Name: Obrazowanie żywych komórek w celu oceny dynamiki czasu metafazy i losu komórki po perturbacjach wrzeciona mitotycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Poznaj metodę obrazowania żywych komórek w celu oceny dynamiki wrzeciona mitotycznego i czasu metafazy. Technika ta pozwala identyfikować defekty podziału komórkowego oraz analizować wpływ leków antymitotycznych na przebieg mitozy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DLM jest obsługiwany przez NSF GRFP. ALM jest wspierany przez fundusze z nagrody Smith Family Award for Excellence in Biomedical Research.

1. Generacja komórek hTERT-RPE-1 stabilnie wyrażających RFP-Histone 2B (RFP-H2B) i α-tubulinę-EGFP (tub-EGFP)
UWAGA: Wszystkie kroki są zgodne z technikami aseptycznymi i odbywają się w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu II+ (BSL2+).
<ol>
	<li>Wygenerowanie retrowirusa przenoszącego interesujące geny (α-tubulina-EGFP i RFP-H2B) poprzez transfekcję komórek 293T odpowiednimi plazmidami lentiwirusowymi zgodnie z instrukcjami producenta systemu dostarczania transfekcji opartej na lipidach.
	<ol>
		<li>Dzień 1: Użyj jednorazowej szklanej pipety Pasteura, aby odessać pożywkę do hodowli komórkowej z płytki z sub-konfluentnymi komórkami 293T i zmyć pozostałą pożywkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), dodając 5 ml PBS. Zamieszać, aby rozprowadzić PBS na dnie płytki, a następnie zassać PBS sterylną jednorazową szklaną pipetą Pasteura.</li>
		<li>Dodać 2 ml 0,05% trypsyny, która została wstępnie podgrzana do 37 °C i umieścić płytkę z powrotem w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 2 do 5 minut, aby umożliwić uwolnienie przylegających komórek z powierzchni szalki do hodowli komórkowej.</li>
		<li>Do płytki zawierającej trypsynę dodać 8 ml świeżej pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny.</li>
		<li>Zawiesić krwinki, delikatnie pipetując, a zawiesinę przenieść do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umieść stożkową probówkę w zbalansowanej wirówce i wiruj z prędkością 161 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby delikatnie otulić komórki.</li>
		<li>Odessać roztwór pożywki/trypsyny z komórek granulowanych i ponownie zawiesić komórki w 10 ml DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliną/streptomycyną. Użyj hemocytometru, aby policzyć zawiesinę komórek 293T i płytkę 2 x 106 komórek 293T na dołek płytki 6-dołkowej.</li>
		<li>Hodowle komórek o łącznej objętości 2 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny i utrzymywane w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
		<li>Dzień 2: Odpipetować 7 μl odczynnika do transfekcji na bazie lipidów i 100 μl zredukowanej pożywki surowicy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i pozostawić do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 5 minut (probówka #1).</li>
		<li>W oddzielnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml odpipetuj 1 μg wektora ekspresyjnego RFP-H2B (lub 1 μg wektora ekspresyjnego α-tubuliny-EGFP) wraz z 5 μl odczynnika wzmacniającego (zgodnie z wymaganiami producenta), 0,5 μg pMD2.G i 1 μg psPAX2 oraz 100 μl zredukowanej pożywki surowicy (probówka #2).</li>
		<li>Połączyć zawartość kroku 1.1.7 i kroku 1.1.8, ostrożnie pipetując probówkę #2 do probówki #1 i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Reakcja może być skalowana w zależności od potrzeb w celu transfekcji komórek w dodatkowych studzienkach.</li>
		<li>Pipetować reakcję transfekcji kroplami do żądanej studzienki zawierającej 293T komórki w 2 ml pożywki i umieścić naczynie z powrotem w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
		UWAGA: Aby wygenerować komórki wykazujące ekspresję zarówno RFP-H2B, jak i α-tubuliny-EGFP, wygeneruj oddzielnego wirusa dla każdego konstruktu ekspresji (kroki 1.1.7-1.1.9).</li>
		<li>Dzień 3: Odessać i zastąpić pożywkę 2 ml świeżego DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny. Umieścić naczynie z powrotem w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 4: Zbierz pożywkę zawierającą wyrażone cząsteczki wirusa, uważając, aby nie zakłócić lub nie usunąć komórek 293T. Przefiltrować pożywkę zawierającą cząsteczki wirusa, przepuszczając ją przez filtr 0,45 μM podłączony do strzykawki o pojemności 5 ml. Podwielokrotność wirusa do krótkotrwałego przechowywania w temperaturze 4 °C lub długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Uzyskane w ten sposób cząsteczki wirusa będą obecne w zakresie ~1 x 107 do 1 x 108 jednostek transdukcyjnych/ml. Ponieważ zarówno komórki wytwarzające wirusa, jak i komórki, które mają być zakażone, są hodowane w tej samej pożywce, stężenie wirusa w celu zastąpienia pożywki nie jest wymagane, a przefiltrowane cząsteczki wirusa mogą być używane bezpośrednio do infekowania komórek.</li>
	<li>Wysiew: 2 x 10 5 komórek hTERT-RPE-1 na studzienkę 6-dołkowego naczynia w ramach przygotowania do infekcji wirusowej. Hodowla komórek w 2 ml DMEM uzupełniona 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny i utrzymywana w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Dzień 5: Dodać bromek heksadimetryny (np. polibren) do komórek hTERT-RPE-1 do końcowego stężenia 8 μg/ml. Zakażone komórki mieszaniną 500 μl wirusa rozcieńczonego w 500 μl pożywki do hodowli komórkowych. 
	UWAGA: Roztwór podstawowy bromku heksadimetryny przygotowuje się w sterylnej wodzie destylowanej, a następnie filtruje przez filtr 0,45 μm.</li>
	<li>Dzień 6: Za pomocą jednorazowej szklanej pipety Pasteura odessać pożywkę z dołków zawierających komórki zakażone wirusem. Zastąp pożywkę do hodowli komórkowej 2 ml DMEM zawierającej 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i odpowiednie stężenia antybiotyku, aby wybrać integrację i ekspresję plazmidu. 
	UWAGA: Plazmid ekspresji α-tubuliny-EGFP użyty w opisanych eksperymentach przenosi gen oporności na puromycynę, a plazmid ekspresyjny RFP-H2B przenosi gen oporności na blasticydynę. Dlatego 10 μg/ml puromycyny i 2 μg/ml blasticydyny stosuje się do selekcji komórek α-tubuliny-EGFP, RFP-H2B eksprymujących hTERT RPE-1. Stężenia antybiotyku użytego do selekcji mogą się różnić dla różnych użytych linii komórkowych.</li>
	<li>Utrzymuj komórki pod selekcją antybiotykową przez 5-7 dni, zastępując pożywkę co 3 dni świeżą pożywką zawierającą odpowiednie odczynniki selekcyjne. 
	UWAGA: Komórki powinny być utrzymywane w stanie konfluencji podrzędnej podczas selekcji i powinny być rozszerzane w razie potrzeby, zgodnie z opisem w krokach od 1.1.1 do 1.1.4.</li>
	<li>Użyj obrazowania immunofluorescencyjnego, aby potwierdzić ekspresję oznakowanych konstruktów. 
	UWAGA: W razie potrzeby można uzyskać klony pojedynczych komórek, aby uzyskać jednolite poziomy ekspresji w populacji komórek. Po potwierdzeniu stabilnych klonów, komórki mogą być utrzymywane w standardowych warunkach hodowli przy braku selekcji antybiotyków.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek do obrazowania żywych komórek po perturbacjach wrzeciona mitotycznego
UWAGA: Stosuj techniki aseptyczne i wykonaj czynności w szafie bezpieczeństwa BSL2.
<ol>
	<li>Używając sterylnej, jednorazowej szklanej pipety Pasteura, odessać pożywkę z płytki hodowlanej zawierającej linię komórkową, która przenosi konstrukt ekspresyjny (konstrukty) ekspresyjny (od kroku 1.7). Krótko przemyć komórki 10 ml sterylnego PBS. Zamieszaj, aby rozprowadzić PBS na dnie płytki, a następnie odessać PBS sterylną jednorazową szklaną pipetą Pasteura.</li>
	<li>Dodaj 2 ml 0,05% trypsyny do 10 cm płytki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 2-5 minut lub do momentu, gdy komórki oderwą się od powierzchni płytki.</li>
	<li>Dodaj 8 ml świeżej pożywki do płytki zawierającej trypsynę. Zawiesić krwinki, delikatnie pipetując, a zawiesinę przenieść do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umieść stożkową probówkę w zbalansowanej wirówce i wiruj z prędkością 161 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby delikatnie otulić komórki.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml PBS, delikatnie pipetując pipetą serologiczną o pojemności 10 ml. Umieść stożkową probówkę w zbalansowanej wirówce i wiruj z prędkością 161 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby delikatnie otulić komórki.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml świeżej pożywki, delikatnie pipetując pipetą serologiczną o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Policz komórki, a następnie oblicz liczbę komórek za pomocą hemacytometru i rozcieńcz do stężenia 1-2 x 105 komórek/ml w pożywce do hodowli komórkowych. Zasiać 500 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka sterylnej 12-dołkowej płytki dolnej do obrazowania. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych i pozwolić komórkom przylgnąć do powierzchni płytki. 
	UWAGA: Obrazowanie żywych komórek wymaga, aby komórki były dobrze przylegające, aby pozostały skojarzone z płaszczyzną obrazowania podczas akwizycji obrazu. Czas potrzebny do przylegania komórek po posiewie może się różnić w zależności od linii komórkowej i powinien być zoptymalizowany dla badanej linii komórkowej.</li>
	<li>Do 30 minut przed rozpoczęciem obrazowania poklatkowego dodaj odpowiednie stężenie leku mitotycznego do jednego lub więcej studzienek obsianych komórkami. Aby uwzględnić potencjalny wpływ rozpuszczalnika organicznego na zachowanie komórek, dodaj równą objętość rozcieńczalnika inhibitora do komórek jako kontrolę. Na przykład należy upewnić się, że dodanie 100 nM specyficznego inhibitora kinazy mitotycznej Aurora A (np. alisertibu) jest równoległe z równą objętością DMSO, rozcieńczalnika dla tego leku, w studzience kontrolnej komórek. 
	UWAGA: Analiza porównawcza dynamicznych zmian w progresji mitotycznej wymaga przygotowania studzienek komórek przy braku zakłóceń, aby umożliwić obrazowanie normalnych mitoz równolegle do warunków eksperymentalnych.</li>
</ol>
3. Mikroskop ustawiony do obrazowania poklatkowego komórek RFP-H2B, α-tubulina-GFP (Rysunek 1, <silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Umieścić płytkę do hodowli komórkowej zawierającą RFP-H2B, α-tubulinę-GFP eksprymujące komórki hTERT RPE-1 do obrazowania w odpowiedniej wstawce etapowej na odwróconym mikroskopie epifluorescencyjnym, który jest wyposażony w kamerę o wysokiej rozdzielczości (rozmiar piksela 0,67 μm przy 20x), komorę środowiskową podgrzaną do 37 °C oraz system dostarczania do nawilżania 5% CO2, 
UWAGA: Odpowiednie mogą być zarówno zamknięte komory środowiskowe, jak i wkładki stage z kontrolowaną temperaturą, pod warunkiem, że można dostarczyć nawilżone 5% CO2 i uzyskać stabilną kontrolę temperatury.</li>
	<li>Użyj obiektywu pneumatycznego o powiększeniu 20x z aperturą numeryczną 0,5 i przystosowanym do obrazowania fluorescencji i kontrastu fazowego o wysokim kontraście lub jasnego pola. Oglądaj komórki z kontrastem fazowym lub jasnym polem i dostosuj przebieg i precyzyjną ostrość pod mikroskopem, aby ustawić ostrość komórek.</li>
	<li>Zidentyfikuj i ustaw optymalne czasy naświetlania dla akwizycji obrazu w jasnym polu, GFP i RFP, wybierając odpowiednią kostkę filtra o odpowiednim wzbudzeniu i emisji dla fluoroforów, które będą obrazowane. Możesz też kliknąć przycisk automatycznej ekspozycji, aby wprowadzić z góry określony czas ekspozycji. Jeśli sygnał nie jest wystarczająco intensywny, wybierz grupowanie pikseli, aby umożliwić krótsze czasy ekspozycji, klikając kartę kategoryzacji i wybierając opcję łączenia pikseli 2 x 2 piksele z menu rozwijanego. 
	UWAGA: Fototoksyczność może upośledzać progresję mitotyczną i żywotność komórek. Niepowodzenie komórek mitotycznych w populacjach kontrolnych w ukończeniu normalnych mitoz może wskazywać, że czasy ekspozycji i/lub czas trwania obrazowania wymagają dalszej optymalizacji.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do akwizycji i analizy, które umożliwia jednoczesne wykonywanie obrazowania wielokierunkowego i wielodołkowego oraz definiowanie parametrów akwizycji obrazu.
	<ol>
		<li>Wybierz i skalibruj stolik mikroskopu do czaszy wielodołkowej, zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj oprogramowania do akwizycji obrazu, aby podświetlić lub w inny sposób wybrać dołki, które zostaną zobrazowane, klikając odpowiednie dołki na schemacie używanego formatu płyty.</li>
		<li>W panelu sterowania GeneratedPoints (Rysunek 2) zdefiniuj współrzędne w każdym dołku, który zostanie zobrazowany, klikając kartę Umieszczanie punktów i wybierając predefiniowane lub losowe rozmieszczenie współrzędnych z menu rozwijanego. Wybierz kartę Obszar roboczy i wybierz opcję Ograniczony z menu rozwijanego, aby ograniczyć obszar wyboru współrzędnych w celu wykluczenia granic studni. Kliknij karty Count (Liczba) i Distribution (Rozkład), aby wybrać odpowiednio liczbę i rozkład punktów do przechwycenia na odwiert. 
		UWAGA: Liczba współrzędnych, które można zobrazować dla każdego dołka w ciągu 5-minutowego przyrostu punktu czasowego, będzie ograniczona liczbą dołków do zobrazowania, a także czasem ekspozycji dla każdego kanału. Zazwyczaj 5-8 współrzędnych na studzienkę wystarcza, aby zaobserwować, jak co najmniej 50 komórek w każdym stanie przechodzi przez mitozę w ciągu 4 godzin.</li>
		<li>Wybierz i wprowadź przedział czasu i czas trwania zbierania obrazów, klikając i wprowadzając wartości w panelu sterowania TimeSequence. 
		UWAGA: Akwizycja obrazów co 1 do 5 minut jest odpowiednia do monitorowania dynamiki progresji mitotycznej. Całkowity czas trwania obrazowania powinien odzwierciedlać pożądany punkt końcowy i szybkość proliferacji linii komórkowej. Na przykład 4 godziny wystarczą, aby zobaczyć, jak wiele komórek przechodzi przez mitozę, 16 godzin wystarczy, aby zobaczyć, jak większość komórek RPE-1 w populacji asynchronicznej przechodzi przez mitozę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza obrazu poklatkowego w celu określenia czasu metafazy i losu komórki mitotycznej po perturbacjach wrzeciona mitotycznego
UWAGA: Przeprowadź analizę obrazu za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazów (Tabela materiałów), ImageJ lub porównywalnego oprogramowania do analizy obrazu.
<ol>
	<li>Wizualizuj chromatynę oznaczoną znakiem RFP-H2B, wybierając obrazy przechwycone z umieszczoną kostką filtra RFP. Zidentyfikuj komórkę wchodzącą w mitozę, jak wskazuje początkowe zagęszczenie chromatyny (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C, niebieski grot strzałki) i rozpad otoczki jądrowej (gdy α-tubulina-EGFP nie jest już wykluczona przez granicę jądrową).</li>
	<li>Określ mitotyczny czas wyrównania metafazy i początku anafazy w poszczególnych komórkach: Śledź komórkę przez kolejne punkty czasowe w uzyskanym filmie, aby określić liczbę punktów czasowych / minut od wejścia mitotycznego do momentu, gdy chromatyna znakowana RFP-H2B zakończy wyrównanie na równiku komórki podczas metafazy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C, żółty grot strzałki).</li>
	<li>Aby monitorować czas mitotyczny, wierność mitotyczną i los komórki, kontynuuj śledzenie komórki przez kolejne punkty czasowe, aby zidentyfikować współrzędną czasową, w której segregacja chromosomów anafazy jest widoczna (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C, biały grot strzałki) i/lub gdzie nastąpiła dekompozycja chromatyny i reformacja otoczki jądrowej (na co wskazuje wykluczenie tubuliny z jądra). 
UWAGA: Perturbacje w montażu wrzeciona lub progresja mitotyczna mogą być oceniane jako funkcja czasu wymaganego do uzyskania dwubiegunowego wrzeciona mitotycznego i osiągnięcia pełnego wyrównania chromosomów lub do całkowitej segregacji chromosomów anafazy.</li>
	<li>Wizualizacja RFP-H2B w celu identyfikacji komórek w każdej populacji, które wykazują defekty mitotyczne, w tym opóźnione chromosomy i mostki chromatyny podczas segregacji chromosomów anafazowych. 
	UWAGA: Obniżona wierność mitotyczna może również skutkować wielojądrowymi lub mikrojądrowymi komórkami potomnymi i może być wizualizowana w komórkach po wyjściu mitotycznym, jak w <silna klasa = "xfig" >Rysunek 3.</li>
</ol>

<ol><li>Szuts, D., Krude, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+arrest+at+the+initiation+step+of+human+chromosomal+DNA+replication+causes+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage.</a> Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).</li>
<li>Gayek, A. S., Ohi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDK-1+Inhibition+in+G2+Stabilizes+Kinetochore-Microtubules+in+the+following+Mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis.</a> PLoS One. 11, e0157491(2016).</li>
<li>Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+nuclear+pore+assembly+lead+to+activation+of+an+Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint.</a> The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).</li>
<li>Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merotelic+kinetochore+orientation+versus+chromosome+mono-orientation+in+the+origin+of+lagging+chromosomes+in+human+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).</li>
<li>Kwon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+to+suppress+multipolar+divisions+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes.</a> Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).</li>
<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li>
<li>Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+anti-mitotic+drugs+kill+cancer+cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?</a> Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).</li>
<li>van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimitotic+drugs+in+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemotherapy+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Antimitotic drugs in the treatment of cancer.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).</li>
<li>Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis-targeted+anti-cancer+therapies%3A+where+they+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand.</a> Cell Death and Diseases. 3, 411(2012).</li>
<li>Martin, M., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+into+Focus%3A+Mechanisms+of+Microtubule+Minus-End+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization.</a> Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).</li>
<li>Maiato, H., Logarinho, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+multipolarity+without+centrosome+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification.</a> Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).</li>
<li>Vitre, B. D., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomes%2C+chromosome+instability+%28CIN%29+and+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).</li>
<li>Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+centrosome+abnormalities+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).</li>
<li>Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+A+inhibition+limits+centrosome+clustering+and+promotes+mitotic+catastrophe+in+cells+with+supernumerary+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes.</a> Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).</li>
<li>Conte, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TACC1-chTOG-Aurora+A+protein+complex+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer.</a> Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).</li>
<li>Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+conserved+centrosomal+kinase%2C+AIR-1%2C+is+required+for+accurate+cell+cycle+progression+and+segregation+of+developmental+factors+in+Caenorhabditis+elegans+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos.</a> Development. 125, 4391-4402 (1998).</li>
<li>Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora-A+inactivation+causes+mitotic+spindle+pole+fragmentation+by+unbalancing+microtubule-generated+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces.</a> Molecular Cancer. 10, 131(2011).</li>
<li>Chan, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+overview+of+centrosome+amplification+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A clinical overview of centrosome amplification in human cancers.</a> International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).</li>
<li>Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+clustering+and+chromosomal+%28in%29stability%3A+a+matter+of+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death.</a> Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).</li>
<li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460, 278-282 (2009).</li>
<li>Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipolar+spindle+pole+coalescence+is+a+major+source+of+kinetochore+mis-attachment+and+chromosome+mis-segregation+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells.</a> PLoS One. 4, e6564(2009).</li>
<li>Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+aberrations%3A+cause+or+consequence+of+cancer+progression%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%2C+Cancer%22%5BJournal%5D)">Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression?</a> Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).</li>
<li>Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomes+and+cancer%3A+how+cancer+cells+divide+with+too+many+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes.</a> Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).</li>
<li>Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+multipolarity+is+prevented+by+centrosomal+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering.</a> Science. 307, 127-129 (2005).</li>
<li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rozdzielczość czasowa zapewniana przez obrazowanie poklatkowe pozwala na wizualizację i ocenę sekwencyjnych zdarzeń komórkowych w obrębie pojedynczych komórek. Podejścia, które wykorzystują synchronizację komórkową, a następnie zbieranie i utrwalanie komórek w sekwencyjnych punktach czasowych, są ograniczone, ponieważ ostatecznie dokonuje się porównań między populacjami komórek. W kontekstach, w których odpowiedź komórkowa na perturbacje może być niejednorodna lub gdy wizualizowany proces jest dynamiczny, obrazowanie pok...

Oparta na obrazie analiza stałych komórek jest powszechnie używana do oceny zmian poziomu populacji komórek w odpowiedzi na różne perturbacje. W połączeniu z synchronizacją komórek, a następnie zbieraniem i obrazowaniem szeregowych punktów czasowych, takie podejścia można wykorzystać do zasugerowania komórkowej sekwencji zdarzeń. Niemniej jednak obrazowanie komórek o stałym poziomie jest ograniczone, ponieważ relacje czasowe są implikowane dla populacji i nie są wykazywane na poziomie pojedynczych komórek. W ten sposób, podczas gdy obrazowanie i analiza komórek stacjonarnych są wystarczające do zaobserwowania solidnych fenotypów i zmian w stanie ustalonym, zdolność do wykrywania przejściowych zmian w czasie i zmian, które wpływają tylko na subpopulację komórek, jest niedoskonała. W przeciwieństwie do tego, obrazowanie żywych komórek jest wymownym narzędziem, które może być używane do obserwacji procesów komórkowych i subkomórkowych w pojedynczej komórce lub populacji komórkowej, w czasie i bez pomocy podejść synchronizacyjnych, które same w sobie mogą wpływać na zachowanie komórek1,2,3,4,5,6.
Utworzenie dwubiegunowego wrzeciona mitotycznego jest niezbędne dla prawidłowej segregacji chromosomów podczas podziału komórki, co skutkuje powstaniem dwóch genetycznie identycznych komórek potomnych. Defekty w strukturze wrzeciona mitotycznego, które zakłócają progresję mitotyczną i zagrażają wierności segregacji chromosomów, mogą powodować katastrofalne podziały komórkowe i zmniejszoną żywotność komórek. Z tego powodu trucizny mitotyczne, które zmieniają tworzenie wrzeciona, są obiecującymi terapiami ograniczającymi szybką proliferację komórek rakowych7,8,9. Niemniej jednak, analiza stałej struktury wrzeciona po dodaniu trucizn mitotycznych ma ograniczoną zdolność do oceny dynamicznego procesu tworzenia wrzeciona i może nie wskazywać, czy obserwowane zmiany w strukturze wrzeciona są trwałe, czy raczej przejściowe i mogą zostać przezwyciężone, aby umożliwić pomyślny podział komórki.
W tym protokole opisujemy podejście do oceny dynamiki mitozy po perturbacjach wrzeciona za pomocą obrazowania żywych komórek. Korzystając z unieśmiertelnionej linii komórkowej RPE-1 hTERT zaprojektowanej do ekspresji histonu 2B oznaczonego RFP w celu wizualizacji chromatyny, wraz z α-tubuliną znakowaną EGFP do wizualizacji mikrotubul, czas wyrównania chromosomów metafazy, początek anafazy i ostatecznie los komórki mitotycznej są oceniane za pomocą wizualnych wskazówek dotyczących ruchu chromosomów, zagęszczenia i morfologii jądrowej.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>25-510</td><td>Proteaza serynowa stosowana do uwalniania przylegających komórek z naczyń hodowlanych</td></tr><tr><td>15ml probówki wirówkowe</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>20x CFI Plan Fluor obiektyw&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>Do stosowania w obrazowaniu żywych komórek do wizualizacji zarówno jasnego pola, jak i fluorescencji</td></tr><tr><td>Komórki 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Do stosowania w transfekcji retrowirusowej; stosowany w kroku 1.1</td></tr><tr><td>a-tubulina-EGFP&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>różne liczby</td><td>Wektor ekspresji dla tubuliny alfa połączonej z zielonym znacznikiem białka fluorescencyjnego; do stosowania w wizualizacji tubuliny w obrazowaniu żywych komórek: komercyjnie dostępny za pośrednictwem Addgene i innych dostawców</td></tr><tr><td>Alisertib</td><td>Selleckchem</td><td>S1133</td><td>Małocząsteczkowy inhibitor kinazy mitotycznej Aurora A. Stężenie podstawowe przygotowuje się w 10 mM w DMSO i stosuje w końcowym stężeniu 100 nM.</td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invitrogen</td><td>A11139-03</td><td>Środek selekcyjny do antybiotyków; stosowany do selekcji komórek eksprymujących a-tub-EGFP</td></tr><tr><td>C02</td><td>Airgas</td><td></td><td>Do stosowania w hodowlach komórkowych i obrazowaniu żywych komórek</td></tr><tr><td>Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3)</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td>Jednozakresowy zestaw filtrów; długość fali wzbudzenia 545nm o szerokości pasma 25nm i emisja przy długości fali 605nm o szerokości pasma 70nm; do wizualizacji H2B-RFP</td></tr><tr><td>Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2)</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td>Zestaw filtrów jednopasmowych; długość fali wzbudzenia 470nm o szerokości pasma 40nm i emisja przy długości fali 525nm o szerokości pasma 50nm; do wizualizacji jednorazowych pipet Pastuer z tubuliny GFP,</td></tr><tr><td>sterylizowane&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td>Do stosowania w komórkach aspiracyjnych&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>11965-084</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych do wzrostu komórek RPE-1 i 293T</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>10438-026</td><td>Suplement pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000 i p3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000-015</td><td>Odczynnik do transfekcji na bazie lipidów do transfekcji plazmidów; stosowany w 1.1.4</td></tr><tr><td>Naczynia do wielodołkowych kultur tkankowych</td><td>Corning</td><td>różne</td><td>do stosowania w hodowli komórkowych, transfekcji/infekcji i obrazowaniu żywych komórek</td></tr><tr><td>Mikroskop Ti-E firmy Nikon</td><td>Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny firmy Nikon do stosowania w obrazowaniu żywych komórek</td><td></td> NIS Elements HC&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>wersja 4.51</td><td>Oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazu; używane w sekcjach 3 i 4</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>31985-070</td><td>Zredukowana pożywka surowicowa do transfekcji komórek; stosowana w kroku 1.1.3</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna&nbsp;</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>15140-122</td><td>antybiotyk stosowany w pożywce</td></tr><tr><td>z roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem do hodowli komórkowych (PBS)</td><td>Caisson labs</td><td>PBP06-10X1LT</td><td>sterylny roztwór soli fizjologicznej do stosowania z hodowlą komórkową</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Lentiwirusowy konstrukt ekspresji otoczki VSV-G; stosowany w kroku 1.1.4</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>Polimer kationowy stosowany do zwiększania skuteczności infekcji wirusowych; stosowany w kroku 1.1.10</td></tr><tr><td>psPAX</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>plazmid do pakowania lentiwirusa 2. generacji; stosowany w kroku 1.1.4</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-pr-1</td><td>Środek selekcyjny antybiotyku; używany do selekcji komórek eksprymujących RFP-H2B</td></tr><tr><td>RFP- Histone 2B (H2B)</td><td>Addgene</td><td>różne liczby</td><td>Wektor ekspresji dla histonu 2B znakowanego białkiem czerwonej fluorescencji; do stosowania w wizualizacji chromatyny w obrazowaniu żywych komórek: komercyjnie dostępny przez Addgene i innych dostawców</td></tr><tr><td>RNAi Max</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td>Odczynnik do transfekcji na bazie lipidów do transfekcji konstruktów siRNA</td></tr><tr><td>Komórki RPE-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td>Linia komórkowa nabłonka barwnika ludzkiego</td></tr> siatkówki <tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 100x20mm</td><td>Corning&nbsp;</td><td>353003</td><td>do stosowania w hodowli komórek adherentnych</td></tr><tr><td>Kamera Zyla sCMOS&nbsp;</td><td>Aparat Nikon</td><td></td><td>dołączony do miroskopu, służący do robienia zdjęć komórek</td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywych komórek w celu oceny dynamiki czasu metafazy i losu komórki po perturbacjach wrzeciona mitotycznego

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Obrazowanie poklatkowe na żywo komórek jest ważnym narzędziem w biologii komórki, które dostarcza wglądu w procesy komórkowe, które w przeciwnym razie mogłyby zostać przeoczone, źle zrozumiane lub błędnie zinterpretowane przez analizę komórek stałych. Podczas gdy obrazowanie i analiza komórek stałych jest solidna i wystarczająca do obserwacji stanu ustalonego komórki, może być ograniczona w definiowaniu czasowej kolejności zdarzeń na poziomie komórkowym i jest słabo przygotowana do oceny przejściowej natury procesów dynamicznych, w tym progresji mitotycznej. W przeciwieństwie do tego, obrazowanie żywych komórek jest wymownym narzędziem, które można wykorzystać do obserwacji procesów komórkowych na poziomie pojedynczej komórki w czasie i ma zdolność uchwycenia dynamiki procesów, które w przeciwnym razie byłyby słabo reprezentowane w obrazowaniu komórek stałych. Tutaj opisujemy podejście do generowania komórek przenoszących znakowane fluorescencyjnie markery chromatyny i mikrotubul oraz ich zastosowanie w podejściach do obrazowania żywych komórek w celu monitorowania wyrównania chromosomów metafazy i wyjścia mitotowego. Opisujemy techniki oparte na obrazowaniu do oceny dynamiki powstawania wrzeciona i progresji mitotycznej, w tym identyfikacji komórek na różnych etapach mitozy, identyfikacji i śledzenia defektów mitotycznych oraz analizy dynamiki wrzeciona i losu komórek mitotycznych po leczeniu inhibitorami mitotycznymi.

Ocena postępu mitozy w obecności zaburzeń wrzeciona 
Regulacja ogniskowania bieguna wrzeciona jest kluczowym etapem prawidłowego tworzenia wrzeciona dwubiegunowego. Zakłócenia w tym procesie poprzez deplecję białek, inhibicję lekową lub zmiany w liczbie centrosomów uszkadzają strukturę wrzeciona i opóźniają lub zatrzymują postęp mitozy10,1,12,13</s...

Tutaj prezentujemy protokół do oceny dynamiki powstawania wrzeciona i progresji mitotycznej. Nasze zastosowanie obrazowania poklatkowego umożliwia użytkownikowi identyfikację komórek na różnych etapach mitozy, śledzenie i identyfikację defektów mitotycznych oraz analizę dynamiki wrzeciona i losu komórek mitotycznych po ekspozycji na leki antymitotyczne.

Obrazowanie żywych komórek w celu oceny dynamiki czasu metafazy i losu komórki po perturbacjach wrzeciona mitotycznego

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

Obrazowanie żywych komórek umożliwia obserwację dynamicznych procesów komórkowych w czasie w obrębie pojedynczej komórki. Podejścia te są skuteczne w ocenie warunków, które wpływają na dynamiczny proces podziału komórek i ujawnianiu wpływu, jaki defekty mitozy mają na proliferację i żywotność komórek potomnych. Fototoksyczność wynikająca z ekspozycji na światło podczas obrazowania stanowi poważne wyzwanie związane z tym protokołem.W związku z tym należy zoptymalizować czasy naświetlania oraz interwał i czas trwania obrazowania. Stosując technikę aseptyczną i komorę bezpieczeństwa biologicznego na drugim poziomie bezpieczeństwa, użyj sterylnej jednorazowej szklanej pipety Pasteura do zasysania pożywki z płytki hodowlanej zawierającej linię komórkową zawierającą interesujący nas konstrukt wyrażenia. Krótko umyj komórki 10 mililitrami sterylnego PBS z wirowaniem i potraktuj komórki dwoma mililitrami 0,05% trypsyny.Po dwóch do pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza dodaj do płytki osiem mililitrów świeżej pożywki, aby zatrzymać reakcję i ponownie zawiesić oderwane komórki za pomocą delikatnego pipetowania. Przenieś roztwór komórek do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów i zbierz komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach PBS i ponownie odwirować komórki.Zawiesić osad w 10 mililitrach pożywki do liczenia i rozcieńczyć komórki do jednego do dwóch razy od 10 do 5 komórek na mililitr stężenia pożywki do hodowli komórkowych. Następnie wysiewaj 500 mikrolitrów komórek do każdej studzienki sterylnej 12-dołkowej płytki dolnej do obrazowania i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych, aby komórki przylegały do powierzchni płytki. Nie później niż 30 minut przed obrazowaniem dodać odpowiednie stężenie leku mitotycznego do jednego lub więcej studzienek i dodać równą objętość rozcieńczalnika inhibitora do tej samej liczby studzienek, co w kontrolach.Aby przygotować mikroskop do obrazowania, należy umieścić płytkę na stoliku odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w kamerę o wysokiej rozdzielczości, komorę środowiskową podgrzaną do 37 stopni Celsjusza oraz system dostarczania nawilżonego 5% dwutlenku węgla. Wybierz 20-krotny obiektyw powietrzny z aperturą numeryczną 0,5 i wyposażony w obrazowanie fluorescencji o wysokim kontraście i kontraście fazowym lub obrazowanie w jasnym polu i view komórki, aby dostosować kurs i znaleźć ostrość, aby ustawić ostrość komórek. Aby ustawić optymalne czasy naświetlania dla akwizycji obrazów w jasnym polu, GFP i RFP, wybierz odpowiednie kostki filtrów o odpowiednim wzbudzeniu i emisji dla fluoroforów, które będą obrazowane, a następnie kliknij przycisk Odtwórz.Jeśli sygnał nie jest wystarczająco intensywny, dostosuj automatyczną ekspozycję i w każdym kanale fluoroforowym wybierz odpowiednie binowanie z menu rozwijanego Format. Wybierz i skalibruj stolik mikroskopu do czaszy wielodołkowej zgodnie z instrukcjami producenta i użyj oprogramowania do akwizycji obrazu, aby podświetlić lub w inny sposób wybrać dołki, które będą obrazowane. Otwórz panel sterowania wygenerowanych punktów i w obszarze Obszar roboczy wybierz Ograniczone i Granica, aby ograniczyć obszar wyboru współrzędnych w celu wykluczenia granic studni.Z menu rozwijanego Ograniczenie obszaru wybierz opcję Cały obszar i wybierz losowe rozmieszczenie punktów. Ustaw liczbę na sześć i kliknij przycisk Losowo, aby wybrać odpowiednio liczbę i rozkład punktów do przechwycenia na odwiert. Następnie kliknij i wprowadź wartości w panelu sterowania sekwencją czasową, aby wybrać i wprowadzić przedział czasowy i czas trwania zbierania obrazów.Aby zobrazować chromatynę oznaczoną RFP-H2B, wybierz obrazy przechwycone z założoną kostką filtra RFP i zidentyfikuj komórkę wchodzącą w mitozę, jak wskazuje początkowe zagęszczenie chromatyny i rozpad otoczki jądrowej, aby określić mitotyczny czas wyrównania metafazy i początku anafazy w poszczególnych komórkach. Śledź interesującą komórkę przez kolejne punkty czasowe w pozyskanym filmie, aby określić liczbę punktów czasowych lub minut od wejścia mitotycznego do momentu, gdy chromatyna znakowana RFP-H2B zakończy wyrównanie na równiku komórki podczas metafazy. Aby monitorować czas mitotyczny, wierność mitotyczną i los komórki, kontynuuj śledzenie komórki przez kolejne punkty czasowe, aby zidentyfikować współrzędną czasową, w której widoczna jest segregacja chromosomów anafazowych i / lub kiedy nastąpiła dekompozycja chromatyny i reformacja otoczki jądrowej.Następnie wizualizuj RFP-H2B, aby zidentyfikować komórki w każdej populacji, które wykazują defekty mitotyczne, w tym opóźnione chromosomy i mostki chromatyny podczas segregacji chromosomów anafazy. Wizualizując tubulinę alfa-EGFP, można zaobserwować, że komórki, które doświadczają zakłóceń wrzeciona, ulegają dynamicznym zmianom, gdy uzyskuje się ogniskowanie przyciągania wrzeciona i tworzy się dwubiegunowe wrzeciono mitotyczne w ramach przygotowań do podziału komórki. Równolegle z montażem wrzeciona, ruch chromosomów można wizualizować za pomocą RFP-H2B w celu oceny wyrównania chromosomów i wierności segregacji.Wykorzystując metody obrazowania żywych komórek, te reprezentatywne wyniki pokazują, że komórki o normalnej zawartości centrosomów są w stanie przejść od rozpadu otoczki jądrowej przez wyrównanie metafazy i początek anafazy, aby osiągnąć podział dwubiegunowy w czasie krótszym niż 30 minut. W obecności dodatkowych centrosomów prawie 50% komórek jest w stanie pokonać przejściowe wielobiegunowe wrzeciono mitotyczne i utworzyć wrzeciono dwubiegunowe w pełnym podziale komórki. Pozostałe komórki nie są w stanie osiągnąć wrzeciona dwubiegunowego, w wyniku czego wychodzą z mitozy poprzez podział wielobiegunowy.Niezależnie od tego, czy osiągnięta zostanie dwubiegunowość wrzeciona, komórki z dodatkowymi centrosomami wykazują znacznie wydłużony czas trwania mitozy w porównaniu z komórkami z dwoma centrosomami. Wskazuje to, że dynamika progresji mitotycznej może być zmieniona nawet wtedy, gdy zmiany w wyniku mitotycznym nie są widoczne. Definiując czasy ekspozycji dla kanałów fluorescencyjnych, zoptymalizuj czasy ekspozycji, aby ograniczyć fototoksyczność.Można również wybrać grupowanie pikseli aparatu, aby umożliwić stosowanie krótszych czasów naświetlania. Procedura ta ma zastosowanie w badaniach farmakologicznych, analizie inwazji i migracji. Podejścia te można również zastosować do zbadania skuteczności leczenia farmakologicznego lub dynamiki ruchliwości komórek.

live-cell-imaging-to-assess-dynamics-metaphase-timing-cell-fate

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisujemy podstawowy protokół obrazowania i kwantyfikacji czasu trwania mitozy w żywych komórkach ssaków hodowlanych po transfekcji siRNA.

Obrazowanie time-lapse mitozy po transfekcji siRNA

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Przejście z metafazy do anafazy jest inicjowane poprzez zależną od kompleksu anafazy-promującego (APC/C) ubikwitynację i następującą po niej degradację cykliny B. W niniejszej pracy opracowaliśmy system, który po zastosowaniu znakowania metodą pulse-chase umożliwia monitorowanie proteolizy cykliny B w całych populacjach komórek oraz ułatwia wykrywanie interferencji wywołanej przez punkt kontrolny mitozy.

Badanie proteolizy cykliny B na poziomie pojedynczej komórki w populacjach całych komórek

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Przedstawiamy protokół podwójnej synchronizacji komórek HeLa z tymidyną, a następnie analizę za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta jest kluczem do uzyskania dużej liczby komórek, które przechodzą synchronicznie z fazy S do mitozy, umożliwiając badania nad mitotycznymi rolami wielofunkcyjnych białek, które również pełnią funkcje interfazowe.

Połączenie mitotycznej synchronizacji komórek i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania roli wielofunkcyjnych białek cyklu komórkowego podczas mitozy

Obrazowanie żywych komórek dostarcza bogactwa informacji o pojedynczych komórkach lub całych populacjach, które są nieosiągalne przez samo obrazowanie komórek stałych. W tym miejscu opisano protokoły obrazowania żywych komórek w celu oceny decyzji dotyczących losu komórek po leczeniu lekiem antymitotycznym paklitakselem.

Długoterminowe obrazowanie żywych komórek w celu oceny losu komórek w odpowiedzi na paklitaksel

Ten protokół opisuje łatwą i wygodną metodę oznaczania i wizualizacji żywych chromosomów w komórkach mitotycznych za pomocą etykiety Histone2B-GFP BacMam 2.0 i systemu mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.

Obrazowanie żywych komórek segregacji chromosomów podczas mitozy

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Podziały komórek mogą być wizualizowane w czasie rzeczywistym za pomocą fluorescencyjnie znakowanych białek i mikroskopii poklatkowej. Korzystając z przedstawionego tutaj protokołu, użytkownicy mogą analizować dynamikę czasu podziału komórki, składanie wrzeciona mitotycznego oraz kongresację i segregację chromosomów. Defekty tych zdarzeń po knockdownie genu za pośrednictwem interferencji RNA (RNAi) można ocenić i określić ilościowo.

Zastosowanie komórek Drosophila S2 do obrazowania podziału komórek na żywo

Tutaj prezentujemy solidną i szczegółową metodę analizy dynamiki mikrotubul w komórkach zsynchronizowanych w prometafazie przy użyciu mikroskopii konfokalnej z żywym krążkiem komórkowym i przetwarzania obrazów opartego na MATLAB.

Pomiar dynamiki mikrotubul za pomocą mikroskopii wirujących dysków w monopolarnych wrzecionach mitotycznych

Poznaj metodę obrazowania żywych komórek w celu oceny dynamiki wrzeciona mitotycznego i czasu metafazy. Technika ta pozwala identyfikować defekty podziału komórkowego oraz analizować wpływ leków antymitotycznych na przebieg mitozy.

Obrazowanie żywych komórek w celu oceny dynamiki czasu metafazy i losu komórki po perturbacjach wrzeciona mitotycznego

Przeglądaj więcej filmów