Name: Ustalenie i charakterystyka sferoid guza neuroendokrynnego jelita cienkiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj protokół 3D hodowli sferoidów guza neuroendokrynnego jelita cienkiego z próbek pacjentów. Ta metoda umożliwia testowanie leków w ciągu trzech tygodni, pokonując ograniczenia tradycyjnych linii komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH przyznaje P50 CA174521 (dla J.R. Howe i A.M. Bellizzi). P.H. Ear jest laureatem nagrody P50 CA174521 Career Enhancement Program.

Wszystkie eksperymenty z użyciem próbek ludzkich guzów neuroendokrynnych zostały zatwierdzone przez komitet IRB Szpitala i Klinik Uniwersytetu Iowa (numer protokołu 199911057). Wykaz wszystkich materiałów i wyposażenia znajduje się w Tabeli Materiałów. Wykaz pożywek wzrostowych i kluczowych rozwiązań znajduje się w tabeli 1.
1. Zbieranie guzów neuroendokrynnych jelita cienkiego (SBNET) i dysocjacja komórek
<ol>
	<li>Uzyskaj wycięte próbki SBNET pacjenta po potwierdzeniu tkanek nowotworowych z rdzenia patologii chirurgicznej.</li>
	<li>Pokrój SBNETy w kostkę o średnicy 5 mm i przechowuj w 25 ml pożywki DMEM/F12 w stożkowej probówce do transportu do laboratorium.</li>
	<li>Przenieś guzy do DMEM zawierającego 1% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep), 1% glutaminy (Wash Medium) i inkubuj w tym pożywce do mycia przez 15 minut.</li>
	<li>Przenieś guzy do nowego naczynia i zmiel guzy na mniej niż 1 mm kawałki za pomocą sterylnych zakrzywionych nożyczek.</li>
	<li>Przenieść zmielone tkanki do nowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml roztworu do mycia.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki w 10 ml pożywki płuczącej zawierającej kolagenazę (100 U/ml) i DNazę (0,1 mg/ml).</li>
	<li>Pozostawić trawienie zmielonych guzów w inkubatorze o temperaturze 37 °C z powolnym wstrząsaniem (50 obr./min) przez 1,5 godziny.</li>
</ol>
2. Hodowla SBNETów jako sferoid nowotworowych w ECM
<ol>
	<li>Po zakończeniu trawienia (etap 1.8) odwirować przy 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 15 ml pożywki płuczącej.</li>
	<li>Umieść sitko o pojemności 70 μm na nowej probówce o pojemności 50 ml i przenieś 10 ml pożywki myjącej na sitko do komórek. Zakręć medium myjącym, aby przykryć bok plastikowej rurki, aby zapobiec przywieraniu komórek NET do boku plastikowej rurki.</li>
	<li>Przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko do komórek.</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 200 μl pożywki płuczącej (całkowita objętość wynosi ~ 250 μl) i umieścić na lodzie.</li>
	<li>Przenieść 5 μl komórek do 500 μl pożywki płuczącej (współczynnik rozcieńczenia 1/100). Użyj rozcieńczonych komórek do zliczania komórek za pomocą hemocytometru, aby uzyskać liczbę komórek na mililitr. Pomnóż przez 100, aby skorygować współczynnik rozcieńczenia.</li>
	<li>Pomnóż liczbę komórek na ml otrzymaną w kroku 2.5 przez całkowitą objętość komórek w zawiesinie otrzymaną w kroku 2.4 (~ 250 μL).</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w ciekłym ECM (1 x 106 komórek/ml) i przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Przenieść 5-20 μl sferoid SBNET w ECM na płytkę 96-dołkową i pozwolić ciekłemu ECM zestalić się, umieszczając płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 5 minut.</li>
	<li>Dodać 200 μl pożywki hodowlanej SBNET (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% glutaminy + 10 mM nikotynamidu + 10 μg/ml insuliny) do każdego dołka 96-dołkowej płytki zawierającej sferoidy SBNET w ECM.</li>
	<li>Alternatywnie, hoduj organoidy SBNET w pożywkach z komórek macierzystych podobne do tego, co zostało wcześniej opisane do hodowli organoidów ludzkiej wątroby lub trzustki9 i wymienione w Tabeli Materiałów.</li>
	<li>Zmieniaj nośniki co 5-7 dni.</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja wielkości sferoidy SBNET za pomocą ImageJ
<ol>
	<li>Zrób 5-10 zdjęć sferoid SBNET w dniu 1, 4, 7, 14, 23 i 97 kultury, używając obiektywu 10x.</li>
	<li>Otwórz zapisane obrazy w ImageJ. Przejdź do zakładki Analizuj, wybierz opcję Ustaw pomiary i zaznacz opcję Obszar.</li>
	<li>Użyj narzędzia do zaznaczania owalu z paska narzędzi, aby wygenerować elipsoidę lub okrąg wokół dobrze wyostrzonej sferoidy.</li>
	<li>Przejdź do zakładki Analiza i wybierz opcję Zmierz. Powtórz kroki 3.4 i 3.5, aby uzyskać pomiar obszaru z 25-50 sferoid SBNET. Wartości są podane w pikselach kwadracie.</li>
	<li>Przekonwertuj obszar piksela na μm2, dzieląc rozmiar każdego piksela przez długość każdego piksela Współczynnik konwersji na μm obrazów mikroskopowych. 
	UWAGA: Komórki SBNET rosną głównie jako sferoidy, a czasami jako elipsoidy.</li>
</ol>
4. Charakterystyka sferoid SBNETS za pomocą immunofluorescencji
<ol>
	<li>Przenieś organoidy wyhodowane w ECM do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety P1000.</li>
	<li>Odwirować przy 1 500 x g przez 1 minutę i usunąć supernatant.</li>
	<li>Umyć kulturę organoidów, dodając 1 ml PBS, wymieszać, odwirować przy 1 500 x g przez 1 minutę i usunąć supernatant.</li>
	<li>Utrwalić organoidy, dodając 500 μl 4% paraformaldehydu i inkubować przez 15 minut.</li>
	<li>Umyj kulturę dwukrotnie 1 ml PBS.</li>
	<li>Przepuszczalność kultury należy dodać 500 μl PBS + 3% BSA + 0,1% Triton X 100 przez 5 minut.</li>
	<li>Następnie umyj trzykrotnie 1 ml PBS + 3% BSA.</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko synaptofizynie (SYP)10 w rozcieńczeniu 1/600 lub chromograniny A (CgA)11 i receptorowi somatostatyny 2 (SSTR2)12 przy rozcieńczeniu 1/400 w buforze przeciwciał (2,5% albuminy surowicy bydlęcej, 0,1% azydku sodu, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM chlorku sodu). 
	UWAGA: Użyj 300 μl lub więcej roztworu przeciwciał na probówkę.</li>
	<li>Umyj trzy razy 1 ml PBS + 3% BSA.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z FITC w rozcieńczeniu 1:500 w buforze przeciwciał przez 1 godzinę. Użyć 300 μl lub więcej roztworu przeciwciała na probówkę.</li>
	<li>Umyj 3 razy 1 ml PBS + 3% BSA. Upewnij się, że odessałeś i odrzuciłeś cały supernatant.</li>
	<li>Dodać 5 μl podłoża montażowego zawierającego barwnik jądrowy DAPI.</li>
	<li>Za pomocą pipety P20 przenieś 5 μl sferoidów SBNET z kroku 4.12 na szkiełko podstawowe i uszczelnij szkiełkiem przykrywkowym.</li>
	<li>Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu obiektywów 10x, 20x lub 40x.</li>
</ol>
5. Charakterystyka sferoid SBNET metodą immunohistochemiczną (IHC)
<ol>
	<li>Przenieść sferoidy SBNET z płytki hodowlanej do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety P1000.</li>
	<li>Odwirować przy 1 500 x g przez 1 minutę i usunąć supernatant.</li>
	<li>Utrwalić sferoidy SBNET, dodając 500 μl 10% formaliny do probówki z kroku 5.2 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2-5 dni przed zatopieniem parafiny i wyciąć skrawki sferoidalne o grubości 4 μm.</li>
	<li>Deparafinowanie, ponowne uwodnienie i wykorzystanie indukowanego ciepłem pobierania epitopów w roztworze do pobierania antygenu o pH 9 poprzez ogrzewanie do 97 °C przez 20 minut przy użyciu automatycznej stacji przetwarzania szkiełek 3 w 1 w celu przygotowania szkiełek do inkubacji przeciwciał.</li>
	<li>Blokuj szkiełka i inkubuj z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko SYP10 w rozcieńczeniu 1/100 przez 15 min, CgA11 w rozcieńczeniu 1/800 przez 15 min i SSTR212 w rozcieńczeniu 1/5 000 przez 30 min.</li>
	<li>Inkubować z wtórnym systemem wykrywania przeciwciał przez 15 minut w przypadku barwienia anty-SYP i CgA oraz 30 minut w przypadku barwienia anty-SSTR2. Rób zdjęcia za pomocą obiektywu 400x.</li>
</ol>
6. Leczenie organoidów SBNET rapamycyną
<ol>
	<li>Rozpuścić rapamycynę w DMSO, aby otrzymać roztwór podstawowy o stężeniu 10 mM.</li>
	<li>Przygotować pożywkę SBNET z DMSO (np. 1 ml pożywki SBNET + 1 μl DMSO) i pożywkę SBNET z 10 μM rapamycyny (np. 1 ml pożywki SBNET + 1 μl 10 mM roztworu podstawowego rapamycyny).</li>
	<li>Przenieść 200 μl pożywki z pożywką SBNET z DMSO lub 10 μM rapamycyną do kultur sferoidalnych SBNET.</li>
	<li>Inkubować sferoidy SBNET przez 5 dni w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 1 μM homodimeru etydyny i inkubować przez 30 minut. Usunąć pożywkę zawierającą homodimer etydyny, przemyć 200 μl PBS i przenieść 200 μl PBS do każdej studzienki.</li>
	<li>Wykonuj obrazy mikroskopowe sferoid SBNET z leczeniem farmakologicznym i bez niego za pomocą czerwonej kostki filtra z obiektywami 10x, 20x lub 40x mikroskopu fluorescencyjnego. 
	UWAGA: Martwe komórki wybarwione homodimerem etydyny pojawiają się na czerwono przy użyciu czerwonej kostki filtracyjnej G dostępnego na rynku mikroskopu (tabela materiałów). Alternatywnie sygnał można przechwycić za pomocą spektrofotometru przy wzbudzeniu 535 nm i emisji 624 nm.</li>
</ol>
7. Dzielenie sferoid SBNET
UWAGA: To jest zrobione w celu rozszerzenia i udostępnienia innym badaczom.
<ol>
	<li>Za pomocą pipety P1000 mechanicznie rozbić moduł ECM i zassać moduł ECM ze sferoidami SBNET do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odwirować przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C, usunąć cały supernatant i umieścić probówkę na lodzie.</li>
	<li>Dodaj 2-4 razy objętość nowego ECM do granulki. Wymieszaj nowy moduł ECM ze starymi sferoidami ECM i SBNET, pipetując 10 razy w górę i w dół. Unikanie wprowadzania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Przenieść 5-20 μl mieszaniny sferoid ECM i SBNET na nową płytkę i pozwolić ECM na zestalenie się.</li>
	<li>Przykryj nową pożywką SBNET i przenieś do inkubatora. Wskaźnik odzysku wynosi około 95 do 100%.</li>
	<li>W przypadku wysyłki sferoid SBNET do innego laboratorium, należy przenieść sferoidy SBNET z nowym ECM do kolby T25 i pozwolić ECM na zestalenie się.</li>
	<li>Napełnij kolbę T25 podłożem sferoidalnym SBNET, mocno dokręć nakrętkę i przygotuj paczkę wysyłkową.</li>
	<li>Po otrzymaniu hodowli sferoidalnej SBNET usuń pożywkę hodowlaną i wykonaj kroki od 7.1 do 7.5, aby umieścić sferoidy SBNET z powrotem w hodowli.</li>
</ol>
8. Krioprzechowywanie i odzyskiwanie sferoid SBNET
<ol>
	<li>Przenieś sferoidy SBNET z 5-10 małych studzienek do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować przy 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant, ponownie zawiesić w pożywce zamrażającej (90% FBS + 10% DMSO), przechowywać w pojemniku do zamrażania komórek i umieścić w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Przenieś do ciekłego azotu w celu dłuższego przechowywania.</li>
	<li>Aby odzyskać sferoidy SBNET, umieść zamrożoną fiolkę na lodzie i poczekaj, aż zawartość całkowicie się rozmrozi. Odwróć rurkę i umieść ją ponownie na lodzie, aby przyspieszyć proces rozmrażania.</li>
	<li>Po rozmrożeniu próbki umieścić ją w wstępnie schłodzonej wirówce i wirować z prędkością 1 000 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić sferoidy w ECM. Trzymaj probówkę na lodzie, przenieś 20 μl na nową płytkę i poczekaj, aż ECM stwardnieje.</li>
	<li>Przenieść 200 μl pożywki SBNET z 10 μM inhibitora ROCK (Y-27632)13 i przenieść do inkubatora.</li>
	<li>Pozwól sferoidom SBNET zregenerować się i rosnąć przez 1 tydzień. Usunąć starą pożywkę hodowlaną, uzupełnić 200 μl pożywki SBNET i wrócić do inkubatora.</li>
	<li>Pozwól sferoidom SBNET na dalszy wzrost. 
	UWAGA: Potrzeba co najmniej 1 tygodnia, aby szybko rosnące sferoidy zaczęły się regenerować po krioprezerwacji13. Sferoidy SBNET potrzebują co najmniej 2-4 tygodni, aby zacząć rosnąć. Wiele komórek SBNET umrze w ciągu pierwszych 2 tygodni, a wskaźnik przeżycia wynosi mniej niż 10%. Ponieważ jest to bardzo czasochłonny i mało wydajny proces, lepiej jest podzielić się z innymi badaczami sferoidami SBNET w kolbach hodowlanych (jak opisano w kroku 7). Kriomagazynowanie i odzyskiwanie powinno być używane tylko jako plan awaryjny w przypadku wystąpienia skażenia bakteryjnego.</li>
</ol>

<ol><li>Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Diagnostics+and+Therapeutics+in+Pancreatic+Neuroendocrine+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors.</a> Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).</li>
<li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+continuous+cell+line+from+a+human+carcinoid+of+the+small+intestine+%28KRJ-I%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I).</a> International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).</li>
<li>Kolby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transplantable+human+carcinoid+as+model+for+somatostatin+receptor-mediated+and+amine+transporter-mediated+radionuclide+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake.</a> American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).</li>
<li>Van Buren, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+characterization+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line.</a> Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).</li>
<li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+three+novel+cell+lines+-+P-STS%2C+L-STS%2C+H-STS+-+derived+from+a+human+metastatic+midgut+carcinoid%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid.</a> Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).</li>
<li>Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Varying+opinions+on+the+authenticity+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line--letter%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter.</a> Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).</li>
<li>Hofving, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroendocrine+phenotype%2C+genomic+profile+and+therapeutic+sensitivity+of+GEPNET+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines.</a> Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).</li>
<li>Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+of+rapamycin+and+octreotide+as+single+agents+or+in+combination+in+neuroendocrine+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors.</a> Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).</li>
<li>Saito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Patient-Derived+Organoids+and+Drug+Screening+for+Biliary+Tract+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma.</a> Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).</li>
<li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bone+marrow+metastases+of+neuroblastoma+with+immunohistochemical+staining+of+CD56%2C+chromogranin+A%2C+and+synaptophysin%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemisty+and+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin.</a> Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).</li>
<li>Clifton-Bligh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+diagnosis+of+tumor-induced+osteomalacia+with+Gallium-68+DOTATATE+PET%2FCT%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).</li>
<li>Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation%2C+Expansion%2C+and+Cryopreservation+of+Human+Primary+Tissue-Derived+Normal+and+Diseased+Organoids+in+Embedded+Three-Dimensional+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture.</a> Current Protocols in Cell Biology. 82, 66(2019).</li>
<li>Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethidium+dimer%3A+a+new+reagent+for+the+fluorimetric+determination+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).</li>
<li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172, 373-386 (2018).</li>
<li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communication. 9, 2404(2018).</li>
<li>Singh, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSTR2-based+reporters+for+assessing+gene+transfer+into+non-small+cell+lung+cancer%3A+evaluation+using+an+intrathoracic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model.</a> Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Hodowle 3D nowotworów stały się cennym zasobem do przedklinicznych testów leków15. Niedawno utworzono różne biobanki organoidów nowotworowych z nowotworów raka piersi i raka prostaty16,17. W tym badaniu przedstawiamy szczegółowy protokół hodowli SBNET jako sferoidów oraz prostą i szybką metodę walidacji kultur sferoidalnych dla markerów NET za pomocą immunofluorescencji i badania wrażliwości leku. Z naszego doświadczenia wynika, że sferoid...

Guzy neuroendokrynne jelita cienkiego (SBNET) wywodzą się z komórek enterochromafinowych jelita cienkiego. Chociaż SBNET-y są ogólnie znane z tego, że rosną powoli, często dają przerzuty do wątroby1. Chociaż w wielu przypadkach można rozważyć chirurgiczne usunięcie lub ablację guza, nawrót jest prawie powszechny, dlatego terapia medyczna odgrywa ważną rolę w leczeniu. Włożono ogromne wysiłki w wygenerowanie nowych linii komórkowych SBNET do testowania leków. Sukcesy były jednak bardzo niewielkie. Zgłoszono tylko 6 linii komórkowych SBNET (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS)2,3,4,5; i niestety jedna linia komórkowa nie wykazuje już ekspresji NET markers6, a trzy inne linie komórkowe SBNET (KRJ-I, L-STS, H-STS) zostały określone jako pochodzące z transformowanych limfoblastów zamiast NETs7. Aby przyspieszyć identyfikację leków ukierunkowanych na SBNET, potrzebne są alternatywne metody testowania narkotyków in vitro.
Tutaj korzystamy z dostępności wyciętych SBNETów i stworzyliśmy sposób na hodowlę tych SBNET-ów pochodzących od pacjentów jako sferoid rosnących w ECM. Ogólnym celem tego manuskryptu jest opisanie metody hodowli SBNET jako hodowli trójwymiarowej (3D) oraz nakreślenie procedur charakteryzujących te sferoidy w celu zachowania markerów SBNET przez barwienie immunofluorescencyjne i immunohistochemię.
Ponadto pokazujemy, jak te sferoidy SBNET mogą być używane do testowania działania rapamycyny, leku przeciwnowotworowego dla NETs8. Uzasadnieniem tego protokołu jest opracowanie nowej metody hodowli komórek SBNET in vitro i wykorzystania ich do testowania leków. Przewagą tej techniki nad tradycyjną metodą tworzenia linii komórkowej SBNET jest to, że można szybko uzyskać hodowle 3D SBNET, a testy narkotykowe można wykonać w ciągu 3 tygodni. Sferoidy SBNET mogą być potencjalnie wykorzystane jako model do przeprowadzania badań przesiewowych leków in vitro w celu identyfikacji nowych leków dla pacjentów z SBNET. Ponieważ linie komórkowe SBNET nie są powszechnie dostępne, hodowle 3D sferoid SBNET mogą służyć jako nowy model in vitro do badania SBNET i mogą być udostępniane naukowcom w tej dziedzinie.

<table><tbody><tr><td>Anty-królik FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>11-095-152</td><td>Wtórna para przeciwciał do zielonego fluoroforu</td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania antygenu</td><td>Agilent Dako</td><td>S2367</td><td>Roztwór o pH 9 do przygotowania szkiełek do</td></tr><tr><td>IHC Autostainer Link 48</td><td>Agilent Dako</td><td>Niedostępny</td><td>Zautomatyzowany system do barwienia przeciwciał</td></tr><tr><td>Pojemnik do zamrażania komórek</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Pojemnik do zamrażania komórek</td></tr><tr><td>CellSence</td><td>Olympus</td><td>Version 1.18</td><td>Oprogramowanie komputerowe do korzystania z mikroskopu fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Przeciwciało chromograniny A</td><td>Abcam-45179</td><td>RB-9003-PO</td><td>Przeciwciała dla IF</td></tr><tr><td>Przeciwciało chromograniny A (klon LK2H10)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA5-13096</td><td>Przeciwciała dla</td></tr><tr><td>IHC Collagenaza</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td>Enzym do trawienia tkanki nowotworowej</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Pożywka do przygotowania tkanek</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>Pożywka do kultur organoidów</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Rozpuszczalnik do rozpuszczania DNA leku</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>Enzym do trawienia tkanki nowotworowej</td></tr><tr><td>Ethidium Homodimer</td><td>Chemodex</td><td>CDX-E0012-T1E</td><td>Barwnik wiążący DNA i RNA</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>Odczynnik do pożywek hodowlanych</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>CKX35</td><td>Mikroskop do robienia zdjęć sferoid SBENT</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td>Odczynnik do pożywek hodowlanych</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>Version 1.51</td><td>Oprogramowanie komputerowe do obrazowania analiza</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>Odczynnik do pożywek hodowlanych</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356235</td><td>Matryca do osadzania i zakotwiczania organoidów</td></tr><tr><td>Podłoże montażowe (VECTASHIELD)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Utrwalacz do znakowanych komórek z barwnikiem jądrowym</td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma</td><td>72340</td><td>Odczynnik do pożywek</td></tr> <tr><td>hodowlanychParaformaldehydowa</td><td>mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td>Odczynnik do utrwalania komórek</td></tr><tr><td>PEN/STREP</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Odczynnik do pożywek</td></tr><tr><td>hodowlanych PT Link</td><td>Agilent Dako</td><td>Niedostępny</td><td>Zautomatyzowany system do przygotowania szkiełek do barwienia IHC</td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62473</td><td>Lek, który może hamować wzrost NET</td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe dla IHC</td><td>Agilent Dako</td><td>K8000</td><td>Przeciwciała drugorzędowe dla IHC przy użyciu systemu EnVision FLEX na bazie polimerów</td></tr><tr><td>Przeciwciało SSTR2</td><td>GeneScritp</td><td>A01591</td><td>Przeciwciała przeciwko przeciwciału IF</td></tr><tr><td>SSTR2 (klon UMB1)</td><td>Abcam</td><td>ab134152</td><td>Przeciwciała przeciwko</td></tr><tr><td>synaptofizynie</td> IHC <td>Abcam</td><td>32127</td><td>Przeciwciała przeciwko</td></tr><tr><td>IF Synaptophysin (klon DAK-SYNAP)</td><td>Agilent Dako</td><td>Przeciwciała M7315</td><td>dla IHC</td></tr><tr><td>TritonX</td><td>Mallinckrodt</td><td>3555 KBGE</td><td>Odczynnik do przenikania komórek</td></tr><tr><td>Inhibitor Y-2763 ROCK</td><td>Adipogen</td><td>AG-CR1-3564-M005</td><td>W celu poprawy żywotności sferoidów SBNET po rozmrożeniu</td></tr></tbody></table>

ustalenie i charakterystyka sferoid guza neuroendokrynnego jelita cienkiego

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Guzy neuroendokrynne jelita cienkiego (SBNETs) są rzadkimi nowotworami wywodzącymi się z komórek enterochromafinowych jelita. Badania w tej dziedzinie były ograniczone, ponieważ wygenerowano bardzo niewiele linii komórkowych SBNET pochodzących od pacjentów. Dobrze zróżnicowane komórki SBNET rosną wolno i są trudne do rozmnażania. Kilka linii komórkowych, które zostały ustanowione, nie jest łatwo dostępnych, a po pewnym czasie w hodowli może nie wykazywać nadal cech komórek NET. Generowanie nowych linii komórkowych może zająć wiele lat, ponieważ komórki SBNET mają długi czas podwojenia i potrzeba wielu etapów wzbogacania w celu wyeliminowania szybko dzielących się fibroblastów związanych z rakiem. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy protokół hodowli komórek SBNET z chirurgicznie usuniętych guzów jako sferoid w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). ECM tworzy trójwymiarową matrycę, która otacza komórki SBNET i naśladuje mikrośrodowisko guza, umożliwiając wzrost komórek SBNET. Tutaj scharakteryzowaliśmy tempo wzrostu sferoid SBNET i opisaliśmy metody identyfikacji markerów SBNET za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej i immunohistochemii w celu potwierdzenia, że sferoidy są neuroendokrynnymi komórkami nowotworowymi. Dodatkowo wykorzystaliśmy sferoidy SBNET do badania cytotoksyczności rapamycyny.

Obecnie opracowano i opublikowano jedynie 2 linie komórkowe SBNET2,3,4,5, które nie są łatwo dostępne dla wielu badaczy. W niniejszej pracy proponujemy hodowlę SBNET w formie sferoidów w ECM i wykorzystanie ich jako alternatywnego modelu do badania wrażliwości SBNET na leki. Pobrano guz od pacjenta z SBNET z przerzutami do wątroby, poddano go trawieniu w celu uwolnienia komórek SBNET, a następn...

Guzy neuroendokrynne (NET) wywodzą się z komórek neuroendokrynnych grzebienia nerwowego. Rosną wolno i stanowią wyzwanie dla kultury. Przedstawiamy alternatywną strategię hodowli NET z jelita cienkiego poprzez hodowlę ich jako sferoid. Te sferoidy mają markery siatki jelita cienkiego i mogą być używane do testowania narkotyków.

Ustalenie i charakterystyka sferoid guza neuroendokrynnego jelita cienkiego

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Dobrze zróżnicowane komórki SBNET rosną wolno i są trudne do rozmnażania. Nieliczne znane linie komórkowe nie są łatwo dostępne dla badaczy. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy ten protokół hodowli 3D.Przewagą tej techniki nad tradycyjną metodą tworzenia linii komórkowej SBNET jest to, że można uzyskać kultury 3D i przeprowadzić testy narkotykowe w ciągu trzech tygodni. Metodę tę można zastosować do innych nowotworów neuroendokrynnych, takich jak guzy neuroendokrynne trzustki. Po uzyskaniu wyciętej próbki SBNET pacjenta, pokrój ją w pięciomilimetrową kostkę i przechowuj w 25 mililitrach pożywki DMEM F12 w stożkowej probówce do transportu.Inkubować guzy w pożywce przygotowanej zgodnie z instrukcjami manuskryptu przez 15 minut. Następnie przenieś je do nowego naczynia i zmiel na mniej niż milimetrowe kawałki za pomocą sterylnych zakrzywionych nożyczek. Przenieść zmielone tkanki do nowej 50-mililitrowej probówki zawierającej 25 mililitrów pożywki myjącej, a następnie odwirować próbkę z prędkością 500 razy g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki w 10 mililitrach pożywki myjącej z kolagenazą i DNazą. Pozwól zmielonym guzom strawić się w temperaturze 37 stopni Celsjusza, powoli potrząsając przez 90 minut. Ważne jest, aby nie trawić nadmiernie próbek guza.Zbyt dużo enzymu lub dłuższy czas inkubacji zabije komórki SBNET. Po zakończeniu trawienia odwirować probówkę o masie 500 razy g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 15 mililitrach pożywki myjącej.Umieść sitko o pojemności 70 mikrometrów na nowej probówce o pojemności 50 mililitrów i przenieś 10 mililitrów buforu do płukania przez sitko. Zakręć buforem płuczącym wewnątrz probówki, aby zapobiec przywieraniu komórek do boków. Następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko.Odwirować komórki w temperaturze 500 razy g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach środka myjącego. Umieść probówkę na lodzie i użyj pięciu mikrolitrów komórek do zliczenia komórek za pomocą hemocytometru.Obliczyć liczbę komórek, a następnie powtórzyć wirowanie w celu usunięcia supernatantu i ponownego zawieszenia komórek w ciekłym ECM w stężeniu miliona komórek na mililitr. Następnie przenieś od pięciu do 20 mikrolitrów sferoid SBNET w ECM na płytkę 96-dołkową i umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby płynny ECM mógł się zestalić. Dodać 200 mikrolitrów pożywki hodowlanej SBNET do każdej studzienki zawierającej sferoidy lub wyhodować organoidy w pożywce z komórek macierzystych, jak opisano wcześniej.Za pomocą pipety P1000 przenieś organoidy do probówki o pojemności 1,5 mililitra i odwiruj probówkę z ciśnieniem 1 500 razy g przez jedną minutę w celu usunięcia supernatantu. Umyj kulturę jednym mililitrem PBS i ponownie odwiruj, aby usunąć supernatant. Następnie utrwal organoidy, dodając 500 mikrolitrów paraformaldehydu i inkubując je przez 15 minut.Po inkubacji przemyj kulturę dwukrotnie jednym mililitrem PBS. Dodaj 500 mikrolitrów PBS z 3% BSA i 0,1% Triton X-100, aby przepuszczalność kultury. Inkubować probówkę przez pięć minut, a następnie umyć organoidy trzykrotnie jednym mililitrem PBS i 3% BSA.Następnie inkubuj kulturę z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez godzinę, a następnie powtórz płukanie PBS i BSA. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi i powtórzyć płukanie, upewniając się, że wszystkie supernatanty zostały odessane i odrzucone. Aby zobrazować sferoidy, dodaj pięć mikrolitrów podłoża montażowego zawierającego DAPI i użyj pipety P20, aby przenieść pięć mikrolitrów sferoid na szklane szkiełko.Uszczelnij szkiełko za pomocą szkiełka nakrywkowego i zobrazuj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego za pomocą obiektywów 10, 20 i 40X. Mechanicznie rozbij ECM za pomocą pipety P1000 i przenieś ją do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Odwirować probówkę z ciśnieniem 1 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie usuń cały supernatant i umieść probówkę na lodzie. Dodać dwa do czterech razy więcej objętości nowego ECM do osadu i wymieszać zawartość probówki, pipetując w górę i w dół 10 razy, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Przenieść od pięciu do 20 mikrolitrów mieszaniny ECM i SBNET na nową płytkę 96-dołkową i pozwolić ECM zestalić się.Następnie przykryj zestalony ECM nową pożywką SBNET i umieść płytkę w inkubatorze. W przypadku wysyłki sferoid SBNET do innego laboratorium, należy przenieść sferoidy z nowym ECM do kolby T25 i pozwolić ECM na zestalenie się. Napełnij kolbę podłożem sferoidalnym SBNET, mocno zakręć nakrętkę i przygotuj paczkę wysyłkową.Po otrzymaniu kultury sferoidalnej usuń pożywkę hodowlaną i powtórz poprzednie kroki, aby umieścić sferoidy z powrotem w kulturze. Tempo wzrostu sferoidów SBNET monitorowano za pomocą obrazowania mikroskopowego. Sferoidy SBNET potrzebują około 14 dni, aby podwoić swoją wielkość, gdy pożywka hodowlana jest zmieniana raz w tygodniu.Po 14 dniach w hodowli sferoidy SBNET nie powiększają się. Sferoidy wybarwiono przeciwciałami specyficznymi przeciwko synaptofizynie, chromograninie A i SSTR2 i zobrazowano za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Dane wykazały, że markery te są zlokalizowane w cytoplazmie i na błonie komórek SBNET.Aby zapewnić swoistość przeciwciał, te same procedury barwienia przeprowadzono na linii organoidowej z guza trzustki, który nie wykazuje ekspresji synaptofizyny, chromograniny A i SSTR2 i nie wykryto żadnego zielonego sygnału. Główną zaletą obrazowania immunofluorescencyjnego jest to, że można je wykonać w ciągu czterech godzin i dostarczyć podobnych informacji o barwieniu jak immunohistochemia. Hodowla SBNET jako sferoid jest cenną techniką identyfikacji leków, które mogą hamować wzrost SBNET.Sferoidy leczono rapamycyną i inhibitorem mTOR. Po pięciu dniach sferoida potraktowana rapamycyną utworzyła strukturę podobną do winogron i stała się apoptotyczna lub nekrotyczna. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby wstępnie zwilżyć sitko do komórek i rurkę zbiorczą środkiem myjącym.Zapobiegnie to przywieraniu komórek SBNET do sitka i plastikowej rurki. Dzięki temu protokołowi naukowcy i klinicyści mogą tworzyć hodowle sferoidalne SBNET z wyciętych guzów, udostępniać je innym laboratoriom i wykorzystywać do testowania leków zatwierdzonych przez FDA.

establishment-characterization-small-bowel-neuroendocrine-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przedstawiamy prostą platformę z nakładką z agarozy do hodowli trójwymiarowych wielokomórkowych sferoidów z wykorzystaniem linii komórkowych raka neuroendokrynnego. Metoda ta stanowi bardzo wygodny sposób badania wpływu leków terapeutycznych na komórki nowotworów neuroendokrynnych. Może ona również pomóc w tworzeniu ludzkich sferoidów nowotworów neuroendokrynnych do celów terapii antynowotworowej.

Linie komórkowe ludzkich guzów neuroendokrynnych jako trójwymiarowy model do badania terapii ludzkich guzów neuroendokrynnych

Ten film demonstruje strategię dzielenia i rozprzestrzeniania sferoidów powstałych z komórek nowotworowych neuroendokrynnych jelita cienkiego. Te sferoidy mają markery guza neuroendokrynnego jelita cienkiego i mogą być rozmnażane i dalej wykorzystywane do testowania leków przeciwnowotworowych.

Dzielenie sferoid w celu hodowli i wysyłki: procedura rozmnażania i przenoszenia sferoid z guza neuroendokrynnego jelita cienkiego

Źródło: Ear, P. H., et. al. Ustalenie i charakterystyka sferoidów guza neuroendokrynnego jelita cienkiego. J. Vis. Exp. (2019)Ten film pokazuje barwienie immunofluorescencyjne sferoidów guza neuroendokrynnego jelita cienkiego. Sferoidy są utrwalane, przepuszczalne i blokowane, a następnie inkubowane z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi. Barwnik jest dodawany do jąder barwnika przed ich zamontowaniem i wizualizacją pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Charakterystyka sferoid guza neuroendokrynnego jelita cienkiego za pomocą immunofluorescencji

Wprowadzamy protokół generowania dużych liczb (od tysięcy do setek tysięcy) sferoid guza o jednakowej wielkości i składzie, używając dostępnych na rynku płytek mikrodołkowych.

Produkcja dużej liczby sferoid guza o kontrolowanej wielkości przy użyciu płytek mikrodołkowych

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Opisujemy ewolucję trójwymiarowego modelu in vitro opartego na sferoidach, który umożliwia nam przetestowanie obecnego standardu eksperymentalnych schematów terapii raka płaskonabłonkowego głowy i szyi na liniach komórkowych, mając na celu ocenę podatności i odporności na terapię na pierwotnych komórkach z próbek ludzkich w przyszłości.

Testowanie terapii w sferoidalnym modelu hodowli komórkowej 3D raka płaskonabłonkowego głowy i szyi

Tutaj opisujemy łatwy w użyciu test na inwazję glejaka. Ten test jest odpowiedni dla komórek macierzystych podobnych do glejaka. Opisano również makro Fidżi do łatwego ilościowego określania inwazji, migracji i proliferacji.

Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego

Ten protokół przedstawia nowatorski, solidny i powtarzalny system hodowli do generowania i hodowania trójwymiarowych sferoidów z komórek gruczolakoraka jelita grubego Caco2. Wyniki stanowią pierwszy dowód na słuszność koncepcji tego podejścia do badania biologii nowotworowych komórek macierzystych, w tym odpowiedzi na chemioterapię.

Trójwymiarowy model sferoid do badania komórek macierzystych raka jelita grubego

Obecny protokół opisuje generowanie modeli hodowli 3D guzów z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenę ich wrażliwości na leki za pomocą testów żywotności komórek i badań mikroskopowych.

Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Ten artykuł demonstruje ustandaryzowaną metodę konstruowania trójwymiarowych sferoid nowotworowych. Opisano również strategię obserwacji sferoidy i analizy głębokiego uczenia opartego na obrazach przy użyciu zautomatyzowanego systemu obrazowania.

Generowanie sferoid 3D guza do badań oceny leków

Tutaj prezentujemy protokół, który umożliwia szybką, solidną i tanią produkcję sferoid nowotworowych, a następnie enkapsulację hydrożelową. Ma szerokie zastosowanie, ponieważ nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Byłoby to szczególnie przydatne do badania interakcji sferoida-matryca oraz budowania modeli fizjologii lub patologii tkanek in vitro.

Wytwarzanie i enkapsulacja sferoidów nowotworowych w hydrożelach glikolu polietylenowego do badania oddziaływań sferoida-matryca

Poznaj protokół 3D hodowli sferoidów guza neuroendokrynnego jelita cienkiego z próbek pacjentów. Ta metoda umożliwia testowanie leków w ciągu trzech tygodni, pokonując ograniczenia tradycyjnych linii komórkowych.

Ustalenie i charakterystyka sferoid guza neuroendokrynnego jelita cienkiego

Przeglądaj więcej filmów