Name: Przygotowanie powierzchni ślimaka u dorosłej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Naucz się modyfikowanej techniki przygotowania powierzchni ślimaka u dorosłej myszy z wykorzystaniem odkwapniania EDTA i kleju tkankowego. Ta metoda umożliwia lepszą wizualizację narządu Cortiego poprzez immunohistochemię.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opisany projekt badawczy był wspierany przez grant R01 DC009222 z National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Prace te prowadzono w budynku WR w MUSC w odnowionej przestrzeni wspieranej przez grant C06 RR014516. Zwierzęta były trzymane w obiektach dla zwierząt MUSC CRI wspieranych przez grant C06 RR015455 z Programu Zaocznych Placówek Badawczych Narodowego Centrum Zasobów Badawczych. Autorzy dziękują dr. Jochenowi Schachtowi za cenne uwagi oraz Andrie Talasce za korektę rękopisu.

Wszystkie protokoły badań z udziałem samców dorosłych myszy CBA/J w wieku 10-12 tygodni i myszy C57BL/6J w wieku 6-8 tygodni zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Medycznym Południowej Karoliny (MUSC). Opieka nad zwierzętami była nadzorowana przez Zakład Laboratoryjnych Zasobów Zwierzęcych MUSC.
UWAGA: W przypadku przedstawionych poniżej procedur, myszy są znieczulane ketaminą (100 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg) poprzez zastrzyki dootrzewnowe. Myszy są dekapitacjonowane po tym, jak zwierzę nie reaguje już na bolesne bodźce, takie jak uszczypnięcie palca u nogi.
1. Ekstrakcja kości skroniowych
<ol>
	<li>Natychmiast po sekcji zwłok należy odciąć głowę myszy nożyczkami chirurgicznymi (o długości 17 cm) i przeciąć kość czaszki nożyczkami od tylnej części do przodu wzdłuż linii środkowej czaszki po odsłonięciu kości czaszki poprzez pociągnięcie skóry do przodu.</li>
	<li>Usuń tkankę mózgową za pomocą kleszczy i ręcznie usuń kości skroniowe kciukiem i palcem wskazującym u myszy w wieku trzech miesięcy lub starszych. Użyj małych nożyczek chirurgicznych (o długości 11 cm), aby przeciąć kość skroniową myszy w wieku poniżej trzech miesięcy.</li>
	<li>Umieścić kość skroniową na szalce Petriego (o średnicy 30 mm) zawierającej lodowato świeży 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) rozpuszczony w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pH 7.4, 
	nuta: Przygotuj świeży 4% roztwór PFA i dostosuj pH do 7,4 tuż przed utrwaleniem kości skroniowych, ponieważ niewłaściwe zrównoważenie pH roztworu PFA obniży jakość znakowania immunologicznego.</li>
</ol>
2. Fiksacja i perfuzja
<ol>
	<li>Usuń strzemiączko z owalnego okienka i nakłuj okrągłą membranę okienną kleszczami w rozmiarze #5. Pod mikroskopem stereoskopowym wykonaj mały otwór w wierzchołku ślimaka za pomocą igły 27 G podłączonej do strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Delikatnie i powoli perfekować ślimak 4% roztworem PFA przez okrągłe i owalne okienka, aż roztwór wypłucze się z małego otworu na wierzchołku. Przenieść ślimak (jeden lub dwa ślimaki na fiolkę) do fiolek scyntylacyjnych o objętości 20 ml zawierających 10 ml 4% roztworu PFA.</li>
	<li>Fiolki scyntylacyjne delikatnie mieszać w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 godziny i pozostawić na noc w lodówce (4 °C) na rotatorze. 
	nuta: Czas utrwalenia można dostosować w zależności od zastosowanego przeciwciała. Na przykład ograniczenie fiksacji do 1,5 godziny pozwoli na skuteczne znakowanie immunologiczne zakończeń postsynaptycznych przy użyciu przeciwciała GluA 2.</li>
</ol>
3. Odwapnienie kości skroniowej
<ol>
	<li>Usuń roztwór PFA i umyj ślimaki świeżym PBS 3x przez 5 minut każdy.</li>
	<li>Dodać 20 ml 4% roztworu soli disodowej (EDTA) kwasu etylenodiaminotetraoctowego (pH 7,4) do fiolek scyntylacyjnych i przechowywać w lodówce przez 48–72 godziny na rotatorze z delikatnym mieszaniem. Zmieniaj roztwór EDTA codziennie, aż ślimaki zostaną odwapnione. Sprawdź, czy ślimaki są odwapnione, dotykając kościstej części przedsionkowej kleszczami, aby ocenić elastyczność lub po prostu odetnij mały kawałek od krawędzi części przedsionkowej. Jeśli w wyniku takiego cięcia powstaje zmiażdżony kawałek, ślimak nie jest odwapniony. 
	nuta: Roztwór EDTA może zakłócać reakcję immunologiczną przeciwciał pierwszorzędowych w zależności od stężenia roztworu. Przygotować 4% EDTA w PBS i dostosować pH do 7,4. Do konsekwentnego odwapniania kości skroniowych stosuje się świeży roztwór EDTA.</li>
	<li>Zmień roztwór na PBS do mikrodysekcji po zakończeniu odwapnienia. 
	nuta: Jeśli ślimaki nie są wystarczająco odwapnione, nie można przeprowadzić sekcji ślimaka.</li>
</ol>
4. Mikrodysekcja nabłonka ślimaka
UWAGA: Po zakończeniu odwapnienia, mikrodysekcja nabłonka ślimaka w celu immunoznakowania musi być wykonana tak szybko, jak to możliwe. W czystej, 30-milimetrowej szalce Petriego zawierającej PBS, ucho wewnętrzne jest zorientowane w następujący sposób: w odniesieniu do góry (pokrywy) i dołu szalki Petriego, okrągłe i owalne okienka ślimaka są skierowane ku górze. W odniesieniu do dysektorium, część ślimakowa jest zorientowana do przodu (z dala od dysektorium), a część przedsionkowa do tyłu (w pobliżu dysektorium). Poniżej szczegółowo opisano te kroki.
<ol>
	<li>Przytrzymaj przedsionkową część kości skroniowej kleszczami i przetnij zwój wierzchołkowy skalpelem pod kątem 45°, jak wskazuje czerwona linia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1a).</li>
	<li>Przeciąć pionowo wzdłuż słabej linii między okrągłym oknem a owalnym okienkiem, jak wskazuje czerwona linia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1b), aby oddzielić ślimak od części przedsionkowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1c). 
	nuta: Ta część ślimaka zawiera środkową, podstawową i haczykową część nabłonka.</li>
	<li>Umieść część ślimakową z podstawowym zwojem skierowanym w dół, a środkowym skrętem w kierunku góry szalki Petriego i odetnij kostną torebkę i boczną ścianę środkowego zwoju w kierunku końca, z którego usunięto przekrój wierzchołkowy, jak wskazuje czerwona linia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1d,e).</li>
	<li>Kontynuuj cięcie, aby całkowicie oddzielić środkową część od obszaru podstawowego i haczykowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1f,g). 
	nuta: Obszar haczyka ślimaka to koniec nabłonka ślimaka odpowiadający wrażliwości na tony 48 kHz i wyższe u myszy.</li>
	<li>Umieść część podstawową i haczykową z błoną podstawną skierowaną w stronę dna naczynia i pionowo odetnij modiolus z obszaru haczyka, aby usunąć modiolus, jak wskazuje pionowa czerwona linia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1g). 
	nuta: Modiolus to centralna oś ślimaka w kształcie stożka, która składa się z gąbczastej kości i nerwu ślimakowego, a także zwoju spiralnego. Lepiej byłoby wykonać to cięcie nożyczkami.</li>
	<li>Wytnij obszary podstawy i haczyka, jak wskazuje druga czerwona linia w Rysunek 1g, aby oddzielić część haczyka (Rysunek 1h). 
	nuta: Ślimak został teraz podzielony na część wierzchołkową, środkową, podstawową i haczykową. Kolejnymi krokami będzie końcowe rozebranie każdego z poszczególnych zakrętów, na przykładzie środkowego zakrętu.</li>
	<li>Odetnij stosunkowo duże porcje torebki kostnej i tkanki ściany bocznej środkowego skrętu, jak wskazuje czerwona linia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1i). 
	nuta: Boczną ścianę przewodu ślimakowego tworzy więzadło spiralne i prążek naczyniowy.</li>
	<li>Przytrzymaj boczną ścianę kleszczami, aby wyrównać kostną torebkę i boczną ścianę z dnem szalki Petriego i przeciąć te tkanki od strony błony podstawnej. Następnie spłaszcz próbkę, aby zorientować czuciową powierzchnię komórek rzęsatych stroną do góry. Odetnij resztę kostnej torebki i ściankę boczną (<silna klasa="xfig">Rysunek 1j).</li>
	<li>Usuń membranę tektorialną za pomocą kleszczy, aby całkowicie oddzielić środkowy obszar (<silna klasa="xfig">Rysunek 1k).</li>
	<li>Powtórz kroki 4.7−4.9 dla końcowych sekcji pozostałych zwojów lub obszarów, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1l.</li>
	<li>Przygotować okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 10 mm w celu przyklejenia nabłonka czuciowego. Za pomocą pipety ręcznie rozprowadź 0,5 μl kleju komórkowego i tkankowego na środku okrągłego szkiełka nakrywkowego. Po wyschnięciu (3–5 min w temperaturze suchej) umieść szkiełka nakrywkowe w PBS na szalkach Petriego.</li>
	<li>Przykleić wszystkie cztery części nabłonka czuciowego na okrągłym szkiełku nakrywkowym o średnicy 10 mm na szalce Petriego. Następnie przytrzymaj jedną krawędź szkiełka nakrywkowego, aby przenieść go do naczynia z czterema dołkami w celu znakowania immunologicznego lub immunohistochemii (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1m). 
	UWAGA: Rysunek 2 ilustruje lokalizację głównych cięć.</li>
</ol>
5. Znakowanie immunologiczne synaps ślimakowych
UWAGA: Protokół znakowania immunologicznego dla synaps ślimakowych stosowany w tym badaniu został wcześniej opisany13. Wstęgi presynaptyczne znakowano przeciwciałem CtBP2 (mysie białko wiążące anty-karboksyl-zakończenie 2 IgG1, znakujące domenę B białka rusztowania RIBEYE). Zakończenia postsynaptyczne znakowano przeciwciałem GluA2 (mysi receptor antyglutaminianu 2 IgG2a, znakujący podjednostki receptora AMPA).
<ol>
	<li>Przemyj nabłonek czuciowy PBS 3x przez 5 minut każde płukanie w naczyniu czterodołkowym, a następnie dodaj 2 ml 2% niejonowego środka powierzchniowo czynnego (tj. Triton-X 100) do naczynia na 30 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze.</li>
	<li>Usunąć niejonowy roztwór środka powierzchniowo czynnego z naczynia za pomocą pipety i dodać 100 μl roztworu blokującego zawierającego 10% normalnej surowicy koziej do każdego dołka przez 1 godzinę na rotatorze z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć roztwór blokujący z każdej studzienki, przemyć PBS 3x przez 5 minut przy każdym płukaniu pod delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 100 μl pierwszorzędowych przeciwciał rozcieńczonych PBS: mysi anty-GluA2 IgG2a (1:2,000), mysie anty-CtBP2 IgG1 (1:400). Przykryj każde czterodołkowe naczynie pokrywką i umieść w dużym nawilżonym pojemniku, który chroni przed światłem. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 h. 
	nuta: Opcjonalnie można dodać króliczą anty-miozynę VIIa (1:400) do znakowania immunologicznego czuciowych komórek rzęsatych.</li>
	<li>Myć 3x PBS przez 5 minut każde pranie z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 100 μl przeciwciał drugorzędowych Alexa 594 kozi anty-mysi IgG1a (1:1,000), Alexa 488 kozioł anty-mysi IgG2a (1:1,000) rozcieńczonych PBS do każdego dołka. Przykryj każde czterodołkowe naczynie pokrywką i umieść w dużym nawilżonym pojemniku, który chroni przed światłem. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 h. 
	nuta: Jeśli stosuje się miozynę VIIa, dodaj kozią anty-króliczą Alexa 350 (1:200).</li>
	<li>Myć 3x PBS przez 5 min. Następnie przenieść okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 10 mm na szkiełko podstawowe z próbkami na wierzchu.</li>
	<li>Ostrożnie dodaj 8 μl Fluoro-Gel z buforem Tris na środek szkiełka nakrywkowego. Następnie przytrzymaj krawędź kolejnego okrągłego szkiełka nakrywkowego o średnicy 10 mm za pomocą kleszczyków, aby zamontować je na górze, łącząc ze sobą oba szkiełka nakrywkowe.</li>
	<li>Użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić szkiełka, włóż je do kartonowej teczki na slajdy i przechowuj w lodówce. 
	nuta: Jeśli podczas montażu między szkiełkami nakrywkowymi wycieknie trochę żelu fluorowego, wyczyść krawędzie szkiełek nakrywkowych przed uszczelnieniem szkiełka lakierem do paznokci. Zdjęcia konfokalne należy wykonać w ciągu 7 dni.</li>
</ol>

<ol><li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA%2FJ+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li>
<li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+guide+to+plotting+a+cochleogram%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-10), (2004).</li>
<li>Sha, S. H., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+therapeutic+interventions+against+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Investigational+Drugs%22%5BJournal%5D)">Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+insult+to+injury%3A+cochlear+nerve+degeneration+after+%22temporary%22+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li>
<li>Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+Noise+Activates+Rho-Family+GTPases+through+Transient+Cellular+Energy+Depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion.</a> Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).</li>
<li>Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-Induced+Loss+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synaptopathy+Are+Mediated+by+the+Activation+of+AMPK%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK.</a> Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).</li>
<li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Histone+Methyltransferase+G9a+Attenuates+Noise-Induced+Cochlear+Synaptopathy+and+Hearing+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss.</a> Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).</li>
<li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+attenuates+noise-induced+hearing+loss+by+reducing+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidant+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress.</a> Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Calcium+Transporters+Mediate+Sensitivity+to+Noise-Induced+Losses+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469(2018).</li>
<li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross%2C+cellular+and+subcellular+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li>
<li>Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-independent+pathways+of+hair+cell+death+induced+by+kanamycin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo.</a> Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).</li>
<li>Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+and+neural+degeneration+with+aging%2C+as+seen+in+microdissections+of+the+human+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology%2C+and+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).</li>
<li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+HDAC+with+a+novel+inhibitor+effectively+reverses+paclitaxel+resistance+in+non-small+cell+lung+cancer+via+multiple+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms.</a> Cell Death & Disease. 7, 2063(2016).</li>
<li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li>
<li>Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEngstr%C3%B6m%2C+H+%22Structural+pattern+of+the+organ+of+Corti%3A+a+systematic+mapping+of+sensory+cells+and+neural+elements%22">Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements</a>. , Almqvist & Wiksell. Stockholm, Sweden. (1966).</li>
<li>Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+and+vestibular+lesions+in+capsular+otosclerosis+as+seen+in+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology%2C+and+Laryngology+Supplement%22%5BJournal%5D)">Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, Pt 3 Suppl 48 1-40 (1978).</li>
<li>MassEyeAndEar.org. , https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019).</li>
<li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Mount+Dissection+and+Immunofluorescence+of+the+Adult+Mouse+Cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li>
<li>Corning Cell Culture Surfaces. , https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019).</li>
<li>Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+hair+cell+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).</li>
<li>Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+anatomy+of+the+%27hook%27+region+of+the+human+cochlea+and+how+it+relates+to+cochlear+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Audiology+and+Neurootology%22%5BJournal%5D)">On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation.</a> Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).</li>
<li>Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+hook+region+of+the+cochlea+for+bone-conduction+hearing%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).</li>
<li>Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-interacting+protein+kinases+modulate+noise-induced+sensory+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death.</a> Cell Death & Disease. 5, 1262(2014).</li>
<li>Brown, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-Mediated+Glial+Cell+Elimination+in+the+Postnatal+Mouse+Cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mikrodysekcja ślimaka preparatów powierzchniowych w całości w połączeniu z immunoznakowaniem stanowi podstawowe narzędzie do badania patologii ucha wewnętrznego i mechanizmów molekularnych. Ta zmodyfikowana metoda wypreparowania ślimaka u dorosłych myszy przy użyciu kleju komórkowego i tkankowego upraszcza tę trudną procedurę.
Chociaż ta zmodyfikowana metoda przygotowania powierzchni ślimaka jest stosunkowo łatwa i dostępna, nadal wymaga praktyki, aby osiągnąć biegłość. Aby wykonać prawidłowe ...

Ślimak jest przeznaczony do wykrywania dźwięku i odpowiada za słuch. Przewód ślimakowy jest zwinięty w spiralny kształt w błędniku kostnym i zawiera narząd końcowy czucia słuchowego, narząd Cortiego (OC). OC spoczywa na błonie podstawnej, tworzącej nabłonek ślimaka, o długości około 5,7 mm po rozwinięciu u dorosłych myszy CBA/CaJ1,2. Ponieważ OC jest zorganizowane tonotopowo z wysokimi częstotliwościami wykrywanymi w podstawie i niskimi częstotliwościami w wierzchołku, nabłonek ślimaka jest często dzielony na trzy części w celu porównań analitycznych: zwoje wierzchołkowe, środkowe i podstawowe odpowiadające odpowiednio wykrywaniu niskich, średnich i wysokich częstotliwości. Oprócz szeregu komórek podporowych, OC składa się z jednego rzędu wewnętrznych komórek rzęsatych (IHC) położonych przyśrodkowo i trzech rzędów zewnętrznych komórek rzęsatych (OHC) położonych bocznie w stosunku do spirali ślimakowej.
Prawidłowe przetwarzanie słuchowe zależy od integralności czuciowych komórek rzęsatych w ślimaku. Uszkodzenie lub utrata czuciowych komórek rzęsatych jest powszechną patologiczną cechą nabytego ubytku słuchu, spowodowaną licznymi etiologiami, takimi jak narażenie na nadmierny hałas, stosowanie leków ototoksycznych, bakteryjne lub wirusowe infekcje ucha, urazy głowy i proces starzenia3. Dodatkowo, integralność i funkcja wewnętrznych synaps komórek rzęsatych/nerwów słuchowych może być osłabiona przez łagodne obelgi4. Dzięki dostępności informacji molekularnej i genetycznej oraz manipulacji genami za pomocą technik knockout i knock-in, myszy są szeroko stosowane w naukach słuchowych. Chociaż ślimak dorosłej myszy jest maleńki, a nabłonek ślimaka jest otoczony kostną torebką, co powoduje technicznie trudne mikrodysekcja, przygotowanie powierzchniowe nabłonka w połączeniu z immunoznakowaniem lub immunohistochemią i obrazowaniem konfokalnym jest szeroko stosowane do badania patologii ślimaka, w tym utraty synaps wstęgowych i komórek rzęsatych, zmian poziomu białek w czuciowych komórkach rzęsatych i komórkach podporowych, i regeneracja komórek włosa. Preparaty z powierzchni ślimaka stosowano również do określania wzorca ekspresji genów reporterowych (tj. GFP) oraz potwierdzania udanej transdukcji i identyfikacji transdukowanych typów komórek. Techniki te były wcześniej wykorzystywane do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw utraty słuchu wywołanej hałasem przy użyciu dorosłych myszy CBA/J5,6,7,8,9.
W przeciwieństwie do immunohistochemii wykorzystującej skrawki parafiny lub kriosekcje do uzyskania małych przekrojów poprzecznych ślimaka, które zawierają trzy zewnętrzne komórki rzęsate (OHC) i jedną wewnętrzną komórkę rzęsatą (IHC) na każdej sekcji, preparaty powierzchni ślimaka pozwalają na wizualizację całej długości OC do liczenia czuciowych komórek rzęsatych i synaps wstęgowych oraz znakowania immunologicznego czuciowych komórek rzęsatych odpowiadających określonym częstotliwościom funkcjonalnym. Tabela 1 przedstawia mapowanie częstotliwości słyszenia w funkcji odległości wzdłuż długości spirali ślimakowej u dorosłej myszy CBA/J zgodnie z badaniami Muller1 oraz Viberg and Canlon1,2. Preparaty powierzchniowe ślimaka są szeroko stosowane do badania patologii ślimaka4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15. Metoda całomocistej sekcji ślimaka została pierwotnie opisana w książce zredagowanej przez Hansa Engstroma w 1966 roku16. Technika ta została następnie udoskonalona i dostosowana do różnych gatunków, jak opisano w literaturze przez wielu naukowców z hearing science10,11,12,13,15,17 oraz przez Eaton-Peabody Laboratories w Massachusetts Eye and Ear18. Niedawno inna metoda preparacji ślimaka została opisana przez Montgomery et al.19. Mikrodysekcja ślimaka jest niezbędnym i krytycznym etapem przygotowania powierzchni ślimaka. Jednak preparowanie ślimaków myszy jest wyzwaniem technicznym i wymaga znacznej praktyki. W tym artykule przedstawiono zmodyfikowaną metodę przygotowania powierzchni ślimaka do stosowania u ślimaków dorosłych myszy. Metoda ta wymaga odwapnienia i użycia kleju komórkowego i tkankowego (tj. Cell-Tak) w celu przyklejenia kawałków nabłonka ślimaka do 10 mm okrągłych szkiełek nakrywkowych w celu znakowania immunologicznego. Klej komórkowy i tkankowy jest szeroko stosowany w immunohistochemii20. Ta zmodyfikowana metoda mikrodysekcji ślimaka jest stosunkowo prosta w porównaniu z poprzednio opisanymi18,19.

<table><tbody><tr><td>10 mm Rund Szkiełka nakrywkowe</td><td>Produkty mikroskopowe dla nauki i przemysłu</td><td>260367</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Koza Anty-mysia IgG2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Koza Anty-mysia IgG1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21125</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Koza Anty-królicza IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Kartonowe mikro tacki przesuwne</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-587-10</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego Corning</td><td>Scientific</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>Narzędzia naukowe FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sól disodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-żel z buforem Tris</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>17985-10</td><td></td></tr><tr><td>Czterodołkowe naczynia do hodowli komórkowych</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-miozyny VIIa</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-CtBP2</td><td>BD Biosciences</td><td>#612044</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-Glu2R</td><td>Millipore</td><td>MAB397</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31872</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>VWR</td><td>100491-038</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Nożyczki sprężynowe</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>15001-08</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie powierzchni ślimaka u dorosłej myszy

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Przetwarzanie słuchowe w ślimaku zależy od integralności mechanosensorycznych komórek rzęsatych. W ciągu całego życia ubytek słuchu może wynikać z wielu etiologii, takich jak narażenie na nadmierny hałas, stosowanie leków ototoksycznych, bakteryjne lub wirusowe infekcje ucha, urazy głowy i proces starzenia. Utrata czuciowych komórek rzęsatych jest powszechną patologiczną cechą różnych nabytych ubytków słuchu. Dodatkowo wewnętrzna synapsa komórek rzęsatych może zostać uszkodzona przez łagodne urazy. Dlatego przygotowanie powierzchni nabłonka ślimaka, w połączeniu z technikami znakowania immunologicznego i obrazowaniem konfokalnym, jest bardzo przydatnym narzędziem do badania patologii ślimaka, w tym utraty synaps wstęgowych i czuciowych komórek rzęsatych, zmian poziomu białka w komórkach rzęsatych i komórkach podporowych, regeneracji komórek rzęsatych oraz określania ekspresji genu raportowego (tj. GFP) w celu weryfikacji udanej transdukcji i identyfikacji transdukowanych typów komórek. Ślimak, kostna struktura w kształcie spirali w uchu wewnętrznym, zawiera końcowy narząd słuchu i czucia, narząd Cortiego (OC). Czuciowe komórki rzęsate i otaczające je komórki podporowe w OC są zawarte w przewodzie ślimakowym i spoczywają na błonie podstawnej, zorganizowanej w sposób tonotopowy, z detekcją wysokiej częstotliwości występującej u podstawy i niskiej częstotliwości w wierzchołku. Dzięki dostępności informacji molekularnej i genetycznej oraz możliwości manipulowania genami za pomocą technik knockout i knock-in, myszy są szeroko stosowane w badaniach biologicznych, w tym w naukach o słuchu. Jednak ślimak dorosłej myszy jest maleńki, a nabłonek ślimaka jest zamknięty w błędniku kostnym, co utrudnia mikrodysekcję. Chociaż techniki preparacji zostały opracowane i są stosowane w wielu laboratoriach, ta zmodyfikowana metoda mikrodysekcji z użyciem kleju komórkowego i tkankowego jest łatwiejsza i wygodniejsza. Może być stosowany we wszystkich typach ślimaków dorosłych myszy po odwapnieniu.

Przygotowania powierzchniowe nabłonka ślimaka, w połączeniu z immunoznakowaniem i obrazowaniem konfokalnym, są szeroko stosowane w nauce o słuchu do badania patologii ślimaka, takich jak ilościowe określanie liczby synaps wstążkowych, komórek rzęskowych sensorycznych oraz ekspresji białek w komórkach rzęskowych sensorycznych5,6,7,8. Chociaż sekcja ślimaków dorosłych myszy w celu wykonania prepa...

Ten artykuł przedstawia zmodyfikowaną metodę przygotowania powierzchni ślimaka, która wymaga odwapnienia i użycia kleju komórkowego i tkankowego do przyklejenia kawałków nabłonka ślimaka do 10 mm okrągłych szkiełek nakrywkowych do immunohistochemii u dorosłych ślimaków myszy.

Przygotowanie powierzchni ślimaka u dorosłej myszy

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Preparaty powierzchni ślimaka umożliwiają wizualizację całej soczewki narządu Cortiego za pomocą immunohistochemii i obrazowania konfokalnego. Jest szeroko stosowany do badania określonych patologii ślimaka będących przedmiotem zainteresowania. Zmodyfikujemy metodę mikrodysekcji ślimaka.Główną zaletą tej techniki jest przyleganie kawałka nabłonka ślimaka do 10-milimetrowych okrągłych szkiełek nakrywkowych w celu przeprowadzenia procedury znakowania immunologicznego, przy jednoczesnym uniknięciu utraty tkanki podczas wielu etapów mycia. Oprócz patologii ślimaka, przygotowanie powierzchni ślimaka może być również wykorzystane do oceny ekspresji i regeneracji komórek rzęsatych. Do tej techniki wymagane są podstawowe umiejętności obsługi mikroskopu, a wizualna demonstracja metody może pomóc w zapewnieniu, że każdy krok jest wykonywany prawidłowo.Procedurę zademonstruje Qiaojun Fang, doktorant z mojego laboratorium. W celu ekstrakcji kości skroniowej, natychmiast po sekcji zwłok pociągnij skórę do przodu, aby odsłonić kość czaszki i użyj nożyczek, aby przeciąć kość od tylnej części do przodu wzdłuż linii środkowej czaszki. Użyj kleszczy, aby usunąć tkankę mózgową przed użyciem kciuka i palca wskazującego do ręcznego usunięcia kości skroniowych myszy w wieku trzech miesięcy lub starszych.Umieść kości na szalce Petriego o średnicy 30 milimetrów zawierającej świeże, lodowate 4% PFA i PBS pod mikroskopem preparacyjnym i usuń strzemiączko z okienka owalnego. Nakłuj okrągłą błonę okienną kleszczami numer pięć i użyj igły o rozmiarze 27 przymocowanej do jednomililitrowej strzykawki zawierającej świeże 4% PFA, aby zrobić mały otwór w wierzchołku ślimaka. Delikatnie i powoli perfekować ślimak roztworem utrwalającym przez okrągłe i owalne okienka, aż roztwór wymyje się z małego otworu na wierzchołku.Następnie przenieś do dwóch perfuzjowanych ślimaków do pojedynczych 20-mililitrowych fiolek scyntylacyjnych zawierających 10 mililitrów 4% PFA na fiolkę i delikatnie mieszaj próbki przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przechowuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze. Następnego ranka umyj ślimaki trzema pięciominutowymi płukaniami świeżym PBS na jedno pranie. Po ostatnim przemyciu dodaj 20 mililitrów 4% EDTA do każdej fiolki i obracaj próbki przez 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając.Pod koniec inkubacji należy dotknąć kleszczami kostnej części przedsionkowej każdego ślimaka, aby ocenić elastyczność próbek. Jeśli kości są elastyczne, a nie twarde, ślimak został odwapniony. Zastąp EDTA dla każdej próbki świeżym PBS.W celu mikrodysekcji nabłonka ślimaka chwyć przedsionkową część kości skroniowej kleszczami i użyj skalpela, aby przeciąć skręt wierzchołkowy pod kątem 45 stopni. Przeciąć pionowo wzdłuż słabej linii między okrągłym oknem a owalnym okienkiem, aby oddzielić ślimak od części przedsionkowej i ustawić część ślimakową z podstawowym zwojem w kierunku dołu i środkowymi zwojami w kierunku góry szalki Petriego. Z tej pozycji odetnij kostną torebkę i boczną ścianę środkowego skrętu w kierunku końca, z którego usunięto przekrój wierzchołkowy i kontynuuj cięcie, aby całkowicie oddzielić środkową część od obszarów podstawy i haczyka.Umieszczając część podstawową i haczykową z błoną podstawną skierowaną w stronę dna naczynia, pionowo odetnij medialis z obszaru haczyka, aby usunąć medialis i odetnij obszary podstawowe i haczykowe, aby oddzielić część haczykową. Aby uniknąć zniekształcenia tkanki, odetnij medialis od obszaru haczyka przed oddzieleniem zwoju podstawnego i obszaru haka. Odetnij stosunkowo duże części torebki kostnej i tkanki ściany bocznej środkowego zwoju i przytrzymując boczną ścianę kleszczami, aby wyrównać torebkę kostną i ścianę boczną z dnem szalki Petriego, odetnij te tkanki od strony błony podstawnej.Następnie spłaszcz próbkę, aby zorientować czuciową powierzchnię komórek rzęsatych stroną do góry i odetnij resztę kostnej torebki i bocznej ściany. Następnie użyj kleszczy, aby usunąć membranę tektorialną, aby całkowicie oddzielić środkowy obszar i usunąć kostną torebkę, tkankę ściany bocznej i obszary tektorialne pozostałych zwojów, jak właśnie pokazano. Po wycięciu wszystkich zwojów ślimaka rozprowadź 0,5 mikrolitra kleju komórkowego i tkankowego na środku jednego okrągłego 10-milimetrowego szkiełka nakrywkowego i pozostaw klej do wyschnięcia na trzy do pięciu minut w temperaturze pokojowej.Umieścić wysuszone szkiełka nakrywkowe na szalce Petriego i przykleić wszystkie cztery części każdej próbki nabłonka czuciowego na jednym szkiełku nakrywkowym. Następnie użyj kleszczy, aby chwycić jedną krawędź każdego szkiełka nakrywkowego, aby przenieść próbki do indywidualnych dołków czterodołkowej płytki do hodowli komórek w celu znakowania immunologicznego. W celu znakowania immunologicznego preparatów synaps ślimakowych należy przemyć każdy nabłonek czuciowy trzy razy przez pięć minut w świeżym PBS na przemycie, a następnie potraktować każdą próbkę dwoma mililitrami 2% niejonowego środka powierzchniowo czynnego przez 30 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze.Pod koniec inkubacji odessać roztwór środka powierzchniowo czynnego z każdej studzienki i zablokować wszelkie niespecyficzne wiązania za pomocą 100 mikrolitrów roztworu blokującego na studzienkę przez jedną godzinę na rotatorze z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji blokującej przemyć próbki trzykrotnie PBS, jak wykazano pod wpływem delikatnego mieszania, a następnie oznaczyć każdy nabłonek 100 mikrolitrami pierwotnych przeciwciał będących przedmiotem zainteresowania przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, chronionych przed światłem. Następnego dnia przemyć próbki trzy razy świeżym PBS i delikatnie mieszać przy każdym myciu i oznaczyć próbki 100 mikrolitrami odpowiednich przeciwciał drugorzędowych przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem.Pod koniec inkubacji umyć próbki trzema pięciominutowymi płukaniami w świeżym PBS na przemycie, a następnie umieścić każde szkiełko nakrywkowe na indywidualnych szkiełkach mikroskopowych próbkami skierowanymi do góry. Następnie ostrożnie dodaj osiem mikrolitrów odpowiedniego podłoża montażowego do środka każdego szkiełka nakrywkowego i za pomocą kleszczy zamontuj kolejne 10 milimetrowe szkiełko nakrywkowe na każdej próbce. Następnie uszczelnij boki każdej kanapki z szkiełkiem nakrywkowym przezroczystym lakierem do paznokci, umieść próbki w tekturowym folderze na szkiełka i przechowuj szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Chociaż sekcja ślimaków dorosłych myszy w celu przygotowania powierzchni nie jest prosta, naukowcy nowi w tej technice powinni być w stanie nauczyć się tej metody po ćwiczeniach z 10 do 15 uszami. Znakowanie immunologiczne preparatów powierzchniowych nieleczonych 10 do 12-tygodniowych myszy CBAJ za pomocą CTBP2 i GluA2 pokazuje, że zarówno wstążki presynaptyczne, jak i zakończenia postsynaptyczne znajdują się odpowiednio poniżej wewnętrznych jąder komórek rzęsatych i są zestawione ze sobą, wskazując na funkcjonalne synapsy. Znakowanie immunologiczne miozyny 7A i barwienie przeciwstawne falloidyną i DAPI ujawnia obecność czuciowych komórek rzęsatych, w tym zewnętrznych komórek rzęsatych i wewnętrznych komórek rzęsatych oraz ich jąder.Znakowanie immunologiczne miozyny 7A i barwienie przeciwstawne falloidyną nie wykazuje różnic w immunoreaktywności lub jednorodności z użyciem lub bez użycia kleju komórkowego i tkankowego. Ponadto skaningowa mikroskopia elektronowa preparatów powierzchniowych od nieleczonych myszy C57 Black 6 w wieku od sześciu do ośmiu tygodni wykazuje dobrze zorganizowaną stereocilię w kształcie litery V zewnętrznych komórek rzęsatych w trzech rzędach próbki. Pamiętaj, aby delikatnie i powoli napełniać ślimak roztworem utrwalającym przez okrągłe i owalne okienka, aż roztwór wymyje się z małego otworu na wierzchołku.Przed oddzieleniem obszaru haka od zwoju podstawy, należy zwrócić uwagę, aby odciąć medialis od obszaru haka, aby ułatwić usunięcie medialis.

cochlear-surface-preparation-in-the-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Istnieją różne metody wprowadzania czynników ototoksycznych do ślimaków modeli zwierzęcych. Przedstawiono protokół chirurgiczny dostarczania środków ototoksycznych do wnęki okrągłego okna. Procedura jest niezawodna, tworzy ukierunkowane zmiany wewnątrzślimakowe i pozwala uniknąć mechanicznych uszkodzeń mikroarchitektury. Możliwe jest badanie samonaprawy/regeneracji ślimaka.

Mysie podejście oparte na okrągłym oknie do dostarczania czynników ototoksycznych: szybka i niezawodna technika indukowania zwyrodnienia komórek ślimakowych

Pierwotne rzęski wpływają na różne szlaki sygnałowe. Ślimak ssaków jest idealny do badania sygnalizacji biegunowości komórek płaskich (PCP). Dysfunkcja rzęsek wpływa na rozrost ślimaka, wzór komórkowy i orientację komórek rzęsatych, odczyty PCP. Naszym celem jest analiza sygnalizacji PCP w ślimaku myszy za pomocą analizy fenotypowej, immunohistochemii i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Ocena fenotypów polaryzacji komórek płaskich w ślimaku myszy z mutacją ciliopatii

Przedstawiamy metodę izolowania dorosłego organu Cortiego jako trzech nienaruszonych zwojów ślimaka (wierzchołek, środek i podstawa). Demonstrujemy również procedurę barwienia immunologicznego za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał. Razem techniki te pozwalają na badanie komórek rzęsatych, komórek podporowych i innych typów komórek znajdujących się w ślimaku.

Rozwarstwienie całej góry i immunofluorescencja ślimaka dorosłej myszy

Opisano tutaj i porównano dwa podejścia mikrochirurgiczne do miejscowego dostarczania leków do ucha wewnętrznego pod względem wpływu na parametry słuchu, cytoarchitekturę ślimaka i ekspresję markerów stanu zapalnego.

Badanie porównawcze metod dostarczania leków ukierunkowanych do ucha wewnętrznego myszy: pęcherzyk a wstrzyknięcie przezbębenkowe

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie przygotowania, hodowli, leczenia i barwienia immunologicznego eksplantatów ślimakowych u noworodków myszy. Technika ta może być wykorzystana jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu.

Technika eksplantatu ślimakowego u noworodków jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu

Zwierzęce modele implantów ślimakowych mogą poszerzyć wiedzę na temat technologicznych podstaw leczenia trwałego odbiorczego ubytku słuchu za pomocą stymulacji elektrycznej. W badaniu przedstawiono protokół chirurgiczny ogłuszenia i implantacji ślimakowej zestawu elektrod u myszy, a także ocenę funkcjonalną z odpowiedzią słuchową pnia mózgu.

Operacja wszczepienia implantu ślimakowego i elektrycznie wywołane nagrania słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u myszy C57BL/6

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalny protokół oceny cech morfologicznych i statusu funkcjonalnego synaps wstęgowych u normalnych myszy. Prezentowany model nadaje się również do modeli z ograniczeniami synaptopatii ślimakowej wywołanych hałasem i związanych z wiekiem. Omówiono również korelacyjne wyniki poprzednich badań na myszach.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji wychwytu 3 kDa Texas Red-labeled dextranu w słuchowych komórkach rzęsatych z funkcjonalnymi kanałami mechanotransdukcji. Ponadto dektrans o stężeniu 3–10 kDa może być stosowany do badania endocytozy we włosach i komórkach podporowych narządu Cortiego.

Znakowanie i wychwyt dekstranu w żywych i funkcjonalnych mysich komórkach rzęsatych ślimaka

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od myszy. Początkowo narząd Cortiego został wypreparowany z noworodków (w wieku 3-5 dni) mysich ślimaków pod mikroskopem. Następnie komórki trawiono enzymatycznie do zawiesiny jednokomórkowej i identyfikowano za pomocą immunofluorescencji po kilku dniach w hodowli.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od nowonarodzonych myszy

Ten protokół, przeznaczony dla początkujących użytkowników tkanek ucha wewnętrznego myszy, szczegółowo opisuje etapy przetwarzania uszu wewnętrznego myszy na różnych etapach rozwoju w celu barwienia immunologicznego sekcji.

Kriosekcja i barwienie immunologiczne tkanki ucha wewnętrznego myszy: od stadium embrionalnego do dorosłego

Przedstawiamy tutaj protokół izolacji, oczyszczania i hodowli pierwotnych komórek marginalnych z myszy stria vascularis oraz do tworzenia in vitro modeli stresu oksydacyjnego i starzenia komórkowego w celu badania zaburzeń ściany bocznej ślimaka.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek brzegowych prążkowania naczyniowego u noworodkowych myszy

Naucz się modyfikowanej techniki przygotowania powierzchni ślimaka u dorosłej myszy z wykorzystaniem odkwapniania EDTA i kleju tkankowego. Ta metoda umożliwia lepszą wizualizację narządu Cortiego poprzez immunohistochemię.

Przygotowanie powierzchni ślimaka u dorosłej myszy

Przeglądaj więcej filmów