Name: Zdecentralizowany (ex vivo) mysi model pęcherza moczowego z usuniętym mięśniem wypierającym w celu uzyskania bezpośredniego dostępu do błony dróg moczowych podczas napełniania pęcherza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Poznaj zdecentralizowany model pęcherza myszego bez mięśnia wypierającego do badania mechanizmów sygnałowych między nabłonkiem a podnabłonkiem podczas napełniania. Ta metoda umożliwia analizę mediatorów urotelialnych i związków ciśnienie-objętość.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grant DK41315.

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt opisane w tym manuskrypcie zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Narodowych Instytutów Zdrowia dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych oraz Instytucjonalnym Komitetem ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Nevady.
UWAGA: Prezentowany tutaj model polega na usunięciu mięśnia wypieracza, podczas gdy nabłonek dróg moczowych i SubU/LP pozostają nienaruszone (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B), aby umożliwić badaczom bezpośredni dostęp do SubU/LP w trakcie napełniania pęcherza.
1. Sekcja preparatu pęcherza bez truzów
<ol>
	<li>Umieścić odizolowany pęcherz moczowy w naczyniu preparacyjnym wypełnionym zimnym (10 °C) i natlenionym 5% roztworem wodorowęglanuCO2/95%O2 Krebsa (KBS) o następującym składzie (mM): 118,5 NaCl, 4,2 KCl, 1,2 MgCl2, 23,8 NaHCO3, 1,2 KH2PO4, 11,0 dekstroza, 1,8 CaCl2 (pH 7,4)13.</li>
	<li>Przypnij niewielką część kopuły izolowanego pęcherza moczowego do pokrytego Sylgardem naczynia preparacyjnego wypełnionego KBS. Upewnij się, że szpilka przechodzi przez kawałek błony surowiczej lub najbardziej zewnętrzną krawędź mięśnia wypieracza z dala od najbardziej wewnętrznej krawędzi mięśnia, który jest skierowany w stronę SubU/LP.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu zidentyfikuj cewkę moczową i moczowody i przypnij każdy z nich do dna naczynia preparacyjnego.</li>
	<li>Usuń nadmiar tkanki tłuszczowej i łącznej tak, aby wyświetlić całą główną część pęcherza moczowego, cewkę moczową i oba moczowody.</li>
	<li>Zawiąż moczowody nylonowymi szwami 6-0. Następnie przypnij otwarte końce moczowodów do dna naczynia preparacyjnego, aby zabezpieczyć preparat.</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką delikatnie pociągnij kawałek błony surowiczej w rogu między moczowodem a trzonem pęcherza.</li>
	<li>Dostosuj światło mikroskopu, aby zwiększyć przezroczystość i rozróżnić brzeg błony podśluzowej pod mięśniem wypieracza.</li>
	<li>Rozpocznij nacinanie (nie złuszczanie!) ściany pęcherza nożyczkami z cienką końcówką wzdłuż wewnętrznej powierzchni warstwy mięśni wypieracza, jednocześnie delikatnie odciągając odcięty segment od preparatu. Przez cały czas upewnij się, że boczna krawędź błony śluzowej jest widoczna i unikaj jej dotykania.</li>
	<li>Całkowicie usunąć mięsień wypieracza, obracając naczynie preparacyjne tak, aby pozycja preparatu była wygodna do kontynuowania wycinania mięśnia wypieracza.</li>
	<li>Pozostaw mały kawałek mięśnia wypieracza na szczycie kopuły pęcherza, aby zapewnić możliwość unieruchomienia preparatu podczas pozostałych etapów protokołu.</li>
	<li>Zrób podwójną pętlę z nylonowej nici 6-0, umieść ją na szyi preparatu do pęcherza i pozostaw pętlę luźną.</li>
	<li>Dodaj drugą podwójną pętelkę z jedwabnej nici 6-0, umieść ją na szyi preparatu do pęcherza i pozostaw pętelkę luźną. Posiadanie dwóch szwów zapobiega przeciekaniu wokół szwów.</li>
	<li>Przeciąć około 2 cm rurki PE (cewnika), rozszerzyć końcówkę, powoli przesuwając końcówkę w pobliżu płomienia.</li>
	<li>Napełnij cewnik ciepłym (37 °C) natlenionym KBS.</li>
	<li>Wprowadzić cewnik do otworu cewki moczowej pęcherza moczowego i delikatnie popchnąć cewnik, aż końcówka cewnika dotrze mniej więcej do środka pęcherza.</li>
	<li>Zawiąż szew wokół cewnika i otaczającej tkanki szyjki pęcherza.</li>
	<li>Powoli napełnij pęcherz około 50-100 μl ciepłego (37 °C) natlenionego KBS, unieś go na chwilę (<10 s) nad powierzchnię KBS i monitoruj, czy nie ma wycieków na szwach i korpusie pęcherza.</li>
	<li>Jeśli nie zaobserwuje się wycieku, preparat jest gotowy do eksperymentu. Jeśli zaobserwuje się nieszczelność wokół szwu, zdejmij szew i wymień go. W przypadku zauważenia wycieku z otworu w korpusie pęcherza moczowego należy wyrzucić preparat.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do wypełnienia odmulonego pęcherza
<ol>
	<li>Przeprowadzić perfuzję KBS (37 °C) w komorze o pojemności 3 ml naczynia organowego z płaszczem wodnym (37 °C) z dnem Sylgarda.</li>
	<li>Wyreguluj przewody tlenowe i ssące.</li>
	<li>Umieść preparat do obnażonego pęcherza moczowego w komorze.</li>
	<li>Przymocować cewnik z boku komory tak, aby preparat nie unosił się nad powierzchnią roztworu perfuzyjnego.</li>
	<li>Podłączyć cewnik pęcherza moczowego do dłuższej rurki PE20 (linii infuzyjnej) podłączonej do trójdrożnego kranu za pomocą łącznika o tym samym rozmiarze.</li>
	<li>Upewnij się, że przewody między pompą infuzyjną, przetwornikiem ciśnienia i pęcherzem są otwarte.</li>
	<li>Napełnić strzykawkę infuzyjną świeżym, ciepłym (37 °C) i natlenionym KBS.</li>
	<li>Dostosuj parametry pompy: rodzaj/objętość strzykawki (np. 1 ml), działanie (np. zaparzanie), przepływ (tj. stały) i natężenie przepływu (np. 15 μl/min).</li>
	<li>Naciśnij przycisk Start na pompie strzykawkowej, aby napełnić pęcherz.</li>
	<li>Monitoruj objętość napełnienia i ciśnienie śródpęcherzowe podczas napełniania pęcherza.</li>
</ol>
3. Wykrywanie mediatorów w aspekcie SubU/LP preparatu z odmulonym pęcherzem
<ol>
	<li>Zebrać podwielokrotności roztworu kąpieli do lodowatych probówek do mikrowirówek lub wkładek do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).</li>
	<li>Przygotować i przetworzyć próbki zgodnie z odpowiednią aplikacją do wykrywania. W przypadku wykrycia dostępności puryn należy przetworzyć próbki za pomocą HPLC z detekcją fluorescencji13,18.</li>
</ol>

<ol><li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uroepithelial-associated+sensory+web%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).</li>
<li>Fry, C. H., Vahabi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Mucosa+in+Normal+and+Abnormal+Bladder+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+and+Clinical+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).</li>
<li>Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptors%2C+channels%2C+and+signalling+in+the+urothelial+sensory+system+in+the+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviewes+Urology%22%5BJournal%5D)">Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder.</a> Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).</li>
<li>Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+is+released+from+rabbit+urinary+bladder+epithelial+cells+by+hydrostatic+pressure+changes--a+possible+sensory+mechanism%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism?</a> Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).</li>
<li>Wang, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+and+purinergic+receptor-dependent+membrane+traffic+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).</li>
<li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+for+Piezo1+in+stretch-evoked+Ca%282%29%28%2B%29+influx+and+ATP+release+in+urothelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).</li>
<li>Mochizuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TRPV4+cation+channel+mediates+stretch-evoked+Ca2%2B+influx+and+ATP+release+in+primary+urothelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).</li>
<li>McLatchie, L. M., Fry, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+release+from+freshly+isolated+guinea-pig+bladder+urothelial+cells%3A+a+quantification+and+study+of+the+mechanisms+involved%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+International%22%5BJournal%5D)">ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved.</a> BJU International. 115, 987-993 (2015).</li>
<li>Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic-+and+capsaicin-evoked+nitric+oxide+release+from+urothelium+and+afferent+nerves+in+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).</li>
<li>Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO%3A+effect+on+bladder+afferent+neurons+and+nitric+oxide+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release.</a> Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).</li>
<li>Birder, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanilloid+receptor+expression+suggests+a+sensory+role+for+urinary+bladder+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).</li>
<li>Birder, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-adrenoceptor+agonists+stimulate+endothelial+nitric+oxide+synthase+in+rat+urinary+bladder+urothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells.</a> Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).</li>
<li>Durnin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+bladder+model+with+detrusor+smooth+muscle+removed+to+analyse+biologically+active+mediators+released+from+the+suburothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium.</a> Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).</li>
<li>Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-neuronal+cholinergic+system+in+human+bladder+urothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium.</a> Urology. 67, 425-430 (2006).</li>
<li>Beckel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pannexin+1+channels+mediate+the+release+of+ATP+into+the+lumen+of+the+rat+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder.</a> Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).</li>
<li>Collins, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OnabotulinumtoxinA+significantly+attenuates+bladder+afferent+nerve+firing+and+inhibits+ATP+release+from+the+urothelium%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+International%22%5BJournal%5D)">OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium.</a> BJU International. 112, 1018-1026 (2013).</li>
<li>Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+afferent+pathways+and+urothelial+function+in+the+male+mouse+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder.</a> Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).</li>
<li>Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+purine+release+during+filling+of+murine+and+primate+bladders%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).</li>
<li>Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+signalling+underlies+transforming+growth+factor-beta-mediated+bladder+afferent+nerve+hyperexcitability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability.</a> Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).</li>
</ol>

Część tej pracy została wcześniej opublikowana w czasopiśmie Journal of Physiology (PMCID: PMC6418748; DOI:10.1113/JP27692413). Firma Wiley and Sons, Inc. udzieliła zgody na wykorzystanie materiałów zawartych w tej publikacji. Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów finansowych ani innych.

Pęcherz moczowy pełni dwie funkcje: magazynowanie i oddawanie moczu. Normalne działanie tych funkcji wymaga odpowiedniego mechanicznego wykrywania objętości i ciśnienia w świetle oraz transdukcji sygnałów przez komórki w ścianie pęcherza moczowego w celu regulacji pobudliwości mięśni wypieracza. Uważa się, że błona śluzowa pęcherza moczowego (nabłonek dróg moczowych) reguluje pobudliwość pęcherza moczowego poprzez uwalnianie różnych cząsteczek sygnałowych w SubU / LP, które wpływają na wiele typów komórek w ścianie pęche...

Celem tego modelu jest umożliwienie bezpośredniego dostępu do podśluzówkowej strony błony śluzowej pęcherza podczas różnych faz napełniania pęcherza.
Pęcherz musi powstrzymać się od przedwczesnego skurczu podczas napełniania i opróżnić się, gdy zostanie osiągnięta krytyczna objętość i ciśnienie. Nieprawidłowa nietrzymanie moczu lub oddawanie moczu są często związane z nieprawidłową pobudliwością mięśni gładkich wypieracza (DSM) w trakcie napełniania pęcherza. Pobudliwość DSM jest determinowana przez czynniki właściwe komórkom mięśni gładkich oraz przez wpływy generowane przez różne typy komórek w ścianie pęcherza moczowego. Ściana pęcherza moczowego składa się z nabłonka dróg moczowych (błona śluzowa), błony śluzowej (SubU)/blaszki właściwej (LP), mięśni gładkich wypieracza (DSM) i błony surowiczej (ryc. 1A). Nabłonek dróg moczowych składa się z komórek parasolowych (tj. Najbardziej zewnętrznej warstwy nabłonka dróg moczowych), komórek pośrednich i komórek podstawnych (tj. Najbardziej wewnętrznej warstwy nabłonka dróg moczowych). W SubU/LP znajdują się różne typy komórek, w tym komórki śródmiąższowe, fibroblasty, doprowadzające zakończenia nerwowe, małe naczynia krwionośne i komórki odpornościowe. Powszechnie przyjmuje się, że nabłonek moczowy pęcherza moczowego jest narządem czucia, który inicjuje odruchową mikcję i nietrzymanie moczu poprzez uwalnianie mediatorów do błony podśluzowej, które wpływają na komórki w SubU/ LP i DSM1,2,3. W większości takie założenia opierają się na badaniach, które wykazały uwalnianie mediatorów: z fragmentów błony śluzowej narażonych na zmiany ciśnienia hydrostatycznego4,5; z hodowanych komórek urotelialnych wystawionych na rozciąganie6,7, pęcznienie komórek wywołane hipotonicznością7 lub siły oporu8; z izolowanych pasków ściany pęcherza moczowego po aktywacji receptora lub nerwu9,10,11,12,13,14; oraz w świetle pęcherza moczowego na końcu wypełnienia pęcherza15,16,17,18,19. Chociaż takie badania miały zasadnicze znaczenie dla wykazania uwalniania mediatorów po mechanicznej stymulacji segmentów ściany pęcherza moczowego lub hodowanych komórek urotelialnych, muszą być poparte bezpośrednimi dowodami na uwalnianie mediatorów w błonie podśluzowej, które są wywoływane przez bodźce fizjologiczne odtwarzające wypełnienie pęcherza. Jest to trudne zadanie, biorąc pod uwagę, że SubU/LP znajduje się głęboko w ścianie pęcherza, co utrudnia bezpośredni dostęp do okolic SubU/LP podczas napełniania pęcherza.
Tutaj ilustrujemy zdecentralizowany (ex vivo) model mysiego pęcherza moczowego z usuniętym mięśniem wypieracza13, który został opracowany w celu ułatwienia badań nad lokalnymi mechanizmami mechanotransdukcji, które uczestniczą w sygnalizacji między nabłonkiem moczowym, DSM i innymi typami komórek w ścianie pęcherza. Takie podejście jest lepsze niż stosowanie płaskich arkuszy ścian pęcherza moczowego, pasków ścian pęcherza moczowego lub hodowanych komórek urotelialnych, ponieważ umożliwia bezpośrednie pomiary w pobliżu SubU/LP mediatorów pochodzących z nabłonka dróg moczowych, które są uwalniane lub tworzone w odpowiedzi na fizjologiczne ciśnienia i objętości w pęcherzu moczowym i pozwala uniknąć potencjalnych zmian fenotypowych w hodowli komórkowej. Może być stosowany do pomiaru dostępności, uwalniania, metabolizmu i transportu przezurotelialnego mediatorów w SubU/LP na różnych etapach napełniania pęcherza moczowego (ryc. 1B). Preparat może być również stosowany do badania sygnalizacji urotelialnej i mechanotransdukcji w modelach zespołów pęcherza nadaktywnego i niedoaktywnego.

<table><tbody><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td>Źródło elastyczne</td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Fisher</td><td>D16</td><td>Źródło elastyczne</td></tr><tr><td>Szpilki preparacyjne</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>Źródło elastyczne</td></tr><tr><td>Pompa infuzyjna</td><td>Kent Scientific</td><td>GenieTouch</td><td>Źródło elastyczne</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td>Źródło elastyczne</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P284</td><td>Źródło elastyczne</td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>SCHOTT ACEI</td><td></td><td>Źródło elastyczne</td></tr><tr><td></td><td>Olympus SZX7</td><td></td><td>Elastyczny w użyciu z dowolnym zakresem</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>M33</td><td>Źródło elastyczne</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S671</td><td>Źródło elastyczne</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>S233</td><td>Źródło elastyczne</td></tr><tr><td>igły 25G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td>Źródło elastyczne</td></tr><tr><td>Kąpiel organowa</td><td>Wykonane</td><td></td> na zamówienie <td>Elastyczne źródło; Wykonaliśmy go z naczynia preparacyjnego Radnoti</td></tr>, <tr><td>rurki PE-20</td>, <td>Intramedic</td><td>427405</td><td>Źródło elastyczne</td></tr><tr><td>Przetwornik ciśnienia</td><td>Przyrząd</td><td></td> AD <td>Źródło elastyczne</td></tr><tr><td>S & T Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki o naprawie</td><td>00632-11</td><td>Źródło elastyczne</td></tr><tr><td>oprogramowanie ciśnienie i objętość</td><td>AD Instruments</td><td>Power lab</td><td></td></tr><tr><td>Szew nylonowy, 6-0</td><td>AD chirurgiczny</td><td>S-N618R13</td><td>Źródło elastyczny</td></tr><tr><td>szew Silk, 6-0</td><td>Deknatel przez Braintree Scientific, Inc.</td><td>07J1500190</td><td>Źródło elastyczne</td></tr><tr><td>strzykawki 1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td>Source elastyczne</td></tr><tr><td>nożyczki sprężynowe Vannas</td><td>Narzędzia do nauki o nauce</td><td>15000-08</td><td>Źródło elastyczne</td></tr><tr><td>Cyrkulator wody</td><td>Baxter</td><td>K-MOD 100</td><td>Źródło elastyczne</td></tr></tbody></table>

zdecentralizowany (ex vivo) mysi model pęcherza moczowego z usuniętym mięśniem wypierającym w celu uzyskania bezpośredniego dostępu do błony dróg moczowych podczas napełniania pęcherza

A Decentralized (Ex Vivo) Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling

Poprzednie badania wykazały uwalnianie substancji chemicznych z płaskich arkuszy błony śluzowej pęcherza moczowego umieszczonych w komorach Ussing i wystawionych na zmiany ciśnienia hydrostatycznego lub mechanicznego rozciągania oraz z hodowanych komórek urotelialnych przy zmianach ciśnienia hydrostatycznego, rozciąganiu, pęcznieniu komórek lub siłach oporu, a także w świetle pęcherza moczowego pod koniec napełniania. Takie odkrycia doprowadziły do założenia, że mediatory te są również uwalniane w suburothelium (SubU)/blaszce właściwej (LP) podczas napełniania pęcherza, gdzie wpływają na komórki głęboko w ścianie pęcherza, aby ostatecznie regulować pobudliwość pęcherza. Istnieją co najmniej dwa oczywiste ograniczenia w takich badaniach: 1) żadne z tych podejść nie dostarcza bezpośrednich informacji o obecności mediatorów w SubU/LP oraz 2) stosowane bodźce nie są fizjologiczne i nie podsumowują autentycznego wypełnienia pęcherza. W tym miejscu omówiono procedurę, która umożliwia bezpośredni dostęp do podurotelialnej powierzchni błony śluzowej pęcherza moczowego w trakcie napełniania pęcherza moczowego. Stworzony przez nas preparat bez mysich wytruzów bardzo przypomina napełnianie nienaruszonego pęcherza moczowego i umożliwia wykonywanie badań ciśnienia i objętości pęcherza moczowego przy braku zakłócającej sygnalizacji z odruchów rdzeniowych i wypieracza mięśni gładkich. Korzystając z nowatorskiego modelu pęcherza moczowego wolnego od wytruzów, wykazaliśmy niedawno, że pomiary śródpęcherzowe mediatorów nie mogą być używane jako wskaźnik zastępczy tego, co zostało uwolnione lub jest obecne w SubU/LP podczas napełniania pęcherza. Model umożliwia badanie cząsteczek sygnałowych pochodzących z nabłonka dróg moczowych, które są uwalniane, generowane przez metabolizm i/lub transportowane do SubU/LP w trakcie napełniania pęcherza moczowego w celu przekazywania informacji do neuronów i mięśni gładkich pęcherza moczowego oraz regulowania jego pobudliwości podczas trzymania moczu i mikcji.

Ściana preparatu pęcherza myszy pozbawionego mięśnia detrusora jest nienaruszona i zawiera wszystkie warstwy z wyjątkiem DSM i błony surowiczej. Badania potwierdzające zasadę działania wykazały, że ściana pęcherza pozbawiona DSM obejmuje urothelium oraz SubU/LP, podczas gdy tunica muscularis i błona surowicza są nieobecne (Rysunek 2)13.
Napełnianie pęcherza pozbawion...

Model pęcherza bez detrusorów umożliwia bezpośredni dostęp do błony podmoczowej w celu zbadania lokalnych mechanizmów regulacji dostępności biologicznie aktywnego mediatora w suburotelium/blaszce właściwej podczas przechowywania i oddawania moczu. Preparat bardzo przypomina napełnianie nienaruszonego pęcherza moczowego i pozwala na wykonanie badań ciśnienia i objętości bez wpływów ogólnoustrojowych.

Zdecentralizowany (ex vivo) mysi model pęcherza moczowego z usuniętym mięśniem wypierającym w celu uzyskania bezpośredniego dostępu do błony dróg moczowych podczas napełniania pęcherza

Previous studies have established the release of chemical substances from flat bladder mucosa sheets affixed in Ussing chambers and exposed to changes in ...

Nasz model pęcherza moczowego z usuniętym mięśniem wypierającym jest nowym eksperymentalnym podejściem do jednoczesnego badania dostępności mediatorów urotelialnych w lamii właściwej i świetle pęcherza moczowego podczas napełniania pęcherza. Model ten może dostarczyć nowych informacji na temat mechanizmów sygnalizacyjnych między nabłonkiem dróg moczowych, nabłonkiem dróg moczowych i mięśniem wypierającym, które regulują pobudliwość pęcherza podczas napełniania. Zacznij od umieszczenia nienaruszonej próbki mysiego pęcherza moczowego w naczyniu preparacyjnym pod mikroskopem preparacyjnym zawierającym natleniony KBS o temperaturze 10 stopni Celsjusza i oczyszczeniu tkanki łącznej i tłuszczowej wokół pęcherza.Przypnij niewielką część kopuły izolowanego pęcherza moczowego aż do najbardziej zewnętrznej krawędzi mięśnia wypieracza daleko od najbardziej wewnętrznej krawędzi mięśnia, który jest skierowany w stronę suburothelium lamia propria, do naczynia preparacyjnego pokrytego sylgardem wypełnionego KBS, a następnie przypnij moczowody i szyję pęcherza, aby wyświetlić nienaruszone przygotowanie pęcherza. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką delikatnie pociągnij kawałek błony surowiczej w rogu między moczowodem a trzonem pęcherza moczowego i dostosuj światło mikroskopu, aby zwiększyć przezroczystość i odróżnić brzeg błony podśluzówkowej pod mięśniem wypieracza. Aby uniknąć perforacji ścianki preparatu, należy pamiętać o odcięciu mięśnia wypieracza tylko wtedy, gdy boczna krawędź błony śluzowej pęcherza jest wyraźnie widoczna.Za pomocą nożyczek z cienką końcówką rozpocząć przecinanie ściany pęcherza wzdłuż wewnętrznej powierzchni warstwy mięśni wypieracza, jednocześnie delikatnie odciągając przecięty segment od preparatu, uważając, aby można było zaobserwować boczną krawędź błony śluzowej, unikając dotykania krawędzi tkanki. Pozostaw mały kawałek mięśnia wypieracza na szczycie kopuły pęcherza, aby umożliwić unieruchomienie preparatu podczas pozostałych etapów protokołu i wypełnij dwucentymetrowy kawałek 20 rurek polietylenowych natlenionym KBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po wprowadzeniu cewnika do ujścia cewki moczowej pęcherza moczowego delikatnie dociśnij cewnik, aż końcówka cewnika dotrze mniej więcej do środka pęcherza.Następnie zabezpiecz cewnik w otaczającej tkance szyjki pęcherza moczowego za pomocą nylonowego szwu 6,0 z podwójną pętlą. Po sprawdzeniu tkanki pod kątem przecieków, umieść obnażony preparat do pęcherza moczowego w trzymililitrowej komorze z naczyniem organowym z płaszczem wodnym o temperaturze 37 stopni Celsjusza z dnem sylgardowym i przymocuj cewnik z boku komory, tak aby preparat nie unosił się nad powierzchnią roztworu perfuzyjnego. Podłącz cewnik pęcherza moczowego do kawałka rurki z polietylenu 20 podłączonej do trójdrożnego kranu i strzykawki infuzyjnej wypełnionej natlenionym KBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza i uruchom pompę infuzyjną, aby napełnić pęcherz KBS, zwracając uwagę na monitorowanie objętości napełnienia w ciśnieniu śródpęcherzowym podczas napełniania.W celu wykrycia mediatorów w aspekcie suburothelium lamina propria preparatu, należy zebrać podwielokrotności roztworu kąpieli w różnych odpowiednich punktach czasowych doświadczenia i przetworzyć próbki zgodnie z planowaną analizą w dalszej kolejności. Odsłonięta ściana preparująca pęcherz moczowy zawiera nabłonek dróg moczowych i nabłonek dróg moczowych, ale nie wypieracza mięśni gładkich. Zależności ciśnienia i objętości są zadziwiająco podobne w nienaruszonych i ogołoconych preparatach.Przydatność modelu do pomiaru mediatorów pochodzących z nabłonka dróg moczowych, które są uwalniane po stronie suburothelium blaszki właściwej podczas napełniania, może być badana poprzez pomiar uwalniania mediatorów purynowych do roztworu kąpiącego suburothelium blaszkę właściwą preparatu ogołoconego. Jak wykazano, znikome ilości puryn można wykryć w kąpieli zawierającej izolowany preparat do pęcherza moczowego z nienaruszonym mięśniem wypierającym; podczas gdy ilości tych puryn są znacznie wyższe w próbkach pobranych z kąpieli zawierających preparat do usuwania pęcherza moczowego. Warto zauważyć, że rozkład puryn i metabolitów w próbkach pobranych ze światła i suburothelium blaszki właściwej pod koniec napełniania różni się znacznie.Dodanie atheno ATP, wysoce fluorescencyjnego analogu ATP, do suburotelialnej strony preparatu wolnego od truzji powoduje zmniejszenie ATP ateny i wzrost produktów ATP ateny, atheno ADP, atheno AMP i atheno ADO. Podobnie, dodanie atheno ATP do preparatu światła powoduje zmniejszenie atheno ATP i wzrost atheno ADP, atheno AMP i atheno ADO w lumenie. Ponadto dodanie atheno ATP do suburothelium lamina propria po stronie obnażonego preparatu powoduje pojawienie się atheno AMP i atheno ADO w świetle reflektora.Podobnie, dodanie ATP ateny do światła powoduje pojawienie się atheno AMP i atheno ADO w blaszce właściwej suburothelium. Po tej procedurze można zmierzyć dostępność mediatorów pobudzających i hamujących w blaszce właściwej oraz w świetle pęcherza moczowego na różnych etapach napełniania pęcherza. Za pomocą tego modelu można również badać obustronny transport przezcewkowy mediatorów i metabolizm mediatorów.Wykorzystanie tego nowego modelu pęcherza moczowego pozwoli na nowe zrozumienie wewnętrznej, miejscowej mechanowrażliwej sygnalizacji między nabłonkiem dróg moczowych a mięśniami gładkimi wypieracza, które kontrolują pobudliwość pęcherza moczowego w zdrowiu i chorobie.

a-decentralized-ex-vivo-murine-bladder-model-with-detrusor-muscle

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Guzy pęcherza moczowego u myszy żeńskich indukuje się w sposób małoinwazyjny poprzez cewnikowanie, lokalną kauteryzację oraz następującą po niej adhezję komórek raka do miejsc oparzeń.

Ortotopowy model mysiego raka pęcherza moczowego

Ustanowienie ortotopowego modelu nowotworu pęcherza moczowego w celu oceny efektów przeciwnowotworowych wewnątrz pęcherzowo podanego saRNA oraz monitorowanie wzrostu guza za pomocą ultradźwięków i obrazowania bioluminescencyjnego.

Ortotopowy model nowotworu pęcherza moczowego oraz ocena leczenia wewnątrz pęcherzowego za pomocą saRNA

Źródło: O'Brien, V. P., i in., Nawracająca infekcja dróg moczowych Escherichia coli wywołana ekspozycją pęcherza pochwowego Gardnerella u myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film demonstruje wykorzystanie skaningowej mikroskopii elektronowej do wizualizacji kolonizacji bakterii oraz interakcji gospodarz–patogen w nabłonku pęcherza moczowego modelu myszy przed zakażeniem.

Przygotowanie tkanek pęcherza myszy do wizualizacji infekcji bakteryjnej

W tym filmie opisujemy ortotopową transplantację hodowanych organoidów guza pęcherza moczowego do mysiego pęcherza moczowego, aby zbadać rolę środowiska narządu w rozwoju nowotworów.

Model organoidów guza pęcherza moczowego: metoda ortotopowego przeszczepu organoidów pęcherza moczowego do mysiego pęcherza biorcy

W tym filmie pokazujemy izolację komórek mięśni gładkich wypieracza z próbek ludzkiego pęcherza moczowego za pomocą dwuetapowej sekwencyjnej obróbki enzymatycznej.

Izolacja komórek mięśni gładkich Detrusor: procedura trawienia enzymatycznego w celu uzyskania komórek DSM z próbek ludzkiego pęcherza moczowego

Sprawdzona technika szczepienia pierwotnych inwazyjnych ksenoprzeszczepów raka ortotopowego pęcherza moczowego wymaga laparotomii i mobilizacji pęcherza. Procedura ta powoduje znaczną zachorowalność u myszy, jest technicznie trudna i czasochłonna. W związku z tym opracowaliśmy wysoce precyzyjne, przezskórne podejście wykorzystujące kontrolę ultrasonograficzną.

Małoinwazyjne założenie mysich ortotopowych ksenoprzeszczepów pęcherza moczowego

Około 3-8 milionów ludzi w Stanach Zjednoczonych cierpi na śródmiąższowe zapalenie pęcherza moczowego/zespół bólu pęcherza moczowego (IC/BPS), wyniszczający stan charakteryzujący się częściowo bólem miednicy. W celu zbadania udziału układu nerwowego w tym stanie, stosuje się fizjologiczny model bólu pęcherza moczowego u myszy i szczurów.

Wzdęcie pęcherza moczowego wywołało reakcje trzewnomotoryczne jako model bólu pęcherza moczowego u myszy

Celem tego protokołu jest zastosowanie zoptymalizowanego protokołu dysocjacji tkanek do mysiego modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego i walidacja podejścia do analizy pojedynczych komórek za pomocą cytometrii przepływowej.

Metoda dysocjacji pojedynczych komórek do analizy molekularnej pęcherza moczowego u myszy po urazie rdzenia kręgowego

Prezentujemy metodę tworzenia modelu niedoczynności wypieracza przez przecięcie stożka rdzenia u szczurów. U tych zwierząt skutecznie stymulowano niedoczynność wypieracza. Model może być wykorzystany do badania funkcji dróg moczowych.

Model niedoczynności wypieracza u szczurów za pomocą przecięcia stożka medullaris

Ten protokół opisuje proces generowania i charakterystyki mysich organoidów urotelialnych zawierających delecje w interesujących genach. Metody obejmują pobieranie mysich komórek urotelialnych, transdukcję ex vivo z adenowirusem napędzającym ekspresję Cre za pomocą promotora CMV oraz charakterystykę in vitro i in vivo.

Ex vivo Organoidalny model delecji genów za pośrednictwem adenowirusa-cre w mysich komórkach urotelialnych

Poznaj zdecentralizowany model pęcherza myszego bez mięśnia wypierającego do badania mechanizmów sygnałowych między nabłonkiem a podnabłonkiem podczas napełniania. Ta metoda umożliwia analizę mediatorów urotelialnych i związków ciśnienie-objętość.

Zdecentralizowany (ex vivo) mysi model pęcherza moczowego z usuniętym mięśniem wypierającym w celu uzyskania bezpośredniego dostępu do błony dróg moczowych podczas napełniania pęcherza (Wideo) | JoVE Journal

Zdecentralizowany (ex vivo) mysi model pęcherza moczowego z usuniętym mięśniem wypierającym w celu uzyskania bezpośredniego dostępu do błony dróg moczowych podczas napełniania pęcherza

Przeglądaj więcej filmów