Bezwzględna kwantyfikacja metabolizmu syntezy białek bezkomórkowych za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami i spektrometrią mas
25 października 2019
Tutaj prezentujemy solidny protokół do ilościowego oznaczania 40 związków biorących udział w centralnym metabolizmie węgla i energii w reakcjach syntezy białek bez komórek. Bezkomórkowa mieszanina syntezy jest derywatyzowana aniliną w celu skutecznego rozdzielania za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, a następnie oznaczana ilościowo za pomocą spektrometrii mas przy użyciu izotopowo znakowanych wzorców wewnętrznych.
Bezkomórkowa synteza białek to nowa technologia w systemach i biologii syntetycznej do produkcji białek in vitro. Bezkomórkowe systemy syntezy białek nie mają ściany komórkowej, dzięki czemu mamy bezpośredni dostęp do metabolitów. W tym protokole określamy ilościowo bezwzględne pomiary 40 metabolitów biorących udział w centralnym metabolizmie węgla i energii, co pozwala nam scharakteryzować metabolizm bezkomórkowy.
Protokół opiera się na przerzutowaniu związków za pomocą aniliny, co pozwala na lepszą separację i wyższą rozdzielczość spektrometrii mas. Ponadto stosujemy wzorce wewnętrzne z izotopem, który oznaczamy aniliną, do bezwzględnej kwantyfikacji metabolitów. Oznaczone metabolity wymywają się, co eliminuje skutki supresji żelaza.
Pozwala to na dokładne określenie ilościowe związków. Pracując w okapie, połącz 550 mikrolitrów aniliny z 337,5 mikrolitrami wody klasy LC-MS. I 112,5 mikrolitrów 12-molowego kwasu solnego w probówce wirówkowej.
Dobrze przemieszaj i przechowuj sześciomolowy roztwór aniliny o pH 4,5 i czterech stopniach Celsjusza. Aby przygotować sześciomolowy roztwór aniliny węgiel-13 o pH 4,5, połącz 250 miligramów aniliny węglowo-13 ze 132 mikrolitrami wody i 44 mikrolitrami 12-molowego kwasu solnego. Dobrze wymieszaj i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Aby przygotować 200 miligramów na mililitr roztworu EDC, rozpuść dwa miligramy EDC w 10 mikrolitrach wody na każdą próbkę, która ma być oznaczona. I dobrze wirować. Aby przygotować próbki, należy schłodzić i wytrącić białka w bezkomórkowej reakcji syntezy białek, dodając równą objętość lodowatego 100% etanolu do reakcji syntezy bezkomórkowej.
Odwirować próbkę o masie 12 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant próbki do nowej probówki wirówkowej. Aby oznaczyć próbkę roztworem aniliny węglowo-12, przenieś sześć mikrolitrów próbki do nowej probówki wirówkowej i doprowadź objętość do 50 mikrolitrów wodą.
Dodaj 5 mikrolitrów 200 miligramów na mililitr roztworu EDC, dobrze wymieszaj roztwór aniliny węglowo-12 i przenieś 5 mikrolitrów do probówki. Wirować reakcję delikatnym wstrząsaniem przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po dwóch godzinach wyjmij rurki z wytrząsarki i przenieś je do dygestorium.
Dodaj 1,5 mikrolitra trietyloaminy do każdej reakcji, aby zatrzymać reakcję znakowania aniliną i ustabilizować związki. Wirować przy 13 500 g przez trzy minuty. I uratuj supernatant.
Aby oznaczyć wzorce wewnętrzne roztworem aniliny węglowo-13, należy rozcieńczyć wewnętrzny roztwór podstawowy do 80 mikromoli o końcowej objętości 50 mikrolitrów. Dodaj pięć mikrolitrów 200 miligramów na mililitr roztworu EDC i pięć mikrolitrów dobrze wymieszanego roztworu aniliny węglowej-13. Wirować reakcję delikatnym wstrząsaniem przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.
Po dwóch godzinach wyjmij probówki z wytrząsarki i dodaj 1,5 mikrolitra trietyloaminy do reakcji w dygestorium. Odwirować przy 13 500 g przez trzy minuty i zachować supernatant. Aby odgadnąć oznaczony wzorzec wewnętrzny i oznaczoną próbkę, wymieszaj 25 mikrolitrów każdego z nich w fiolce z automatycznym samplerem.
I analizuj za pomocą procedury LC-MS. Następnie, aby utworzyć krzywą wzorcową dla nieoznakowanych metabolitów, najpierw rozcieńczyć roztwór podstawowy nieoznakowanych metabolitów do różnych stężeń o objętości 50 mikrolitrów. Dodaj pięć mikrolitrów 200 miligramów na mililitr roztworu EDC i pięć mikrolitrów roztworu aniliny węgla-12 do każdego stężenia.
Wirować reakcję delikatnym wstrząsaniem przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. I przystąp do leczenia trietyloaminą. I wirowanie przed analizą przez LC-MS, jak poprzednio.
Po inicjalizacji LC-MS, zgodnie z instrukcjami producenta, wstrzyknąć pięć mikrolitrów próbki do kolumny. I uzyskać odpowiednie intensywności jonów m over z dla próbki oznaczonej aniliną węgla-12. Następnie ponownie wstrzyknąć pięć mikrolitrów tej samej próbki.
I uzyskaj intensywność jonów m over z dla wzorców aniliny oznaczonej węglem-13. W tym protokole określono ilościowo metabolity wyrażające białko zielonej fluorescencji w bezkomórkowej syntezie białek na bazie E. coli. 40 metabolitów biorących udział w centralnym metabolizmie węgla i energii wykryto i określono ilościowo za pomocą wzorców wewnętrznych.
Opracowano również standardową krzywą dla pięciu metabolitów, które nie były znakowane aniliną. Różnorodne metabolity zaangażowane w te szlaki stanowiły klasę fosforylowanych cukrów, kwasów fosfokarboksylowych, kwasów karboksylowych, nukleotydów i kofaktorów. Ponadto metoda ta umożliwiła rozdzielenie par izomerów strukturalnych, takich jak fosforan glukozy-sześcioma i fosforan fruktozy-sześcio-fosforanowy, w jednym cyklu LC-MS.
Najważniejszym krokiem jest znakowanie odbiałkozonej próbki aniliną. Ponieważ roztwór aniliny ulega oddzieleniu, ważne jest, aby pracować szybko i skutecznie, przy jednoczesnym zachowaniu dobrych praktyk bezpieczeństwa. Metoda ta pomaga scharakteryzować metabolizm bezkomórkowy dzięki ilościowemu określeniu 40 metabolitów.
Ale w mieszaninie bezkomórkowej znajdują się dodatkowe związki, takie jak aminokwasy, które można określić ilościowo. Pomogłoby to w zapewnieniu bardziej kompleksowego spojrzenia na metabolizm bezkomórkowy. Metoda ta ujawniła, że systemy bezkomórkowe mają złożony metabolizm, który nadal działa, a który można potencjalnie wykorzystać do uzyskania lepszej efektywności energetycznej i uzysku węgla.
Protokół opiera się na znakowaniu związków aniliną przy użyciu EDC jako katalizatora. Oba te odczynniki są niebezpieczne i należy ich używać ostrożnie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metodę ilościowego oznaczania 40 metabolitów zaangażowanych w centralny metabolizm węgla i energii podczas bezkomórkowej syntezy białek. Dzięki zastosowaniu aniliny do derywatyzacji, protokół poprawia rozdzielczość w chromatografii cieczowej w fazie odwróconej i wykorzystuje spektrometrię mas do precyzyjnego oznaczania ilościowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Bezkomórkowa synteza białek
- Metabolomika
- Spektrometria mas
Wstęp
- Bezkomórkowa synteza białek umożliwia bezpośredni dostęp do metabolitów.
- Zrozumienie centralnego metabolizmu węgla i energii jest kluczowe dla charakterystyki systemów bezkomórkowych.
- Derywatyzacja aniliną poprawia rozdzielczość i separację podczas analizy.
- Izotopowo znakowane standardy wewnętrzne ułatwiają kwantyfikację absolutną.
Cel badania
- W celu ilościowego oznaczenia metabolitów zaangażowanych w centralny metabolizm węglowy i energetyczny.
- W celu pogłębienia zrozumienia procesów metabolicznych zachodzących w układach bezkomórkowych.
- Aby dostarczyć wiarygodny protokół dla badaczy w dziedzinie biologii syntetycznej.
Zastosowane Metody
- Derywatyzacja metabolitów za pomocą aniliny.
- Przeciwprądowa chromatografia cieczowa w celu rozdzielenia.
- Spektrometria mas w celu ilościowego oznaczenia z wykorzystaniem standardów znakowanych izotopowo.
- Współelucja znakowanych metabolitów w celu zminimalizowania efektów tłumienia jonów.
Główne wyniki
- Pomyślna kwantyfikacja 40 metabolitów.
- Poprawa rozdzielczości i separacji w spektrometrii mas.
- Skuteczna eliminacja efektów supresji jonów wynikających z koelucji.
- Opracowanie niezawodnego protokołu do przyszłych badań.
Wnioski
- Protokół dostarcza kompleksową metodę ilościowego oznaczania metabolitów.
- Umożliwia on lepsze zrozumienie szlaków metabolicznych w systemach bezkomórkowych.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować różne projekty z zakresu biologii syntetycznej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna kwantyfikacja centralnych metabolitów węglowych i energetycznych w bezkomórkowej syntezie białek umożliwia predykcyjną ocenę wydajności systemu, uzysku oraz efektywności energetycznej. Możliwość ta wspiera mechanistyczną minimalizację ryzyka w platformach bezkomórkowych przeznaczonych do produkcji leków biologicznych w systemie just-in-time poprzez identyfikację wąskich gardeł metabolicznych i ograniczeń kofaktorów. Metoda ta dostarcza translacyjnych odczytów metabolicznych, podobnych do biomarkerów, które informują o decyzjach go/no-go we wczesnej fazie odkrywania oraz w rozwoju przedklinicznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie strumienia metabolitów z wydajnością syntezy białek w systemach bezkomórkowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowe profilowanie metaboliczne w celu zmniejszenia ryzyka związanego z walidacją celu poprzez wyjaśnienie szlaków i ocenę funkcjonalną.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia ustandaryzowane, powtarzalne ilościowe oznaczenie 40 metabolitów w celu wsparcia gotowości do analiz w platformach przesiewowych opartych na systemach bezkomórkowych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia kompatybilne z wysoką przepustowością przepływy pracy LC/MS z 10-minutowymi przebiegami, umożliwiając skalowalne przesiewanie metabolitów w różnych warunkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie systemów istotnych dla chorób poprzez charakteryzację ciągłości metabolicznej od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną.
- Wartość operacyjna: Zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji wiodących kandydatów poprzez powiązanie wydajności metabolicznej z wydajnością i produktywnością białek.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, dostarczając danych o strumieniach metabolicznych, które pozwalają na wybór celu terapeutycznego i optymalizację szlaków przed identyfikacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków metabolicznych poprzez bezwzględne oznaczanie ilościowe produktów pośrednich glikolizy, cyklu TCA oraz szlaku pentozofosforanowego.
- Przesiewy: Umożliwia standaryzację i powtarzalność analiz dzięki normalizacji za pomocą standardów wewnętrznych oraz eliminacji tłumienia jonizacji opartej na koelucji.
- Analityka: Dostarcza ilościowe pomiary zmiennych zależnych (stężenia metabolitów w zakresie 2-3 rzędów wielkości), co pozwala na porównanie różnych warunków i ocenę statystyczną.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość badań przedklinicznych poprzez ustanowienie punktów odniesienia dla wydajności energetycznej i wydajności węglowej w systemach bezkomórkowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy reużywalną platformę metabolomiczną opartą na LC/MS do powtarzalnej charakterystyki warunków bezkomórkowych w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Przewidywalność wydajności systemu bezkomórkowego dzięki kompleksowemu mapowaniu metabolicznemu i redukcji niejednoznaczności mechanistycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki korekcji standardem wewnętrznym oraz szybkim, 10-minutowym analizom chromatograficznym.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), efektywność kapitałowa i ograniczenie ryzyka biologicznego na późnych etapach dzięki wczesnej identyfikacji ograniczeń metabolicznych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje dotyczące dalszego rozwoju w oparciu o mierzalne wskaźniki metabolizmu energetycznego i regeneracji kofaktorów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu derywatyzacji metabolitów, obsługi LC/MS oraz postępowania z odczynnikami niebezpiecznymi (anilina, EDC, HCl).
- Zależność od infrastruktury chromatografii cieczowej w fazie odwróconej sprzężonej ze spektrometrią mas z możliwością jonizacji z rozpylaniem.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa procesów gasiących próbki, precypitacji białek oraz czasu derywatyzacji w celu zapewnienia koelucji i dokładności kwantyfikacji.
- Kwestie adaptacyjne obejmują rozszerzenie metody na aminokwasy i inne metabolity węgla niecentralne obecne w mieszaninach wolnych od komórek.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność precyzyjnej kontroli pH podczas derywatyzacji oraz potencjalne zakłócenia ze strony złożonych matryc próbek, pomimo łagodzenia efektu tłumienia jonizacji.
