Name: Wysokoprzepustowe testy kokultur do badania interakcji mikrobiologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Poznaj wysokoprzepustowe testy kokultur do badania interakcji mikrobiologicznych i odkrywania związków przeciwdrobnoustrojowych. Ta metoda pozwala szybko przesiewać interakcje między drobnoustrojami i identyfikować szczepy o właściwościach hamujących.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Danielowi Mayowi, Marcowi Chevrette'owi i Donowi Hoangowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Praca ta, w tym wysiłki Camerona R. Currie, była wspierana przez University of Wisconsin-Madison, Biuro Wicekanclerza ds. Badań i Kształcenia Podyplomowego z funduszami z Wisconsin Alumni Research Foundation, finansowanie zapewnione również przez National Institutes of Health Centers for Excellence for Translational Research (U19-AI109673-01). Reed M. Stubbendieck otrzymał grant szkoleniowy National Library of Medicine na program szkoleniowy Computation and Informatics in Biology and Medicine (NLM 5T15LM007359). Grantodawcy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i interpretacji danych ani w podejmowaniu decyzji o przesłaniu pracy do publikacji.

Uzyskano świadomą zgodę od rodziców dawcy, a Komitet ds. Badań Ludzkich na Uniwersytecie Wisconsin-Madison zatwierdził badanie (numer zatwierdzenia Institutional Review Board [IRB] H-2013-1044).
1. Przykładowa kultura
UWAGA: Ta procedura jest tutaj używana do badania interakcji między izolatami bakterii z ludzkiej jamy nosowej. Zasadniczo poniższe metody mają zastosowanie do każdego stanu hodowli. Rosół z naparu mózgowo-sercowego (BHI) służy do ogólnego rozmnażania bakterii w nosie. Wszystkie płytki są zestalane przy użyciu 1,5% agaru. Do tego badania próbki pobiera się z roztworu soli fizjologicznej spłukiwanego do nosa dawcy (płukanie nosa), przenosi do probówek mikrowirówek i zamraża w temperaturze -80 °C.
<ol>
	<li>Użyć standardowych technik hodowli, aby umieścić 100 μl każdej z rozmrożonych próbek popłuczyn na płytkach BHI.</li>
	<li>Inkubować płytki w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C przez 1 tydzień.</li>
	<li>Po inkubacji wybrać ≥2 kolonie każdego odrębnego morfotypu na płytkę i przeprowadzić izolaty tlenowo na płytkach BHI, rozprowadzając kolonię z płytki początkowej na nową płytkę BHI i inkubując płytkę w temperaturze 37 °C. Powtarzać, aż kultury bakterii będą czyste. 
	nuta: Izolaty bakteryjne można zidentyfikować za pomocą morfologii kolonii, barwienia metodą Grama, sekwencjonowania genu 16S rRNA lub innej metody. Jednak znajomość tożsamości izolatu nie jest konieczna do kontynuowania protokołu.</li>
	<li>Kriokonserwować wszystkie izolaty bakteryjne w temperaturze -80 °C po połączeniu 1 ml 50% glicerolu z 1 ml nocnej hodowli bakteryjnej (patrz punkt 3) w krioprobówkach.</li>
</ol>
2. 3D Drukowanie znaczków
UWAGA: Poliwęglan został wybrany jako materiał do tłoczenia ze względu na jego wysoką temperaturę zeszklenia (147 °C), która przekracza standardowe temperatury autoklawu (121 °C), co minimalizuje możliwość deformacji po wielokrotnym użyciu.
<ol>
	<li>Załaduj do drukarki 3D filament poliwęglanowy.</li>
	<li>Nałóż biały klej szkolny (polioctan winylu) na stół roboczy, aby poprawić przyczepność i zminimalizować wypaczanie stempla inokulacyjnego podczas drukowania.</li>
	<li>Załaduj plik . Plik modelu STL (Plik danych uzupełniających) dla stempla inokulacji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1) do oprogramowania drukarki 3D.</li>
	<li>Wydrukuj stempel inokulacji przy temperaturze dyszy 290 °C, temperaturze stołu 60 °C i wysokości warstwy 0,38 mm.</li>
	<li>Zawiń stempel w folię aluminiową i sterylizuj w autoklawie przez 1,5 godziny w cyklu grawitacyjnym z 15 minutami suszenia. 
	nuta: Chociaż poliwęglan jest higroskopijny, stemple zachowują tylko około 0,5% masy wody po autoklawowaniu.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kultur nocnych
<ol>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej odpipetować 3 ml sterylnego bulionu BHI do 14 ml probówek hodowlanych.</li>
	<li>Używając sterylnej pętli zaszczepiającej o pojemności 1 μl, zaszczepij kolonię bakteryjną w bulionie. Zakręć pętlą, aby grudka rozproszyła się w bulionie. Krótko przed inkubacją wymieszać probówki hodowlane.</li>
	<li>Inkubować probówki hodowlane w temperaturze 37 °C przez noc (~16 h) na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min.</li>
	<li>Wirować, aby rozbić grudki komórek, gdy kultury bakteryjne osiągną wystarczające zmętnienie (OD600 ≥ 1).</li>
</ol>
4. Przygotowanie płytek do testów biologicznych
UWAGA: Płytki do testów biologicznych są przygotowywane w kapturze z przepływem laminarnym, aby zachować sterylność.
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę BHI z 1,5% agarem i sterylizuj w autoklawie zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Po sterylizacji w autoklawie schłodzić pożywkę BHI do temperatury 55 °C w łaźni wodnej o kontrolowanej temperaturze.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej odpipetuj 3 ml stopionego podłoża BHI do każdego z 12 dołków na 12-dołkowej płytce. Upewnij się, że studzienki są tak dokładne i równe, jak to możliwe. Jeden litr pożywki da ~ 27 płytek do testów biologicznych.</li>
	<li>Pozostaw agar na noc do zastygnięcia.</li>
</ol>
5. Inokulacja płytek do testów biologicznych organizmem testowym
UWAGA: Organizm testowy odnosi się do organizmu, dla którego produkcja aktywności hamującej (np. produkcja antybiotyku) jest określana za pomocą testu interakcji z kulturą współistniejącą. W tym eksperymencie organizmami testowymi są promieniowce wyizolowane z próbek z płukanek nosowych.
<ol>
	<li>Zaszczepić badany organizm na płytce do testu biologicznego, wkładając sterylną pętlę inokulacyjną o pojemności 10 μl do nocnej kultury i rozprowadzając kroplę kultury nad lewą trzecią częścią płytki. 
	nuta: Zaleca się pokrycie smug tylko jednej trzeciej dołka, ponieważ przerost studzienki uniemożliwia późniejsze zaszczepienie organizmów docelowych.</li>
	<li>Powtarzać tę czynność, aż wszystkie 12 studzienek na płytce zostanie zaszczepionych badanym organizmem.</li>
	<li>Inkubować płytki do góry nogami w odpowiedniej temperaturze przez 7 dni. W wyższych temperaturach (≥37 °C) lub w bardziej suchym klimacie należy przechowywać płytki w wilgotnym pojemniku, aby zapobiec ich wysychaniu.</li>
</ol>
6. Przygotowanie organizmów docelowych
UWAGA: Organizm docelowy odnosi się do organizmu, którego status zahamowania jest określany za pomocą testu interakcji z kulturą współistniejącą. W tym eksperymencie organizmami docelowymi są Staphylococcus spp. wyizolowane z próbek z płukania nosa.
<ol>
	<li>Po inkubacji na płytkach do testów biologicznych przez 6 dni należy przygotować przez noc kultury określonych organizmów docelowych, jak to opisano powyżej (patrz sekcja 3).</li>
</ol>
7. Inokulacja organizmu docelowego
UWAGA: Po całonocnej inkubacji upewnij się, że kultury są mętne (OD600 ≥ 1). Niektóre kultury bakteryjne mogą flokulować na dnie probówki hodowlanej. Wirować probówki hodowlane, aby rozproszyć grudki i ocenić zmętnienie kultury.
<ol>
	<li>Przygotować płytkę docelową, wypełniając każdą studzienkę pustej płytki 12-dołkowej 1,8 ml BHI i 200 μl docelowej kultury przez noc</li>.
	<li>Rozpakować i umieścić sterylny stempel inokulacyjny na płytce docelowej. Delikatnie obracaj kultury w studzienkach, uważając, aby kultury nie zanieczyściły sąsiednich studni.</li>
	<li>Podnieś stempel zaszczepiający i upewnij się, że na każdej końcówce stempla znajduje się kropla rozcieńczonej kultury docelowej.</li>
	<li>Przygotuj płytkę kontrolną monokultury, umieszczając stempel inokulacyjny na nieinokulowanej płytce do testu biologicznego i delikatnie kołysz stempelem, tak aby kropla kultury zaszczepiła każdą studzienkę. Po usunięciu stempla inokulacji, kropla kultury powinna być widoczna w dołkach płytki do testu biologicznego.
	<ol>
		<li>Jeśli jakiekolwiek studzienki nie zostaną zaszczepione pieczęcią inokulacyjną z powodu nierównomiernego poziomu pożywki, należy nanieść 3 μl rozcieńczonej kultury przez noc po prawej stronie studzienek za pomocą pipety.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaszczepić płytki testu biologicznego, jak to zrobiono powyżej (patrz krok 7.4.1), ale wyrównaj stempel tak, aby końcówki zrównały się z prawą stroną płytki 12-dołkowej. Upewnij się, że stempel nie styka się z istniejącą kolonią bakteryjną podczas zaszczepiania studzienek.</li>
	<li>Ostrożnie usuń stempel i umieść go z powrotem w tabliczce docelowej.</li>
	<li>Powtarzać inokulację dla każdej płytki do testu biologicznego, aż wszystkie płytki zostaną zaszczepione.</li>
	<li>Inkubować płytki do testów biologicznych do góry nogami w odpowiedniej temperaturze przez 7 dni.</li>
</ol>
8. Punktacja
<ol>
	<li>Po wspólnej hodowli organizmów testowych i docelowych przez 1 tydzień, oceń interakcje na podstawie następującej oceny wizualnej:
	<ol>
		<li>Oceń studzienki ze wzrostem organizmu docelowego, który wykazuje wzrost nie do odróżnienia od kontroli monokultury jako "0" (brak zahamowania) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A,B).</li>
		<li>Oceń studzienki z organizmem docelowym, który wykazuje zmniejszony wzrost w porównaniu z kontrolą, jako "1" (słabe hamowanie) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
		<li>Oceń dołki, w których organizm docelowy nie rósł, jako "2" (silne hamowanie) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Communities%3A+Interactions+to+Scale%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial Communities: Interactions to Scale.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (August), 1234(2016).</li>
<li>Green, J., Bohannan, B. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+scaling+of+microbial+biodiversity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Spatial scaling of microbial biodiversity.</a> Trends in Ecology & Evolution. 21 (9), 501-507 (2006).</li>
<li>Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Antibacterial+Action+of+Cultures+of+a+Penicillium%2C+with+Special+Reference+to+their+Use+in+the+Isolation+of+B.+influenz%C3%A6%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the Isolation of B. influenzæ.</a> British Journal of Experimental Pathology. 10 (3), 226(1929).</li>
<li>Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+from+Lethal+Bacterial+Competition+through+Coupled+Activation+of+Antibiotic+Resistance+and+a+Mobilized+Subpopulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Escape from Lethal Bacterial Competition through Coupled Activation of Antibiotic Resistance and a Mobilized Subpopulation.</a> PLoS Genetics. 11 (12), e1005722(2015).</li>
<li>Zipperer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+commensals+producing+a+novel+antibiotic+impair+pathogen+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization.</a> Nature. 535 (7613), 511-516 (2016).</li>
<li>Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungus-growing+ants+use+antibiotic-producing+bacteria+to+control+garden+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites.</a> Nature. 398 (6729), 701-704 (1999).</li>
<li>Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+in+vitro+evaluating+antimicrobial+activity%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).</li>
<li>Heatley, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+assay+of+penicillin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">A method for the assay of penicillin.</a> The Biochemical Journal. 38 (1), 61-65 (1944).</li>
<li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Performance+standards+for+antimicrobial+disk+susceptibility+tests%3B+approved+standard+-11th+ed.+CLSI+document+M02-A11%22">Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard -11th ed. CLSI document M02-A11</a>. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, Pennsylvania. (2012).</li>
<li>Adnani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coculture+of+Marine+Invertebrate-Associated+Bacteria+and+Interdisciplinary+Technologies+Enable+Biosynthesis+and+Discovery+of+a+New+Antibiotic%2C+Keyicin%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Coculture of Marine Invertebrate-Associated Bacteria and Interdisciplinary Technologies Enable Biosynthesis and Discovery of a New Antibiotic, Keyicin.</a> ACS Chemical Biology. 12 (12), 3093-3102 (2017).</li>
<li>Nichols, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+iChip+for+high+throughput+in+situ+cultivation+of+%26%2334%3Buncultivable%26%2334%3B+microbial+species%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of iChip for high throughput in situ cultivation of &#34;uncultivable&#34; microbial species.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).</li>
<li>Gonzalez, D. J., et al. Microbial competition between Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus monitored by imaging mass spectrometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGonzalez%2C+DJ+%22Microbiology+%28Reading%2C+England%29%22">Microbiology (Reading, England)</a>. 157 (Pt 9), 2485-2492 (2011).</li>
<li>Hoefler, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+resistance+to+the+lipopeptide+surfactin+as+identified+through+imaging+mass+spectrometry+of+bacterial+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13082-13087 (2012).</li>
<li>Hoefler, B. C., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry%2C+Metabolism%2C+and+New+Views+of+the+Microbial+World%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Products+Analysis%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World.</a> Natural Products Analysis. , 349-396 (2014).</li>
<li>Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+metabolic+exchange+with+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry.</a> Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).</li>
<li>Stubbendieck, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+among+Nasal+Bacteria+Suggests+a+Role+for+Siderophore-Mediated+Interactions+in+Shaping+the+Human+Nasal+Microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (10), 1-17 (2019).</li>
<li>Winkelmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+siderophore-mediated+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">Microbial siderophore-mediated transport.</a> Biochemical Society transactions. 30 (4), 691-696 (2002).</li>
<li>Chevrette, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+potential+of+Streptomyces+from+insect+microbiomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes.</a> Nature Communications. 10 (1), 516(2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Antybiotyki i inne metabolity wtórne, które pośredniczą w interakcjach mikrobiologicznych, są przydatne w wielu zastosowaniach, w tym w odkrywaniu leków. W niniejszym artykule przedstawiono protokół testów kokulturowych w celu oceny dużej liczby interakcji mikrobiologicznych. Te testy interakcji z kokulturami są prostym, niedrogim, skalowalnym i wysokowydajnym sposobem do badania wielu par kombinacji mikroorganizmów w tandemie. Organizmy docelowe są wykrywane obok organizmów badanych w studzience na płytce 12-dołkowej za...

W naturze mikroorganizmy rzadko występują w izolacji; w związku z tym nieustannie wchodzą w interakcje z innymi organizmami. Dlatego badanie, w jaki sposób mikroorganizmy oddziałują ze sobą, jest niezbędne do zrozumienia wielu zachowań mikroorganizmów1. Interakcje mikrobiologiczne mogą być wzajemne, komensalne lub antagonistyczne. Te z kolei mogą wpływać nie tylko na same mikroorganizmy, ale także na środowisko i gospodarzy, których mikroorganizmy kolonizują1,2.
Wielu naukowców bada interakcje mikrobiologiczne w celu zidentyfikowania nowych cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych. Jedna z pierwszych klinicznie ważnych cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych została odkryta dzięki badaniom interakcji mikrobiologicznych. Sir Alexander Fleming zaobserwował zanieczyszczający izolat Penicillium spp., który hamował wzrost szczepu Staphylococcus, co doprowadziło do odkrycia powszechnie stosowanego antybiotyku penicyliny3. Charakterystyka mechanizmów, które mikroorganizmy wykorzystują do antagonizowania swoich konkurentów, pozostaje owocnym źródłem dla odkrycia cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych. Na przykład niedawno wykazano, że Streptomyces sp. szczep Mg1 wytwarza antybiotyk linearmycins, który ma działanie lityczne i degradujące przeciwko Bacillus subtilis4.
Ponadto, niedawno odkryto nierybosomalny peptyd o nazwie lugdunin po obserwacji, że komensal nosowy Staphylococcus lugdunensis hamuje Staphylococcus aureus5. Badania wykazały również, że wzajemne interakcje między mikroorganizmami są równie silne jak interakcje antagonistyczne w odkrywaniu cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych. Na przykład, wiele mrówek hodujących grzyby w plemieniu Attini ma symbiotyczne bakterie zwane Pseudonocardia na swoim egzoszkielecie, które wytwarzają cząsteczki przeciwgrzybicze, aby zahamować obowiązkowy patogen ich uprawy grzybów6. Ponieważ badania nad interakcjami mikrobiologicznymi przyniosły korzyści w odkrywaniu cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych, zastosowanie wysokoprzepustowych badań przesiewowych może doprowadzić do odkrycia nowych cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych.
Jeśli chodzi o koszt i łatwość wykonania, metodologie używane do badania interakcji mikrobiologicznych wahają się od prostych do złożonych. Na przykład test z korkiem agarowym jest niedrogą i prostą metodą, którą można wykorzystać do zbadania antagonizmu między wieloma mikroorganizmami7. Jednak test z zatyczką agarową nie jest wydajną procedurą i może być pracochłonny w przypadku wielu kombinacji parami. Aby ocenić wpływ produktów wytwarzanych przez drobnoustroje na docelowe izolaty będące przedmiotem zainteresowania w sposób wysokoprzepustowy, wiele laboratoriów stosuje testy dyfuzji krążkowej8. Testy te są łatwe i niedrogie oraz można je skalować do większej liczby próbek7. Jednak test ten wymaga wytworzenia ekstraktów mikrobiologicznych i może dać mylące wyniki dla niektórych kombinacji organizmów docelowych i antybiotyków, takich jak Salmonella i cefalosporyny9.
Poprzednie podejścia polegają na wyizolowanych komponentach w celu wywołania odpowiedzi w organizmie docelowym, zamiast pozwalać mikroorganizmom na wzajemne interakcje. Jest to godne uwagi, ponieważ interakcje między drobnoustrojami mogą wywoływać produkcję "tajemniczych" cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych, które nie są wytwarzane w monokulturze. Na przykład niedawno wykazano, że przeciwdrobnoustrojowa keyycyna jest wytwarzana przez Micromonospora sp. tylko wtedy, gdy jest hodowana wspólnie z Rhodococcus sp., która jest izolowana z tego samego mikrobiomu gąbki10. Bardziej złożone metodologie interakcji pozwalają obejść tę potencjalną przeszkodę związaną z monokulturą. Na przykład iChip jest przydatny do izolowania rzadkich i trudnych do wyhodowania bakterii z próbek środowiskowych i pozwala na obserwację interakcji mikrobiologicznych poprzez wzrost in situ11. Do szczegółowego zbadania interakcji można zastosować spektrometrię mas z obrazowaniem czasu przelotu wspomaganą matrycą laserową (MALDI-TOF-IMS). Takie podejście dostarcza szczegółowych informacji na temat składu i dystrybucji małych cząsteczek i peptydów wytwarzanych przez oddziałujące kolonie drobnoustrojów z wysoką rozdzielczością przestrzenną. MALDI-TOF-IMS został również wykorzystany w wielu badaniach interakcji bakteryjnych w celu scharakteryzowania mechanizmów konkurencji12,13,14,15. Jednak MALDI-TOF-IMS często wymaga pracochłonnego przygotowania próbek, specjalistycznej wiedzy specjalistycznej do obsługi sprzętu oraz drogich i specjalistycznych spektrometrów masowych. Z tych powodów jest to technika trudna do wykorzystania w badaniach o wysokiej przepustowości. W związku z tym korzystny byłby prosty, skalowalny i wysokoprzepustowy test kokulturowy dla interakcji mikrobiologicznych, który przezwycięża wiele ograniczeń powyższych podejść.
Tutaj przedstawiono protokół dla wysokoprzepustowej kohodowli mikrobiologicznej. Ten test jest prosty i łatwy do włączenia do istniejących wcześniej badań interakcji mikrobiologicznych. W przeciwieństwie do wielu powszechnie stosowanych metod badania interakcji mikrobiologicznych, nasza metoda jest prosta, niedroga i nadaje się do badania dużej liczby interakcji. Testy te są nie tylko łatwe do wykonania, ale materiały są powszechnie dostępne u większości dostawców laboratoryjnych lub w zasobach publicznych (np. bibliotekach i przestrzeniach twórczych). W związku z tym test ten jest korzystny jako pierwsza linia badań w celu identyfikacji i przeanalizowania interesujących wzorców wśród wielu par kombinacji mikroorganizmów, co może być szczególnie przydatne w badaniu ekologii drobnoustrojów.

<table><tbody><tr><td>1 &mu; L jednorazowe polistyrenowe pętelki do zaszczepiania, niebieskie</td><td>VWR</td><td>12000-806</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L jednorazowe polistyrenowe pętle do zaszczepiania, żółte</td><td>VWR</td><td>12000-810</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka do hodowli komórkowych, sterylna z pokrywką</td><td>Greiner bio-one</td><td>665 180</td><td></td></tr><tr><td>14 mL polistyrenowa probówka z okrągłym dnem, 17 x 100 mm 2style, niepirogenna, sterylna</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>2.0 samostojące probówki z nakrętkami, sterylne</td><td>USA scientific</td><td>1420-9710</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 25 ml</td><td>Cell Treat</td><td>229225B</td><td></td></tr><tr><td>Agar, bakteriologiczny</td><td>VWR</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion Broth Dot</td><td>Scientific</td><td>DSB11000-5000</td><td></td></tr><tr><td>Filament poliwęglanowy, biały, średnica 3 mm</td><td>Keene Village Plastics</td><td>12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Klej szkolny</td><td>Elmer's</td><td>EPIE304</td><td></td></tr><tr><td>Drukarka 3D Taz 6</td><td>Lulzbot</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe testy kokultur do badania interakcji mikrobiologicznych

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

Badanie interakcji między mikroorganizmami doprowadziło do licznych odkryć, od nowych środków przeciwdrobnoustrojowych po wgląd w ekologię mikroorganizmów. Wiele podejść stosowanych do badania interakcji mikrobiologicznych wymaga specjalistycznego sprzętu, jest kosztownych i czasochłonnych. W artykule przedstawiono protokół testów interakcji między kulturami, które są niedrogie, skalowalne do dużej liczby próbek i łatwe do dostosowania do wielu projektów eksperymentalnych. Mikroorganizmy są hodowane razem, przy czym każdy studzienka reprezentuje jedną parzystą kombinację mikroorganizmów. Badany organizm jest hodowany po jednej stronie każdej studzienki i najpierw inkubowany w monokulturze. Następnie organizmy docelowe są jednocześnie inokulowane po przeciwnej stronie każdej studzienki za pomocą wydrukowanego w 3D stempla inokulacyjnego. Po wspólnej hodowli zakończone testy są oceniane pod kątem fenotypów wizualnych, takich jak wzrost lub zahamowanie. Testy te mogą być wykorzystane do potwierdzenia fenotypów lub identyfikacji wzorców wśród interesujących izolatów. Korzystając z tej prostej i skutecznej metody, użytkownicy mogą szybko i wydajnie analizować kombinacje mikroorganizmów. To podejście oparte na współhodowli ma zastosowanie zarówno do odkrywania antybiotyków, jak i badań nad mikrobiomem w oparciu o hodowle i zostało już z powodzeniem zastosowane w obu zastosowaniach.

Testy interakcji w kokulturze mogą być wykorzystywane do zrozumienia interakcji mikrobiologicznych, identyfikacji interesujących wzorców oraz wykrywania izolatów mikrobiologicznych o intrygującej aktywności. W tych testach organizm testowy jest hodowany w monokulturze po jednej stronie 12-dołkowej płytki agarowej i inkubowany przez 7 dni. Następnie obok organizmu testowego nanosi się organizm docelowy, a oba mikroorganizmy są hodowane wspólnie przez 7 dni przed oceną fenotypu wzrostu orga...

Testy interakcji międzykulturowych przedstawione w tym protokole są niedrogie, mają wysoką przepustowość i są proste. Testy te można wykorzystać do obserwacji interakcji mikrobiologicznych w kokulturze, identyfikacji wzorców interakcji i scharakteryzowania potencjału hamującego badanego szczepu drobnoustrojów przeciwko patogenom ludzkim i środowiskowym.

Wysokoprzepustowe testy kokultur do badania interakcji mikrobiologicznych

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Nasz protokół zapewnia wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych dużej liczby par interakcji mikrobiologicznych w połączeniu w celu zidentyfikowania interesujących interakcji, które mogą pomóc w badaniach nad mikrobiomem i odkrywaniu środków przeciwdrobnoustrojowych. Metoda ta jest łatwo stosowana do badania interakcji mikrobiologicznych w różnych systemach, o ile mikroorganizmy są przyjazne do hodowli w warunkach laboratoryjnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala użytkownikom na badanie przesiewowe dużej liczby interakcji mikrobiologicznych w stosunkowo krótkim czasie.Nowi użytkownicy tej techniki powinni poświęcić trochę czasu, zwłaszcza podczas inokulacji płytek do testów biologicznych, ponieważ ważne jest, aby zachować ostrożność, aby zminimalizować przerost lub zanieczyszczenie. Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie, ponieważ inokulacja płytek do testów biologicznych wymaga precyzji, aby zapewnić, że organizmy nie przerosną studzienek i że kokultury nie zostaną skażone. Zacznij od przygotowania kultur na noc.Użyj pipety serologicznej, aby dodać trzy mililitry bulionu BHI do 14-mililitrowych probówek hodowlanych. Następnie użyj sterylnej pętli inokulacyjnej o pojemności jednego mikrolitra, aby zaszczepić kolonię bakterii w bulionie. Zakręć pętlą, aby upewnić się, że grudka rozproszy się w bulionie.Krótko zawiruj probówki hodowlane i inkubuj je przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min. Gdy kultury bakteryjne osiągną OD 600 powyżej jednego, wiruj je, aby rozbić grudki komórek. Przygotuj pożywkę PHI z 1,5% agarem i wysterylizuj ją w autoklawie.Następnie schłodzić pożywkę do 55 stopni Celsjusza w łaźni wodnej o kontrolowanej temperaturze i dozować trzy mililitry stopionego podłoża BHI do każdej z 12 studzienek na talerzu, upewniając się, że studzienki są jak najbardziej równe. Następnie pozwól agarowi zastygnąć przez noc. Zaszczepić badany organizm na płytce do testu biologicznego, wkładając sterylną pętlę inokulacyjną o pojemności 10 mikrolitrów do nocnej kultury i rozprowadzając kropelkę kultury nad lewą trzecią częścią płytki.Powtarzaj tę czynność, aż wszystkie 12 dołków na płytce zostanie zaszczepionych. Inkubować płytki do góry nogami w odpowiedniej temperaturze przez siedem dni. W przypadku inkubacji w temperaturach wyższych lub równych 37 stopni Celsjusza lub w bardziej suchym klimacie przechowuj płytki w wilgotnym pojemniku, aby zapobiec ich wysychaniu.Po sześciodniowej inkubacji płytki do testów biologicznych należy przygotować nocne kultury organizmu docelowego, jak opisano powyżej. Przygotuj płytkę docelową, wypełniając każdą studzienkę pustej płytki 12-dołkowej 1,8 mililitra BHI i 200 mikrolitrów docelowej kultury przez noc. Umieścić sterylny stempel zaszczepiający na płytce docelowej.Delikatnie zamieszaj kultury wokół studzienek, upewniając się, że nie zanieczyszczają krzyżowo sąsiednich studni. Podnieś stempel zaszczepiający i upewnij się, że na każdej końcówce stempla znajduje się kropla rozcieńczonej kultury docelowej. Umieść stempel inokulacyjny na niezaszczepionej płytce do testu biologicznego i delikatnie kołysz stempelem, aby kropla kultury zaszczepiła każdą studzienkę.Po usunięciu stempla w studzienkach powinna być widoczna kropla kultury. Jeśli jakiekolwiek studzienki nie są zaszczepione pieczęcią inokulacyjną, umieść trzy mikrolitry rozcieńczonej kultury przez noc na studzienkach za pomocą pipety. Następnie zaszczepić płytki do testów biologicznych zgodnie z wcześniejszym opisem, ale wyrównaj końcówki stempla z prawą stroną płytki 12-dołkowej, upewniając się, że stempel nie styka się z istniejącą kolonią bakteryjną.Ostrożnie usuń stempel i umieść go z powrotem w tabliczce docelowej. Jeśli agar zastygł w studzienkach nierównomiernie, delikatnie kołysz stempelem w przód i w tył, ale należy uważać, aby nie przesunąć stempla do wzrostu badanego organizmu. Powtórzyć inokulację dla każdej płytki do testu biologicznego, aż wszystkie płytki zostaną zaszczepione, a następnie inkubować płytki do góry nogami w odpowiedniej temperaturze przez siedem dni.Po kokulturze organizmu testowego i docelowego przez tydzień, oceń interakcje na podstawie oceny wizualnej. Oceń studzienki z docelowym wzrostem organizmu, który wykazuje nieodróżnialny wzrost od monokultury, jako zero. Oceń studnie ze zmniejszonym wzrostem jako jeden, a brak wzrostu jako dwa.Opisane tutaj testy kohodowli wykorzystano do oceny aktywności hamującej badanych organizmów promieniowców w stosunku do organizmów docelowych gatunków Staphylococcus wyizolowanych z ludzkiej jamy nosowej. Łącznie przetestowano 812 kombinacji parami. Warto zauważyć, że Corynebacterium propinquum silnie hamowało gronkowce koagulazo-ujemne, szczególnie w porównaniu z innymi Corynebacteria, które albo słabo hamowały gronkowce koagulazo-ujemne, albo nie miały działania hamującego.Dzięki zastosowaniu genomiki porównawczej zidentyfikowano biosyntetyczny klaster genów do produkcji sideroforów w genomie Corynebacterium propinquum. Testy interakcji z kokulturą przy użyciu standardowej i uzupełnionej żelazem pożywki BHI wykazały, że fenotyp hamowania między Corynebacterium propinquum a gronkowcami koagulazo-ujemnymi był w rzeczywistości zależny od żelaza. Ważne jest, aby zachować ostrożność podczas stemplowania tabliczki.Dokładnie sprawdź każdą studzienkę po stemplowaniu i upewnij się, że stempel zaszczepiania jest prawidłowo wyrównany, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Po zidentyfikowaniu interesujących interakcji, kolejne badania z wykorzystaniem genetyki i genomiki drobnoustrojów, izolacji i charakterystyki produktów naturalnych lub obrazowej spektrometrii mas mogą być wykorzystane do scharakteryzowania mechanizmów leżących u podstaw tych interakcji. Protokół ten został niedawno wykorzystany do odkrycia konkurencji między ludzką mikrobiotą nosa za pośrednictwem sideroforów i pomógł w odkryciu nowej cząsteczki przeciwgrzybiczej zwanej cyfomycyną.

high-throughput-co-culture-assays-for-investigation-microbial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Ali, I., i in. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów mikroorganizmów o wpływie na zdrowie Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2022)Ten film prezentuje wysokowydajny test fluorescencyjny, mający na celu ocenę, jak bakterie jelitowe wpływają na odporność na stres u Caenorhabditis elegans. Śledząc niebieską fluorescencję z pękniętych granulek jelit, test ujawnia wcześniejsze sygnały śmierci u robaków narażonych na testowe bakterie.

Wysokowydajny test fluorescencjonujący do badania interakcji mikroorganizmów z robakami

Źródło: Temkin, M. I. i in. Wysokoprzepustowe testy kokultury do badania interakcji mikroorganizmów. J. Vis. Exp. (2019)Ten film prezentuje test in vitro do badania interakcji mikroorganizmów między Corynebacterium propinquum a Staphylococcus w współkulturze.

Test in vitro do badania interakcji mikroorganizmów w kokulturze

Bakterie wytwarzają wydzielane związki, które mogą wpływać na fizjologię swoich mikrobiologicznych sąsiadów. W tym miejscu opisujemy badanie przesiewowe kokultury, które umożliwia wykrywanie takich chemicznie zapośredniczonych interakcji międzygatunkowych poprzez mieszanie mikroorganizmów glebowych z fluorescencyjnymi transkrypcyjnymi szczepami reporterowymi Bacillus subtilis na podłożach stałych.

Wykorzystanie kokultury do wykrywania interakcji międzygatunkowych o podłożu chemicznym

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Ten protokół obrazowania żywych komórek bakteryjnych pozwala na wizualizację interakcji między wieloma gatunkami bakterii na poziomie pojedynczej komórki w czasie. Obrazowanie poklatkowe pozwala na obserwację każdego gatunku bakterii w monokulturze lub kokulturze w celu zbadania interakcji międzygatunkowych w wielogatunkowych społecznościach bakteryjnych, w tym ruchliwości i żywotności poszczególnych komórek.

Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych interakcji bakteryjnych

W tym artykule metodycznym prezentujemy strategię wysokoprzepustowych badań przesiewowych w celu identyfikacji związków chemicznych, takich jak osmolity, które mają znaczący wpływ na trwałość bakterii.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków chemicznych w celu wyjaśnienia ich wpływu na trwałość bakterii

Fenotypy wzrostu drożdży są precyzyjnie mierzone za pomocą wysoce równoległego obrazowania poklatkowego unieruchomionych komórek rosnących w mikrokolonie. Jednocześnie można monitorować tolerancję na stres, ekspresję białek i lokalizację białek, generując zintegrowane zestawy danych w celu zbadania, w jaki sposób różnice środowiskowe i genetyczne, a także niejednorodność ekspresji genów wśród komórek izogenicznych, modulują wzrost.

Wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii na żywo w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów

Tutaj opisujemy metodę bakteryjnej koekspresji różnie znakowanych białek za pomocą zestawu kompatybilnych wektorów, a następnie konwencjonalne techniki pulldown do badania kompleksów białkowych, które nie mogą się składać in vitro.

Test pulldown w połączeniu z koekspresją w komórkach bakteryjnych jako efektywne czasowo narzędzie do testowania trudnych interakcji białko-białko

Ten protokół dostarcza wyczerpujących wytycznych dotyczących konfiguracji i ilościowego monitorowania kokultur, w tym fotoautotroficznych cyjanobakterii wydzielających cukier i drożdży heterotroficznych.

Składanie i kwantyfikacja kokultur łączących drożdże heterotroficzne z fototroficznymi cyjanobakteriami wydzielającymi cukier

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Poznaj wysokoprzepustowe testy kokultur do badania interakcji mikrobiologicznych i odkrywania związków przeciwdrobnoustrojowych. Ta metoda pozwala szybko przesiewać interakcje między drobnoustrojami i identyfikować szczepy o właściwościach hamujących.

Wysokoprzepustowe testy kokultur do badania interakcji mikrobiologicznych

Przeglądaj więcej filmów