Name: Witryfikacja kropel masowych w celu pierwotnego zachowania hepatocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Poznaj metodę witryfikacji kropel masowych do zachowania hepatocytów szczura z użyciem niskich stężeń środków krioprotekcyjnych. Technika poprawia przeżywalność i aktywność metaboliczną komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie z amerykańskich Narodowych Instytutów Zdrowia (R01DK096075, R01DK107875 i R01DK114506) oraz Departamentu Obrony USA (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) jest bardzo doceniane.

Podstawowe izolacje hepatocytów dla tego protokołu zostały przeprowadzone przez Cell Resource Core (CRC) w Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, USA. Protokół dla zwierząt (#2011N000111) został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Szpitala Ogólnego w Massachusetts.
1. Witryfikacja kropelek
<ol>
	<li>Przygotować roztwory do witryfikacji.
	<ol>
		<li>Dodać 40 mg albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 17,0 ml roztworu Uniwersytetu Wisconsin (UW), aby uzyskać roztwór witryfikacyjny 1 (V1). Sterylnie przefiltrować roztwór V1 za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: UW jest powszechnie stosowanym rozwiązaniem do konserwacji narządów. Zawiera 50 g/l skrobi hydroksyetylu, 35,83 g/l kwasu laktobionowego, 3,4 g/l jednozasadowego fosforanu potasu, 1,23 g/l siedmiowodnego siarczanu magnezu, 17,83 g/l pentahydratu rafinozy, 1,34 g/l adenozyny, 0,136 g/l allopurynolu, 0,992 g/l całkowitego glutationu, 5,61 g/l wodorotlenku potasu i wodorotlenek sodu w celu dostosowania pH do 7,4.</li>
		<li>Połącz 7,0 ml UW, 6,5 ml DMSO, 6,5 ml glikolu etylenowego (EG), 40 mg BSA i 5,48 g sacharozy, aby uzyskać roztwór witryfikacyjny 2 (V2). Sterylny przefiltrować roztwór V2 za pomocą filtra 0,22 μm. Załadować 3,5 ml sterylnego, przefiltrowanego roztworu V2 do strzykawki o pojemności 3 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Aby ułatwić rozpuszczanie CPA, roztwory przygotowuje się w większych ilościach niż jest to wymagane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować aparat do witryfikacji kropel luzem.
	<ol>
		<li>Aby przygotować igłę do mieszania, najpierw przeciąć wzdłuż jednej strony zewnętrznej szarej tulei igły mieszającej, a następnie zegnij rękaw, aby wyjąć go z igły mieszającej.</li>
		<li>Nasuń dwie 25-milimetrowe odcinki silikonowej rurki na wloty igły mieszającej i zabezpiecz ich położenie klejem (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Przyciąć igłę na długość 20 mm (tj. długość wewnętrznej spirali mieszającej), jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A. 
		UWAGA: Długość igły mieszającej jest proporcjonalna do objętości wewnątrz igły i dlatego można ją zmienić, aby kontrolować czas ekspozycji hepatocytów na roztwór o wysokim stężeniu CPA.</li>
		<li>Włożyć wylot odcinający igły mieszającej do igły iniekcyjnej 20 G (<klasa silna="xfig">Rysunek 1B). 
		UWAGA: Rozmiar igły do wstrzykiwań ma wpływ na wielkość kropli.</li>
		<li>Wysterylizuj zespół igły mieszającej przez autoklawowanie.</li>
		<li>Napełnij sterylny Dewara ciekłym azotem. Wysterylizuj zewnętrzną część Dewara izopropanolem przed umieszczeniem Dewara w sterylnym kapturze do hodowli komórek z przepływem laminarnym. 
		UWAGA: Zanieczyszczenie jest ważnym czynnikiem podczas bezpośredniego wystawienia kropelek na działanie ciekłego azotu. Chociaż w obecnym protokole nie stwierdzono zanieczyszczenia przy użyciu niesterylizowanego ciekłego azotu, ciekły azot może być filtrowany lub napromieniowywany w celu zapewnienia sterylności w razie potrzeby16.</li>
		<li>Włóż lejek o tej samej średnicy zewnętrznej co wewnętrzna średnica ciekłego azotu Dewara do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, aby stworzyć urządzenie do zbierania kropel (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C−E).</li>
		<li>Zanurz urządzenie do zbierania kropelek w ciekłym azocie, powoli dociskając je w końcowej pozycji pionowej za pomocą dużych kleszczyków. Upewnij się, że stożkowa rura spoczywa w pozycji pionowej na dole Dewara (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D−E). 
		UWAGA: Lejek powinien pozostać włożony i spoczywać na stożkowej rurce. Poziom ciekłego azotu powinien znajdować się 1 cm poniżej wysokości wlotu lejka, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1D.</li>
		<li>Zamontuj pompę strzykawkową w pozycji pionowej na ścianie okapu do hodowli komórkowych, przywiązując sznurek od nóżek pompy strzykawkowej do wystających ze ścianki okapu do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Umieść ciekły azot Dewara z urządzeniem do zbierania kropel pod pionowo zamontowaną pompą strzykawkową (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1E).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępna inkubacja z CPA.
	<ol>
		<li>Po uzyskaniu świeżo wyizolowanych hepatocytów szczura, policz stężenie zapasu przez wykluczenie błękitu trypanowego i weź 40 milionów żywotnych hepatocytów. 
		UWAGA: Delikatne obchodzenie się z hepatocytami w zawiesinie ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania śmierci komórek.</li>
		<li>Wirować przy 50 x g przez 5 minut bez hamulca.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić hepatocyty w 3,4 ml roztworu V1.</li>
		<li>Inkubować na lodzie przez 3 minuty.</li>
		<li>Dodać 150 μl DMSO i 150 μl EG do hepatocytów i delikatnie wymieszać.</li>
		<li>Inkubować na lodzie przez 3 minuty.</li>
		<li>Ponownie dodaj 150 μl DMSO i 150 μl EG do hepatocytów i delikatnie wymieszaj.</li>
		<li>Załadować 3,5 ml do strzykawki o pojemności 3 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj witryfikację.
	<ol>
		<li>Wprowadzić strzykawkę ze wstępnie inkubowanymi hepatocytami i strzykawkami z roztworem V2 do adaptera pompy strzykawkowej.</li>
		<li>Przymocuj dwa żeńskie adaptery zadziorów węża Luer lock do strzykawek i nasuń silikonową rurkę zespołu igły mieszającej na złączki z zadziorami (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1F).</li>
		<li>Umieść cały zespół w pompie strzykawkowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
		<li>Trzy minuty po ostatnim dodaniu DMSO i EG do hepatocytów uruchomić pompę przy 2 ml/min.</li>
		<li>Zatrzymaj pompę po dodaniu wszystkich hepatocytów do ciekłego azotu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przechowywanie kriogeniczne
<ol>
	<li>Nakłuć 10 małych otworów w wieczku stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą igły 20 G i owinąć zewnętrzną część pokrywki elastyczną folią, jak pokazano na Rysunek 1B. W ten sposób powstaje zawór, który umożliwia ucieczkę odparowujących resztek ciekłego azotu.</li>
	<li>Aby zebrać zeszklone kropelki hepatocytów, najpierw usuń lejek z ciekłego azotu Dewara. Następnie za pomocą długich kleszczy wyjmij stożkową rurkę zawierającą kropelki z ciekłego azotu i powoli wylej nadmiar ciekłego azotu ze stożkowej rurki.</li>
	<li>Zamknij stożkową rurkę z przebitą pokrywką i bezpośrednio umieść zamkniętą stożkową rurkę ze zeszklonymi kropelkami hepatocytów z powrotem w ciekłym azocie Dewara.</li>
	<li>Przenieś stożkową rurkę z ciekłego azotu do kriozbiornika parowego ciekłego azotu.</li>
</ol>
3. Podgrzewanie zeszklonych kropelek hepatocytów
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór do podgrzewania.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 17,13 g sacharozy w 100 ml pożywki do hodowli hepatocytów DMEM, aby uzyskać roztwór do podgrzewania. Sterylnie przefiltrować roztwór do podgrzewania za pomocą filtra 0,22 μm i ogrzać do 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozgrzej hepatocyty.
	<ol>
		<li>Weź stożkową probówkę z zeszklonymi hepatocytami z kriozbiornika i przetransportuj ją w ciekłym azocie Dewara do kaptura do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Lekko poluzuj nakrętkę i włóż stożkową rurkę z powrotem do ciekłego azotu.</li>
		<li>Dodać zeszklone kropelki hepatocytów do pustej zlewki, natychmiast dodać ciepły (37 °C) roztwór do podgrzewania i natychmiast mieszać przez 10 s. 
		UWAGA: Bardzo ważna jest szybka praca, aby uniknąć zamarznięcia podczas podgrzewania. W zależności od wymagań badania, od kilku do wszystkich zeszklonych kropelek można podgrzać jednocześnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozładuj roztwór do podgrzewania.
	<ol>
		<li>Podzielić roztwór rozgrzewający z hepatocytami na dwie stożkowe probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Odwirować dwie stożkowe probówki przez 2 minuty przy 100 x g w temperaturze 4 °C bez hamulca.</li>
		<li>Odessać supernatant, aby pozostawić całkowitą objętość 12,5 ml, używając znacznika podziałki stożka jako odniesienia i dodać 12,5 ml lodowatego DMEM na probówkę stożkową, aby rozcieńczyć roztwór do podgrzewania do 50%.</li>
		<li>Ponownie zawiesić hepatocyty i inkubować na lodzie przez 3 minuty.</li>
		<li>Dodaj 25 ml lodowatego DMEM na stożkową probówkę, aby rozcieńczyć roztwór do podgrzewania do 25%.</li>
		<li>Wirować przez 5 minut przy 50 x g w temperaturze 4 °C bez hamulca.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić hepatocyty w 2 ml żądanej pożywki hodowlanej do użycia. 
		UWAGA: W razie potrzeby można zastosować wirowanie w gradiencie gęstości do usunięcia martwych hepatocytów z zawiesiny komórkowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+and+bioartificial+liver+devices%3A+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Artificial and bioartificial liver devices: present and future.</a> Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).</li>
<li>Fox, I. J., Chowdhury, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+transplantation%3A+Hepatocyte+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).</li>
<li>Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Status+of+Hepatocyte+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Current Status of Hepatocyte Transplantation.</a> Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).</li>
<li>Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+cryopreservation%3A+is+it+time+to+change+the+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy.</a> World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).</li>
<li>Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+cryopreservation+and+thawing+protocol+for+human+hepatocytes+for+use+in+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation.</a> Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).</li>
<li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of cryopreservation.</a> Methods in Molecular Biology. 368, 39(2007).</li>
<li>Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation%3A+An+emerging+paradigm+change%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation: An emerging paradigm change.</a> Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).</li>
<li>Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+common+cryoprotectants+on+critical+warming+rates+and+ice+formation+in+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions.</a> Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).</li>
<li>Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+as+an+approach+to+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Vitrification as an approach to cryopreservation.</a> Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).</li>
<li>Demirci, U., Montesano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+encapsulating+droplet+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell encapsulating droplet vitrification.</a> Lab on a Chip. 7 (11), 1428(2007).</li>
<li>El Assal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-Inspired+Cryo-Ink+Preserves+Red+Blood+Cell+Phenotype+and+Function+During+Nanoliter+Vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification.</a> Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).</li>
<li>Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+cryopreservation+of+cells+by+rapid+freezing+of+sub-%CE%BCl+drops+using+inkjet+printing--cryoprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing--cryoprinting.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).</li>
<li>Samot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+banking+in+living+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Blood banking in living droplets.</a> PloS One. 6 (3), 17530(2011).</li>
<li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Non-Contact+Vitrification+of+Cell-Laden+Droplets+Based+on+Cell+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2016).</li>
<li>de Vries, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+Droplet+Vitrification%3A+An+Approach+to+Improve+Large-Scale+Hepatocyte+Cryopreservation+Outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome.</a> Langmuir. , (2019).</li>
<li>Parmegiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterilization+of+liquid+nitrogen+with+ultraviolet+irradiation+for+safe+vitrification+of+human+oocytes+or+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos.</a> Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).</li>
<li>Best, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryoprotectant+Toxicity%3A+Facts%2C+Issues%2C+and+Questions%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions.</a> Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują konkurencyjne interesy finansowe. Doktorzy de Vries, Weng, Toner, Tessier i Uygun mają tymczasowe wnioski patentowe związane z tym badaniem. Dr Uygun ma udziały finansowe w Organ Solutions, firmie zajmującej się rozwojem technologii konserwacji narządów. Wszystkie interesy badaczy są zarządzane przez MGH and Partners HealthCare zgodnie z ich polityką przeciwdziałania konfliktowi interesów.

Kriokonserwacja hepatocytów poprzez powolne zamrażanie powoduje zmniejszenie żywotności i funkcji metabolicznych. Witryfikacja stanowi obiecującą alternatywę dla klasycznej kriokonserwacji, ponieważ całkowicie unika się uszkodzeń spowodowanych zamarznięciem9. Jednak wstępna inkubacja z CPA jest wymagana w celu obniżenia krytycznej szybkości chłodzenia8. W związku z tym witryfikacja jest utrudniona ze względu na toksyczność CPA17 i ograniczona do mały...

Utrata żywotności komórek i funkcji metabolicznych po kriokonserwacji hepatocytów jest nadal poważnym problemem, który ogranicza zastosowania kliniczne1,2,3. Wzorcową metodą kriokonserwacji hepatocytów jest powolne zamrażanie, które polega na wstępnej inkubacji hepatocytów z CPA (dimetylosulfotlenek [DMSO], glukoza i albumina), a następnie kontrolowanej szybkości zamrażania (w temperaturze około 1 °C/min) do temperatur kriogenicznych4,5. Pomimo wielu zgłoszonych optymalizacji, toksyczność CPA wraz z szkodliwymi zaburzeniami równowagi osmotycznej podczas zamrażania i mechanicznymi naprężeniami związanymi z tworzeniem się lodu pozostają podstawowymi wadami powolnego zamrażania6,7.
Witryfikacja oferuje przewagę nad powolnym zamrażaniem, ponieważ całkowicie unika się urazów spowodowanych tworzeniem się lodu dzięki bezpośredniemu przejściu fazowemu wody w stan szklany6. Jednak, aby osiągnąć temperaturę zeszklenia czystej wody (-137 °C), woda musi być schładzana z szybkością rzędu miliona stopni Celsjusza na sekundę (tj. krytyczną szybkością chłodzenia), aby uniknąć tworzenia się lodu powyżej temperatury zeszklenia8. Dodanie CPA może obniżyć krytyczną szybkość chłodzenia i zwiększyć temperaturę zeszklenia roztworów wodnych9. Jednak nawet przy wysokich stężeniach CPA (np. 40% v/v DMSO lub wyższych) szybkie szybkości chłodzenia są mimo wszystko wymagane do pomyślnej witryfikacji8,9.
Wymagane szybkości chłodzenia i wysokie stężenia CPA powodują dwie główne wady witryfikacji. Po pierwsze, aby umożliwić szybkie chłodzenie, próbki muszą mieć niską masę termiczną. Po drugie, aby osiągnąć wysokie stężenia CPA przy jednoczesnym uniknięciu uszkodzenia osmotycznego, CPA muszą być powoli wprowadzane i w pełni zrównoważone między przedziałami wewnątrz- i zewnątrzkomórkowymi6. Wydłuża to czas ekspozycji komórek na toksyczne CPA. Razem sprawia to, że witryfikacja jest uciążliwym procesem, który jest ograniczony do kilku małych próbek (mikrolitrów) na raz. Witryfikacja kropelkowa została zaproponowana jako potencjalne rozwiązanie tych ograniczeń. Wystawienie maleńkich kropelek (nanolitrów) zawierających komórki na działanie ciekłego azotu znacznie zwiększa szybkość chłodzenia, co w konsekwencji pozwala na znaczne zmniejszenie stężenia CPA10,11,12,13,14. Chociaż wiele dysz generujących kropelki o wysokiej częstotliwości może być potencjalnie używanych jednocześnie, ekstremalnie mały rozmiar kropli ogranicza przepustowość do mikrolitrów na minutę10, co wyklucza wydajną witryfikację dużych objętości komórek o znacznie większych szybkościach przetwarzania rzędu mililitrów na minutę.
Ostatnio wykazano, że te nieodłączne ograniczenia witryfikacji mogą być pokonane przez witryfikację masowymi kropelkami15. Ta nowatorska metoda wykorzystuje szybkie odwodnienie osmotyczne w celu skoncentrowania wewnątrzkomórkowego stężenia CPA wynoszącego 7,5% v/v glikolu etylenowego i DMSO bezpośrednio poprzedzającego witryfikację, eliminując potrzebę pełnej równowagi toksycznych stężeń CPA. Odwodnienie komórkowe odbywa się w urządzeniu fluidycznym poprzez krótką ekspozycję hepatocytów na wysokie zewnątrzkomórkowe stężenie CPA. Chociaż ta ekspozycja powoduje szybkie odwodnienie osmotyczne, jest zbyt krótka, aby wysokie stężenie CPA mogło dyfundować do komórek. Natychmiast po odwodnieniu komórki są ładowane kropelkami, które są bezpośrednio zeszklone w ciekłym azocie. Metoda ta eliminuje potrzebę pełnego wewnątrzkomórkowego wychwytu wysokich stężeń CPA, podczas gdy wysokie zewnątrzkomórkowe stężenie CPA umożliwia witryfikację kropelek o dużych rozmiarach, co skutkuje dużą przepustowością przy minimalnej toksyczności CPA.
Witryfikacja kropel poprawia bezpośrednią i długoterminową żywotność po konserwacji, a także morfologię i funkcję metaboliczną pierwotnych hepatocytów szczurów w porównaniu z klasyczną kriokonserwacją przez powolne zamrażanie15. Niniejszy manuskrypt zawiera szczegóły metodologiczne dotyczące witryfikacji pierwotnych hepatocytów szczurów za pomocą kropelek masowych.

<table><tbody><tr><td>BD Jednorazowe strzykawki 3 ml z końcówkami Luer-Lok</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS1000-250</td><td></td></tr><tr><td>Belzer UW Roztwór do chłodni</td><td>Bridge to Life</td><td>BUW-001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer żeński Luer do 1/16" niskoprofilowej półsztywnej króćca rurki, PP</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45508-12</td><td></td></tr><tr><td>Kriogeniczny zbiornik do przechowywania / Wykres Cryotank</td><td>Industries</td><td>MVE 800</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, proszek, wysoka zawartość glukozy, pirogronian</td><td>Life Technologies</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107-21-1</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo długie kleszcze</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-316C</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Szybkobieżne, łatwe do odczytania plastikowe probówki wirówkowe - płaskie zamknięcie</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-18</td><td></td></tr><tr><td>Żyłka wędkarska</td><td>Stren</td><td>SOFS4-15</td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>Airgas</td><td>7727-37-9</td><td></td></tr><tr><td>Rurki silikonowe utwardzane platyną Masterflex L/S, L/S 14</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-14</td><td></td></tr><tr><td>Mieszaj końcówki, do użytku z 3HPW1</td><td>Grainger</td><td>3WRL7</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Lejek do proszku polipropylenowego</td><td>ThermoFisher</td><td>4252-0100</td><td></td></tr><tr><td>Igła 20 ga</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M - Elastyczna folia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06369-18</td><td>&nbsp; Sterylny filtr </td></tr><tr><td>Steriflip</td><td>Fisher Scientific</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza (krystaliczna/certyfikowana ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Termos Stołowy pojemnik na ciekły azot</td><td>ThermoFisher</td><td>2122</td><td></td></tr></tbody></table>

witryfikacja kropel masowych w celu pierwotnego zachowania hepatocytów

Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

Witryfikacja jest obiecującą alternatywą dla klasycznej kriokonserwacji próbek biologicznych metodą powolnego zamrażania (około 1 °C/min). Witryfikacja wymaga niezwykle szybkiego tempa chłodzenia, aby osiągnąć przejście wody w fazę szklistą, unikając jednocześnie szkodliwego tworzenia się lodu. Chociaż wstępna inkubacja ze środkami krioprotekcyjnymi (CPA) może zmniejszyć krytyczną szybkość chłodzenia próbek biologicznych, na ogół potrzebne są wysokie stężenia, aby umożliwić kriokonserwację bez lodu przez witryfikację. W rezultacie witryfikacja jest utrudniona przez toksyczność CPA i ograniczona do małych próbek, które można szybko schłodzić. Niedawno wykazano, że te nieodłączne ograniczenia można przezwyciężyć poprzez witryfikację kropel luzem. Korzystając z tej nowatorskiej metody, komórki są najpierw wstępnie inkubowane z niskim wewnątrzkomórkowym stężeniem CPA. Wykorzystując szybkie odwodnienie osmotyczne, wewnątrzkomórkowy CPA jest skoncentrowany bezpośrednio przed witryfikacją, bez konieczności pełnego równoważenia toksycznych stężeń CPA. Odwodnienie komórkowe odbywa się w urządzeniu fluidycznym i jest zintegrowane z ciągłym wytwarzaniem dużych kropelek o wysokiej przepustowości, które są zeszklone ciekłym azotem. Ta bezlodowa metoda kriokonserwacji z minimalną toksycznością CPA jest odpowiednia dla dużych ilości komórek i powoduje zwiększoną żywotność hepatocytów i funkcję metaboliczną w porównaniu z klasyczną kriokonserwacją wolno zamrażającą. Niniejszy manuskrypt szczegółowo opisuje metody udanej witryfikacji kropel luzem.

Do bezpośredniego porównania witryfikacji dużych kropli z klasyczną krio konserwacją, z wykorzystaniem czołowych protokołów powolnego zamrażania opisanych w literaturze4,5, użyto świeżo wyizolowanych pierwotnych hepatocytów z pięciu różnych wątrób szczurzych. W skrócie, hepatocyty zawieszono w roztworze UW uzupełnionym o BSA (2,2 mg/mL), glukozę (333 mM) i DMSO (10% v/v), a następnie zamrożono w zamrażarce o kontrolowanej szybkości schładzania. Po przechowywaniu ...

Ten manuskrypt opisuje metodę kriokonserwacji bez lodu dla dużych ilości hepatocytów szczurów, dzięki której komórki pierwotne są wstępnie inkubowane środkami krioprotrotacyjnymi o niskim stężeniu i zeszklone w dużych kropelkach.

Witryfikacja kropel masowych w celu pierwotnego zachowania hepatocytów

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

Witryfikacja jest zwykle obsługiwana przez toksyczność środków krioprotekcyjnych. I ponownie umieszczane do małych próbek, które można szybko schłodzić. Protokół ten umożliwia witryfikację dużych ilości komórek przy użyciu niskiego stężenia CPA podczas preinkubacji.Stosując szybkie odwodnienie osmotyczne, niski międzykomorowy CPA jest skoncentrowany w urządzeniu płynowym bezpośrednio przed witryfikacją. Eliminuje to konieczność pełnego równoważenia toksycznych stężeń CPA. Witryfikacja kropelkowa może dostarczyć żywotnych i metabolicznie aktywnych hepatocytów do stosowania przeszczepów hepatocytów i biosztucznych urządzeń wątrobowych, które obecnie utrudniają nam nieodpowiednie wyniki po krioprezerwacji.Metoda ta może być potencjalnie dostosowana do witryfikacji innych typów komórek, które muszą być kriokonserwowane w dużych ilościach; takich jak m.in. produkty krwiopochodne lub komórki macierzyste. Na początek przygotuj roztwór witryfikacyjny 1, dodając 40 miligramów BSA do 17,0 mililitrów roztworu University of Wisconsin. Użyj filtra 0,22 mikrometra, aby sterylnie przefiltrować roztwór i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przygotować roztwór do witryfikacji 2 zgodnie z opisem w protokole. I sterylnie przefiltruj go przez filtr 0,22 mikrometra. Załaduj 3,5 mililitra sterylnie przefiltrowanego roztworu V2 do trzymililitrowej strzykawki i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Aby przygotować aparat do witryfikacji kropelek luzem, najpierw przeciąć wzdłuż jednej strony zewnętrznej szarej tulei igieł mieszających. Zegnij rękaw otwarty, aby wyjąć go z igły mieszającej. Następnie przyciąć igłę mieszającą na długość 20 milimetrów i włożyć jej odcięty wylot do igły iniekcyjnej o rozmiarze 20.Nasuń dwie 25-milimetrowe odcinki rurki silikonowej na wloty igły mieszającej. I zabezpiecz ich pozycję klejem. Wysterylizuj ten zespół przez autoklawowanie.Napełnij sterylną kolbę Dewara ciekłym azotem. I wysterylizuj zewnętrzną stronę izopropanolem przed umieszczeniem jej w sterylnym kapturze do hodowli komórek przepływowych Laminer. Upewnij się, że nosisz odpowiednie środki ochrony osobistej, ponieważ ciekły azot może spowodować poważne oparzenia.Aby stworzyć urządzenie do zbierania kropel, włóż lejek o tej samej średnicy zewnętrznej co wewnętrzna średnica Dewara do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Za pomocą dużych kleszczy powoli dociśnij urządzenie do zbierania kropel w ciekłym azocie w końcowej pozycji pionowej. Upewnij się, że stożkowa rurka spoczywa w pozycji pionowej na dole Dewara.A poziom ciekłego azotu jest o jeden centymetr niższy niż krawędź lejka. Aby zamontować pompę strzykawkową w pozycji pionowej na ścianie okapu do hodowli komórkowych, należy przywiązać sznurek od nóżek pompy strzykawkowej do wystających ze ścianki okapu do hodowli komórkowych. Następnie umieść ciekły azot Dewara z urządzeniem do zbierania kropelek pod pionowo zamontowaną pompą strzykawkową.Po uzyskaniu świeżo wyizolowanych hepatocytów szczura policz stężenie zapasu przez wykluczenie niebieskiego tri-pane. I przenieś 40 milionów żywotnych hepatocytów do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Odwirować hepatocyty w temperaturze 50 razy G przez pięć minut bez przerwy.Odessać supernatant. Ponownie zawiesić hepatocyty w 3,4 mililitra roztworu V1. I inkubować na lodzie przez trzy minuty.Następnie dodaj 150 mikrolitrów DMSO i 150 mikrolitrów EG; Delikatnie wymieszaj i ponownie inkubuj na lodzie przez trzy minuty. Ponownie dodaj 150 mikrolitrów DMSO i 150 mikrolitrów EG do hepatocytów i delikatnie wymieszaj. Załaduj 3,5 mililitra tej mieszaniny do trzymililitrowej strzykawki.Włożyć strzykawkę ze wstępnie inkubowanymi hepatocytami i strzykawkę z roztworem V2 do adaptera pompy strzykawkowej. Podłącz dwa żeńskie adaptery do węży Luer Lock do strzykawek. I nasuń silikonową rurkę zespołu igły mieszającej na złączki z zadziorami.Umieść cały ten zespół w pompie strzykawkowej. Trzy minuty po ostatniej edycji DMSO i EG do hepatocytów uruchomić pompę z prędkością dwóch mililitrów na minutę. Po dodaniu wszystkich hepatocytów do ciekłego azotu zatrzymaj pompę.Za pomocą igły o rozmiarze 20 przebij 10 małych otworów w pokrywie stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. I owiń zewnętrzną stronę pokrywy elastyczną folią, tworząc zawór, który umożliwi ucieczkę odparowującego resztek ciekłego azotu. Aby zebrać zeszklone kropelki hepatocytów, najpierw usuń lejek z Dewara za pomocą ciekłego azotu.Następnie długimi kleszczami wyjmij stożkową rurkę zawierającą kropelki ciekłego azotu i powoli wylej nadmiar ciekłego azotu z rurki stożkowej. Zamknij stożkową rurkę z przebitą pokrywką, a następnie bezpośrednio umieść zamkniętą stożkową rurkę z zeszklonymi kropelkami hepatocytów z powrotem w Dewarze z ciekłym azotem. Na koniec przenieś stożkową rurkę z ciekłego azotu do kriozbiornika z ciekłym azotem.Po przygotowaniu roztworu do podgrzewania z sacharozą i pożywką do hodowli hepatocytów DMEM, użyj filtra 0,22 mikrometra, aby sterylnie go przefiltrować. Następnie podgrzej go do 37 stopni Celsjusza. Aby ponownie ogrzać hepatocyty, wyjmij stożkową rurkę z zeszklonymi hepatocytami z kriozbiornika i przetransportuj ją w ciekłym azocie Dewara do okapu subkultury.Lekko poluzuj nakrętkę i umieść stożkową rurkę z powrotem w ciekłym azocie. Pracując szybko, dodaj wszystkie zeszklone kropelki hepatocytów do pustej zlewki, a następnie szybko dodaj 100 mililitrów ciepłego roztworu do podgrzewania o temperaturze 37 stopni Celsjusza, mieszając przez 10 sekund. Gdy kropelki są usuwane z ciekłego azotu, zamrożenie wewnętrzne następuje w ciągu kilku sekund, jeśli kropelki nie zostaną szybko ponownie podgrzane.Dlatego bardzo ważne jest, aby bezpośrednio dodawać pożywkę podgrzewającą do kropelek podczas mieszania. Podziel roztwór rozgrzewający z hepatocytami na dwie stożkowe probówki o pojemności 50 mililitrów. Wirować probówki przez dwie minuty w temperaturze 100 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza bez przerwy.Odessać supernatanty, aby pozostawić całkowitą objętość 12,5 mililitra, używając znacznika podziałki rurki jako odniesienia. Aby rozcieńczyć roztwór do podgrzewania do 50%, dodaj 12,5 mililitra lodowatego DMEM na stożkową rurkę. Ponownie zawiesić i inkubować na lodzie przez trzy minuty.Aby rozcieńczyć roztwór do podgrzewania do 25%, dodaj 25 mililitrów lodowatego DMEM na stożkową rurkę. Po odwirowaniu przez pięć minut w temperaturze 50 razy G w czterech stopniach Celsjusza bez przerwy, odessać supernatant i ponownie zawiesić hepatocyty w dwóch mililitrach żądanej pożywki hodowlanej. Mierzone za pomocą trójczęściowego testu niebieskiego wykluczenia, który określa integralność błony, witryfikacja kropelek masowych spowodowała bezpośrednią żywotność hepatocytów po konserwacji na poziomie 79%Było to znacznie wyższe niż 68% żywotność po klasycznej zoptymalizowanej kriokonserwacji.Wydajność witryfikacji kropelkami masowymi wyniosła 56%, co było o 10% wyższe i bardziej spójne niż w przypadku klasycznej krioprezerwacji. Korzystając z testu metabolizacji presto-glue w długoterminowych kulturach uniwersyteckich i kanapkowych, zmierzono, że aktywność metaboliczna w hepatocytach jest znacznie wyższa po witryfikacji kropelkami objętościowymi niż po klasycznej kriokonserwacji. Synteza albumin, jako najpowszechniej stosowany parametr funkcji syntetycznej hepatocytów, była prawie dwukrotnie większa po witryfikacji kropelkami masowymi, niż po klasycznej kriokonserwacji.Produkcję mocznika wykorzystano do pomiaru funkcji detoksykacji hepatocytów w tygodniowej hodowli. W hepatocytach zeszklonych kropelkami produkcja mocznika była znacznie wyższa niż w klasycznych hepatocytach kriokonserwujących. Aby uzyskać spójne wyniki po witryfikacji kropel masowych, ważne jest, aby dokładnie przestrzegać czasu podczas wstępnej inkubacji CPA i ponownego rozgrzania, jak opisano w tym protokole.Po ponownym podgrzaniu zeszklonych kropelek hepatocytów otrzymasz zawiesinę o lepszym rozmiarze, która dzięki temu może być używana w taki sam sposób, jak gdyby były świeżo wyizolowane. Jako ulepszona metoda konserwacji, witryfikacja kropelek masowych może zwiększyć dostępność pri-ma do zastosowań badawczych i klinicznych.

bulk-droplet-vitrification-for-primary-hepatocyte-preservation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano technikę izolowania ludzkich hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby od tego samego dawcy. Różne typy komórek wątroby stanowią podstawę funkcjonalnych modeli wątroby i inżynierii tkankowej. Ta nowa metoda ma na celu wyizolowanie komórek wątroby w celu uzyskania wysokiej wydajności i żywotności.

Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Celem tego protokołu jest uzyskanie wysokiej żywotności i wysokiej wydajności hepatocytów i komórek śródbłonka sinusoidalnego z wątroby. Osiąga się to poprzez perfuzję wątroby roztworem kolagenazy typu IV przez żyłę wrotną, a następnie wirowanie różnicowe w celu uzyskania hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka.

Oczyszczanie hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka z perfuzji wątroby myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji zdrowych i funkcjonalnych pierwotnych hepatocytów myszy. Opracowano instrukcje dotyczące wykrywania powstającej syntezy białek wątrobowych za pomocą nieradioaktywnego substratu znakującego, aby pomóc w zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw syntezy białek w kontekście homeostazy metabolizmu energetycznego w wątrobie.

Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy do analizy powstającej syntezy białek metodą znakowania nieradioaktywnej L-azydohomoalaniny

Celem tego protokołu jest dostarczenie przewodnika krok po kroku do przeprowadzenia eksperymentów 3-D z wirusem zapalenia wątroby typu B.

Hodowle "wątroby na chipie" pierwotnych hepatocytów i komórek Kupffera w leczeniu zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B

Prezentowany tutaj jest protokół izolacji hepatocytów myszy z wątroby dorosłych myszy przy użyciu zmodyfikowanej techniki perfuzji kolagenazy. Opisano również długoterminową hodowlę hepatocytów w warstwie kolagenowej 3D, a także znakowanie immunologiczne składników cytoszkieletu w celu zbadania tworzenia kanałów żółciowych i ich odpowiedzi na leczenie.

Izolacja i hodowla kanapkowa kolagenu 3D pierwotnych hepatocytów myszy w celu zbadania roli cytoszkieletu w tworzeniu kanałów żółciowych in vitro

Pierwotne hepatocyty są cennym narzędziem do badania reakcji wątroby i metabolizmu in vitro. Wykorzystując dostępne na rynku odczynniki, opracowano ulepszony, efektywny czasowo i pracochłonnie protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy.

Ulepszony protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy pod względem czasu i pracy

Ten protokół szczegółowo opisuje użycie specjalnego cewnika dożylnego, standaryzowanego sterylnego jednorazowego wężyka, kontroli temperatury uzupełnionej monitorowaniem w czasie rzeczywistym, oraz systemu alarmowego dla dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy w celu poprawy spójności żywotności, wydajności i funkcjonalności izolowanych pierwotnych hepatocytów szczurów.

Izolacja pierwotnych hepatocytów szczura z wieloparametrową kontrolą perfuzji

Utlenianie β kwasów tłuszczowych jest niezbędnym szlakiem metabolicznym odpowiedzialnym za wytwarzanie energii w wielu różnych typach komórek, w tym w hepatocytach. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru β-oksydacji kwasów tłuszczowych w świeżo wyizolowanych hepatocytach pierwotnych przy użyciu 14znakowanych C kwasów palmitynowych.

Pomiar β-oksydacji kwasów tłuszczowych w zawiesinie świeżo wyizolowanych hepatocytów myszy

Ten protokół opisuje techniki izolowania pierwotnych mysich hepatocytów z wątroby i elektroportowania CRISPR-Cas9 jako rybonukleoprotein i mRNA w celu zakłócenia terapeutycznego genu docelowego związanego z dziedziczną chorobą metaboliczną wątroby. Opisane metody skutkują wysoką żywotnością i wysokim poziomem modyfikacji genów po elektroporacji.

Dostarczanie rybonukleoprotein Cas9 i mRNA za pośrednictwem elektroporacji do świeżo izolowanych pierwotnych hepatocytów myszy

Hepatocyty bogate w lipidy są nieodłącznym elementem regeneracji wątroby, ale zazwyczaj są tracone po odwirowaniu w gradiance gęstości. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji komórek, który zachowuje stłuszczeniowe hepatocyty, uzyskując reprezentatywne populacje regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy.

Izolacja regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy

Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną dwuetapową technikę perfuzji wątroby kolagenazy w modelu szczurzym i pokazuje użycie izolowanych hepatocytów do długoterminowej hodowli organoidów 3D in vitro.

Perfuzja wątroby szczura i izolacja pierwotnych hepatocytów: stara procedura kluczowa dla najnowocześniejszej hodowli organoidów 3D

Poznaj metodę witryfikacji kropel masowych do zachowania hepatocytów szczura z użyciem niskich stężeń środków krioprotekcyjnych. Technika poprawia przeżywalność i aktywność metaboliczną komórek.

Witryfikacja kropel masowych w celu pierwotnego zachowania hepatocytów

Przeglądaj więcej filmów