Name: Test komórek reporterowych makrofagów do zbadania sygnalizacji NF-kB/AP-1 za pośrednictwem receptora toll-podobnego na zaadsorbowanych warstwach białek na powierzchniach polimerowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj metodę oceny aktywności NF-kappa-B i AP-1 w makrofagach reporterowych na powierzchniach polimerowych z warstwami białkowymi. Protokół umożliwia szybką analizę sygnalizacji TLR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują za finansowanie operacyjne z Canadian Institutes of Health Research Project (PTJ 162251), Queen's University Senate Advisory Research Committee oraz wsparcie infrastrukturalne od Canadian Foundation for Innovation John Evan's Leadership Fund (Projekt 34137) oraz Ministry of Research and Innovation Ontario Research Fund (Project 34137). L.A.M. było wspierane przez Queen's University R. Samuel McLaughlin Fellowship, Kanadyjska Rada ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada) – kanadyjskie stypendium dla absolwentów, nagroda dla absolwentów oraz stypendium dla absolwentów Ontario. Autorzy chcieliby podziękować dr Myronowi Szewczukowi za hojny dar linii komórek reporterowych makrofagów NF-κB/AP-1 oraz doktorom Michaelowi Blennerhassettowi i Sandrze Lourenssen za korzystanie z ich żelowego systemu obrazowania i czytnika płytek.

1. Przygotowanie pożywek i odczynników
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę fibroblastyczną. Połącz 450 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 ml penicyliny/streptomycyny. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.</li>
	<li>Przygotować reporterowe pożywki do wzrostu makrofagów w 50 ml podwielokrotności. Połącz 45 ml DMEM, 5 ml FBS, 5 μg/ml odczynnika do eliminacji mykoplazmy (tabela materiałów) i 200 μg/ml fleomycyny D1 (tabela materiałów). Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.</li>
	<li>Przygotować pożywkę do oznaczania makrofagów reporterowych w 50 ml podwielokrotności. Połącz 45 ml DMEM, 5 ml inaktywowanego termicznie FBS (HI-FBS), 5 μg/ml odczynnika do eliminacji mykoplazmy i 200 μg/ml fleomycyny D1. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.</li>
</ol>
2. Powlekanie powierzchni kultur komórkowych poli(metakrylanem metylu)
<ol>
	<li>Rozpuścić poli(metakrylan metylu) (PMMA) w chloroformie w stężeniu 20 mg/ml (np. 100 mg PMMA w 5 ml chloroformu) w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml. Umieścić mieszadło magnetyczne w fiolce i pozostawić do mieszania przez co najmniej 2 godziny, aż wszystkie ciała stałe się rozpuszczą. 
	ostrożność: Chloroform jest szkodliwy w przypadku wdychania. Upewnij się, że używasz rozpuszczalnika w dygestorium podczas noszenia rękawic PVA.</li>
	<li>Odpipetować 400 μl roztworu PMMA na środek szkiełka mikroskopowego ze szkła borokrzemianowego w powlekarce wirowej i wirować z prędkością 3000 obr./min przez 2 minuty. Przygotować liczbę szkiełek podstawowych wymaganą do testu, a także 3−5 dodatkowych do pomiaru kąta zwilżania wody. Przechowuj szkiełka w czystym pudełku (spryskanym i przetartym 70% etanolem) do wykorzystania w przyszłości. 
	nuta: Powłoka wirowa jest często używana do osadzania cienkiej, jednolitej powłoki na płaskiej powierzchni. Powlekarka wirowa obraca podłoże z dużą prędkością, wykorzystując siłę odśrodkową do rozprowadzenia roztworu powlekającego po powierzchni.
	<ol>
		<li>Zmierz kąt zwilżania wody w dwóch losowych miejscach na powierzchni dodatkowo powlekanych szkiełek (tj. nie szkiełek używanych do hodowli komórkowych) za pomocą goniometru, aby upewnić się, że powierzchnia szkła jest całkowicie pokryta polimerem. 
		nuta: Do pomiarów kąta zwilżania wody należy używać wyłącznie wody o najwyższej czystości (np. szklanej potrójnie destylowanej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) przymocuj 8-komorowe lepkie studzienki do szkiełek pokrytych PMMA za pomocą sterylnych kleszczy i zgodnie z techniką aseptyczną. Mocno dociśnij górną część lepkich studzienek, aby upewnić się, że są mocno przymocowane. Inkubować szkiełka z dołączonymi dołkami lepkimi w temperaturze 37 °C przez noc w celu zabezpieczenia zlomby.
	<ol>
		<li>Przetestuj szczelność lepkich studzienek, dodając do każdej studzienki 200 μl wody klasy hodowli komórkowej (wolnej od endotoksyn). Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 60 minut i upewnić się, że nie ma wycieków przed kontynuowaniem. Zassać wodę, uważając, aby nie naruszyć powłoki PMMA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj płukanie wodą bez endotoksyn, dodając 300 μl wody wolnej od endotoksyn do każdej studzienki i inkubując przez 1 godzinę (trzy razy), 12 godzin i 24 godziny przed użyciem w celu usunięcia pozostałego rozpuszczalnika.</li>
	<li>Zbadać stężenie endotoksyn w szkiełkach, które mają być użyte do hodowli komórek. Inkubować 200 μl wody z odczynnikiem wolnym od endotoksyn (tabela materiałów) w jednym dołku każdego szkiełka przez 1 godzinę. Zmierzyć stężenie endotoksyny w ekstrakcie za pomocą końcowego testu endotoksyn chromogennych (tabela materiałów). 
	nuta: Poniższy protokół jest specyficzny dla zestawu do oznaczania endotoksyn wymienionego w tabeli materiałów.</li>
	<li>Do tej pracy należy używać wyłącznie wody i materiałów eksploatacyjnych (tj. końcówek pipet, probówek do mikrowirówek i płytek studzienkowych), które są certyfikowane jako wolne od pirogenów (tj. wolne od endotoksyn). Ponadto, wszelkie wyroby szklane używane do przygotowania powierzchni pokrytych polimerem powinny być przed ><użyciem poddane depirogenizacji za pomocą sterylizacji na sucho (250 °C przez 30 min). Pomiar endotoksyny w roztworze ekstraktu, jak opisano tutaj, może spowodować niedoszacowanie endotoksyny na powierzchni materiału11,12. W związku z tym zaleca się, aby podczas opracowywania protokołu powlekania polimerowego przeprowadzić reakcję oznaczania endotoksyn (tj. kroki 2.5.4−2.5.6 dla próbek testowych [woda odczynnika] lub kontrole kolców) bezpośrednio w studzienkach zawierających pokrytą próbkę, aby upewnić się, że żadne źródła endotoksyny nie zostaną przypadkowo wprowadzone do systemu podczas procesu powlekania.
	<ol>
		<li>Przynieś wszystkie badane próbki (tj. ekstrakty) i odczynniki do oznaczania endotoksyn do RT. Rozpuść odczynnik chromogenny w buforze testowym i wzorcu endotoksyny w wodzie z odczynnikiem, pozostaw do rozpuszczenia na 5 minut i delikatnie zawiruj przed użyciem. Przykryj wszystkie butelki folią parafinową, gdy nie są używane.</li>
		<li>Utwórz 5-8-punktową standardową krzywą rozcieńczenia wzorca endotoksyny, począwszy od dolnej do górnej granicy testu, wykonując seryjne rozcieńczanie wzorca endotoksyny w wodzie z odczynnikiem.</li>
		<li>Aby kontrolować wzmocnienie lub zahamowanie testu endotoksyn w próbkach testowych, należy przygotować kontrolę pozytywną (zwaną również kontrolą kolca lub próbką wzbogaconą) poprzez rozcieńczenie znanej ilości endotoksyny w niewykorzystanym roztworze próbki testowej. 
		nuta: Stężenie kontroli dodatniej powinno być takie samo jak stężenie wzorca w środku krzywej wzorcowej. Jeżeli odzyskana ilość kolca endotoksyny (tj. stężenie kontroli dodatniej minus stężenie próbki testowej bez wzbogacania) mieści się w zakresie 50-200% nominalnego stężenia kolca endotoksyny, można uznać, że roztwór ekstrakcyjny nie zakłóca znacząco testu.</li>
		<li>Dodać 50 μl wzorców, próbek lub kontrolnych kolców do każdego dołka na 96-dołkowej płytce w dwóch lub trzech kroplach. Użyj wody odczynnika jako kontroli negatywnej.</li>
		<li>Dodaj 50 μl odczynnika chromogennego do każdego dołka. Szybko dodaj odczynnik do wszystkich studzienek. Użyj timera, aby zarejestrować czas potrzebny na dodanie odczynnika do wszystkich studzienek. Przykryć płytkę uszczelką adhezyjną i inkubować w temperaturze 37 °C (czas inkubacji zależy od partii i jest podany w certyfikacie analizy dołączonym do zestawu odczynników chromogennych). Alternatywnie, sprawdzaj na płytce co 15 minut podczas inkubacji, aż do momentu zaobserwowania zmiany koloru we wszystkich standardowych studzienkach.</li>
		<li>Po inkubacji dodać 25 μl 50% kwasu octowego do każdego dołka (końcowe stężenie 10% kwasu octowego na studzienkę), aby zatrzymać reakcję. Dodaj kwas octowy w tej samej kolejności, w jakiej dodano odczynnik chromogenny. Odczytać absorbancję płytki za pomocą czytnika płytek przy długości fali 405 nm. Odessać płyn i wyrzucić płytkę. 
		nuta: Dodanie kwasu octowego powinno zająć tyle samo czasu, aby dodać do każdego dołka, ile zajęło odczynnik chromogenny (± 30 s).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ultrafioletem (UV) sterylizować szkiełka przez 30 minut przed eksperymentami z hodowlą komórkową.</li>
</ol>
3. Powlekanie powierzchni kultur komórkowych polidimetylosiloksanem
<ol>
	<li>Wymieszać elastomer polidimetylosiloksanu (PDMS) w stosunku wagowym 10:1 (baza do utwardzacza). W komorze bezpieczeństwa biologicznego odpipetować około 10 ml zasady polidimetylosiloksanu do sterylnej probówki. Zważyć probówkę i powoli dodawać utwardzacz, aż do dodania 10%. 
	ostrożność: Używaj odczynników PDMS w dobrze wentylowanym pomieszczeniu i unikaj kontaktu z oczami, nosząc okulary ochronne.</li>
	<li>Dokładnie wymieszać elastomer, mieszając sterylną końcówką pipety serologicznej i pipetując w górę i w dół. Dodać około 200 μl roztworu do każdego dołka na 48-dołkowej płytce. Powoli przechylaj płytę studzienki, aby zapewnić całkowite pokrycie studzienek roztworem elastomeru.</li>
	<li>Umieść płytkę studzienkową z elastomerem w piecu próżniowym ustawionym na 50 cmHg, 40 °C. Zdejmij pokrywkę i przykryj jednowarstwową chusteczką, aby zapobiec wpadaniu innych zanieczyszczeń do studzienek. Pozostawić do inkubacji na co najmniej 48 godzin.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że studzienki są całkowicie pokryte poprzez oględziny. Upewnij się, że elastomer jest w pełni utwardzony, delikatnie szturchając sterylną końcówką pipety przed wyjęciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 300 μl 70% etanolu (sporządzonego z absolutnego etanolu i wody wolnej od endotoksyn) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Usunąć etanol i przeprowadzić płukanie wodą bez endotoksyn, dodając 300 μl wody wolnej od endotoksyn do każdej studzienki i inkubując przez 1 godzinę (trzy razy), 12 godzin i 24 godziny przed użyciem w celu usunięcia pozostałego rozpuszczalnika.
	<ol>
		<li>Inkubować 200 μl wody wolnej od endotoksyn w trzech dołkach każdej płytki przez 1 godzinę. Zmierzyć stężenie endotoksyn w ekstraktach wodnych za pomocą końcowego testu endotoksyn chromogennych (kroki 2.5.1−2.5.6).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Powlekanie powierzchni kultur komórkowych fluorowanym poli(tetrafluoroetylenem)
<ol>
	<li>Sporządzić 1 mg/ml roztwór fluorowanego poli(tetrafluoroetylenu) (fPTFE) (np. dodać 10 mg fPTFE do 10 ml rozpuszczalnika fluorowanego [Tabela materiałów]) w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml. Umieścić mieszadło magnetyczne w fiolce i pozostawić do mieszania przez co najmniej 24 godziny, aż wszystkie ciała stałe się rozpuszczą.</li>
	<li>Dodać około 150 μl roztworu polimeru do każdego dołka 48-dołkowej płytki polistyrenowej (tj. nie poddanej działaniu hodowli tkankowej). Powoli przechylaj płytkę studzienki, aby zapewnić całkowite pokrycie wszystkich studzienek roztworem polimeru. Załóż pokrywę.
	<ol>
		<li>Aby zapewnić skuteczną powłokę fPTFE studni, szkiełka nakrywkowe powinny być pokryte fPTFE i używane do pomiaru kąta zwilżania wody (krok 4.3.1). Umieść szkiełka nakrywkowe w dołkach 24-dołkowej płytki. Dodać około 400 μl roztworu polimeru do każdej studzienki zawierającej szkiełko nakrywkowe. Dociśnij szkiełka nakrywkowe za pomocą sterylnych kleszczyków, upewniając się, że są całkowicie pokryte roztworem polimeru, i przykryj płytkę studzienki pokrywką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić płytkę studzienkową z roztworem polimeru i/lub szkiełkami nakrywkowymi w piecu próżniowym ustawionym na 50 cmHg, 40 °C. Zdjąć pokrywkę i przykryć jednowarstwową chusteczką, aby zapobiec wpadaniu innych zanieczyszczeń do studzienek. Pozostawić do inkubacji na co najmniej 48 godzin.
	<ol>
		<li>Zmierz kąt zwilżania wody szkiełek nakrywkowych pokrytych fPTFE za pomocą goniometru, aby zapewnić skuteczne powlekanie. 
		nuta: Do pomiarów kąta zwilżania wody należy używać wyłącznie wody o najwyższej czystości (np. szklanej potrójnie destylowanej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 300 μl 70% etanolu (sporządzonego z absolutnego etanolu i wody wolnej od endotoksyn) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Usunąć etanol i przeprowadzić płukanie wodą bez endotoksyn, dodając 300 μl wody wolnej od endotoksyn do każdej studzienki i inkubując przez 1 godzinę (trzy razy), 12 godzin i 24 godziny przed użyciem w celu usunięcia pozostałego rozpuszczalnika.
	<ol>
		<li>Inkubować 200 μl wody wolnej od endotoksyn w trzech studzienkach każdej płytki przez 1 godzinę. Zmierzyć stężenie endotoksyn w ekstraktach wodnych za pomocą końcowego testu endotoksyn chromogennych (kroki 2.5.1−2.5.6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sterylizuj UV płytki dołkowe przez 30 minut przed eksperymentami z hodowlą komórkową.</li>
</ol>
5. Wytwarzanie lizatu z komórek 3T3
<ol>
	<li>Hoduj komórki 3T3 w wielu kolbach T150 do 70% konfluencji. Aby odłączyć komórki, odessać pożywkę, umyć powierzchnię 5 ml PBS i odessać PBS. Dodać 5 ml niepochodzącego od zwierząt, rekombinowanego enzymu dysocjacji komórek (tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-5 min.</li>
	<li>Odłączyć komórki, delikatnie przechylając kolbę do przodu i do tyłu. Dodaj 5 ml PBS, aby zneutralizować rekombinowany enzym używany do dysocjacji komórek. Przenieść oderwane komórki z kolb do probówki wirówkowej i wymieszać przez pipetowanie. Wykonaj zliczanie żywych komórek za pomocą hemocytometru i barwnika żywotności komórek. 
	nuta: Wybrano enzym dysocjacji komórek, który można zneutralizować poprzez rozcieńczenie w PBS, aby uniknąć wprowadzania białek na bazie surowicy do preparatu lizatu. Jeśli trypsyna jest używana do dysocjacji komórek, należy ją zneutralizować roztworem zawierającym surowicę i przeprowadzić dodatkowe płukanie PBS w celu zmniejszenia ilości białek surowicy przenoszonych do preparatu lizatu.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pierwotnej objętości (tj. 10 ml x liczba kolb) PBS w celu zmycia pozostałej pożywki. Powtórzyć.</li>
	<li>Ponownie odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Dodać objętość PBS wymaganą do osiągnięcia końcowego stężenia komórek 1 x 106 komórek/ml. Umieścić roztwór komórkowy w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu całkowitego zamrożenia próbki (co najmniej 2 godziny).</li>
	<li>Rozmrozić roztwór komórek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po całkowitym rozmrożeniu umieść roztwór z powrotem w zamrażarce o temperaturze -80 °C, aż do całkowitego zamrożenia. Powtórz w sumie 3 cykle zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Wykonać test kwasu mikrobicinchoninowego (BCA) na lizacie komórkowym w różnych rozcieńczeniach (np. 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) w celu określenia stężenia białka. Rozcieńczyć lizat komórkowy do stężenia białka 468,75 μg/ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. 
	nuta: Końcowe stężenie białka w płytce 48-dołkowej wynosi 125 μg/cm2 (w przeliczeniu na powierzchnię jednego dołka, 0,75cm2).</li>
	<li>Wykonaj Western blot w celu oceny obecności DAMP w lizacie (np. białko szoku cieplnego 60 [HSP60], pole grupy wysokiej mobilności 1 [HMGB1]), ładując 40-60 μg białka lizatu w buforze ładującym na 10% żel poliakrylamidowy o grubości 1,5 mm i postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami Western blot.</li>
</ol>
6. Ocena wpływu zaadsorbowanych warstw białkowych i receptorów toll-podobnych na aktywność NF-κB makrofagów
UWAGA: Aby zapoznać się ze schematem eksperymentalnego przepływu pracy i układu płyt, patrz odpowiednio Rysunek 1A i Rysunek uzupełniający 1.
<ol>
	<li>Hoduj makrofagi reporterowe w kolbie o odpowiedniej wielkości do 70% konfluencji. Zassać pożywkę, umyć powierzchnię PBS i odessać PBS. Dodać rekombinowany enzym dysocjacji komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 minut.</li>
	<li>Odłączyć komórki, mocno stukając w boki kolby. Dezaktywować rekombinowany enzym dysocjacji komórek, dodając równą objętość pożywki wzrostowej (zawierającej 10% FBS). Wykonaj zliczanie żywych komórek za pomocą hemocytometru i barwnika żywotności komórek. 
	nuta: Oczekiwana żywotność makrofagów reporterowych po 8-minutowej inkubacji w enzymie dysocjacji komórek wynosi 90%.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w pierwotnej objętości PBS do przepłukania komórek. Ponownie odwirować i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 7,3 x 105 komórek/ml w pożywce testowej (zawierającej inaktywowany termicznie FBS).</li>
	<li>Oddziel zawiesinę komórkową do 3 różnych probówek: inhibitora TLR4, anty-TLR2 i nieleczonej. Inkubować komórki z 1 μg/ml inhibitorem TLR4 przez 60 minut w RT lub z 50 μg/ml anty-TLR2 przez 30 minut w RT.</li>
	<li>Dodać 200 μl lizatu, 10% FBS, 10% komercyjnego osocza myszy (tabela materiałów) lub mieszaninę roztworów białkowych do płytki 48-dołkowej (lub równoważnej) i pozostawić białko do adsorpcji w temperaturze 37 °C przez żądany czas (tj. 30 min, 60 min lub 24 h). Odessać roztwory białkowe ze studzienek, używając świeżej pipety Pasteura do każdego roztworu białkowego, i przemyć powierzchnie 250 μl PBS przez 5 minut. Powtórz w sumie 3 prania. 
	nuta: Ten krok może wymagać wcześniejszego rozpoczęcia w protokole, w zależności od pożądanego czasu adsorpcji. Dostosuj odpowiednio protokół.</li>
	<li>Po okresie inkubacji z inhibitorem TLR4 lub anty-TLR2 należy ponownie zawiesić komórki pipetowane. Dodaj 200 μl roztworu komórkowego do każdej studzienki.</li>
	<li>W przypadku warunków kontroli pozytywnej TLR2 dodać Pam3CSK4 do końcowego stężenia 150 ng/ml. W przypadku warunków kontroli pozytywnej TLR4 dodać lipopolisacharyd (LPS) do końcowego stężenia 1,5 μg/ml. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 20 godzin.</li>
	<li>Pobrać próbkę 20 μl supernatantu z każdej studzienki i płytki w dwóch egzemplarzach do płytki 96-dołkowej. Dołączyć trzy studzienki z 20 μl pożywki do oznaczania jako kontrolę tła. Dodać 200 μl odczynnika reporterowego SEAP do każdego dołka. Przykryć płytkę uszczelką adhezyjną i inkubować przez 2,5 godziny w temperaturze 37 °C. 
	nuta: Czas inkubacji może się różnić w zależności od warunków doświadczalnych i powinien być zoptymalizowany pod kątem dużej różnicy w absorbancji między studzienkami kontroli dodatniej i ujemnej.
	<ol>
		<li>Przenieść pozostałą część supernatantu do probówki o pojemności 1,5 ml (na studzienkę). Wirować przy 1,000 x g przez 10 minut, aby osadzać wszelkie zanieczyszczenia. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. Analizować supernatant pod kątem obecności cytokin prozapalnych (np. TNF-α, interleukiny 6) za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń uszczelkę płytki samoprzylepnej. Odczytać absorbancję płytki za pomocą czytnika płytek przy długości fali 635 nm. Odessać płyn i wyrzucić płytkę.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Głównym celem naszego laboratorium jest odpowiedź gospodarza na implanty tkanek miękkich z biomateriału stałego, a w szczególności sposób, w jaki uszkodzenia komórkowe powstałe podczas procedury implantacji wpływają na odpowiedź gospodarza. Prezentowana praca opisuje wstępne eksperymenty z wykorzystaniem linii komórkowej makrofagów reporterowych i lizatu komórkowego zawierającego DAMP generowanego in vitro, w celu zbadania wpływu cząsteczek uwalnianych podczas uszkodzenia komórek (tj. w wyniku operacji implantologicznej)...

Reakcja na ciało obce (FBR) to przewlekła reakcja gospodarza, która może negatywnie wpłynąć na działanie wszczepionego materiału lub urządzenia (np. urządzeń do dostarczania leków, biosensorów), poprzez ciągłe uwalnianie mediatorów stanu zapalnego i utrudnianie integracji między wszczepionym materiałem a otaczającą tkanką1. Ta wrodzona odpowiedź immunologiczna jest inicjowana przez procedurę implantacji i charakteryzuje się długotrwałą obecnością wrodzonych komórek odpornościowych i tworzeniem się włóknistych torebek wokół implantu1. W kontekście istotnych odpowiedzi gospodarza, interakcje makrofag-materiał mają znaczący wpływ na postęp odpowiedzi gospodarza i rozwój klasy FBR<sup="xref">1. Makrofagi to zróżnicowana wrodzona populacja komórek odpornościowych, rekrutowana do miejsca implantacji z populacji makrofagów rezydujących w tkankach lub z krwi jako makrofagi pochodzące z monocytów. Zaczynają się one gromadzić w miejscu implantacji wkrótce po implantacji, a w ciągu kilku dni stają się dominującą populacją komórek w mikrośrodowisku implantu. Makrofagi przylegające do materiału, wraz z gigantycznymi komórkami ciała obcego (FBGC) powstałymi w wyniku fuzji makrofagów, mogą utrzymywać się na powierzchni materiału przez cały okres użytkowania implantu2,3. W związku z tym makrofagi są uważane za kluczowych graczy w odpowiedzi na ciało obce ze względu na ich role w koordynowaniu charakterystycznych etapów FBR: ostrej odpowiedzi zapalnej, przebudowy tkanek i tworzenia tkanki zwłóknieniowej1.
Receptory toll-podobne (TLR) to rodzina receptorów rozpoznawania wzorców, które są wyrażane przez wiele komórek odpornościowych, w tym makrofagi, i wykazano, że odgrywają znaczącą rolę w stanach zapalnych i gojeniu się ran. Oprócz ligandów pochodzących od patogenów, TLR są w stanie wiązać endogenne cząsteczki, znane jako wzorce molekularne związane z uszkodzeniem (DAMP), które są uwalniane podczas martwicy komórek i aktywują zapalne szlaki sygnałowe, powodując produkcję cytokin prozapalnych4. My i inni zasugerowaliśmy, że uszkodzenia powstałe podczas procedur implantacji biomateriału tkanek miękkich uwalniają DAMPs, które następnie adsorbują się na powierzchniach biomateriału oprócz białek krwi i modulują kolejne interakcje komórka-materiał5,6. Kiedy makrofagi oddziałują z zaadsorbowaną warstwą białka na implancie, ich powierzchniowe TLR mogą rozpoznawać zaadsorbowane DAMP i aktywować prozapalne kaskady sygnalizacyjne, prowadząc do aktywacji czynników transkrypcyjnych NF-κB i AP-1 oraz produkcji cytokin prozapalnych. Wcześniej wykazaliśmy, że mysie makrofagi znacznie zwiększyły aktywność NF-κB / AP-1 i wydzielanie czynnika martwicy nowotworu α (TNF-α, cytokiny prozapalne) w odpowiedzi na zaadsorbowane warstwy białka zawierające DAMP na różnych powierzchniach polimerowych w porównaniu z powierzchniami z zaadsorbowaną surowicą lub osoczem (tj. Brak obecnych DAMP), i że odpowiedź ta jest w dużej mierze pośredniczona przez TLR2, podczas gdy TLR4 odgrywa mniejszą rolę5.
Linia komórkowa reporterowa makrofagów NF-κB/AP-1 (Tabela materiałów) używana w tym protokole jest wygodną metodą pomiaru względnej aktywności NF-κB i AP-1 w makrofagach5,7,8. W połączeniu z inhibitorami szlaku TLR, ta linia komórkowa jest użytecznym narzędziem do badania aktywacji TLR i jej roli w stanie zapalnym w odpowiedzi na różne bodźce5,7,8. Komórki reporterowe są zmodyfikowaną mysią linią komórkową podobną do makrofagów, która może stabilnie wytwarzać wydzielaną embrionalną fosfatazę alkaliczną (SEAP) po aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-κB i AP-19. Kolorymetryczny enzymatyczny test fosfatazy alkalicznej (tabela materiałów) może być następnie wykorzystany do ilościowego określenia względnych ilości ekspresji SEAP jako pośredniej miary aktywności NF-κB / AP-1. Ponieważ NF-κB i AP-1 znajdują się za wieloma szlakami sygnalizacji komórkowej, przeciwciała neutralizujące i inhibitory ukierunkowane na określone TLR (np. TLR2) lub cząsteczki adaptorowe TLR (np. MyD88) można wykorzystać do weryfikacji roli określonego szlaku. Metodologia opisana w tym artykule zapewnia proste i szybkie podejście do oceny udziału sygnalizacji TLR w odpowiedziach mysich makrofagów na różne powierzchnie polimerowe z zaadsorbowanymi warstwami białkowymi zawierającymi zarówno białka krwi, jak i DAMP jako model in vitro wszczepionych biomateriałów.

<table><tbody><tr><td>Odczynniki do hodowli komórkowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-mysi/human CD282 (TLR2)</td><td>Biolegend</td><td>121802</td><td></td></tr><tr><td>CLI-095 (inhibitor TLR4)</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-CLI95</td><td></td></tr><tr><td>C57 osocze dopełniacza K2 EDTA 10ml, innowacyjne pochodzenie z USA</td><td>InnovativeResearch</td><td>IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml</td><td>Osocze myszy</td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka orła firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6429-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td>Bez wapnia, bez magnezu</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS), klasa badawcza</td><td>Żubr</td><td>98150</td><td></td></tr><tr><td>LPS-EK</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-EKLPS</td><td>Lipopolisacharyd z Escherichia coli K12</td></tr><tr><td>Fibroblasty NIH/3T3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Pam3CSK4</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pms</td><td>Syntetyczny triacylowany lipopeptyd - ligand TLR1/2</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>Invivogen</td><td>ANT-MPP</td><td>Odczynnik do eliminacji mykoplazmy</td></tr><tr><td>RAW-Niebieskie komórki</td><td>Invivogen</td><td>raw-sp</td><td>NF-&kappa; Linia komórkowa makrofagów reporterowych B / AP-1</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Enzym ekspresji tryple (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12604021</td><td>wolny od pochodzenia zwierzęcego rekombinowany enzym dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen</td><td>ANT-ZN-1</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy i testy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki powlekane ELISA, mysie IL-6</td><td>Biolegend</td><td>B213022</td><td></td></tr><tr><td>Płytki powlekane ELISA, mysie TNF-&alpha;</td><td>Biolegend</td><td>B220233</td><td></td></tr><tr><td>Endotoksyna (Escherichia coli) - Kontroluj standardową endotoksynę (CSE)</td><td>Współpracownicy Cape Cope Inc.</td><td>E0005-5</td><td>Endotoksyna do krzywej wzorcowej w chromogennym teście endotoksyn</td></tr><tr><td>LAL woda, 100 ml</td><td>Associates of Cape Cope Inc.</td><td>WP1001</td><td>Używany z testem endotoksyn chromogennych</td></tr><tr><td>Test białka Micro BCA</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI23235</td><td></td></tr><tr><td>Limulus Zestaw testowy na endotoksyny pirochromowej</td><td>Associates of Cape Cope, Inc.</td><td>C1500-5</td><td>Odczynnik do oznaczania endotoksyn chromogennych</td></tr><tr><td>QUANTI-Blue Pożywka do wykrywania fosfatazy alkalicznej</td><td>Invivogen</td><td>rep-qb2</td><td>Test fosfatazy alkalicznej do pośredniego pomiaru NF-&kappa; Aktywność B/AP-1</td></tr><tr><td>Odczynniki do powlekania polimerowego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform, bezwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306-1L</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy bezwodny</td><td>Alkohole handlowe</td><td>P006EAAN</td><td>Sigma: Odczynnik alkoholowy, bezwodny, 676829-1L</td></tr><tr><td>Proste stożkowe kleszczyki z cienką końcówką</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-113</td><td></td></tr><tr><td>Rozpuszczalnik fluoroobojętny FC-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9755-100ML</td><td>Fluorowany rozpuszczalnik do fPTFE</td></tr><tr><td>Woda klasy do hodowli komórkowych (bez endotoksyn)</td><td>Fisher Scientific SH30529LS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poli(metakrylan metylu) (PMMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>182230-25G</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw elastomerów Sylgard 184</td><td>Fisher Scientific</td><td>50822180</td><td></td></tr><tr><td>Teflon-AF (fPTFE)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>469610-1G</td><td>Poli[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluorometylo)-1,3-dioksol-ko-tetrafluoroetylen]</td></tr><tr><td>Materiały eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr> Uszczelki <tr><td>samoprzylepne</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki Axygen, 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-155</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki scyntylacyjne ze szkła borokrzemianowego, z białymi nasadkami z polipropylenu</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta 48-dołkowa płytka PS</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-52</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta płytka 96-dołkowa TCPS</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-2C</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta płytka 48-dołkowa TCPS</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1C</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe, kółka</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych Sokoła, T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-10</td><td></td></tr><tr><td>lepkie-Szkiełko 8 Well</td><td>Ibidi</td><td>80828</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Kolby poddane działaniu kultur tkankowych, T150</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-48</td><td></td></tr></tbody></table>

test komórek reporterowych makrofagów do zbadania sygnalizacji nf-kb/ap-1 za pośrednictwem receptora toll-podobnego na zaadsorbowanych warstwach białek na powierzchniach polimerowych

A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces

Uporczywa reakcja zapalna gospodarza na wszczepiony biomateriał, znana jako reakcja ciała obcego, jest znaczącym wyzwaniem w rozwoju i wdrażaniu urządzeń biomedycznych i konstruktów inżynierii tkankowej. Makrofagi, wrodzona komórka odpornościowa, odgrywają kluczową rolę w reakcji na ciało obce, ponieważ pozostają w miejscu implantacji przez cały okres użytkowania urządzenia i są powszechnie badane w celu zrozumienia tej szkodliwej odpowiedzi gospodarza. Wielu badaczy zajmujących się biomateriałami wykazało, że zaadsorbowane warstwy białek na wszczepionych materiałach wpływają na zachowanie makrofagów, a następnie na odpowiedź gospodarza. Metody opisane w tym artykule opisują model in vitro wykorzystujący zaadsorbowane warstwy białek zawierające cząsteczki uszkodzenia komórkowego na powierzchniach biomateriałów polimerowych w celu oceny odpowiedzi makrofagów. Reporterową linię komórkową makrofagów NF-кB/AP-1 i związany z nią test kolorymetrycznej fosfatazy alkalicznej zastosowano jako szybką metodę pośredniego badania aktywności czynnika transkrypcyjnego NF-кB/AP-1 w odpowiedzi na złożone zaadsorbowane warstwy białkowe zawierające białka krwi i wzorce molekularne związane z uszkodzeniem, jako model złożonych zaadsorbowanych warstw białkowych utworzonych na powierzchni biomateriału in vivo.

Przetestowano metody czyszczenia powierzchni pokrytych polimerem, aby upewnić się, że nie dochodzi do uszkodzenia powłoki, co objawiłoby się zmianą kąta zwilżania wodą w porównaniu do niepowlekanego szkiełka nakrywkowego (Rycina 2). Stwierdzono, że moczenie szkiełek mikroskopowych pokrytych PMMA w 70% etanolu przez 1 h powoduje usunięcie powłoki PMMA (Rycina 2, panel lewy), prawdopodobnie ze względu na rozpuszczalność PMMA w 80% wag. etanolu13<...

Ten protokół dostarcza badaczom szybkiej, pośredniej metody pomiaru aktywności czynnika transkrypcyjnego NF-кB/AP-1 zależnego od TLR w linii komórkowej mysich makrofagów w odpowiedzi na różnorodne powierzchnie polimerowe i zaadsorbowane warstwy białek, które modelują mikrośrodowisko implantu biomateriału.

Test komórek reporterowych makrofagów do zbadania sygnalizacji NF-kB/AP-1 za pośrednictwem receptora toll-podobnego na zaadsorbowanych warstwach białek na powierzchniach polimerowych

The persistent inflammatory host response to an implanted biomaterial, known as the foreign body reaction, is a significant challenge in the development ...

Protokół ten umożliwia szybką ocenę aktywności NF-kappa-B i AP-1 w makrofagach reporterowych hodowanych na zaadsorbowanych warstwach białkowych oraz udział szlaków sygnalizacji komórkowej, takich jak receptory Toll-podobne, do tej odpowiedzi. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota, pozwalająca na szybką analizę supernatantów do hodowli komórkowych pod kątem aktywności NF-kappa-B i AP-1 za pomocą prostego testu enzymatycznego. Zacznij od rozpuszczenia PMMA w chloroformie w końcowym stężeniu 20 miligramów na mililitr w 20-mililitrowej szklanej fiolce scyntylacyjnej w dygestorium.Umieść mieszadło magnetyczne w fiolce i mieszaj mieszaninę przez co najmniej dwie godziny. Gdy wszystkie ciała stałe zostaną rozpuszczone, przenieś 400 mikrolitrów roztworu PMMA na środek każdego szkiełka mikroskopowego ze szkła borokrzemianowego zgodnie z planowanymi warunkami na powlekarce wirowej i obracaj PMMA na szkiełku przez dwie minuty z prędkością 3 000 obrotów na minutę. Następnie przechowuj szkiełka z powłoką wirową w czystym pudełku spryskanym 70% etanolem.Następnie, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, użyj sterylnych kleszczy i techniki aseptycznej, aby przymocować ośmiokomorowe lepkie

a-macrophage-reporter-cell-assay-to-examine-toll-like-receptor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Test sialidazy to proste podejście techniczne, które pozwoli wyjaśnić nowe mechanizmy molekularne receptorów TLR w odpowiedzi na infekcje mikrobiologiczne oraz ich udział w chorobach zapalnych na poziomie receptorów na powierzchni komórek żywych makrofagów.

Wykrywanie aktywności sialidazy Neu1 w regulacji aktywacji receptorów Toll-podobnych

Źródło: Barbero, A. M., et.al. Testy fluorescencyjne do badania interakcji Mycobacterium tuberculosis z receptorem odpornościowym SLAMF1. J. Vis. Exp. ( (2025)Ten film demonstruje test oparty na fluorescencji badający interakcję między receptorem makrofagów a antygenami Mycobacterium tuberculosis . Antygeny znakowane fluorescencją na slipie są inkubowane z ekstraktami białek makrofagów, sieciowane, znakowane przeciwciałami i wizualizowane przez nakładające się sygnały fluorescencji.

Test fluorescencyjny do badania interakcji receptorów makrofagów z antygenami bakteryjnymi

Ten film demonstruje test do zbadania zależnej od receptora toll-like (TLR) aktywności czynników transkrypcyjnych: czynnika jądrowego-kappa-B (NF-κB) i białka aktywatora-1 (AP-1) w makrofagach. TLR uruchamiają prozapalną kaskadę sygnalizacyjną po rozpoznaniu wzorców molekularnych związanych z uszkodzeniem (DAMP), aktywując NF-κB i AP-1. Zmodyfikowane makrofagi reporterowe wytwarzają embrionalny enzym fosfatazę alkaliczną (SEAP) po aktywacji NF-κB i AP-1, który jest wykrywany w reakcji...

Test sygnalizacji czynnika transkrypcyjnego NF-&kcy;B/AP-1 zależnego od TLR w makrofagach

Ten film demonstruje test oparty na komórkach reporterowych do badania potencjalnych bioaktywnych nanocząstek, które hamują sygnalizację receptora Toll-podobnego (TLR). Test polega na wprowadzeniu lipopolisacharydów (LPS) zmieszanych z hybrydami nanocząstek peptydu i złota do makrofagów reporterowych eksprymujących białka reporterowe - wydzielaną embrionalną fosfatazę alkaliczną (SEAP) i lucyferazę. Redukcja sygnału TLR indukowanego przez LPS, w którym pośredniczą hybrydy, jest określana przez...

Test do badań przesiewowych bioaktywnych nanocząstek pod kątem hamowania sygnalizacji receptora toll-podobnego

Komórki dendrytyczne (DC) wydzielają IL-1β w odpowiedzi na rozpoznanie TLR8 syntetycznej puryny, R848, a następnie aktywację inflamasomu NLRP3 nigerycyną, dlatego IL-1β może być użyty do pomiaru aktywności inflamasomu NLRP3. Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych, immunoblotting i ELISA służą do dokładnego pomiaru pobudzania i aktywacji inflamasomu NLRP3 poprzez ekspresję IL-1β.

Aktywacja i pomiar aktywności inflamasomu NLRP3 za pomocą IL-1β w ludzkich komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów

W tym protokole opisujemy metody efektywnej transfekcji linii komórkowych mysich makrofagów za pomocą siRNA za pomocą 96-dołkowego systemu Amaxa Nucleofector Shuttle System, stymulacji makrofagów lipopolisacharydem i monitorowania wpływu na produkcję cytokin zapalnych.

Wykorzystanie interferencji RNA do zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u makrofagów myszy

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Tutaj prezentujemy protokół ilościowego oznaczania fagocytozy cząstek fluorescencyjnych za pomocą przylegającej linii komórkowej makrofagów przy użyciu metody fluorometrycznej. Metoda ta ułatwia wysokoprzepustową kwantyfikację internalizacji cząstek, a także wynikającą z niej polimeryzację aktyny.

Wysokoprzepustowa technika fluorometryczna do oceny fagocytozy makrofagów i polimeryzacji aktyny

Opisujemy eksperymentalny układ do wizualizacji z bezprecedensową wysoką rozdzielczością tworzenia i zamykania fagosomów w trzech wymiarach u żywych makrofagów, przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Umożliwia monitorowanie podstawy miseczki fagocytarnej, rozciągających się pseudopodów, a także dokładnego miejsca rozszczepienia fagosomu.

"Test zamykania fagosomu" do wizualizacji powstawania fagosomów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM)

Sygnalizacja receptora Toll-podobnego (TLR) odgrywa ważną rolę w patofizjologii wielu chorób zapalnych u ludzi, a regulacja odpowiedzi TLR przez bioaktywne nanocząstki jest korzystna w wielu stanach zapalnych. Komórki reporterowe oparte na komórkach THP-1 stanowią wszechstronną i solidną platformę przesiewową do identyfikacji nowych inhibitorów sygnalizacji TLR.

Badania przesiewowe bioaktywnych nanocząstek w fagocytarnych komórkach odpornościowych pod kątem inhibitorów sygnalizacji receptora toll-podobnego

Poznaj metodę oceny aktywności NF-kappa-B i AP-1 w makrofagach reporterowych na powierzchniach polimerowych z warstwami białkowymi. Protokół umożliwia szybką analizę sygnalizacji TLR.

Test komórek reporterowych makrofagów do zbadania sygnalizacji NF-kB/AP-1 za pośrednictwem receptora toll-podobnego na zaadsorbowanych warstwach białek na powierzchniach polimerowych (Wideo) | JoVE Journal

Test komórek reporterowych makrofagów do zbadania sygnalizacji NF-kB/AP-1 za pośrednictwem receptora toll-podobnego na zaadsorbowanych warstwach białek na powierzchniach polimerowych

Przeglądaj więcej filmów