hrabstwo Walton, Floryda) od stycznia 2015 do grudnia 2015 roku. Próbkowanie terenowe planowano przeprowadzać co cztery tygodnie; jednak ze względu na wezbrania wód, próbkowania nie przeprowadzono w kwietniu ani we wrześniu 2015 roku. W badaniach terenowych oraz pobieraniu próbek skrzeli pomogły agencje stanowe i federalne, w tym U.S. Geological Survey, U.S. Fish and Wildlife Service oraz Florida Fish and Wildlife Conservation Commission. Każda napotkana podczas badania samica z jajami została poddana terenowemu pobraniu zawartości skrzeli zgodnie z powyższym protokołem, oznakowana (patrz Tabela materiałów) i umieszczona z powrotem w substracie rzecznym. Próbki skrzeli przechowywano w 95% EtOH i przetransportowano do laboratorium Wetland and Aquatic Research Center w U.S. Geological Survey w celu oceny zawartości skrzeli.
Poprzez znakowanie samic i ich ponowne odławianie w odstępach miesięcznych przez cały rok, oceniliśmy zarówno letalne, jak i nieletalne skutki protokołu pobierania próbek skrzeli u łącznie 90 osobników. W trakcie niniejszego badania ponownie odłowiono siedem następujących gatunków: Elliptio pullata (n = 5), Fusconaia burkei (n = 1), Hamiota australis (n = 19), Obovaria choctawensis (n = 1), Strophitus williamsi (n = 1), Villosa lienosa (n = 60) oraz Villosa vibex (n = 3). Nasze próbkowanie objęło osobniki o całkowitej długości od 24 mm do 80 mm oraz dwa gatunki (F. burkei i H. australis) chronione przez amerykańską ustawę o gatunkach zagrożonych (Endangered Species Act). Wszystkie dane wykorzystane w tym badaniu są publicznie dostępne; udostępniliśmy nasz zbiór danych w serwisie ScienceBase (https://doi.org/10.5066/P90VU8EN)42.
Przeżywalność oceniano na podstawie liczby osobników odłowionych ponownie żywych po pobraniu próbki skrzeli. W trakcie badania zaobserwowano wysoką przeżywalność (97%), przy czym odnotowano niektóre przypadki śmiertelności, które na podstawie obserwacji w terenie mogły wynikać z drapieżnictwa. Wyniki wykazały, że około 51% osobników (46 z 90) pozostawało w stanie ciążowym pomiędzy kolejnymi próbkowaniami. Kolejne 10% osobników (9 z 90) było początkowo w stanie ciążowym, podczas ponownego odłowu nie było w stanie ciążowym, a następnie ponownie stwierdzono u nich stan ciążowy. Około 39% osobników (35 z 90) w niniejszym badaniu było w stanie ciążowym w momencie pobrania próbki skrzeli, lecz przy ponownych odłowach w ciągu roku nigdy więcej nie stwierdzono u nich stanu ciążowego. Wyniki wskazują, że opisany tutaj protokół nie jest letalny ani subletalny i nie zakłóca w istotnym stopniu aktualnego okresu inkubacji po pobraniu próbki skrzeli.
Mimo że wielkości prób w niniejszym badaniu są nierówne dla poszczególnych gatunków, uzyskane wyniki podkreślają korzystne i praktyczne zastosowania tego protokołu. Kalendarz ciąż dla V. lienosa ilustruje, że ciężarne samice inkubujące FDG występowały w niemal każdym miesiącu roku z wyjątkiem sierpnia, kiedy stwierdzono obecność wyłącznie samic inkubujących EGG (Rycina 5A). Samica H. australis stwierdzono, że nie były ciążąwe (NG) w lipcu, sierpniu i grudniu. Większa proporcja samic wysiedziała jaja (FDG) w styczniu i lutym, lecz występowały one również w październiku i listopadzie (Rycina 5B). Nie stwierdzono osobników *E. pullata* stwierdzono obecność osobników inkubujących FDG, mimo że samice inkubowały EGG od maja do czerwca, a w czerwcu odnotowano jedną samicę ciążną (GFR) (Rysunek 5C). Jedyna ciążowa F. burkei samica została odnaleziona w stanie GFR w czerwcu i ponownie odłowiona w stanie NG w lipcu. Ta sama O. choctawensis osobnika pobrano FDG w lutym i ponownie odłowiono NG w lipcu. Tylko jeden *S. williamsi* znaleziono i odłowiono ponownie trzy razy. Samicę tę znaleziono w stanie FDG w marcu, NG w maju, GFR w czerwcu oraz EGG w sierpniu (Rycina 5C). Ciężarne samice V. vibex inkubujące FDG odnaleziono między lutym a czerwcem (Rycina 5C).
<img alt="Wykresy słupkowe stanu ciążności; Villosa lienosa, Hamiota australis; trendy miesięcznych danych z próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60244/60244fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Wyniki badania w Bruce Creek, FL przedstawione w formacie kalendarza ciążności.(A) Kalendarz ciążności dla osobników schwytanych/ponownie schwytanych Villosa lienosa. (B) Kalendarz ciążności dla osobników schwytanych/ponownie schwytanych Hamiota australis. (C) Kalendarze ciążności dla wszystkich gatunków, dla których pobrano próbki od mniej niż 10 osobników. Oś y zawiera skróty miesięcy: styczeń (Ja), luty (F), marzec (Mr), maj (My), czerwiec (Jn), lipiec (Jl), sierpień (A), październik (O), listopad (N) i grudzień (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60244/60244fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Ochrona małży słodkowodnych zależy od monitorowania wzorców i procesów reprodukcyjnych gatunków. Badanie to standaryzuje nieśmiertelny protokół pobierania próbek zawartości skrzeli, charakteryzowania rozwoju larwalnego i zapewnienia cyfrowego repozytorium zebranych danych. Ten pakiet protokołów i baz danych będzie ważnym narzędziem dla badaczy małży w odbudowie zagrożonych gatunków.

Standaryzacja nieletalnej metody charakterystyki stanu rozrodczego i rozwoju larwalnego małży słodkowodnych (Bivalvia: Unionida)

Actively monitoring the timing, development, and reproductive patterns of endangered species is critical when managing for population recovery. Freshwater ...

Nasz protokół standaryzuje metodologie pobierania próbek skrzeli małży słodkowodnych i charakteryzowania różnych etapów rozwoju larw, zapewniając jednocześnie bazę danych online do przesyłania danych i eksploracji Almanachu Gravidity. Technika ta nie jest śmiertelna i nie wpływa znacząco na zdolność samic małży do pozostawania w ciężarze po pobraniu próbek ze skrzeli, dlatego metoda może być stosowana zarówno do gatunków pospolitych, jak i chronionych. Metodologię tę można zastosować do organizmów scharakteryzowanych w rodzinach Bivalvia Hyriidae, Margaritiferidae i Unionidae, które występują w ekosystemach słodkowodnych na każdym kontynencie z wyjątkiem Antarktydy.Ważne jest, aby ostrożnie otwierać małże, zbierać informacje o lokalizacji i upewnić się, że dane są zbierane prawidłowo. Jeśli identyfikacja jest wątpliwa, należy zrobić zdjęcia i skontaktować się z odpowiednimi ekspertami. Zacznij od zebrania żywych małży z pola za pomocą dotykowych metod wizualnych.Oceń ciężarność samicy poprzez oględziny w trakcie lub po pobraniu, delikatnie otwierając zawory na tyle, aby zajrzeć do środka i zobaczyć, czy skrzela są napompowane. W przypadku korzystania z zachowanego egzemplarza z muzeum należy przeprowadzić oględziny, otwierając zawory i sprawdzając skrzela. Aby pobrać próbkę zawartości skrzeli, należy przygotować 1,5-mililitrową plastikową probówkę do pobierania mikrowirówek z około jednym mililitrem wody lub etanolu, w zależności od tego, jak szybko nastąpi ocena.Odwiń sterylną igłę ze skośną końcówką w rozmiarze 30 na 10-mililitrowej strzykawce, odkręć nakrętkę, aby odsłonić igłę, i popchnij uchwyt strzykawki w dół, tak aby korek znalazł się na linii zera mililitrów. Podnieś ciężarną samicę i delikatnie podważ dwa zawory za pomocą czubków kciuków. Użyj końcówki igły, aby delikatnie wbić się w pojedynczą rurkę wodną napompowanego skrzela torbacza, a następnie delikatnie zgarnij zawartość skrzeli za pomocą ściętej końcówki igły.Przechowuj je w przygotowanej probówce do mikrowirówki do późniejszej oceny. Rejestruje w arkuszu danych istotne informacje, takie jak identyfikacja rodzaju-gatunku, informacje o miejscu zbierania i status grawidencji, a także umieszcza niepowtarzalny identyfikator na każdym statku pobierania danych, aby zapewnić dokładny zapis danych podczas transportu. Odpowiednio ustaw małża, aby sfotografować prawy zawór w celu potwierdzenia tożsamości, połóż go i zrób zdjęcie, upewniając się, że na zdjęciu znajduje się oznaczona probówka z próbką.Aby ocenić zawartość skrzeli, przenieś je na szalkę Petriego i napełnij dno naczynia wodą. Delikatnie obracaj naczyniem, aby zebrać zawartość w środku, aby uzyskać bardziej skoncentrowany widok próbki. Umieścić szalkę Petriego pod mikroskopem preparacyjnym w celu oceny próbki i, jeśli to możliwe, wykonać zdjęcie próbki pod mikroskopem.Zanotować wyniki, w jakich stadiach rozwojowych występują w każdej próbce skrzeli. Jeżeli samice są larwami wysiadującymi w wielu stadiach rozwojowych, należy podać każdy etap rozwojowy zaobserwowany w danej próbce. Jeśli zidentyfikowano w pełni rozwinięte glochidie, a etanol nie został użyty do konserwacji, należy ocenić ich żywotność, dodając kryształ chlorku sodu do podzbioru kropli próbki skrzeli.Żywotne glochidia zareagują, otwierając i zamykając swoje zawory lub po prostu zamykając je z pozycji otwartej. Należy podać wszystkie glochidie badane pod wpływem soli z literą T na końcu oznaczenia, gdy rejestrowane są dane. Aby zgłosić dane, wejdź na stronę FMGA lub aplikację mobilną i zapisz wyniki w formularzu wprowadzania danych za pomocą menu rozwijanych i pól wprowadzania tekstu.W przypadku dużych, istniejących zestawów danych skontaktuj się z autorami arkusza kalkulacyjnego szablonu. Wprowadź zarejestrowane dane pod odpowiednimi nagłówkami kolumn, pamiętając, że każdy wiersz w arkuszu kalkulacyjnym reprezentuje obserwacje próbki skrzeli od jednego ciężarnego osobnika, a następnie prześlij wyniki, a zostaną one dodane do bazy danych FMGA po zatwierdzeniu przez administratora, który może skontaktować się z kolektorem w celu uzyskania dalszych szczegółów lub zdjęć. Baza danych FMGA kompiluje wszystkie przesłane informacje i umożliwia użytkownikowi wizualizację danych dotyczących ciężaru czasowego dla wszystkich gatunków w bazie danych.Almanach Grawitacji Małży Słodkowodnych jest narzędziem badawczym zaprojektowanym w celu standaryzacji zbierania danych o grawitacji, jednocześnie ułatwiając przyszłe badania, ochronę i wysiłki na rzecz odbudowy. Protokół pobierania próbek skrzeli oceniano poprzez znakowanie i ponowne chwytanie samic w odstępach miesięcznych przez cały rok. Chociaż wielkość prób w badaniu jest nierówna u różnych gatunków, wyniki podkreślają korzystne i praktyczne zastosowania tego protokołu.Kalendarz ciężaru dla Villosa lienosa pokazuje, że ciężarne samice wysiadujące w pełni rozwinięte glochidia znajdowano prawie w każdym miesiącu roku z wyjątkiem sierpnia, kiedy znaleziono tylko samice wysiadujące jaja. Samice Hamiota australis zostały znalezione bez ciężaru w lipcu, sierpniu i grudniu. Większy odsetek samic wysiadywał w pełni rozwinięte glochidia w styczniu i lutym oraz w październiku i listopadzie.Nie znaleziono osobników Elliptio pullata wysiadujących w pełni rozwinięte glochidia, chociaż samice wysiadywały jaja od maja do czerwca. Tylko jedna samica Strophitus williamsi została odnaleziona i schwytana trzy razy. Samica ta została znaleziona z w pełni rozwiniętym glochidią w marcu, bez ciężaru w maju, zgłoszono ciężar w czerwcu i jaja wysiadujące w sierpniu.Między lutym a czerwcem znaleziono ciężarne samice Villosa vibex wysiadujące w pełni rozwinięte glochidia. Małże słodkowodne to grupa organizmów bardzo zagrożonych wyginięciem. Metodologia ta jest ważna, ponieważ zapewnia nieśmiertelny sposób oceny cech reprodukcyjnych zagrożonych gatunków.Bardzo ważne jest, aby obchodzić się z małżami ostrożnie. Warunki środowiskowe, takie jak temperatura wody i przepływy strumieni, można mierzyć w terenie, aby określić, jakie warunki wywołują tarło i rozwój larw małży słodkowodnych. Zestawienie danych dotyczących ciężaru czasowego dla wszystkich gatunków małży słodkowodnych może pomóc w badaniach epidemiologicznych, morfologii glochidiów, historii życia, filogenetyki, rozmnażania i translokacji.

standardizing-non-lethal-method-for-characterizing-reproductive

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wywołane przez rybołówstwo zmiany w eksploatowanych połowach skorupiaków, takie jak amerykańskie połowy homarów, mogą potencjalnie wpłynąć na ich dynamikę reprodukcyjną, prowadząc do zmniejszenia sukcesu godowego. Celem tego badania było opracowanie nieinwazyjnej metody ustalania sukcesu godowego samic homarów, które mogą być fizjologicznie lub funkcjonalnie dojrzałe.

Nieinwazyjna metoda określania in situ udanego krycia u samic homarów amerykańskich (Homarus americanus)

Ten protokół wideo demonstruje metodę badania wpływu płynu nasiennego na ślimaki, przy użyciu hermafrodytycznego ślimaka słodkowodnego Lymnaea stagnalis.

Wpływ produktów z męskich gruczołów dodatkowych na składanie jaj u ślimaków

Celem tego protokołu jest dostarczenie użytkownikom zestawu metod do wysokoprzepustowej dekapsulacji zarodków i larw Lymnaea stagnalis w ramach przygotowań do hybrydyzacji in situ całego wierzchowca oraz do późniejszych zabiegów przed i po hybrydyzacji.

Cała metoda hybrydyzacji in situ dla ślimaka Lymnaea stagnalis

Wskazania biologiczne in situ umożliwiają określenie przydatności środowiska dla zagrożonych gatunków małży. Opisujemy dwie metody oparte na narażeniu młodocianych małży perłowodnych w klatkach na oligotroficzne siedliska rzeczne. Obie metody są stosowane w wariantach dla środowisk wód otwartych i hiporeicznych.

Badanie bioindykacyjne przydatności środowiska strumienia dla młodych perłoródków słodkowodnych przy użyciu metod ekspozycji in situ

Urządzenie przepływowe do wykorzystania metody biodepozycji do ilościowego określania filtracji i żerowania małży zostało zmodyfikowane do użytku na statku. Dwuwymiarowy stół przegubowy zbudowany wokół urządzenia izoluje aparaturę od ruchu łodzi, umożliwiając w ten sposób dokładne ilościowe określenie zmiennych filtracji małży w morskich zakładach akwakultury skorupiaków.

Projektowanie i stosowanie aparatury do ilościowego oznaczania zawiesiny małży zasilających morze

Artykuł proponuje nowatorską metodę in vitro do szybkiej i czułej oceny toksyczności i ekotoksyczności zanieczyszczeń, w oparciu o ruchliwość hemocytów Mytilus galloprovincialis. Metoda ta ma na celu przyczynienie się do opracowania bardziej etycznych i czułych badań narażenia toksykologicznego i ekotoksykologicznego.

Test toksykologiczny i ekotoksykologiczny oparty na ruchliwości hemocytów omułka (Mytilus galloprovincialis)

Test ELISA można łatwo przekształcić w analizę Luminex xMAP, a dzięki zaletom multipleksowania można jednocześnie przesiewowo badać kilka przeciwciał w celu zidentyfikowania optymalnej pary przeciwciał, co prowadzi do zwiększenia czułości i zakresu dynamicznego przy jednoczesnym obniżeniu kosztów analizy.

Konwersja testu ELISA typu capture na test Luminex xMAP z wykorzystaniem metody wielipleksowego przesiewania przeciwciał

Los pojedynczej komórki embrionalnej może być determinowany przez cząsteczki dziedziczne i/lub sygnały pochodzące od sąsiednich komórek. Wykorzystując mapy losów embrionu Xenopus w stadium podziałów, można zidentyfikować pojedyncze blastomery w celu ich izolowanej hodowli, aby ocenić wpływ cząsteczek dziedzicznych w stosunku do oddziaływań międzykomórkowych.

Eksplanty blastomerów do badania determinacji losów komórek podczas rozwoju embrionalnego

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę hodowli zarazków zębów w wycinkach żuchwy za pomocą rozdrabniacza tkanek. Metoda ta pozwala na unikalny dostęp do zęba podczas rozwoju, zapewniając doskonałą możliwość manipulacji i śledzenia linii, niedostępną przy użyciu bardziej tradycyjnych metod hodowli.

Metoda hodowli Slice do śledzenia rozwoju zarodków zębów w hodowli eksplantatów

Ten protokół opisuje technikę przenoszenia barwnika metodą skalpela i fluorescencyjnego, która mierzy komunikację międzykomórkową poprzez kanały połączeń szczelinowych. Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym jest głównym procesem komórkowym, w którym utrzymywana jest homeostaza tkanek, a zakłócenie tej sygnalizacji komórkowej ma niekorzystne skutki zdrowotne.

Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym: funkcjonalny biomarker do oceny niekorzystnych skutków toksyn i toksyn oraz korzyści zdrowotnych produktów naturalnych

Poznaj nieletalną metodę pobierania próbek z skrzeli samic małży słodkowodnych i charakteryzowania larw. Technika ta wspiera ochronę zagrożonych gatunków z rodzin Hyriidae, Margaritiferidae i Unionidae.

Standaryzacja nieletalnej metody charakterystyki stanu rozrodczego i rozwoju larwalnego małży słodkowodnych (Bivalvia: Unionida) (Wideo) | JoVE Journal

Standaryzacja nieletalnej metody charakterystyki stanu rozrodczego i rozwoju larwalnego małży słodkowodnych (Bivalvia: Unionida)

Przeglądaj więcej filmów