Name: Eksperymentalne podejście do badania sygnalizacji leptyny w ciałach szyjnych i jej wpływu na kontrolę oddechu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Dowiedz się, jak badać wpływ leptyny na sygnalizację w ciałach szyjnych i kontrolę oddechu w warunkach hipoksji. Metoda obejmuje denewację nerwu zatokowego szyjnego i transfekcję adenowirusową u myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (MO18M211).
1. Napar leptyny
UWAGA: Aby zbadać wpływ leptyny na oddychanie, podaliśmy leptynę podskórnie chudym myszom C57BL/6J za pomocą pompy osmotycznej, aby podnieść poziom krążącej leptyny do poziomu obserwowanego u otyłych myszy.
<ol>
	<li>Przygotowanie pompy osmotycznej
	<ol>
		<li>Zważyć pustą pompę, aby sprawdzić masę netto załadowanego roztworu.</li>
		<li>Dodać leptynę (5 mg/ml) do pompy osmotycznej (1 μl/h przez 3 dni). Napełnij pompę małą strzykawką (1 ml). Po napełnieniu zamknij pompę za pomocą dostarczonej końcówki rurki napełniającej o średnicy 27 mm. 
		nuta: Strzykawka i dołączona rurka powinny być wolne od pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Po napełnieniu ponownie zważyć pompę, aby sprawdzić masę netto roztworu.</li>
		<li>Wprowadzić pompę leptyny podskórnie w obszar międzyłopatkowy. 
		UWAGA: Jeśli chcesz natychmiast rozpocząć infuzję, należy inkubować wstępnie napełnioną pompę w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w temperaturze 37 °C przez co najmniej 4 do 6 godzin (najlepiej przez noc).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Niedotleniona reakcja wentylacyjna (HVR)
UWAGA: Warunki termoneutralne eliminują czynniki stresogenne narzucone przez niską temperaturę otoczenia i znacząco modyfikują metabolizm u myszy. W związku z tym wszystkie pomiary oddechowe powinny być wykonywane w warunkach termoneutralnych (t = 30 °C) przy użyciu inkubatora dla noworodków12 (Rysunek 1A). Do wszystkich pomiarów wykorzystano komorę pletyzmograficzną całego ciała (WBP). Wszystkie zwierzęta powinny być zaaklimatyzowane do komory pletyzmografii barometrycznej i do pozorowanej obroży na szyję w celu późniejszego zapisu pulsoksymetrii przez 3-5 dni przed pomiarami HVR. HVR jest rejestrowany między godziną 10 a 17. HVR jest tłumiony podczas snu, dlatego może być mierzony oddzielnie podczas snu i cichego czuwania13. Aby zapewnić określony etap snu i czuwania zwierzęcia podczas pomiaru HVR, elektrody EEG/EMG powinny być wszczepione jako uchwyt do montażu na głowie EEG/EMG, jak opisano wcześniej14. Zwierzęta powinny mieć możliwość rekonwalescencji przez co najmniej 72 godziny po założeniu założenia głowy. Etapowanie snu powinno być wykonywane w 5 epokach sekundowych. Sen NREM rozpoznaje się na podstawie aktywności EEG na fali wolnofalowej, zajmującej ponad 50% epoki. Spokojne czuwanie objawia się aktywnością alfa EEG przy braku ruchu. Sen REM jest identyfikowany na podstawie dominującej aktywności EEG alfa i theta w obecności obniżonego napięcia mięśniowego w EMG. Zazwyczaj sen REM nie jest obserwowany podczas wyzwań gazowych HVR.
<ol>
	<li>Protokół nagrywania HVR
	<ol>
		<li>Stosować komorę WBP o następujących rozmiarach: średnica wewnętrzna 80 mm, wysokość 50,5 mm i pojemność 0,4 l. Komora WBP składa się z dwóch komór, komory uszczelnionej i referencyjnej, oraz okrągłej platformy do umieszczenia mouse14 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Dopływ i odpływ wewnątrz komory jest kontrolowany przez źródła nadciśnienia i podciśnienia utrzymujące ciśnienie atmosferyczne. Ta kontrola tworzy stały przepływ polaryzacji w komorze i zapobiega zatrzymywaniu CO2 . Aby uzyskać więcej informacji na temat konfiguracji WBP, zobacz Hernandez and colleagues15.</li>
		<li>Zmierz temperaturę wewnątrz komory i wilgotność względną w pomieszczeniu przed umieszczeniem myszy w WBP.</li>
		<li>Zmierz masę ciała i temperaturę w odbycie.</li>
		<li>Załóż obrożę pulsoksymetru na szyję myszy (obszar powinien być wcześniej ogolony).</li>
		<li>Umieść mysz w WBP i upewnij się, że komora jest całkowicie uszczelniona, aby uniknąć wycieków powietrza.</li>
		<li>Odczekaj około 30 minut, aż mysz wyciszy się, a komora będzie miała stałą głośność.</li>
		<li>Normoxia: po 30 minutach, jeśli mysz jest cicha, zacznij rejestrować sygnały oddechowe i obwodowe nasycenie tlenem (SpO2) w fazie normoxii (21% FiO2 przy 1 atm ciśnienia) przez 20 minut, za pomocą LabChart 7 Pro (wersja 7.2).</li>
		<li>Niedotlenienie: po 20 minutach spokojnej normoksji zacznij rejestrować pierwszy cykl ostrej hipoksji i SpO2. W przypadku fazy hipoksji należy wystawić zwierzęta na stały przepływ mieszaniny gazów składających się z 10%O2 i 3% CO2 przez 5 minut.
		<ol>
			<li>W ciągu pierwszych 30 sekund niedotlenienia zmieszany gaz przepływa przez komorę przez 2 małe boczne porty u podstawy, co pozwala na spadek FiO2 z 21% (przy ciśnieniu 1 atm) do 10%.</li>
			<li>Po upływie początkowych 30 s zamknij jeden z małych bocznych portów komory WBP i kontynuuj nagrywanie w stałym niedotlenieniu przy 10% FiO2 przez 5 min. 
			UWAGA: Mieszanina 10%O2 i 3% CO2 w stanie niedotlenienia jest stosowana w celu utrzymania eucapnea11.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po 5 minutach niedotlenienia ponownie wystawij mysz na działanie powietrza w pomieszczeniu (21% FiO2 przy ciśnieniu 1 atm), przełączając źródło dopływu.</li>
		<li>Odczekaj co najmniej 30 minut do następnego zapisu normoksji, aby odzyskać siły po poprzedniej ekspozycji na niedotlenienie, aby uniknąć zjawiska roll-off wentylacji (tj. centralnego tłumienia oddychania podczas hipoksji16). 
		nuta: Powtórz cykle normoksji/hipoksji trzy razy u każdej myszy, aby zapewnić powtarzalność pomiarów. Z naszego doświadczenia wynika, że należy unikać dodatkowych (więcej niż 3 razy w danym dniu) ekspozycji na niedotlenienie, ze względu na adaptację wentylacji (zjawisko roll-off).</li>
		<li>Pod koniec eksperymentu skalibruj komorę WBP (gdy mysz nadal znajduje się w środku), wstrzykując 3 razy 1 ml powietrza w pomieszczeniu za pomocą strzykawki włożonej w jeden z małych bocznych portów u podstawy komory.</li>
		<li>Ponownie zmierz temperaturę w komorze, gdy zwierzę się w niej znajduje.</li>
		<li>Otwórz komorę i zmierz temperaturę myszy w odbycie przed umieszczeniem jej z powrotem w klatce domowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie HVR
	<ol>
		<li>Digitalizacja wszystkich sygnałów do obliczeń HVR przy 1 000 Hz (częstotliwość próbkowania na kanał). 
		nuta: Analiza objętości pływowej WBP jest wykonywana na wykresie laboratoryjnym 7 w oparciu o równanie Drorbaugha i Fenna17. Wymagane zmienne obejmują temperaturę myszy w odbycie i temperaturę komory (przed i po pomiarze HVR), wilgotność względną oraz stałą gazu w komorze. Stała ta wynika z ugięcia ciśnienia WBP po wstrzyknięciu 1 ml powietrza w fazie kalibracji. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz Hernandez and colleagues15.</li>
		<li>Po obliczeniu równania Drorbaugha i Fenna pomnóż kanał komory objętości oddechowej (Vt) przez stałą.</li>
		<li>Wybór nagrań do analizy
		<ol>
			<li>Normoksja: wybierz tylko odcinki stałego oddychania ze stałą objętością oddechową. Unikaj sekcji znajdujących się w bliskiej odległości od ruchów myszy.</li>
			<li>Niedotlenienie: odrzuć pierwsze 30 s, gdy poziomO2 spada z 21% do 10%, wybierz odcinki od 30 s do 2 minut ekspozycji na 10%O2 (interwał 90 s). W tym przedziale wybierz tylko sekcje ze stałym oddechem ze stałą objętością oddechową. Unikaj sekcji znajdujących się w bliskiej odległości od ruchów myszy. Analiza jest wiarygodna, jeśli w każdym cyklu wybrano co najmniej 10 s hipoksji. 
			nuta: Komponent peryferyjny chemoreflex zarządzany przez CB dominuje w ciągu pierwszych 1-2 minut ekspozycji16,18,19. Podczas drugiej fazy, od 2 do 5 minut ekspozycji na niedotlenienie, rolę odgrywają zarówno komponent obwodowy, jak i centralny. Wreszcie trzecia faza, trwająca > 5 minut, charakteryzuje się hipowentylacją (zjawiskiem roll-off) zarządzaną głównie przez centralne chemoreceptory. Z naszego doświadczenia wynika, że myszy często nie śpią podczas ekspozycji na niedotlenienie z powodu ręcznych przełączników w źródle przepływu powietrza.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po dokonaniu wyboru należy obliczyć średnią minutową wentylację (VE) w warunkach normoksycznych i niedotlenionych, korzystając ze wzoru VE = częstość oddechów X objętość oddechowa.</li>
		<li>Obliczyć średnie SpO2 w warunkach normoksji i niedotlenienia.</li>
		<li>Oblicz HVR ręcznie, korzystając ze wzoru HVR = (VE (10% O2) - VE (21%O2)) / (SpO2 (10% O2) – SpO2 (21% O2)). 
		nuta: U myszy C57BL/6J pompa osmotyczna do infuzji leptyny może pogarszać dokładne wykrywanie sygnału SpO2 przez obrożę na szyję. W tym przypadku HVR oblicza się na podstawie wartości FiO2 w warunkach normoksycznych i hipoksyjnych jako HVR = ΔVE / ΔFiO211.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Denerwacja ciała szyjnego lub rozwarstwienie nerwu zatokowego szyjnego (CSND)
UWAGA: Przeprowadziliśmy łączoną chirurgiczną i chemiczną denerwację w odstępie tygodnia, ponieważ samo odnerwienie chirurgiczne nie znosi hipoksyjnego chemoreflexu.
<ol>
	<li>Przygotowanie chirurgiczne
	<ol>
		<li>Wykonaj wszystkie procedury na dorosłych samcach myszy C57BL/6J. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne. Używaj sterylnych rękawiczek chirurgicznych, strzykawek i aplikatorów z bawełnianą końcówką.</li>
		<li>Znieczulij samce myszy C57BL/6J 1-2% izofluranem za pomocą stożka nosowego i umieść ciepły koc, aby zapobiec hipotermii. Izofluran jest starannie dostosowywany w celu utrzymania częstości oddechów na poziomie 1 Hz (60 oddechów/min). Adekwatność znieczulenia przed rozpoczęciem operacji będzie oceniana na podstawie częstotliwości oddychania, braku ruchów i słyszalnych dźwięków, braku reakcji na bodźce dotykowe oraz odruchu wycofania pedału kończyny przedniej lub tylnej.</li>
		<li>Buprenorfinę (0,05 mg/kg) należy podawać dootrzewnowo, aby zapobiec dolegliwościom bólowym. Usuń włosy w brzusznej części szyi i zdezynfekuj obszar betadyną i alkoholem.</li>
		<li>Aby zapobiec wysuszeniu rogówki, podczas znieczulenia należy nasmarować oczy myszy sterylną maścią okulistyczną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedury CSND 
	Etap 1: Chirurgiczne odnerwienie
	<ol>
		<li>Po nacięciu linii środkowej odsłonić rozwidlenie tętnic szyjnych wspólnych, usuwając tkanki łączne i tkankę tłuszczową.</li>
		<li>Zidentyfikuj nerw podjęzykowy, który jest zwykle bardzo widoczny, a następnie podnieś go, aby odsłonić nerw językowo-gardłowy bezpośrednio pod spodem. Wypreparuj nerwy zatok szyjnych obustronnie za pomocą nożyczek mikrosprężynowych.</li>
		<li>Zamknij nacięcie jedwabnym szwem 6-0.</li>
		<li>Podawać podskórnie 1 ml soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu.</li>
		<li>Umieść myszy w komorze regeneracyjnej i monitoruj ich zachowanie co 15 minut przez początkową 1 godzinę, aż myszy odzyskają przytomność, aby utrzymać leżący mostek. Przywróć myszy do ich klatek domowych po całkowitym wyzdrowieniu. Monitoruj myszy dwa razy dziennie przez następne 3 dni. Podaj dodatkowo buprenorfinę, jeśli myszy wykazują jakiekolwiek oznaki bólu (np. zmniejszony apetyt, niepokój). 
		Etap 2: Odnerwienie chemiczne</li>
		<li>Tydzień po zabiegu należy pomalować tętnicę szyjną roztworem 2% fenolu rozcieńczonego w etanolu w punktach rozgałęziania się od nerwu językowo-gardłowego do bieguna czaszkowego CB. Po odnerwieniu chemicznym należy zapewnić taką samą opiekę pooperacyjną, jak opisano powyżej w sekcji Denerwacja chirurgiczna. 
		UWAGA: W przypadku grupy chirurgii pozorowanej wykonywane są te same procedury, z wyjątkiem rozwarstwienia nerwu zatoki szyjnej.</li>
		<li>Pozwól zwierzętom dojść do siebie przez 5-7 dni przed pomiarami HVR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ekspresja LepRb w CB przy użyciu wektora adenowirusowego (Ad-LepRb) vs kontrola (Ad-LacZ)
<ol>
	<li>Zawiesina Ad-LepRb i Ad-LacZ
	<ol>
		<li>Transfekcja myszy adenowirusem (Ad-LepR b-GFP, 2-5x10 10 pfu / ml dla nadekspresji, Ad-Lacz 1 x10 pfu / ml dla kontroli) do obszaru CB.</li>
		<li>Rozmrozić matrycę Matrigel, zanurzając fiolkę w lodzie w lodówce o temperaturze 4 °C na noc.</li>
		<li>Delikatnie zawiesić adenowirusa w płynnej matrycy Matrigel w stosunku 1:5 (1 μl matrycy Matrigel i 4 μl adenowirusa nałożone obustronnie).</li>
		<li>Zawiesinę wirusa należy zawsze przechowywać na lodzie, dopóki nie zostanie nałożona na CB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie chirurgiczne
	<ol>
		<li>Używaj tych samych narzędzi chirurgicznych, co w protokole CSND.</li>
		<li>Znieczulij myszy z niedoborem B LepR db/db za pomocą 2-2,5% izofluranu za pomocą stożka nosowego i umieść zwierzęta na ciepłym kocu, aby zapobiec hipotermii. Izofluran jest starannie dostosowywany w celu utrzymania częstości oddechów na poziomie 1 Hz (60 oddechów/min). Adekwatność znieczulenia będzie oceniana na podstawie częstotliwości oddychania, braku ruchów i słyszalnych dźwięków, braku reakcji na bodźce dotykowe oraz odruchu wycofania pedału kończyny przedniej lub tylnej.</li>
		<li>Buprenorfinę (0,05 mg/kg) podawać dootrzewnowo.</li>
		<li>Usuń włosy w brzusznej części szyi i zdezynfekuj obszar betadyną i alkoholem, jak w protokole CSND.</li>
		<li>Aby zapobiec wysuszeniu rogówki, podczas znieczulenia należy nasmarować oczy myszy sterylną maścią okulistyczną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie CB adenowirusem
	<ol>
		<li>Wystawić CB zgodnie z opisem w protokole CSND i obustronnie nałożyć 5 μl zawiesiny wirusa na obszar CB.</li>
		<li>Odczekaj 2-3 minuty, aż płynna matryca Matrigel stanie się żelem. Po potwierdzeniu, że zawiesina wirusa zastygła, zamknij nacięcie szwem jedwabnym 6,0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zabiegu chirurgicznym
	<ol>
		<li>Umieść myszy w komorze regeneracyjnej i monitoruj ich zachowanie co 15 minut przez początkową 1 godzinę, aż myszy odzyskają przytomność, aby utrzymać leżący mostek. Przywróć myszy do ich klatek domowych po całkowitym wyzdrowieniu. Monitoruj myszy dwa razy dziennie przez następne 3 dni. Podaj dodatkową buprenorfinę, jeśli myszy wykazują jakiekolwiek oznaki bólu (np. zmniejszony apetyt, niepokój).</li>
		<li>Buprenorfinę (0,05 mg/kg) należy podawać dootrzewnowo w razie potrzeby, aby zapobiec dyskomfortowi bólowemu w okresie pooperacyjnym.</li>
		<li>Zmierz HVR 9 dni po transfekcji adenowirusa.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>O'donnell, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+prevents+respiratory+depression+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Leptin prevents respiratory depression in obesity.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159, 1477-1484 (1999).</li>
<li>Polotsky, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+gender+exacerbates+respiratory+depression+in+leptin-deficient+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Female gender exacerbates respiratory depression in leptin-deficient obesity.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, 1470-1475 (2001).</li>
<li>Bassi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+leptin+replacement+enhances+chemorespiratory+responses+in+leptin-deficient+mice+independent+of+changes+in+body+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Pflu%CC%88gers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Central leptin replacement enhances chemorespiratory responses in leptin-deficient mice independent of changes in body weight.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 145-153 (2012).</li>
<li>Inyushkina, E. M., Merkulova, N. A., Inyushkin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+the+respiratory+activity+of+leptin+at+the+level+of+the+solitary+tract+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of the respiratory activity of leptin at the level of the solitary tract nucleus.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 40, 707-713 (2010).</li>
<li>Considine, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+immunoreactive-leptin+concentrations+in+normal-weight+and+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans.</a> New England Journal of Medicine. 334, 292-295 (1996).</li>
<li>Maffei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+levels+in+human+and+rodent%3A+measurement+of+plasma+leptin+and+ob+RNA+in+obese+and+weight-reduced+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Leptin levels in human and rodent: measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects.</a> Nature Medicine. 1, 1155-1161 (1995).</li>
<li>Phipps, P. R., Starritt, E., Caterson, I., Grunstein, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+serum+leptin+with+hypoventilation+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Association of serum leptin with hypoventilation in human obesity.</a> Thorax. 57, 75-76 (2002).</li>
<li>Berger, S., Polotsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+and+Leptin+Resistance+in+the+Pathogenesis+of+Obstructive+Sleep+Apnea%3A+A+Possible+Link+to+Oxidative+Stress+and+Cardiovascular+Complications%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Leptin and Leptin Resistance in the Pathogenesis of Obstructive Sleep Apnea: A Possible Link to Oxidative Stress and Cardiovascular Complications.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 5137947(2018).</li>
<li>Ribeiro, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+blunts+the+effects+of+leptin+on+ventilation+and+on+carotid+body+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">High fat diet blunts the effects of leptin on ventilation and on carotid body activity.</a> The Journal of Physiology. 96, 3187-3199 (2018).</li>
<li>Yuan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+signaling+in+the+carotid+body+regulates+a+hypoxic+ventilatory+response+through+altering+TASK+channel+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Leptin signaling in the carotid body regulates a hypoxic ventilatory response through altering TASK channel expression.</a> Frontiers in Physiology. 9, 249(2018).</li>
<li>Caballero-Eraso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+acts+in+the+carotid+bodies+to+increase+minute+ventilation+during+wakefulness+and+sleep+and+augment+the+hypoxic+ventilatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Leptin acts in the carotid bodies to increase minute ventilation during wakefulness and sleep and augment the hypoxic ventilatory response.</a> The Journal of Physiology. 591, 151-172 (2018).</li>
<li>Jun, J. C., Shin, M. K., Yao, Q., Devera, R., Fonti-Bevans, S., Polotsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoneutrality+modifies+the+impact+of+hypoxia+on+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Thermoneutrality modifies the impact of hypoxia on lipid metabolism.</a> American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 304, 424-435 (2012).</li>
<li>Polotsky, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+interrupted+leptin+pathways+on+ventilatory+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Impact of interrupted leptin pathways on ventilatory control.</a> Journal of Applied Physiology. 96, 991-998 (2004).</li>
<li>Pho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+leptin+replacement+on+sleep-disordered+breathing+in+the+leptin-deficient+ob%2Fob+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">The effect of leptin replacement on sleep-disordered breathing in the leptin-deficient ob/ob mouse.</a> Journal of Applied Physiology. 120, 78-86 (2016).</li>
<li>Hernandez, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+whole+body+plethysmography+system+for+the+continuous+characterization+of+sleep+and+breathing+in+a+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Novel whole body plethysmography system for the continuous characterization of sleep and breathing in a mouse.</a> Journal of Applied Physiology. 112, 671-680 (2012).</li>
<li>Powell, F. L., Milsom, W. K., Mitchell, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+domains+of+the+hypoxic+ventilatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Respiration+Physiology%22%5BJournal%5D)">Time domains of the hypoxic ventilatory response.</a> Respiration Physiology. 112, 123-134 (1998).</li>
<li>Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+barometric+method+for+measuring+ventilation+in+newborn+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">A barometric method for measuring ventilation in newborn infants.</a> Pediatrics. 16, 81-87 (1955).</li>
<li>Duffin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+ventilatory+response+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measuring the ventilatory response to hypoxia.</a> The Journal of Physiology. 587, 285-293 (2007).</li>
<li>Teppema, L. J., Dahan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ventilatory+Response+to+Hypoxia+in+Mammals%3A+Mechanisms%2C+Measurement%2C+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Ventilatory Response to Hypoxia in Mammals: Mechanisms, Measurement, and Analysis.</a> Physiological Reviews. 90, 675-754 (2010).</li>
<li>Nurse, C. A., Fearon, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carotid+body+chemoreceptors+in+dissociated+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Carotid body chemoreceptors in dissociated cell culture.</a> Microscopy Research and Technique. 59, 249-255 (2002).</li>
<li>Kumar, P., Prabhakar, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+chemoreceptors%3A+function+and+plasticity+of+the+carotid+body%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Peripheral chemoreceptors: function and plasticity of the carotid body.</a> Comprehensive Physiology. 2, 141-219 (2012).</li>
<li>Roux, J. C., Peyronnet, J., Pascual, O., Dalmaz, Y., Pequignot, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilatory+and+central+neurochemical+reorganisation+of+O2+chemoreflex+after+carotid+sinus+nerve+transection+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ventilatory and central neurochemical reorganisation of O2 chemoreflex after carotid sinus nerve transection in rat.</a> The Journal of Physiology. 522, 493-501 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów ani ujawnień.

Głównym celem naszego badania było zbadanie wpływu sygnalizacji leptyny na układ oddechowy w CB. Opracowano kilka protokołów oceny roli leptyny w sposób mechanistyczny. Po pierwsze, specyficzny udział CB w HVR przeanalizowano poprzez staranne ilościowe określenie HVR podczas pierwszych 2 minut ekspozycji na hipoksję. Po drugie, znaczenie CB w regulacji w górę kontroli oddechu za pośrednictwem leptyny zbadano za pomocą dwóch uzupełniających się podejść. U szczupłych myszy typu dzikiego z niskim poziomem leptyny HVR mierzo...

W podwzgórzu działa hormon leptyna wytwarzany przez adipocyty, który hamuje przyjmowanie pokarmu i zwiększa tempo przemiany materii. Badania przeprowadzone w naszym laboratorium1,2 oraz przez innych badaczy3,4 wykazały, że leptyna zwiększa hiperkapniczną odpowiedź oddechową (HVR), zapobiegając otyłości hipowentylacji w otyłości z niedoborem leptyny. Jednak większość osób otyłych ma wysoki poziom leptyny w osoczu i wykazuje odporność na metaboliczne i oddechowe działanie hormonu5,6,7,8. Oporność na leptynę jest wieloczynnikowa, ale główną rolę odgrywa ograniczona przepuszczalność bariery krew-mózg (BBB) dla leptyny. Sugerujemy, że leptyna działa poniżej BBB w kluczowym narządzie o obwodowej wrażliwości na niedotlenienie, ciałach szyjnych (CB), aby bronić oddychania u osób otyłych. CB wyrażają długą funkcjonalną izoformę receptora leptyny, LepRb, ale rola CB w skutkach oddechowych leptyny nie została wystarczająco wyjaśniona9,10.
Celem naszej metody było zbadanie wpływu sygnalizacji leptyny w CB na HVR. Naszym uzasadnieniem było przeprowadzenie (a) eksperymentów z utratą funkcji polegających na podawaniu leptyny myszom z nienaruszonymi ciałami szyjnymi i odnerwionymi ciałami szyjnymi, a następnie pomiarami HVR; (b) eksperymenty ze wzmocnieniem funkcji u myszy db / db bez LepRb, w których zmierzyliśmy HVR na początku i po ekspresji LepRb wyłącznie w CB. Zaletą naszych technik było to, że wszystkie nasze eksperymenty przeprowadziliśmy na nieskrępowanych, nieznieczulonych myszach podczas snu i czuwania. Poprzedni badacze albo przeprowadzali swoje eksperymenty pod narkozą9 lub nie mierzyli wpływu leptyny podczas snu10. Ponadto nasze badanie jest pierwszym, w którym wykorzystano unikalne podejście do wzmocnienia funkcji z selektywną ekspresją LepRb w CB opisaną powyżej.
W szerokim kontekście, nasze podejście można uogólnić na inne receptory wyrażane w CB i ich rolę we wrażliwości na niedotlenienie. Badacze mogą podać ligand do receptora będącego przedmiotem zainteresowania i zmierzyć HVR na początku badania i po odnerwieniu CB. Jako podejście uzupełniające, receptor będący przedmiotem zainteresowania może ulegać nadekspresji w CB, a pomiary HVR można wykonać przed i po nadekspresji przy użyciu naszej technologii opisanej w tym manuskrypcie.

<table><tbody><tr><td>1 ml Strzykawki</td><td>insulinowe BD Biosciences</td><td>309311</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (pH 7,4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Ad-Lacz</td><td>Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago)</td><td></td><td>1 x 1010 pfu/mL</td></tr><tr><td>Ad-LepRb-GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>ADV-263380</td><td>2-5 x 1010 pfu/ml</td></tr><tr><td>Wózek anestezjologiczny</td><td>Atlantic Biomedical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Products Ltd.</td><td>12496-0757-5</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (Buprenex)</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.</td><td>12496-0757-5</td><td>0,3 mg / ml</td></tr><tr><td>C57Bl / 6J</td><td>Jackson laboratoryjny</td><td>000664</td><td>Szczep</td></tr> myszy <tr><td>Bawełniane gąbki z gazy</td><td>Fisherbrand</td><td>22-362-178</td><td></td></tr><tr><td>db / db</td><td>Jackson laboratoryjny</td><td>000697</td><td>Szczep myszy</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vetone</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Lab Wykres Data</td><td>Science International (DSI)</td><td></td><td>Oprogramowanie</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Micro Spring Scissors</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>14124</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Ox Plus</td><td>STARR Life Sciences Corp.</td><td></td><td>Oprogramowanie</td></tr><tr><td>Mysz Ox Plus Czujnik obroży</td><td>STARR Life Sciences Corp.</td><td>015022-2</td><td>Średni klips do kołnierza Special 7"</td></tr><tr><td>Komora pletyzmograficzna całego ciała myszy</td><td>Data Science International (DSI)</td><td>PLY3211</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Ohio Care Plus</td><td>Ohmeda</td><td>HCHD000173</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki operacyjne</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>501753-G</td><td>Prosta</td></tr><tr><td>pompa osmotyczna</td><td>Alzet</td><td>1003D</td><td>1 &mu; L/h, 3 dni</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane białko leptyny myszy</td><td>R& Systemy D</td><td>498-OB-05M</td><td>5 mg</td></tr><tr><td>soli fizjologicznej</td><td>RICCA Chemical</td><td>7210-16</td><td>0,9%</td></tr><tr><td>sterylny szew chirurgiczny</td> chlorku sodu <td>DemeTech</td><td>DT-639-1</td><td>Jedwab, rozmiar 6-0</td></tr><tr><td>Termometr</td><td>Innowacyjne roztwory kalibracyjne (INNOCAL)</td><td>EW 20250-91</td><td></td></tr></tbody></table>

eksperymentalne podejście do badania sygnalizacji leptyny w ciałach szyjnych i jej wpływu na kontrolę oddechu

Experimental Approach to Examine Leptin Signaling in the Carotid Bodies and its Effects on Control of Breathing

Hormon wytwarzany przez adipocyty, leptyna, jest silnym stymulantem układu oddechowego, który może odgrywać ważną rolę w obronie funkcji oddechowych w otyłości. Ciała szyjne (CB), kluczowy narząd o obwodowej wrażliwości na niedotlenienie, wyrażają długą funkcjonalną izoformę receptora leptyny (LepRb), ale rola sygnalizacji leptyny w kontroli oddychania nie została w pełni wyjaśniona. Zbadaliśmy niedotlenienie odpowiedzi oddechowej (HVR) (1) u myszy C57BL / 6J przed i po infuzji leptyny na początku badania i po odnerwieniu CB; (2) u myszy z niedoborem LepRb otyłych db / db na początku badania i po nadekspresji LepRb w CBs. U myszy C57BL / 6J leptyna zwiększyła HVR, a wpływ leptyny na HVR został zniesiony przez odnerwienie CB. U myszy db / db ekspresja LepRb w CB zwiększyła HVR. Dlatego wnioskujemy, że leptyna działa w CB w celu wzmocnienia odpowiedzi na niedotlenienie.

Ciągła infuzja leptyny znacząco zwiększyła HVR u szczupłych myszy C57BL/6J z 0,23 do 0,31 mL/min/g/ΔFiO2 (P &lt; 0,001, Rysunek 2)11. CSND zniosło indukowany leptyną wzrost HVR (Rysunek 2), podczas gdy w grupie poddanej operacji pozorowanej po infuzji leptyny nie zaobserwowano żadnych efektów osłabiających HVR przez CSND.
Ekspresja LepRb w CB otyłych myszy db/db z niedoborem L...

Nasze badanie skupia się na wpływie sygnalizacji leptyny w tętnicy szyjnej (CB) na niedotlenienie reakcji oddechowej (HVR). Przeprowadziliśmy eksperymenty "utraty funkcji" mierzące wpływ leptyny na HVR po odnerwieniu CB oraz eksperymenty "wzmocnienia funkcji" mierzące HVR po nadekspresji receptora leptyny w CB.

Eksperymentalne podejście do badania sygnalizacji leptyny w ciałach szyjnych i jej wpływu na kontrolę oddechu

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The ...

Nasz protokół może być wykorzystany do zbadania wpływu leptyny na układ oddechowy na ciało szyjne w obwodowym oddychaniu chemoreflex, kontroli i fizjologicznych reakcji na niedotlenienie. Możemy również ocenić skutki utraty i wzmocnienia funkcji ciała szyjnego, stosując odpowiednio odnerwienie chirurgiczne i chemiczne oraz transfekcję adenowirusa. Przed rozpoczęciem zabiegu zmierz temperaturę wewnątrz wykonanej na zamówienie komory plasthemagroficznej całego ciała i zmierz wilgotność względną w laboratorium.Następnie zmierz masę ciała i temperaturę w odbycie myszy eksperymentalnej. Umieść mysz w komorze i umieść obrożę pulsoksymetryczną wokół ogolonej szyi zwierzęcia. I pamiętaj, aby całkowicie uszczelnić komorę, aby uniknąć wycieków powietrza.Odczekaj około 30 minut, aż mysz wyciszy się, a komora będzie miała stałą głośność. Przed rozpoczęciem rejestrowania sygnałów oddechowych i obwodowego nasycenia tlenem w normoksji. Po 20 minutach normoksji wystawiaj zwierzę na stały przepływ zmieszanych gazów składających się z 10% tlenu i 3% dwutlenku węgla.I zacznij rejestrować pierwszy cykl ostrej hipoksji sygnałów oddechowych i obwodowego nasycenia tlenem. Podczas pierwszych 30 sekund nie

experimental-approach-to-examine-leptin-signaling-carotid-bodies-its

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Celem jest przedstawienie nowej metody, stymulacji elektrycznej kontroli oddechu (BreEStim) do leczenia bólu neuropatycznego i spastyczności.

Stymulacja elektryczna sterowana oddychaniem (BreEStim) w leczeniu bólu neuropatycznego i spastyczności

Aferentna sygnalizacja błędna przekazuje ważne informacje do ośrodkowego układu nerwowego z receptorów znajdujących się w narządach brzucha i klatki piersiowej. Zwoje nerwu błędnego bez dawki zawierają wiele rodzajów receptorów, które modulują aktywność nerwu błędnego. Protokół ten opisuje metodę miejscowych wstrzykiwań neurochemikaliów do zwojów nerwowych bez dawki.

Metoda wstrzykiwania zwojów nerwowych bez dawki u szczura Sprague-Dawley

Centralny napęd oddechowy znajduje się w pniu mózgu. Spontaniczny sygnał motoryczny układu oddechowego z izolowanego rdzenia kręgowego pnia mózgu jest rejestrowany poprzez umieszczenie elektrody na czwartym korzeniu brzusznym. To eksperymentalne podejście jest cenne dla badań farmakologicznych lub oceny wyzwań oddechowych i manipulacji genetycznych dotyczących rytmicznych zachowań motorycznych.

Elektrofizjologia izolowanych preparatów rdzenia kręgowego od nowonarodzonych gryzoni umożliwia rejestrację danych wyjściowych sieci neuronowej układu oddechowego

Tutaj prezentujemy protokół oparty na immunohistologicznej detekcji białka c-FOS, klasycznej technice używanej do identyfikacji populacji neuronów zaangażowanych w określone reakcje fizjologiczne in vivo i ex vivo.

Wykrywanie immunohistologiczne białka c-FOS: użyteczne narzędzie jako marker centralnych szlaków zaangażowanych w określone reakcje fizjologiczne in vivo i ex vivo

Metoda RAPID przetwarzania krwi może być stosowana u ludzi i daje wyższe poziomy peptydów, jak również pozwala na ocenę prawidłowej formy molekularnej. Dlatego metoda ta będzie cennym narzędziem w badaniach nad peptydami.

SZYBKA metoda przetwarzania krwi w celu zwiększenia wydajności stężenia peptydów w osoczu we krwi ludzkiej

Częstość występowania otyłości wzrasta i zwiększa ryzyko przewlekłych chorób płuc. Aby ustalić podstawowe mechanizmy i strategie zapobiegawcze, potrzebne są dobrze zdefiniowane modele zwierzęce. W tym miejscu przedstawiamy trzy metody (test tolerancji glukozy, pletysmografia ciała i stabilizacja płuc) w celu zbadania wpływu otyłości na wyniki płucne u myszy.

Dootrzewnowy test tolerancji glukozy, pomiar czynności płuc i zespolenie płuc w celu zbadania wpływu otyłości i upośledzonego metabolizmu na wyniki płucne

Nieskrępowana pletyzmografia barometryczna służy do ilościowego określenia wzorca oddychania u obudzonych myszy. Pokazujemy, że 15-sekundowe segmenty w ustandaryzowanym protokole wyświetlają podobne wartości do wydłużonego czasu cichego oddychania. Metodologia ta pozwala również na ilościowe określenie bezdechu i przyspieszonych oddechów w ciągu pierwszej godziny w komorze.

Metoda uzyskiwania wzorca oddychania u starzejących się myszy za pomocą nieskrępowanej pletyzmografii barometrycznej

Baroreflex to mechanizm regulacji tętna przez autonomiczny układ nerwowy w odpowiedzi na zmiany ciśnienia krwi. Opisujemy technikę chirurgiczną polegającą na wszczepieniu nadajników telemetrycznych do ciągłego i jednoczesnego pomiaru elektrokardiogramu i ciśnienia krwi u myszy. Może to określać spontaniczną wrażliwość baroodruchową, ważny marker prognostyczny chorób sercowo-naczyniowych.

Implantacja połączonych telemetrycznych przetworników EKG i ciśnienia krwi w celu określenia spontanicznej wrażliwości barorefleksu u przytomnych myszy

Tutaj prezentujemy protokół hodowli określonych podtypów komórek podwzgórza w hodowli. Komórki mogą być wybierane na podstawie odpowiednich/unikalnych markerów błonowych i wykorzystywane w wielu zastosowaniach, w tym w testach immunofluorescencyjnych, elektrofizjologicznych i biochemicznych.

Izolacja docelowych neuronów podwzgórza do badań regulacji hormonalnej, metabolicznej i elektrycznej

Niniejsza praca szczegółowo opisuje sposób wykorzystania komór hipoksji z przepływem ciągłym do generowania atmosfer o określonych stężeniach O2 w celu zrozumienia reakcji biologicznych na obniżone stężenie O2. System ten jest łatwy w konfiguracji i konserwacji oraz wystarczająco elastyczny, aby dostosować go do szerokiego zakresu stężeń O2 oraz różnych systemów...

Tworzenie określonych środowisk gazowych w celu badania wpływu hipoksji na C. elegans

Dowiedz się, jak badać wpływ leptyny na sygnalizację w ciałach szyjnych i kontrolę oddechu w warunkach hipoksji. Metoda obejmuje denewację nerwu zatokowego szyjnego i transfekcję adenowirusową u myszy.

Eksperymentalne podejście do badania sygnalizacji leptyny w ciałach szyjnych i jej wpływu na kontrolę oddechu

Przeglądaj więcej filmów