Przygotowanie powierzchni ślimaka u dorosłej myszy

Preparaty powierzchni ślimaka umożliwiają wizualizację całej soczewki narządu Cortiego za pomocą immunohistochemii i obrazowania konfokalnego. Jest szeroko stosowany do badania określonych patologii ślimaka będących przedmiotem zainteresowania. Zmodyfikujemy metodę mikrodysekcji ślimaka.

Główną zaletą tej techniki jest przyleganie kawałka nabłonka ślimaka do 10-milimetrowych okrągłych szkiełek nakrywkowych w celu przeprowadzenia procedury znakowania immunologicznego, przy jednoczesnym uniknięciu utraty tkanki podczas wielu etapów mycia. Oprócz patologii ślimaka, przygotowanie powierzchni ślimaka może być również wykorzystane do oceny ekspresji i regeneracji komórek rzęsatych. Do tej techniki wymagane są podstawowe umiejętności obsługi mikroskopu, a wizualna demonstracja metody może pomóc w zapewnieniu, że każdy krok jest wykonywany prawidłowo.

Procedurę zademonstruje Qiaojun Fang, doktorant z mojego laboratorium. W celu ekstrakcji kości skroniowej, natychmiast po sekcji zwłok pociągnij skórę do przodu, aby odsłonić kość czaszki i użyj nożyczek, aby przeciąć kość od tylnej części do przodu wzdłuż linii środkowej czaszki. Użyj kleszczy, aby usunąć tkankę mózgową przed użyciem kciuka i palca wskazującego do ręcznego usunięcia kości skroniowych myszy w wieku trzech miesięcy lub starszych.

Umieść kości na szalce Petriego o średnicy 30 milimetrów zawierającej świeże, lodowate 4% PFA i PBS pod mikroskopem preparacyjnym i usuń strzemiączko z okienka owalnego. Nakłuj okrągłą błonę okienną kleszczami numer pięć i użyj igły o rozmiarze 27 przymocowanej do jednomililitrowej strzykawki zawierającej świeże 4% PFA, aby zrobić mały otwór w wierzchołku ślimaka. Delikatnie i powoli perfekować ślimak roztworem utrwalającym przez okrągłe i owalne okienka, aż roztwór wymyje się z małego otworu na wierzchołku.

Następnie przenieś do dwóch perfuzjowanych ślimaków do pojedynczych 20-mililitrowych fiolek scyntylacyjnych zawierających 10 mililitrów 4% PFA na fiolkę i delikatnie mieszaj próbki przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przechowuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze. Następnego ranka umyj ślimaki trzema pięciominutowymi płukaniami świeżym PBS na jedno pranie. Po ostatnim przemyciu dodaj 20 mililitrów 4% EDTA do każdej fiolki i obracaj próbki przez 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając.

Pod koniec inkubacji należy dotknąć kleszczami kostnej części przedsionkowej każdego ślimaka, aby ocenić elastyczność próbek. Jeśli kości są elastyczne, a nie twarde, ślimak został odwapniony. Zastąp EDTA dla każdej próbki świeżym PBS.

W celu mikrodysekcji nabłonka ślimaka chwyć przedsionkową część kości skroniowej kleszczami i użyj skalpela, aby przeciąć skręt wierzchołkowy pod kątem 45 stopni. Przeciąć pionowo wzdłuż słabej linii między okrągłym oknem a owalnym okienkiem, aby oddzielić ślimak od części przedsionkowej i ustawić część ślimakową z podstawowym zwojem w kierunku dołu i środkowymi zwojami w kierunku góry szalki Petriego. Z tej pozycji odetnij kostną torebkę i boczną ścianę środkowego skrętu w kierunku końca, z którego usunięto przekrój wierzchołkowy i kontynuuj cięcie, aby całkowicie oddzielić środkową część od obszarów podstawy i haczyka.

Umieszczając część podstawową i haczykową z błoną podstawną skierowaną w stronę dna naczynia, pionowo odetnij medialis z obszaru haczyka, aby usunąć medialis i odetnij obszary podstawowe i haczykowe, aby oddzielić część haczykową. Aby uniknąć zniekształcenia tkanki, odetnij medialis od obszaru haczyka przed oddzieleniem zwoju podstawnego i obszaru haka. Odetnij stosunkowo duże części torebki kostnej i tkanki ściany bocznej środkowego zwoju i przytrzymując boczną ścianę kleszczami, aby wyrównać torebkę kostną i ścianę boczną z dnem szalki Petriego, odetnij te tkanki od strony błony podstawnej.

Następnie spłaszcz próbkę, aby zorientować czuciową powierzchnię komórek rzęsatych stroną do góry i odetnij resztę kostnej torebki i bocznej ściany. Następnie użyj kleszczy, aby usunąć membranę tektorialną, aby całkowicie oddzielić środkowy obszar i usunąć kostną torebkę, tkankę ściany bocznej i obszary tektorialne pozostałych zwojów, jak właśnie pokazano. Po wycięciu wszystkich zwojów ślimaka rozprowadź 0,5 mikrolitra kleju komórkowego i tkankowego na środku jednego okrągłego 10-milimetrowego szkiełka nakrywkowego i pozostaw klej do wyschnięcia na trzy do pięciu minut w temperaturze pokojowej.

Umieścić wysuszone szkiełka nakrywkowe na szalce Petriego i przykleić wszystkie cztery części każdej próbki nabłonka czuciowego na jednym szkiełku nakrywkowym. Następnie użyj kleszczy, aby chwycić jedną krawędź każdego szkiełka nakrywkowego, aby przenieść próbki do indywidualnych dołków czterodołkowej płytki do hodowli komórek w celu znakowania immunologicznego. W celu znakowania immunologicznego preparatów synaps ślimakowych należy przemyć każdy nabłonek czuciowy trzy razy przez pięć minut w świeżym PBS na przemycie, a następnie potraktować każdą próbkę dwoma mililitrami 2% niejonowego środka powierzchniowo czynnego przez 30 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze.

Pod koniec inkubacji odessać roztwór środka powierzchniowo czynnego z każdej studzienki i zablokować wszelkie niespecyficzne wiązania za pomocą 100 mikrolitrów roztworu blokującego na studzienkę przez jedną godzinę na rotatorze z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji blokującej przemyć próbki trzykrotnie PBS, jak wykazano pod wpływem delikatnego mieszania, a następnie oznaczyć każdy nabłonek 100 mikrolitrami pierwotnych przeciwciał będących przedmiotem zainteresowania przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, chronionych przed światłem. Następnego dnia przemyć próbki trzy razy świeżym PBS i delikatnie mieszać przy każdym myciu i oznaczyć próbki 100 mikrolitrami odpowiednich przeciwciał drugorzędowych przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem.

Pod koniec inkubacji umyć próbki trzema pięciominutowymi płukaniami w świeżym PBS na przemycie, a następnie umieścić każde szkiełko nakrywkowe na indywidualnych szkiełkach mikroskopowych próbkami skierowanymi do góry. Następnie ostrożnie dodaj osiem mikrolitrów odpowiedniego podłoża montażowego do środka każdego szkiełka nakrywkowego i za pomocą kleszczy zamontuj kolejne 10 milimetrowe szkiełko nakrywkowe na każdej próbce. Następnie uszczelnij boki każdej kanapki z szkiełkiem nakrywkowym przezroczystym lakierem do paznokci, umieść próbki w tekturowym folderze na szkiełka i przechowuj szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Chociaż sekcja ślimaków dorosłych myszy w celu przygotowania powierzchni nie jest prosta, naukowcy nowi w tej technice powinni być w stanie nauczyć się tej metody po ćwiczeniach z 10 do 15 uszami. Znakowanie immunologiczne preparatów powierzchniowych nieleczonych 10 do 12-tygodniowych myszy CBAJ za pomocą CTBP2 i GluA2 pokazuje, że zarówno wstążki presynaptyczne, jak i zakończenia postsynaptyczne znajdują się odpowiednio poniżej wewnętrznych jąder komórek rzęsatych i są zestawione ze sobą, wskazując na funkcjonalne synapsy. Znakowanie immunologiczne miozyny 7A i barwienie przeciwstawne falloidyną i DAPI ujawnia obecność czuciowych komórek rzęsatych, w tym zewnętrznych komórek rzęsatych i wewnętrznych komórek rzęsatych oraz ich jąder.

Znakowanie immunologiczne miozyny 7A i barwienie przeciwstawne falloidyną nie wykazuje różnic w immunoreaktywności lub jednorodności z użyciem lub bez użycia kleju komórkowego i tkankowego. Ponadto skaningowa mikroskopia elektronowa preparatów powierzchniowych od nieleczonych myszy C57 Black 6 w wieku od sześciu do ośmiu tygodni wykazuje dobrze zorganizowaną stereocilię w kształcie litery V zewnętrznych komórek rzęsatych w trzech rzędach próbki. Pamiętaj, aby delikatnie i powoli napełniać ślimak roztworem utrwalającym przez okrągłe i owalne okienka, aż roztwór wymyje się z małego otworu na wierzchołku.

Przed oddzieleniem obszaru haka od zwoju podstawy, należy zwrócić uwagę, aby odciąć medialis od obszaru haka, aby ułatwić usunięcie medialis.