Name: Wyciszanie iskry: edycja genomu CRISPR/Cas9 u ryb o słabym natężeniu elektrycznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj edycję genomu CRISPR/Cas9 u ryb o słabym natężeniu elektrycznym z rodzin Gymnotiformes i Mormyridae. Ta metoda umożliwia badanie funkcji genów i ich wpływu na fenotyp oraz zachowanie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują bohaterskim wysiłkom Moniki Lucas, Katherine Shaw, Ryana Taylora, Jareda Thompsona, Nicole Robichaud i Hope Healey za pomoc w hodowli ryb, zbieraniu danych i wczesnym rozwoju protokołu. Chcielibyśmy również podziękować trzem recenzentom za sugestie dotyczące manuskryptu. Uważamy, że produkt końcowy jest lepszej jakości po ustosunkowaniu się do ich uwag. Praca ta została sfinansowana dzięki wsparciu Narodowej Fundacji Nauki #1644965 i #1455405 dla JRG oraz grantu DG Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (Natural Sciences and Engineering Research Council) dla VLS.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Bogactwo fenotypowe ryb o słabym natężeniu elektryczności, wraz z niedawnym rozpowszechnieniem zasobów genomicznych, motywuje silne zapotrzebowanie na funkcjonalne narzędzia genomiczne w modelu ryb o słabym natężeniu elektryczności. System ten jest szczególnie atrakcyjny ze względu na zbieżną ewolucję licznych cech fenotypowych w równoległych liniach ryb, które można łatwo przechowywać w laboratorium.
Opisany tutaj protokół demonstruje skuteczność techniki CRISPR/Cas9 w liniach słabo elektrycz...

Elektrorecepcja i elektrogeneza zmieniły się w ewolucyjnej historii kręgowców. Dwie linie ryb teleostowych, osteoglossiformes i siluriformes, rozwijały elektrorecepcję równolegle, a pięć linii teleostów (gymnotiformes, mormyrids i rodzaje Astroscopus, Malapterurus i Synodontis) ewoluowało równolegle. Istnieje uderzający stopień zbieżności w tych niezależnie wywodzących się fenotypach, które mają wspólną architekturę genetyczną1,2,3.
To jest być może najlepszym przykładem liczne zbieżne cechy gymnotiform i mormyridów, dwóch bogatych gatunkowo kladów teleost, które wytwarzają i wykrywają słabe pola elektryczne i są nazywane rybami o słabym napędzie elektrycznym. W ciągu 50 lat od odkrycia, że ryby o niskiej elektryczności wykorzystują elektryczność do wyczuwania otoczenia i komunikowania się4, rosnąca społeczność naukowców zdobyła ogromny wgląd w ewolucję rozwoju1,5,6, systemy i obwody neuronauka7,8,9,10, fizjologia komórkowa11,12, ekologia i energetyka13,14,15,16,17, behavior18,19, oraz macroevolution3,20,21.
Ostatnio nastąpił wzrost ilości zasobów genomicznych, transkryptomicznych i proteomicznych dla ryb elektrycznych1,22,23,24,25,26,27,28. Korzystanie z tych zasobów przyniosło już ważne spostrzeżenia dotyczące związku między genotypem a fenotypem u tych gatunków1,2,3,28,29,30. Główną przeszkodą w integracji danych genomicznych z danymi fenotypowymi ryb o słabym natężeniu elektrycznym jest obecny brak funkcjonalnych narzędzi genomicznych31.
Jednym z takich narzędzi jest niedawno opracowana technika Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats sparowana z endonukleazą Cas9 (CRISPR/Cas9, CRISPR). CRISPR/Cas9 to narzędzie do edycji genomu, które weszło do powszechnego użycia zarówno w modelu32,33,34 i organizmach niemodelowych35,36,37. Technologia CRISPR/Cas9 rozwinęła się do punktu, w którym laboratorium zdolne do podstawowej biologii molekularnej może z łatwością generować specyficzne dla genów sondy zwane krótkimi przewodnikami RNA (sgRNA), przy niskich kosztach przy użyciu metody bez klonowania38. CRISPR ma przewagę nad innymi strategiami nokautu/knockdown, takimi jak morpholinos39,40, nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALENs) i nukleazy palca cynkowego (ZFN), których generowanie dla każdego docelowego genu jest kosztowne i czasochłonne.
System CRISPR/Cas9 działa w celu tworzenia nokautów genów, celując w określony region genomu, kierowany przez sekwencję sgRNA i powodując dwuniciowe pęknięcie. Pęknięcie dwuniciowe jest wykrywane przez komórkę i uruchamia endogenne mechanizmy naprawy DNA preferencyjnie przy użyciu szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ). Szlak ten jest bardzo podatny na błędy: podczas procesu naprawy cząsteczka DNA często zawiera insercje lub delecje (indele) w miejscu pęknięcia dwuniciowego. Indele te mogą powodować utratę funkcji z powodu (1) przesunięć w otwartej ramce odczytu, (2) wstawienia przedwczesnego kodonu stop lub (3) przesunięć w krytycznej strukturze pierwszorzędowej produktu genu. W tym protokole wykorzystujemy edycję CRISPR/Cas9 do celowania w mutacje punktowe w genach docelowych za pomocą NHEJ u słabo elektrycznych gatunków ryb. Chociaż ta metoda mutagenezy jest prostsza i bardziej skuteczna niż inne techniki, oczekuje się, że spowoduje to szereg nasileń fenotypowych w F0, co przypisuje się mozaicyzmowi genetycznemu41,42,43,44.
Wybór organizmów 
W celu ułatwienia przyszłych badań nad genomiką porównawczą ryb o słabym natężeniu elektrycznym, konieczne było wybranie gatunku reprezentatywnego zarówno dla gymnotiformes, jak i mormyridów w celu opracowania protokołu. Po dyskusjach podczas spotkania Electric Fish w Montevideo w 2016 r. w Montevideo w Urugwaju, społeczność zgodziła się na wykorzystanie gatunków, które już mogły być hodowane w laboratorium i które miały dostępne zasoby genomowe. Gymnotiform Brachyhypopomus gauderio i mormyrid Brienomyrus brachyistius zostały wybrane jako gatunki spełniające te kryteria. U obu gatunków naturalne sygnały do wywoływania i utrzymywania warunków rozrodczych są łatwe do naśladowania w niewoli. B. gauderio, gatunek gymnotiform z Ameryki Południowej, ma tę zaletę, że ma niskie wymagania hodowlane: ryby mogą być trzymane w stosunkowo dużym zagęszczeniu w stosunkowo małych (4 l) zbiornikach. B. gauderio charakteryzuje się również szybką wymianą pokoleniową w warunkach niewoli. W warunkach laboratoryjnych B. gauderio może rozwinąć się z jaja do dorosłego osobnika w ciągu około 4 miesięcy.
B. brachyistius, gatunek ryb mormyrydów z Afryki Środkowo-Zachodniej, łatwo rozmnaża się w niewoli. B. brachyistius jest łatwo dostępny w handlu akwarystycznym i był szeroko stosowany w wielu badaniach, a obecnie dysponuje wieloma zasobami genomicznymi. Ich cykl życia wynosi 1-3 lata, w zależności od warunków laboratoryjnych. Wymagania hodowlane są nieco bardziej intensywne dla tego gatunku, wymagające średniej wielkości zbiorników (50−100 l) ze względu na ich agresję podczas lęgów.
Laboratoria badające inne gatunki ryb elektrycznych powinny być w stanie łatwo dostosować ten protokół, o ile gatunki mogą być hodowane, a zarodki jednokomórkowe mogą być zbierane i hodowane do dorosłości. Wskaźniki utrzymania, hodowli larw i zapłodnienia in vitro (IVF) prawdopodobnie zmienią się w przypadku innych gatunków; Jednak protokół ten może być wykorzystany jako punkt wyjścia do prób rozrodu u innych ryb o słabym natężeniu elektrycznym.
Idealny cel genetyczny do dowodu słuszności koncepcji: scn4aa<br />
Słabo elektryczne ryby mormyrydowe i gymnotiform wytwarzają pola elektryczne (elektrogenezę) poprzez rozładowanie wyspecjalizowanego narządu, zwanego narządem elektrycznym. Wyładowania elektryczne narządów (EOD) powstają w wyniku jednoczesnego wytwarzania potencjałów czynnościowych w komórkach narządów elektrycznych zwanych elektrocytami. EOD są wykrywane przez szereg elektroreceptorów w skórze w celu stworzenia wysokiej rozdzielczości obrazów elektrycznych otoczenia ryby45. Słabo elektryczne ryby są również zdolne do wykrywania cech przebiegów EOD swoich współplemieńców18, a także ich szybkości rozładowania46, co pozwala EOD funkcjonować dodatkowo jako sygnał komunikacji społecznej analogiczny do śpiewu ptaków lub wokalizacji żab47.
Głównym składnikiem generowania potencjału czynnościowego w elektrocytach zarówno ryb mormyrydowych, jak i gimnastykokształtnych o słabo elektrycznym wyglądzie jest bramkowany napięciem kanał sodowy NaV1.42. Nieelektryczne teleosty wyrażają dwie paralogiczne kopie genów, scn4aa i scn4ab, kodujące bramkowany napięciem kanał sodowy NaV1.430. Zarówno w liniach ryb gymnotiform, jak i mormyridów, scn4aa ewoluował szybko i przeszedł liczne substytucje aminokwasów, które wpływają na jego właściwości kinetyczne48. Co najważniejsze, scn4aa został podzielony w obu liniach na organy elektryczne2,3. Stosunkowo ograniczona ekspresja scn4aa w narządzie elektrycznym, a także jego kluczowa rola w generowaniu EOD, czyni go idealnym celem dla eksperymentów z nokautem CRISPR/Cas9, ponieważ ma minimalne szkodliwe efekty plejotropowe. Ponieważ słabo elektryczne ryby zaczynają rozładowywać swoje larwalne narządy elektryczne 6-8 dni po zapłodnieniu (DPF), celowanie w scn4aa idealnie nadaje się do szybkiego fenotypowania po mikroiniekcji zarodka.

<table><tbody><tr><td>20 mg / ml glikogen klasy RNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0551</td><td></td></tr><tr><td>50 pz drabinka DNA</td><td>NEB</td><td>N3236L</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara ze szkła borokrzemianowego z włóknem</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-58-10</td> <td>(średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,58 mm, długość 10 cm)</td></tr> <tr><td>Białko Cas9 z NLS; 1 mg / ml</td><td>PNA Biology</td><td>CP01</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Blood & Zestaw chusteczek</td><td>higienicznych Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf FemptoJet 4i Mikrowtryskiwacz</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5252000021</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader Końcówki do pipet</td><td></td> Strzykawka <td>Fisher Scientific</td> 10289651 <td></td></tr><tr><td>Hamilton</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-654</td><td>określana w protokole jako "precyzyjna szklana strzykawka"</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>określany jako "delikatne czyszczenie zadaniowe" w protokole</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Zestaw do transkrypcji</td><td>Invitrogen</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3 NEB</td><td></td><td>B7003S</td><td>używany do testu rozszczepienia in vitro</td></tr><tr><td>Zestaw DNA OneTaq</td><td>NEB</td><td>M0480L</td><td></td></tr><tr><td>Ovaprim</td><td>Syndel USA</td><td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td><td>określany jako "czynnik tarłowy" w protokole</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td>określany jako "termoplastyczny" w protokole</td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>WPI</td><td>SU-P97</td><td>marki</td></tr><tr><td>sutter Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Igła wielokrotnego użytku - wymaga dostosowania</td><td>Fisher Scientific</td><td>7803-02</td><td>Dostosuj do długości 0,7 cala; styl punktowy 4 i kąt 25</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA T4</td><td>NEB</td><td>M0203L</td><td>Używaj z 10x buforem NEB, który jest dołączony</td></tr> do <tr><td>narzędzi pokrytych teflonem</td><td>bonefolder.com</td><td>T-SPATULA4PIECE</td><td>określanych w protokole jako "politetrafluoroeten"</td></tr></tbody></table>

wyciszanie iskry: edycja genomu crispr/cas9 u ryb o słabym natężeniu elektrycznym

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Elektrorecepcja i elektrogeneza zmieniły się w ewolucyjnej historii kręgowców. Istnieje uderzający stopień konwergencji w tych niezależnie wyprowadzonych fenotypach, które mają wspólną architekturę genetyczną. Być może najlepszym tego przykładem są liczne zbieżne cechy gymnotiformes i mormyridów, dwóch bogatych gatunkowo kladów teleostowych, które wytwarzają i wykrywają słabe pola elektryczne i nazywane są rybami słabo elektrycznymi. W ciągu 50 lat od odkrycia, że słabo elektryczne ryby wykorzystują elektryczność do wyczuwania otoczenia i komunikowania się, rosnąca społeczność naukowców uzyskała ogromny wgląd w ewolucję rozwoju, systemy i obwody, neurobiologię, fizjologię komórkową, ekologię, biologię ewolucyjną i zachowanie. Ostatnio nastąpił wzrost zasobów genomowych ryb elektrycznych. Wykorzystanie tych zasobów umożliwiło już uzyskanie ważnych informacji na temat związku między genotypem a fenotypem u tych gatunków. Główną przeszkodą w integracji danych genomicznych z danymi fenotypowymi ryb o słabym natężeniu elektrycznym jest obecny brak funkcjonalnych narzędzi genomicznych. Przedstawiamy tutaj pełny protokół przeprowadzania mutagenezy CRISPR/Cas9, który wykorzystuje endogenne mechanizmy naprawy DNA u ryb o słabym natężeniu elektrycznym. Wykazaliśmy, że protokół ten jest równie skuteczny zarówno w przypadku gatunku mormyrydów Brienomyrus brachyistius, jak i gimnastyki Brachyhypopomus gauderio, wykorzystując CRISPR / Cas9 do celowania w indele i mutacje punktowe w pierwszym eksonie genu kanału sodowego scn4aa. Korzystając z tego protokołu, uzyskano zarodki obu gatunków i poddano je genotypowaniu, aby potwierdzić, że przewidywane mutacje w pierwszym eksonie kanału sodowego scn4aa były obecne. Fenotyp sukcesu nokautu został potwierdzony nagraniami wykazującymi zmniejszone amplitudy wyładowań elektrycznych narządów w porównaniu z niewstrzykniętymi kontrolami o dopasowanej wielkości.

Miejsca docelowe sgRNA zidentyfikowano w eksonie 1 genu scn4aa u obu gatunków, B. gauderio i B. brachyistius, zgodnie z opisem w sekcji 1. sgRNA wygenerowano zgodnie z opisem w sekcji 2. Po pomyślnym wyborze i syntezie sgRNA (Rycyna 1), przetestowano cięcie in vitro (Rycina 2). Następnie wybrano sgRNA wykazujące zdolność do cięcia in vitro do mikroiniekcji pojedynczych komórek.
Dorosłe ryby poddano kondycjon...

Tutaj przedstawiono protokół do produkcji i hodowli ryb elektrycznych z nokautem genomu CRISPR/Cas9. Szczegółowo przedstawiono wymagane wymagania z zakresu biologii molekularnej, hodowli i hodowli zarówno dla żywiciela, jak i mormyryda, a także techniki iniekcji w celu wytworzenia larw indelu F0 indukowanych przez Cas9.

Wyciszanie iskry: edycja genomu CRISPR/Cas9 u ryb o słabym natężeniu elektrycznym

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Edycja genów CRISPR/Cas9 u ryb o słabym natężeniu prądu, szczególnie w kontekście porównawczym, umożliwi naukowcom przetestowanie hipotez na temat tego, w jaki sposób określone geny i wariancja genetyczna przyczyniają się do zmienności fenotypowej. CRISPR/Cas9 to skuteczna metoda generowania zmutowanych zarodków F-zero. Protokół ten pozwala naukowcom na przeprowadzanie manipulacji CRISPR-Cas9 na dwóch zbieżnie wyewoluowanych gatunkach ryb o słabej elektryczności.Kluczem do zastosowania tego podejścia z pewnymi modyfikacjami u innych ryb elektrycznych lub innych gatunków ryb jest dostępność zasobów transkryptomicznych lub genomowych do wytwarzania sgRNA. Wykonywanie mikroiniekcji i wizualizacja komórek w lokalizacji 3D w płaszczyźnie 2D może być trudne. Uzyskaj małą kolonię danio pręgowanego na jaja, aby ćwiczyć ogólne techniki mikroiniekcji.Procedurę z Savvasem Constantinou zademonstruje Jared Thompson, technik z mojego laboratorium. Po umieszczeniu interesujących gatunków ryb w odpowiednich warunkach hodowlanych, należy zidentyfikować samice ryb, które wydają się ciężarne. U B.gauderio samica będzie miała spuchnięte gonady tuż doogonowe do otworu wentylacyjnego.U B.brachyistius samice będą miały spuchnięte brzuchy i będą wyglądać na głębokie. Po podaniu znieczulenia dodać środek tarlakowy do czterokrotności objętości DPBS w probówce PCR z dokładnym wymieszaniem. Roztwór stanie się mętny.Za pomocą pipety odmierz obliczoną dawkę i dozuj rozcieńczony środek do kawałka tworzywa termoplastycznego przed pobraniem roztworu do precyzyjnej szklanej strzykawki wyposażonej w igłę ze skosem o długości od 19 do 25 mililitrów w rozmiarze 28. Roztwór należy wstrzykiwać do mięśnia grzbietowego tułowia z płynną szybkością i pozostawić igłę na dwie do czterech sekund przed usunięciem. Następnie natychmiast umieść ryby w słodkiej wodzie systemowej w celu odzyskania sprawności.Do pobrania nasienia B.gauderio po 24 godzinach wybierz dużego samca ryby i jak najszybciej po uspokojeniu dokładnie wysusz rybę, szczególnie w okolicach głowy i otworu wentylacyjnego. Umieść suszoną rybę brzuszną stroną do góry, z przodu po lewej stronie w odpowiednim uchwycie, przykrytą wilgotnym ręcznikiem papierowym nasączonym MS222 z głową jak najbardziej równoległą do stołu. Natychmiast wywieraj nacisk w kierunku ogonowym do rostralnego ze światłem ściskając natychmiast nad gonadami w kierunku otworu wentylacyjnego i za pomocą mikropipetera z końcówką ostrożnie zbieraj plemniki, gdy są wyciskane z samca w odstępach co 50 mikrolitrów.Dodaj porcję plemników bezpośrednio do 500-mikrolitrowych objętości roztworu przedłużacza nasienia na lodzie. Natychmiast po zebraniu umieść ryby w świeżej wodzie systemowej uzdatnionej środkiem chroniącym przed śluzem. W przypadku zbierania jaj B.gauderio, po wysuszeniu znieczulonej samicy ryby B.gauderio, natychmiast ułóż rybę na boku z głową skierowaną w stronę ręki niedominującej i wywieraj nacisk w kierunku ogonowym do rostralnego ze światłem ściskającym przyśrodkowo nad gonadami w kierunku otworu wentylacyjnego.Za pomocą narzędzia z politetrafluoroetylenu ostrożnie zbierz jajka wyciskane z kloaki i szybko umieść jajka na małej przykrytej szalce Petriego. Jeśli pracujesz sam, po ściśnięciu dotknij masy jajowej do podstawy małej szalki Petriego, gdy są one wydalane z samicy. Natychmiast po zebraniu ikry należy umieścić ryby w świeżej wodzie systemowej uzdatnionej środkiem chroniącym przed śluzem.W przypadku zapłodnienia in vitro B.gauderio dodaj 100 mikrolitrów dobrze wymieszanego roztworu SES plemników bezpośrednio na masę jajową, a następnie jeden mililitr świeżej wody systemowej. Dokładnie wymieszaj zawiesinę gamet przez 30 do 60 sekund przed dodaniem do komórek dodatkowego jednego do dwóch mililitrów 0,22 mikrometra przefiltrowanej wody systemowej. Oznacz naczynie czasem zapłodnienia in vitro i umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 29 stopni Celsjusza, ustawiając 50-minutowy timer, aby sprawdzić postęp rozwoju.W okresie nawożenia należy użyć końcówki pipety do mikroładowacza, aby załadować dwa mikrolitry interesującego roztworu do wstrzykiwań do igły do mikroiniekcji i usunąć płyn jak najbliżej końcówki. Kiedy pojedyncza komórka utworzy się na biegunie zwierzęcym co najmniej jednej komórki, przenieś naczynie pod mikroskop preparacyjny i użyj pary cienkich kleszczyków, aby złamać końcówkę igły pod kątem skośnym w kierunku miejsca, w którym stożek igły zaczyna wykazywać sztywność. Otwór igły powinien pozostać jak najmniejszy, zachowując sztywny stożek.Zidentyfikuj rozwijające się zygoty pod mikroskopem i użyj plastikowej pipety transferowej z naciętą końcówką, aby umieścić od 10 do 20 jaj w jak najmniejszej ilości wody na krawędzi szklanego szkiełka mikroskopowego umieszczonego w odwróconej górnej części szalki Petriego. Za pomocą delikatnej chusteczki roboczej delikatnie dociśnij szkiełko, aby usunąć nadmiar wody, aby jajka mocno przylegały do krawędzi szkiełka. Woda będzie przesiąknięta pod zjeżdżalnią i będzie przyciągać jajka do krawędzi.Powinno być tylko tyle wody, aby jaja były wilgotne, a jednocześnie utrzymywały niewielką wilgotność stojącą, aby uniknąć ruchu jaj podczas wstrzykiwania. Ustaw jaja względem szkiełka pionowo, prostopadle do zbliżającej się igły i użyj mikromanipulatora, aby ustawić igłę względem kosmówki. Następnie, trzymając igłę pod kątem około 45 stopni, włóż końcówkę najpierw do kosmówki, a następnie do pojedynczej komórki, wstrzykując przez żółtko, jeśli to możliwe.Podczas wstrzykiwania należy usunąć wszelkie rozbite jaja za pomocą cienkich kleszczyków. Po wstrzyknięciu wszystkich jaj użyj butelki z wodą z filtrem porowym o średnicy 0,22 mikrometra, aby delikatnie przepłukać jaja z etapu wstrzykiwania do nowej szalki Petriego o średnicy 100 milimetrów. Po udanej selekcji i syntezie RNA w krótkim przewodniku, rozszczepienie in vitro można przetestować pod kątem selekcji mikroiniekcji pojedynczych komórek.Po oczyszczeniu i sklonowaniu metodą PCR, w tym reprezentatywnym eksperymencie, mutacje indukowane przez CRISPR-Cas9 zidentyfikowano w indywidualnych klonach B.gauderio i B.brachyistius z silnym zmniejszeniem amplitudy wyładowań elektrycznych, podczas gdy niewstrzyknięte grupy kontrolne wykazywały tylko referencyjne genotypy. Wizualizacja amplitudy wyładowań elektrycznych między potwierdzonymi mutantami CRISPR a wielkością środka dopasowaną do niewstrzykniętych kontroli wykazała, że zarówno zarodki B.brachyistius, jak i B. gauderio z mutacją SCN-4 AA i B. gauderio miały znacznie niższe amplitudy wyładowań narządowych niż kontrole. Podczas wykonywania mikroiniekcji należy poruszać się tak szybko i celowo, jak to możliwe, aby zmaksymalizować liczbę wstrzykniętych zarodków jednokomórkowych, które przeżyją.Nie trać czasu na trudne jajka. Po zidentyfikowaniu udanych mutantów, tradycyjne metody hodowli mogą stworzyć stabilne linie mutantów, które wyeliminują problemy związane z mozaicyzmem związanym z CRSPR. Protokół ten pozwoli naukowcom na przeprowadzenie porównawczych badań genomicznych z walidacją funkcjonalną na dwóch konwergencyjnie wyewoluowanych gatunkach ryb o słabej elektryczności.

silencing-the-spark-crisprcas9-genome-editing-in-weakly-electric-fish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje technikę nokautowania genów za pomocą mikroiniekcji blokujących translację morfolinosów w stadium jednokomórkowym ryby jaskiniowej. Morfolinos to oligonukleotydy DNA, które wiążą się z komplementarną sekwencją docelowego mRNA i blokują jej translację do białka. W związku z tym morfoliny są używane jako narzędzia molekularne do przejściowego zatrzymywania lub zmniejszania ekspresji genu.

Edycja genów za pośrednictwem morfolino: technika knockdownu genów wykorzystująca translacyjne blokowanie oligonukleotydów morfolino w jednokomórkowych jajach ryb jaskiniowych

Transgeniczne manipulacje i edycja genomu są kluczowe dla funkcjonalnego testowania ról genów i elementów cis-regulatorowych. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji w celu generowania modyfikacji genomowych (w tym fluorescencyjnych konstruktów transgenów reporterowych za pośrednictwem Tol2, TALEN-ów i CRISPR) dla wyłaniającej się ryby modelowej, ciernika trójkolcowego.

Mikroiniekcja do transgenezy i edycji genomu u cierników trójgrzbietowych

Mutageneza ukierunkowana na geny jest teraz możliwa w szerokim zakresie organizmów przy użyciu technik edycji genomu. W tym miejscu demonstrujemy protokół celowanej mutagenezy genów przy użyciu aktywatora transkrypcji, takiego jak nukleazy efektorowe (TALEN) u Astyanax mexicanus, gatunku ryb, który obejmuje ryby powierzchniowe i jaskiniowe.

Edycja genomu w Astyanax mexicanus przy użyciu nukleaz efektorowych podobnych do aktywatora transkrypcji (TALEN)

Przedstawiono prosty i skuteczny protokół mikroiniekcji do edycji genów w zarodkach sumów kanałowych za pomocą systemu CRISPR/Cas9. W tym protokole przewodnikowe RNA i białko Cas9 zostały mikrowstrzyknięte do żółtka jednokomórkowych zarodków. Protokół ten został zweryfikowany poprzez wyeliminowanie dwóch genów związanych z odpornością suma kanałowego.

Mikroiniekcja białka CRISPR/Cas9 do suma kanałowego, Ictalurus punctatus, zarodków do edycji genów

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Opisujemy podejścia do manipulacji genami w systemie modelu ewolucyjnego Astyanax mexicanus. Opisano trzy różne techniki: transgenezę za pośrednictwem Tol2, ukierunkowaną manipulację genomem za pomocą CRISPR/Cas9 oraz knockdown ekspresji za pomocą morpholinos. Narzędzia te powinny ułatwić bezpośrednie badanie genów leżących u podstaw zmienności między formami zamieszkującymi powierzchnię i jaskinie.

Manipulacja funkcją genów u meksykańskich ryb jaskiniowych

Tutaj opisujemy narzędzie do edycji genomu oparte na czasowej i warunkowej stabilizacji zgrupowanego, regularnie rozmieszczonego, krótkiego białka 9 (Cas9) związanego z powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) pod małą cząsteczką Shield-1. Metoda może być stosowana w przypadku hodowanych komórek i modeli zwierzęcych.

Nowy zestaw narzędzi do oceny funkcji genów za pomocą warunkowej stabilizacji Cas9

Ten protokół opisuje podejście ułatwiające precyzyjną edycję w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Przedstawiono proces fenotypowania, aby zademonstrować możliwość zastosowania tych technik do modelowania wariantu genu związanego z zespołem wydłużonego odstępu QT.

Precyzyjne edycje Knock-In za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w sercach danio pręgowanego

Technologie CRISPR-Cas zrewolucjonizowały dziedzinę edycji genomu. Jednak znalezienie i wyizolowanie pożądanej edycji linii zarodkowej pozostaje głównym wąskim gardłem. Dlatego protokół ten opisuje solidną metodę szybkiego badania przesiewowego nasienia danio pręgowanego wstrzykniętego za pomocą F0 CRISPR pod kątem edycji linii zarodkowej przy użyciu standardowych technik PCR, trawienia restrykcyjnego i elektroforezy żelowej.

Badania przesiewowe plemników w celu szybkiej izolacji zmian linii zarodkowej u danio pręgowanego

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić efektywną edycję zasady adeninowej bez ograniczeń PAM, aby zbudować precyzyjny model choroby danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e.

Wydajna edycja bazy bez PAM do modelowania chorób genetycznych człowieka u danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e

W tym miejscu opisujemy protokół generowania matczynego mutanta, który łączy stabilną linię knock-in zpc: cas9 z dostarczaniem kaset ekspresyjnych sgRNA za pośrednictwem Tol2.

Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego

Poznaj edycję genomu CRISPR/Cas9 u ryb o słabym natężeniu elektrycznym z rodzin Gymnotiformes i Mormyridae. Ta metoda umożliwia badanie funkcji genów i ich wpływu na fenotyp oraz zachowanie.

Wyciszanie iskry: edycja genomu CRISPR/Cas9 u ryb o słabym natężeniu elektrycznym

Przeglądaj więcej filmów