Ustalenie i charakterystyka sferoid guza neuroendokrynnego jelita cienkiego

Dobrze zróżnicowane komórki SBNET rosną wolno i są trudne do rozmnażania. Nieliczne znane linie komórkowe nie są łatwo dostępne dla badaczy. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy ten protokół hodowli 3D.

Przewagą tej techniki nad tradycyjną metodą tworzenia linii komórkowej SBNET jest to, że można uzyskać kultury 3D i przeprowadzić testy narkotykowe w ciągu trzech tygodni. Metodę tę można zastosować do innych nowotworów neuroendokrynnych, takich jak guzy neuroendokrynne trzustki. Po uzyskaniu wyciętej próbki SBNET pacjenta, pokrój ją w pięciomilimetrową kostkę i przechowuj w 25 mililitrach pożywki DMEM F12 w stożkowej probówce do transportu.

Inkubować guzy w pożywce przygotowanej zgodnie z instrukcjami manuskryptu przez 15 minut. Następnie przenieś je do nowego naczynia i zmiel na mniej niż milimetrowe kawałki za pomocą sterylnych zakrzywionych nożyczek. Przenieść zmielone tkanki do nowej 50-mililitrowej probówki zawierającej 25 mililitrów pożywki myjącej, a następnie odwirować próbkę z prędkością 500 razy g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki w 10 mililitrach pożywki myjącej z kolagenazą i DNazą. Pozwól zmielonym guzom strawić się w temperaturze 37 stopni Celsjusza, powoli potrząsając przez 90 minut. Ważne jest, aby nie trawić nadmiernie próbek guza

Zbyt dużo enzymu lub dłuższy czas inkubacji zabije komórki SBNET. Po zakończeniu trawienia odwirować probówkę o masie 500 razy g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 15 mililitrach pożywki myjącej.

Umieść sitko o pojemności 70 mikrometrów na nowej probówce o pojemności 50 mililitrów i przenieś 10 mililitrów buforu do płukania przez sitko. Zakręć buforem płuczącym wewnątrz probówki, aby zapobiec przywieraniu komórek do boków. Następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko.

Odwirować komórki w temperaturze 500 razy g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach środka myjącego. Umieść probówkę na lodzie i użyj pięciu mikrolitrów komórek do zliczenia komórek za pomocą hemocytometru.

Obliczyć liczbę komórek, a następnie powtórzyć wirowanie w celu usunięcia supernatantu i ponownego zawieszenia komórek w ciekłym ECM w stężeniu miliona komórek na mililitr. Następnie przenieś od pięciu do 20 mikrolitrów sferoid SBNET w ECM na płytkę 96-dołkową i umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby płynny ECM mógł się zestalić. Dodać 200 mikrolitrów pożywki hodowlanej SBNET do każdej studzienki zawierającej sferoidy lub wyhodować organoidy w pożywce z komórek macierzystych, jak opisano wcześniej.

Za pomocą pipety P1000 przenieś organoidy do probówki o pojemności 1,5 mililitra i odwiruj probówkę z ciśnieniem 1 500 razy g przez jedną minutę w celu usunięcia supernatantu. Umyj kulturę jednym mililitrem PBS i ponownie odwiruj, aby usunąć supernatant. Następnie utrwal organoidy, dodając 500 mikrolitrów paraformaldehydu i inkubując je przez 15 minut.

Po inkubacji przemyj kulturę dwukrotnie jednym mililitrem PBS. Dodaj 500 mikrolitrów PBS z 3% BSA i 0,1% Triton X-100, aby przepuszczalność kultury. Inkubować probówkę przez pięć minut, a następnie umyć organoidy trzykrotnie jednym mililitrem PBS i 3% BSA.

Następnie inkubuj kulturę z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez godzinę, a następnie powtórz płukanie PBS i BSA. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi i powtórzyć płukanie, upewniając się, że wszystkie supernatanty zostały odessane i odrzucone. Aby zobrazować sferoidy, dodaj pięć mikrolitrów podłoża montażowego zawierającego DAPI i użyj pipety P20, aby przenieść pięć mikrolitrów sferoid na szklane szkiełko.

Uszczelnij szkiełko za pomocą szkiełka nakrywkowego i zobrazuj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego za pomocą obiektywów 10, 20 i 40X. Mechanicznie rozbij ECM za pomocą pipety P1000 i przenieś ją do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Odwirować probówkę z ciśnieniem 1 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie usuń cały supernatant i umieść probówkę na lodzie. Dodać dwa do czterech razy więcej objętości nowego ECM do osadu i wymieszać zawartość probówki, pipetując w górę i w dół 10 razy, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Przenieść od pięciu do 20 mikrolitrów mieszaniny ECM i SBNET na nową płytkę 96-dołkową i pozwolić ECM zestalić się.

Następnie przykryj zestalony ECM nową pożywką SBNET i umieść płytkę w inkubatorze. W przypadku wysyłki sferoid SBNET do innego laboratorium, należy przenieść sferoidy z nowym ECM do kolby T25 i pozwolić ECM na zestalenie się. Napełnij kolbę podłożem sferoidalnym SBNET, mocno zakręć nakrętkę i przygotuj paczkę wysyłkową.

Po otrzymaniu kultury sferoidalnej usuń pożywkę hodowlaną i powtórz poprzednie kroki, aby umieścić sferoidy z powrotem w kulturze. Tempo wzrostu sferoidów SBNET monitorowano za pomocą obrazowania mikroskopowego. Sferoidy SBNET potrzebują około 14 dni, aby podwoić swoją wielkość, gdy pożywka hodowlana jest zmieniana raz w tygodniu.

Po 14 dniach w hodowli sferoidy SBNET nie powiększają się. Sferoidy wybarwiono przeciwciałami specyficznymi przeciwko synaptofizynie, chromograninie A i SSTR2 i zobrazowano za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Dane wykazały, że markery te są zlokalizowane w cytoplazmie i na błonie komórek SBNET.

Aby zapewnić swoistość przeciwciał, te same procedury barwienia przeprowadzono na linii organoidowej z guza trzustki, który nie wykazuje ekspresji synaptofizyny, chromograniny A i SSTR2 i nie wykryto żadnego zielonego sygnału. Główną zaletą obrazowania immunofluorescencyjnego jest to, że można je wykonać w ciągu czterech godzin i dostarczyć podobnych informacji o barwieniu jak immunohistochemia. Hodowla SBNET jako sferoid jest cenną techniką identyfikacji leków, które mogą hamować wzrost SBNET.

Sferoidy leczono rapamycyną i inhibitorem mTOR. Po pięciu dniach sferoida potraktowana rapamycyną utworzyła strukturę podobną do winogron i stała się apoptotyczna lub nekrotyczna. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby wstępnie zwilżyć sitko do komórek i rurkę zbiorczą środkiem myjącym.

Zapobiegnie to przywieraniu komórek SBNET do sitka i plastikowej rurki. Dzięki temu protokołowi naukowcy i klinicyści mogą tworzyć hodowle sferoidalne SBNET z wyciętych guzów, udostępniać je innym laboratoriom i wykorzystywać do testowania leków zatwierdzonych przez FDA.