Obrazowanie żywych komórek w celu oceny dynamiki czasu metafazy i losu komórki po perturbacjach wrzeciona mitotycznego
20 września 2019
Tutaj prezentujemy protokół do oceny dynamiki powstawania wrzeciona i progresji mitotycznej. Nasze zastosowanie obrazowania poklatkowego umożliwia użytkownikowi identyfikację komórek na różnych etapach mitozy, śledzenie i identyfikację defektów mitotycznych oraz analizę dynamiki wrzeciona i losu komórek mitotycznych po ekspozycji na leki antymitotyczne.
Obrazowanie żywych komórek umożliwia obserwację dynamicznych procesów komórkowych w czasie w obrębie pojedynczej komórki. Podejścia te są skuteczne w ocenie warunków, które wpływają na dynamiczny proces podziału komórek i ujawnianiu wpływu, jaki defekty mitozy mają na proliferację i żywotność komórek potomnych. Fototoksyczność wynikająca z ekspozycji na światło podczas obrazowania stanowi poważne wyzwanie związane z tym protokołem.
W związku z tym należy zoptymalizować czasy naświetlania oraz interwał i czas trwania obrazowania. Stosując technikę aseptyczną i komorę bezpieczeństwa biologicznego na drugim poziomie bezpieczeństwa, użyj sterylnej jednorazowej szklanej pipety Pasteura do zasysania pożywki z płytki hodowlanej zawierającej linię komórkową zawierającą interesujący nas konstrukt wyrażenia. Krótko umyj komórki 10 mililitrami sterylnego PBS z wirowaniem i potraktuj komórki dwoma mililitrami 0,05% trypsyny.
Po dwóch do pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza dodaj do płytki osiem mililitrów świeżej pożywki, aby zatrzymać reakcję i ponownie zawiesić oderwane komórki za pomocą delikatnego pipetowania. Przenieś roztwór komórek do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów i zbierz komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach PBS i ponownie odwirować komórki.
Zawiesić osad w 10 mililitrach pożywki do liczenia i rozcieńczyć komórki do jednego do dwóch razy od 10 do 5 komórek na mililitr stężenia pożywki do hodowli komórkowych. Następnie wysiewaj 500 mikrolitrów komórek do każdej studzienki sterylnej 12-dołkowej płytki dolnej do obrazowania i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych, aby komórki przylegały do powierzchni płytki. Nie później niż 30 minut przed obrazowaniem dodać odpowiednie stężenie leku mitotycznego do jednego lub więcej studzienek i dodać równą objętość rozcieńczalnika inhibitora do tej samej liczby studzienek, co w kontrolach.
Aby przygotować mikroskop do obrazowania, należy umieścić płytkę na stoliku odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w kamerę o wysokiej rozdzielczości, komorę środowiskową podgrzaną do 37 stopni Celsjusza oraz system dostarczania nawilżonego 5% dwutlenku węgla. Wybierz 20-krotny obiektyw powietrzny z aperturą numeryczną 0,5 i wyposażony w obrazowanie fluorescencji o wysokim kontraście i kontraście fazowym lub obrazowanie w jasnym polu i view komórki, aby dostosować kurs i znaleźć ostrość, aby ustawić ostrość komórek. Aby ustawić optymalne czasy naświetlania dla akwizycji obrazów w jasnym polu, GFP i RFP, wybierz odpowiednie kostki filtrów o odpowiednim wzbudzeniu i emisji dla fluoroforów, które będą obrazowane, a następnie kliknij przycisk Odtwórz.
Jeśli sygnał nie jest wystarczająco intensywny, dostosuj automatyczną ekspozycję i w każdym kanale fluoroforowym wybierz odpowiednie binowanie z menu rozwijanego Format. Wybierz i skalibruj stolik mikroskopu do czaszy wielodołkowej zgodnie z instrukcjami producenta i użyj oprogramowania do akwizycji obrazu, aby podświetlić lub w inny sposób wybrać dołki, które będą obrazowane. Otwórz panel sterowania wygenerowanych punktów i w obszarze Obszar roboczy wybierz Ograniczone i Granica, aby ograniczyć obszar wyboru współrzędnych w celu wykluczenia granic studni.
Z menu rozwijanego Ograniczenie obszaru wybierz opcję Cały obszar i wybierz losowe rozmieszczenie punktów. Ustaw liczbę na sześć i kliknij przycisk Losowo, aby wybrać odpowiednio liczbę i rozkład punktów do przechwycenia na odwiert. Następnie kliknij i wprowadź wartości w panelu sterowania sekwencją czasową, aby wybrać i wprowadzić przedział czasowy i czas trwania zbierania obrazów.
Aby zobrazować chromatynę oznaczoną RFP-H2B, wybierz obrazy przechwycone z założoną kostką filtra RFP i zidentyfikuj komórkę wchodzącą w mitozę, jak wskazuje początkowe zagęszczenie chromatyny i rozpad otoczki jądrowej, aby określić mitotyczny czas wyrównania metafazy i początku anafazy w poszczególnych komórkach. Śledź interesującą komórkę przez kolejne punkty czasowe w pozyskanym filmie, aby określić liczbę punktów czasowych lub minut od wejścia mitotycznego do momentu, gdy chromatyna znakowana RFP-H2B zakończy wyrównanie na równiku komórki podczas metafazy. Aby monitorować czas mitotyczny, wierność mitotyczną i los komórki, kontynuuj śledzenie komórki przez kolejne punkty czasowe, aby zidentyfikować współrzędną czasową, w której widoczna jest segregacja chromosomów anafazowych i / lub kiedy nastąpiła dekompozycja chromatyny i reformacja otoczki jądrowej.
Następnie wizualizuj RFP-H2B, aby zidentyfikować komórki w każdej populacji, które wykazują defekty mitotyczne, w tym opóźnione chromosomy i mostki chromatyny podczas segregacji chromosomów anafazy. Wizualizując tubulinę alfa-EGFP, można zaobserwować, że komórki, które doświadczają zakłóceń wrzeciona, ulegają dynamicznym zmianom, gdy uzyskuje się ogniskowanie przyciągania wrzeciona i tworzy się dwubiegunowe wrzeciono mitotyczne w ramach przygotowań do podziału komórki. Równolegle z montażem wrzeciona, ruch chromosomów można wizualizować za pomocą RFP-H2B w celu oceny wyrównania chromosomów i wierności segregacji.
Wykorzystując metody obrazowania żywych komórek, te reprezentatywne wyniki pokazują, że komórki o normalnej zawartości centrosomów są w stanie przejść od rozpadu otoczki jądrowej przez wyrównanie metafazy i początek anafazy, aby osiągnąć podział dwubiegunowy w czasie krótszym niż 30 minut. W obecności dodatkowych centrosomów prawie 50% komórek jest w stanie pokonać przejściowe wielobiegunowe wrzeciono mitotyczne i utworzyć wrzeciono dwubiegunowe w pełnym podziale komórki. Pozostałe komórki nie są w stanie osiągnąć wrzeciona dwubiegunowego, w wyniku czego wychodzą z mitozy poprzez podział wielobiegunowy.
Niezależnie od tego, czy osiągnięta zostanie dwubiegunowość wrzeciona, komórki z dodatkowymi centrosomami wykazują znacznie wydłużony czas trwania mitozy w porównaniu z komórkami z dwoma centrosomami. Wskazuje to, że dynamika progresji mitotycznej może być zmieniona nawet wtedy, gdy zmiany w wyniku mitotycznym nie są widoczne. Definiując czasy ekspozycji dla kanałów fluorescencyjnych, zoptymalizuj czasy ekspozycji, aby ograniczyć fototoksyczność.
Można również wybrać grupowanie pikseli aparatu, aby umożliwić stosowanie krótszych czasów naświetlania. Procedura ta ma zastosowanie w badaniach farmakologicznych, analizie inwazji i migracji. Podejścia te można również zastosować do zbadania skuteczności leczenia farmakologicznego lub dynamiki ruchliwości komórek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia protokół oceny formacji wrzeciona i dynamiki postępowania mitozy poprzez obrazowanie time-lapse. Podejście to umożliwia identyfikację defektów mitotycznych oraz analizę dynamiki wrzeciona w odpowiedzi na leki przeciwmitotyczne.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Podział komórki
- Defekty mitotyczne
- Dynamika wrzeciona
Tło
- Obrazowanie żywych komórek ujawnia dynamiczne procesy komórkowe
- Fototoksyczność stanowi wyzwanie w protokołach obrazowań
- Zrozumienie mitozy wpływa na żywotność komórek potomnych
Stosowane metody
- Obrazowanie time-lapse
- Techniki hodowania komórek
- Mikroskopia fluorescencyjna
Główne wyniki
- Normalna zawartość centrosomy pozwala na terminowe i dwubiegunowe dzielenie
- Dodatkowe centrosomy powodują zmiany w postępowaniu mitozy
- Optymalizacja fototoksyczności poprawia jakość obrazowania
Wnioski
- Badanie przedstawia metodę wizualizowaniu mitozy i dynamiki wrzeciona.
- To badanie jest istotne dla zrozumienia procesów podziału komórki i ich implikacji.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Live cell imaging of mitotic spindle dynamics enables biopharma teams to directly observe the temporal sequence and fidelity of cell division events, which are critical for understanding drug-induced mitotic perturbations. This approach provides predictive confidence in evaluating compound effects on cell fate and division timing, supporting early discovery and mechanistic de-risking. Integrating dynamic imaging into R&D pipelines enhances the ability to triage targets and compounds based on real-time cellular outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Direct visualization of mitotic progression clarifies the impact of candidate targets on cell division fidelity.
- Dynamic tracking of spindle formation and chromosome alignment supports mechanistic de-risking in target validation.
- Quantitative timing of metaphase and anaphase transitions informs predictive confidence for downstream assays.
Screening & Assay Development
- Establishes validated live-cell systems for screening mitotic inhibitors and assessing compound-induced defects.
- Enables reproducible, quantitative measurement of mitotic timing and cell fate outcomes.
- Supports assay standardization by capturing transient phenotypes not observable in fixed-cell analysis.
Translational & Preclinical Research
- Facilitates evaluation of drug effects on cell division relevant to disease models with mitotic dysregulation.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by linking mechanistic effects to cell fate decisions.
- Enables risk-adjusted advancement of compounds with favorable mitotic profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This live cell imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling real-time assessment of mitotic events following compound treatment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on spindle assembly and chromosome segregation mechanisms.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for compound triage based on mitotic timing and defect rates.
- Analytics: Provides time-resolved measurements of metaphase duration and cell fate outcomes for comparative analysis.
- Translational Research: Aligns mitotic phenotypes with disease-relevant cellular models when supported by the system.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging platform adaptable to diverse cell lines and perturbations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target and compound selection by resolving dynamic mitotic processes.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging workflows for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions by linking mechanistic effects to cell fate outcomes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of assets based on quantitative mitotic readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, fluorescence microscopy, and cell culture techniques.
- Demands access to high-resolution, environmentally controlled imaging platforms.
- Necessitates optimization of exposure times and imaging intervals to minimize phototoxicity.
- Standardization across cell lines and experimental conditions is essential for reproducibility.
- Phototoxicity and transient phenotype detection represent practical limitations to consider.
