Rozrost kłębuszków nerkowych jako test ex vivo do analizy szlaków zaangażowanych w aktywację komórek nabłonka ciemieniowego

Aktywacja komórek nabłonka okładzinowego jest kluczowym czynnikiem w rozwoju tkanki bliznowatej w kłębuszkach nerkowych. Korzystając z tej metody, możemy badać procesy komórkowe zaangażowane w tę aktywację i miejmy nadzieję, że znajdziemy opcje leczenia, które spowolnią lub nawet zatrzymają postęp choroby. Główną zaletą naszej techniki jest to, że wykorzystujemy komórki pierwotne, które wyrastają prosto z izolowanych kłębuszków nerkowych.

Po uwolnieniu nerek, zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym, przytrzymaj nerkę kleszczami chirurgicznymi i użyj innej pary kleszczy, aby wyciągnąć torebki nerkowe. Następnie umieść nerki w studzienkach sześciodołkowej płytki hodowlanej, z których każda zawiera dwa mililitry HBSS i umieść płytkę hodowlaną na lodzie. Najpierw przenieś nerki na 100-milimetrową szalkę Petriego i użyj dwóch skalpeli, aby zmielić je na małe kawałki o wielkości około jednego do dwóch milimetrów.

Utrzymuj zmielone kawałki nerki w stanie mokrym za pomocą HBSS. Następnie umieść kawałki nerki na metalowym sicie o grubości 300 mikrometrów i przeciśnij nerkę przez sito za pomocą tłoka ze strzykawki o pojemności 20 mililitrów. Kilkakrotnie przepłukać sito HBSS pomiędzy nimi i użyć pipety serologicznej, aby zebrać przepływ i przenieść go na czystą szalkę Petriego.

Za pomocą skalpela zeskrob wszystko, co pozostało na dnie sita i przenieś to do zebranego homogenatu nerkowego. Przepłukać homogenat nerkowy przez sito o wielkości 75 i 53 mikrometrów z HBSS. Następnie umyj oba sita HBSS, aby usunąć wszystkie mniejsze struktury.

Zebrać struktury nerkowe i materiał, który pozostał na sitach, przemywając górną powierzchnię każdego z nich DMEM uzupełnionym 20% płodową surowicą cielęcą i przenieść materiał do studzienek sześciodołkowej mikropłytki o bardzo niskim przyłączeniu. Przynieś mikropłytkę o bardzo niskim nasadce do mikroskopu z odwróconym światłem i użyj pipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby zebrać pojedyncze kapsułkowane i/lub zdekapsulowane kłębuszki nerkowe. Po złapaniu pojedynczego kłębuszka nerkowego w końcówce pipety, dodać świeżą pożywkę DMEM bez pobranego materiału nerkowego do tej samej końcówki pipety do objętości 20 mikrolitrów.

Przenieś pojedyncze kłębuszki nerkowe z pożywką DMEM do środka studzienki 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy godziny, aby umożliwić przyłączenie kłębuszków nerkowych do środka studzienki. Po inkubacji kłębuszki nerkowe zostaną przymocowane do środka studni. Ostrożnie dodaj 500 mikrolitrów śródbłonkowego podłoża podstawowego uzupełnionego zestawem czynników wzrostu oraz dodatkowymi 5% FBS i 1% penicyliny i streptomycyny do każdej studzienki.

Hoduj pojedyncze kłębuszki nerkowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez sześć dni. Po sześciu dniach inkubacji użyj cyfrowego mikroskopu światła odwróconego, aby wykonać zdjęcia i przeanalizować wyrostek kłębuszków nerkowych. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, określ powierzchnię wyrostu kłębuszków nerkowych, otwierając jeden z plików obrazu za pomocą paska skali.

Narysuj linię prostą na pasku skali i kliknij Analizuj, a następnie zmierz, aby określić odległość w pikselach. Aby określić skalę, kliknij przycisk Analizuj i ustaw skalę, a następnie wprowadź znaną odległość w pikselach, znaną odległość i jednostkę długości. Kliknij przycisk W porządku po zakończeniu.

Kliknij Analizuj i ustaw pomiary. Następnie sprawdź opcje Obszar i Wyświetlaj etykietę. Kliknij przycisk W porządku po zakończeniu.

Następnie narysuj odręczne zaznaczenie wokół wyrostka kłębuszkowego nerkowca. Kliknij przycisk Analizuj i zmierz, aby wyświetlić tabelę wyników, która zawiera pole powierzchni wzrostu w wcześniej określonej skali. W tym badaniu wyrostki komórek nabłonka kłębuszków ciemieniowych otorkowanych kłębuszków są izolowane z nerek myszy, hodowane i analizowane.

Reprezentatywne obrazy z mikroskopii świetlnej pokazują wyrostki kłębuszków nerkowych w różnych punktach czasowych podczas hodowli po wyizolowaniu kłębuszków nerkowych od nerek myszy. W celu potwierdzenia, że wyrastające komórki są komórkami nabłonka okładzinowego, izoluje się również odkapsulowane kłębuszki nerkowe i hoduje je przez sześć dni. Zdecapsulowane kłębuszki nerkowe nie wykazują wzrostu komórkowego w tym okresie inkubacji.

Następnie przeprowadza się barwienie immunofluorescencyjne dla różnych markerów komórek nabłonka ciemieniowego, markerów specyficznych dla miejsca zdjęcia, a także markerów komórek śródbłonka. Wyniki potwierdzają, że wyrastające komórki są rzeczywiście komórkami nabłonka ciemieniowego. Kłębuszki nerkowe związane z myszami z nokautem CD44 wykazują zmniejszoną liczbę wyrastających komórek, a także zmniejszoną powierzchnię przerostu kłębuszków nerkowych w porównaniu z kłębuszkami wyizolowanymi od myszy typu dzikiego.

Sugeruje to ważną rolę CD44 w aktywacji komórek nabłonka ciemieniowego. Za pomocą tej techniki możliwe jest również badanie wpływu leków na aktywację komórek nabłonka okładzinowego. Można to zrobić, traktując izolowane kłębuszki nerkowe wybranym lekiem i analizując różnice we wzroście komórek i migracji komórek.