Name: Przeżywalność komórek Purkiniego w organtypowych kulturach warstwowych móżdżku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Poznaj metodę hodowli organotypowych plasterków móżdżku myszy do badania śmierci komórek Purkiniego i testowania związków neuroprotekcyjnych w warunkach zbliżonych do in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Prace obrazowe zostały przeprowadzone w Northwestern University Center for Advanced Microscopy, hojnie wspieranym przez NCI CCSG P30 CA060553 przyznane Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Dziękujemy Seanowi McDermottowi za jego pomoc techniczną i wsparcie oraz Mayi Epstein za ręcznie rysowane ilustracje pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 1.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami komitetu Northwestern University Animal Studies.
1. Przygotowanie przed organotypowymi kulturami plastrów móżdżku
<ol>
	<li>W kapturze do hodowli komórkowej spryskanym wcześniej 70% etanolem przygotuj 200 ml pożywki hodowlanej w butelkowym filtrze próżniowym o pojemności 250 ml podłączonym do sterylnego odbiornika butelki. Dodaj 100 ml Basal Medium Eagle (BME), 50 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS), 50 ml inaktywowanej termicznie surowicy końskiej, 1 ml 200 mM L-glutaminy (końcowe stężenie 1 mM) i 5 ml 200 g/l glukozy (końcowe stężenie 5 mg/ml). Przefiltrować próżniowo pożywkę hodowlaną i utrzymywać ją w temperaturze +4 °C przez okres do miesiąca.</li>
	<li>W wysterylizowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego wyjmij z opakowania 6-dołkową płytkę hodowlaną. Napełnij każdą studzienkę 1 ml pożywki hodowlanej. Jeśli badana jest dawka, należy dodać środek farmakologiczny do studzienki poddanej działaniu substancji i taką samą objętość roztworu nośnika do studzienki kontrolnej. W niniejszym badaniu dodaliśmy 1 μl sterylnego 3 M roztworu KCl do uzdatnionej studzienki (30 mM końcowej) i 1 μl sterylnej wody do studzienek kontrolnych.</li>
	<li>Wprowadzić do okapu do hodowli komórkowej potrzebną liczbę indywidualnie owiniętych wkładek do hodowli komórkowych z hydrofilową membraną z politetrafluoroetylenu (PTFE) (wielkość porów = 0,4 μm). Ostrożnie rozpakuj je i wyjmij wkładki do hodowli komórkowych za pomocą sterylnych kleszczy. Wrzuć je pojedynczo do dołka na 6-dołkowej płytce, unikając pęcherzyków na granicy faz między membraną wkładki a pożywką do hodowli komórkowej. Pozostawić wkładki w pożywce w inkubatorze o temperaturze 5% CO2 przez co najmniej 2 godziny przed hodowlą. 
	UWAGA: Rozdrabniacz tkanek na stałe znajduje się w kapturze do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Przygotuj dwie zlewki o pojemności 200 ml, jedną wypełnioną 150 ml sterylnej wody, a drugą wypełnioną 150 ml 70% etanolu. Zanurz narzędzia chirurgiczne w kąpieli z 70% etanolem, a następnie w wodzie przed ich użyciem. 
	UWAGA: Nie używaj narzędzi chirurgicznych bezpośrednio po kontakcie z etanolem.</li>
	<li>Zdezynfekuj obosieczne ostrze w zlewce z 70% etanolem. Umieść go na uchwycie ostrza za pomocą sterylnych kleszczy i przytrzymaj go na miejscu za pomocą ostrza clamp klucz. Pozostaw do wyschnięcia do czasu użycia.</li>
	<li>Zdezynfekuj plastikowy krążek dostarczony z rozdrabniaczem do tkanek w zlewce z 70% etanolem. Spryskaj stół do cięcia 70% etanolem przed umieszczeniem na nim tarczy. Pozostaw do wyschnięcia do czasu użycia.</li>
</ol>
2. Sekcja i organotypowe kultury warstwowe móżdżku
<ol>
	<li>Wprowadź młode myszy do kaptura do hodowli komórkowej, aby przeprowadzić sekcję.</li>
	<li>Szybko odetnij głowę szczeniakowi za pomocą prostych nożyczek operacyjnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Trzymając głowę szczeniaka za nos za pomocą prostych kleszczy opatrunkowych, rozetnij skórę głowy prostymi nożyczkami do oczu, zaczynając od tylnego końca i idąc na boki do linii środkowej.</li>
	<li>Postępuj identycznie dla czaszki. 
	UWAGA: Upewnij się, że końcówki nożyczek są skierowane na zewnątrz, aby uniknąć uszkodzenia móżdżku podczas sekcji.</li>
	<li>Wyjmij mózg i przenieś go do 60-milimetrowego naczynia wypełnionego zimnym HBSS + 5 mg/ml glukozy.</li>
	<li>Ostrożnie wypreparuj móżdżek za pomocą sterylnych, prostych, cienkich kleszczyków (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Przenieś go na plastikowy krążek umieszczony na stole do cięcia rozdrabniacza tkanek za pomocą sterylnych, zakrzywionych drobnych kleszczyków.</li>
	<li>Zorientuj tkankę, obracając stół do cięcia, aby wykonać sekcje przystrzałkowe.</li>
	<li>Przesuń stół do cięcia, pociągając pokrętło zwalniające stół w prawo, tak aby ostrze znalazło się na krawędzi tkanki.</li>
	<li>Dostosuj grubość plastra do 350 μm, a prędkość ostrza na średnią.</li>
	<li>Uruchom helikopter. Gdy cały móżdżek zostanie pokrojony (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C), wyłącz siekacz.</li>
	<li>Usuń plastikowy krążek za pomocą sterylnych kleszczyków.</li>
	<li>Ostrożnie zbliż plastikowy krążek do naczynia o średnicy 60 mm zawierającego HBSS + 5 mg/ml glukozy. Odpipetować zimny HBSS + 5 mg/ml glukozy na tkankę za pomocą sterylnej pipety transferowej, aby umożliwić pobranie plastrów móżdżku w naczyniu wypełnionym buforem.</li>
	<li>Oddziel plastry móżdżku od siebie za pomocą mikrosondy. Wyjmij dobrej jakości skrawki za pomocą pipety transferowej (zaleca się używanie skrawków tkanki, które znajdują się blisko robaka) i wrzuć je do wstępnie zbalansowanej wkładki do hodowli komórkowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Umieść plastry móżdżku na wkładce do hodowli komórkowej za pomocą mikrosondy, a następnie ostrożnie usuń nadmiar roztworu glukozy HBSS + 5 mg/ml za pomocą pipety transferowej. 
	UWAGA: Na tym etapie tkanka jest niezwykle wrażliwa i podatna na uszkodzenia fizyczne. Maksymalna liczba wycinków móżdżku na wkładkę do hodowli komórkowej zależy od wieku zwierzęcia dawcy. W przypadku zwierzęcia w wieku P0–P4 można wyhodować 6–8 plastrów, a w przypadku zwierząt starszych niż P5 – 4–6 plastrów.</li>
	<li>Umieść naczynie hodowlane w inkubatorze, całkowicie zmieniając pożywkę co 2-3 dni.</li>
	<li>Aby ocenić przeżywalność komórek Purkinjego, plastry można pobrać już po 5 dniach in vitro. Dla innych celów można je utrzymywać w hodowli przez kilka tygodni (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F). 
	UWAGA: W przypadku eksperymentów z przeżywalnością komórek Purkinjego nie ma potrzeby odnawiania leczenia farmakologicznego przy zmianie pożywki do hodowli komórkowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F).</li>
</ol>
3. Immunofluorescencja
<ol>
	<li>Wyjąć płytkę 6-dołkową z inkubatora. Usuń pożywkę do hodowli komórkowych, umyj wkładkę do hodowli komórkowej 1x PBS i przymocuj plastry zimnym 4% roztworem paraformaldehydu przez 1 godzinę, z 1 ml pod wkładką do hodowli komórkowej i 500 μl na wierzchu wkładki do hodowli komórkowej.</li>
	<li>Umyj wkładki 4x 10 min za pomocą 1x PBS, z 1 ml pod spodem i 500 μl na górze wkładki, na wytrząsarce orbitalnej.</li>
	<li>Za pomocą pędzla przenieś plastry móżdżku z 1 wkładki do hodowli komórkowej do 1 dołka 24-dołkowego wstępnie wypełnionego 1x PBS, 0,25% Triton X-100 i 3% BSA (PBS-TB), 500 μL/basenik.</li>
	<li>Przepuszczać i blokować plastry przez inkubację w PBS-TB przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze PBS-TB, przez noc w temperaturze + 4 °C, na wytrząsarce orbitalnej, 200 μl/basenik.</li>
	<li>Następnego dnia wykonaj cztery płukania po 10 minut z 1x PBS, na wytrząsarce orbitalnej, 500 μL/studzienkę.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze PBS-TB, przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, na wytrząsarce orbitalnej i chronić przed światłem, 200 μl/basenik.</li>
	<li>Wykonaj cztery płukania po 10 minut z 1x PBS, na wytrząsarce orbitalnej, 500 μL/studzienkę.</li>
	<li>Przeciwbarwić plastry za pomocą Hoechst 33342, rozcieńczonego w 1x PBS (2 μg/ml), przez 10 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem, 500 μl/studzienkę.</li>
	<li>Zamontuj plastry móżdżku na szkiełku mikroskopowym za pomocą pipety transferowej. Pozostaw je do całkowitego wyschnięcia na powietrzu, chroniąc przed światłem. Ponownie nawilż je 1x PBS i nałóż szkiełko nakrywkowe pokryte kilkoma kroplami podłoża montażowego (~80 μL). Unikaj robienia bąbelków.</li>
	<li>Po utwardzeniu podłoża montażowego, skrawki móżdżku są gotowe do obrazowania.</li>
</ol>
4. Obrazowanie i kwantyfikacja przeżywalności komórek
<ol>
	<li>Włącz mikroskop i lasery zgodnie z instrukcjami producenta i/lub centrum obrazowania.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do akwizycji.</li>
	<li>Używając obiektywu 10X, zlokalizuj niezmienione wycinki móżdżku, które mają 9–10 zrazików (zwykle odcinki móżdżku blisko robaka).</li>
	<li>Aktywuj akwizycję z-stack. Zdefiniuj zakres stosu z, aby objąć wszystkie komórki Purkinjego obecne w wycinku móżdżku. Ustaw rozmiar kroku 2 μm i rozpocznij akwizycję. Zapisz uzyskany obraz w formacie producenta oprogramowania do akwizycji, aby zachować skojarzone metadane.</li>
	<li>Otwórz pobrany plik w ImageJ za pomocą wtyczki Bio-formats18.</li>
	<li>Przejdź do Image > Stacks > Z-project... (Rysunek 2A).</li>
	<li>Wybierz opcję Max Intensity (Maksymalna intensywność) z menu rozwijanego Projection type (Typ projekcji) i kliknij przycisk OK (Rysunek 2B).</li>
	<li>Zostanie wygenerowany spłaszczony obraz 2-W. Kliknij dwukrotnie narzędzie Wielopunktowe, aby wyświetlić okno narzędzia Wskazywanie. Usuń zaznaczenie opcji Oznacz punkty, aby ułatwić wizualizację zliczanych komórek. Następnie, kliknij bezpośrednio na somę komórki Purkinjego, aby rozpocząć liczenie (Rysunek 1E). Całkowita liczba zliczonych komórek zostanie wskazana w dolnej części okna narzędzia Wskazywanie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). 
	UWAGA: Zwykle można określić ilościowo co najmniej 3 nieuszkodzone sekcje zawierające 9–10 zrazików na wkładkę do hodowli komórkowej. Aby ocenić działanie neuroprotekcyjne środka farmakologicznego, należy przeprowadzić co najmniej 3 niezależne eksperymenty.</li>
</ol>

<ol><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li>
<li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li>
<li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).</li>
<li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+Confocal+Imaging+of+Migrating+Neurons+in+Organotypic+Slice+Culture+of+Embryonic+Mouse+Brain+Using+In+Utero+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55886(2017).</li>
<li>Daviaud, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+nigrostriatal+degeneration+in+organotypic+cultures%2C+a+new+ex+vivo+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 256, 10-22 (2014).</li>
<li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mifepristone+%28RU486%29+protects+Purkinje+cells+from+cell+death+in+organotypic+slice+cultures+of+postnatal+rat+and+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).</li>
<li>Labombarda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotection+by+steroids+after+neurotrauma+in+organotypic+spinal+cord+cultures%3A+a+key+role+for+progesterone+receptors+and+steroidal+modulators+of+GABA%28A%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors.</a> Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).</li>
<li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X7+receptor-sensitivity+of+astrocytes+and+neurons+in+the+substantia+gelatinosa+of+organotypic+spinal+cord+slices+of+the+mouse+depends+on+the+length+of+the+culture+period%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period.</a> Neuroscience. , 195-207 (2017).</li>
<li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li>
<li>Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+purkinje+cell+death+is+spatiotemporally+organized+in+the+developing+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum.</a> Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).</li>
<li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+Bcl-2+and+Caspase-3+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture%3A+an+in+vitro+model+to+study+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis.</a> European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).</li>
<li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+kinase+C+prevents+Purkinje+cell+death+but+does+not+affect+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration.</a> Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).</li>
<li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+mifepristone+involves+neuron+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization.</a> FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).</li>
<li>Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Jun+N-terminal+kinase+%28JNK%29+and+p38+play+different+roles+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture.</a> Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).</li>
<li>Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Is+Required+for+the+Neuroprotective+Effect+of+Mifepristone+on+Immature+Purkinje+Cells+in+Cerebellar+Slice+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metadata+matters%3A+access+to+image+data+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li>
<li>Uesaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+coculture+preparation+for+the+study+of+developmental+synapse+elimination+in+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain.</a> Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).</li>
<li>Falsig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+pathogenesis+is+faithfully+reproduced+in+cerebellar+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985(2012).</li>
<li>Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+loss+of+the+ability+of+Purkinje+cells+to+regenerate+their+axons+occurs+in+the+absence+of+myelin%3A+an+in+vitro+model+to+prevent+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination.</a> Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).</li>
<li>Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+calcium+waves+in+granule+cells+in+cerebellar+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).</li>
<li>Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+excitatory+amino+acids+of+Purkinje+cells%27+and+neurones+of+the+deep+nuclei+in+cerebellar+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures.</a> Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Hodowla plastrów móżdżku jest potężnym narzędziem do badania zaprogramowanej śmierci komórek Purkinjego podczas rozwoju pourodzeniowego. Technika ta może być wykorzystana do szybkiego badania przesiewowego cząsteczek kandydujących pod kątem ich potencjału neuroprotekcyjnego. Główną zaletą jest to, że konfiguracja jest prosta i bardzo opłacalna oraz wymaga jedynie niewielkiej inwestycji w sprzęt (wibratom może kosztować do 3 razy więcej niż rozdrabniacz tkanek). Co więcej, z jednego szczeniaka myszy można wygenerować od 1...

Modelowanie in vitro jest niezbędnym narzędziem w badaniach biomedycznych. Pozwala badaczom badać i ściśle kontrolować określone mechanizmy w ograniczonych typach komórek lub w izolowanych systemach/narządach. Organotypowa hodowla plastrów jest szeroko stosowaną techniką in vitro, zwłaszcza w dziedzinie neuronauki1. Metoda została po raz pierwszy opracowana przez Gähwilera, który hodował wycinki mózgu za pomocą techniki roller tube2, a następnie zmodyfikowana przez Yamamoto et al., którzy wprowadzili użycie mikroporowatej membrany do wykonywania kultur warstw korowych3. W porównaniu z pierwotnymi hodowlami komórkowymi, organotypowe hodowle warstwowe mają tę zaletę, że zachowują cytoarchitekturę tkanki, a także natywne połączenia komórka-komórka w płaszczyźnie przekroju tkanki.
Organotypowe plastry zostały wyhodowane z wielu części ośrodkowego układu nerwowego, takich jak hipokamp4, cortex5, striatum6, cerebellum4,7 i rdzeń kręgowy8,9, między innymi. Udowodniono, że są one potężnym narzędziem w badaniach nad odkrywaniem leków10. Wpływ cząsteczek neuroaktywnych można ocenić na wiele sposobów: przeżycie i neurodegenerację za pomocą testów immunobarwienia i biochemii, tworzenie obwodów neuronalnych lub zakłócenia za pomocą elektrofizjologii i obrazowania na żywo.
Celem tej pracy jest opisanie prostej metody przeprowadzania organotypowej hodowli plastrów móżdżku, która jest znana jako odpowiedni model do naśladowania rozwoju móżdżku in vitro. W szczególności skupiliśmy się na badaniu śmierci rozwojowej komórek Purkinjego. In vivo komórki Purkinjego ulegają apoptozie w pierwszym tygodniu po urodzeniu, osiągając szczyt w 3 dniu po urodzeniu (P3)11. Ten sam wzorzec obserwuje się w kulturze warstw móżdżku, z neuronami Purkinjego umierającymi przez apoptozę, gdy móżdżek jest pobierany od zwierząt między P1 a P8, ze szczytem na P34,12. Wykorzystanie organotypowych kultur warstw móżdżku pozwoliło zidentyfikować kilka cząsteczek neuroprotekcyjnych7,13, a także zrozumieć część mechanizmów związanych z tą zaprogramowaną śmiercią komórki14,15,16. Tutaj opisujemy protokół oparty na badaniu Stoppini et al.17 w hipokampie i dostosowany do móżdżku przez Dusart i wsp.4 Obejmuje szybki rozbiór i siekanie poporodowej móżdżki; krojenie kultury na wkładkę do hodowli komórkowej zawierającą mikroporowatą błonę, z leczeniem neuroprotekcyjnem lub bez niego; i barwienie immunofluorescencyjne w celu oceny przeżycia neuronów.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 594 Przeciwciało wtórne przeciw mysim IgG osła</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>A21203</td><td></td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle (BME)</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>21010046</td><td></td></tr><tr><td>Komora bezpieczeństwa biologicznego Klasa II, typ A2</td><td>NuAire</td><td>NU-540-400</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Millipore</td><td>Sigma A2153</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel</td><td></td><td></td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>anty-Calbindin D-28K (CB-955)</td><td>Abcam</td><td>ab82812</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>NuAire</td><td>NU-5700</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Płaskie dno 6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, 22 x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze opatrunkowe, proste</td><td>Aparat Harvard</td><td>72-8949</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza o podwójnym ostrzu</td><td>Fisher Scientific</td><td>50949411</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 proof</td><td>Decon Labs, Inc</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do oczu, proste</td><td>Aparat Harvard</td><td>72-8428</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze drobnoziarniste</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-127</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 100X</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>25030149</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór glukozy</td><td>ThermoFisher</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>naukowy Hanks' Zrównoważony roztwór soli</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodzian</td><td>Fisher Scientific</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>Serum dla koni, inaktywowane termicznie, pochodzenie z Nowej Zelandii</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9914528</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosondy</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-850</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli komórkowych Millicell Millipore</td><td>Sigma</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Sterylne jednorazowe filtry o szybkim przepływie z membraną PES, 250 ml</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>168-0045</td><td></td></tr><tr><td>System konfokalnego mikroskopu laserowego Nikon A1R</td><td>Oprogramowanie</td> do obrazowania NIS-Elements firmy Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Acros Organics</td><td>41678-0010</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki operacyjne, prosty</td><td>Aparat Harvard</td><td>72-8403</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna Tancerka brzucha</td><td>IBI Scientific</td><td>BDRLS0003</td><td></td></tr><tr><td>Prism 8</td><td>Szkiełka mikroskopowe GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus</td> Naczynie do hodowli tkankowych <td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>, 60 mm z pierścieniem uchwytowym</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012921</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowych, 24 dołki</td><td>Falcon/Corning</td><td></td><td></td>353047</tr><tr><td>Pipety transferowe, sterylne</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>13-711-21</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

przeżywalność komórek purkiniego w organtypowych kulturach warstwowych móżdżku

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Organotypowa hodowla plastrów to potężny model in vitro, który naśladuje warunki in vivo bardziej niż zdysocjowane pierwotne hodowle komórkowe. Wiadomo, że we wczesnym rozwoju postnatalnym komórki Purkinjego móżdżku przechodzą przez wrażliwy okres, podczas którego przechodzą zaprogramowaną śmierć komórki. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprowadzania organotypowej hodowli móżdżku myszy w tym krytycznym czasie. Plastry są dalej znakowane w celu oceny przeżycia komórek Purkinjego i skuteczności leczenia neuroprotekcyjnego. Metoda ta może być niezwykle cenna w badaniach przesiewowych pod kątem nowych cząsteczek neuroaktywnych.

Jak pokazano na Rysunku 4, protokół ten pozwala na przygotowanie organotypowych hodowli plastrów móżdżku, w których przeżywalność komórek Purkinjego można ocenić po etapach immunofluorescencji i akwizycji obrazów. Komórki Purkinjego znakowano za pomocą kombinacji przeciwciał anty-Calbindin D-28K (rozcieńczenie 1/20) oraz Alexa594 anty-mysie (rozcieńczenie 1/30). Szycie obrazów (stitching) zostało wykonane automatycznie przez oprogramowanie mikroskopu (NIS-Elements) w celu uzyskania obrazu ca...

Organotypowe kultury plastrów są potężnym narzędziem do badania procesów neurorozwojowych lub degeneracyjnych/regeneracyjnych. Tutaj opisujemy protokół, który modeluje śmierć neurorozwojową komórek Purkinjego w hodowlach warstw móżdżku myszy. Metoda ta może przynieść korzyści w badaniach nad odkrywaniem leków neuroprotekcyjnych.

Przeżywalność komórek Purkiniego w organtypowych kulturach warstwowych móżdżku

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

Organotypowa kultura plastrów jest potężnym narzędziem do badania procesów neurorozwojowych i zwyrodnieniowych lub regeneracyjnych. Technika ta może być wykorzystana do szybkiego badania przesiewowego cząsteczek kandydujących pod kątem ich potencjału neuroprotekcyjnego. Metoda ta ściśle naśladuje warunki in vivo, w porównaniu ze zdysocjowanymi pierwotnymi hodowlami komórkowymi, ponieważ architektura zestawu tkanek i natywne połączenia komórka-komórka są zachowane w płaszczyznach sekcji.Tutaj pokazujemy badanie śmierci komórek Purkinjego w rozwijającym się móżdżku. Ale organotypowa hodowla plastrów jest równie odpowiednia do modelowania chorób neurodegeneracyjnych w prawie każdym regionie ośrodkowego układu nerwowego. Procedurę zademonstruje z Jennifer Rakotomamonjy Sean McDermott, technik z mojego laboratorium.Przed zebraniem wycinków móżdżku, w wysterylizowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego, należy wypełnić każdą studzienkę sześciodołkowej płytki hodowlanej jednym mililitrem przefiltrowanej próżniowo pożywki hodowlanej i dodać środek farmakologiczny będący przedmiotem zainteresowania do studzienek zabiegowych oraz równą objętość nośnika do studzienek kontrolnych. Za pomocą

purkinje-cell-survival-in-organotypic-cerebellar-slice-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejsza metoda opisuje generowanie organotypowych kultur móżdżku oraz wpływ określonych bodźców apoptotycznych na żywotność różnych typów komórek móżdżku.

Organotypowe hodowle móżdżku: wyzwania apoptotyczne i ich detekcja

Przedstawiamy protokół umożliwiający obrazowanie i ilościową ocenę morfologii drzewa dendrytycznego pojedynczych komórek Purkinjego hodowanych w organotypowych kulturach skrawków móżdżku. Protokół ten ma na celu wspieranie badań nad mechanizmami rozwoju dendrytów komórek Purkinjego.

Analiza morfologii dendrytów komórek Purkinjego w organotypowych kulturach skrawków

Ten film ilustruje technikę uzyskiwania organotypowych wycinków móżdżku z mózgu szczeniaka myszy i hodowania tych wycinków w pożywkach uzupełnionych składnikami odżywczymi i czynnikami wzrostu, aby naśladować rozwój móżdżku in vitro. Dodatkowo określone wycinki móżdżku są traktowane badanym związkiem, a zdolność neuroprotekcyjna związku jest analizowana przy użyciu techniki barwienia immunofluorescencyjnego.

Analiza przeżywalności komórek Purkiniego w organotypowych kulturach warstwowych móżdżku

Opisano technikę badania komórek NG2 i oligodendrocytów za pomocą systemu hodowli plasterkowej w przodomózgowiu i móżdżku.  Metoda ta pozwala na badanie dynamiki proliferacji i różnicowania komórek w obrębie linii oligodendrocytów, w której można łatwo manipulować środowiskiem zewnątrzkomórkowym przy zachowaniu cytoarchitektury tkanek.

Organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji

Tutaj opisujemy technikę badania neurogenezy poporodowej hipokampa za pomocą techniki organotypowej hodowli plastrów. Metoda ta pozwala na manipulację neurogenezą dorosłych w warunkach in vitro i pozwala na bezpośrednie zastosowanie środków farmakologicznych do hodowanego hipokampa.

Organotypowe kultury warstwowe do badań neurogenezy poporodowej

Zewnętrzna warstwa granulatu móżdżku jest miejscem największego wzmocnienia tranzytu w rozwijającym się mózgu. W tym miejscu przedstawiamy protokół ukierunkowany na modyfikację genetyczną tej warstwy w szczycie proliferacji przy użyciu elektroporacji ex vivo i hodowli plastrów móżdżku z embrionalnych zarodków piskląt dnia 14.

Ex vivo Hodowla wycinków móżdżku piskląt i przestrzennie ukierunkowana elektroporacja prekursorów komórek ziarnistych

Tutaj prezentujemy metodę przygotowania organotypowych kultur warstwowych z barwienia móżdżku myszy i osłonki mielinowej za pomocą immunohistochemii, odpowiednią do badania mechanizmów mielinizacji i remielinizacji w ośrodkowym układzie nerwowym.

Przygotowanie i barwienie immunologiczne mielinizujących organotypowych kultur warstwowych móżdżku

Przeprowadzanie eksperymentów in vitro w celu jak najdokładniejszego odzwierciedlenia warunków in vivo nie jest łatwym zadaniem. Zastosowanie pierwotnych kultur komórkowych jest ważnym krokiem w kierunku zrozumienia biologii komórki w całym organizmie. Dostarczony protokół określa, jak skutecznie hodować i hodować embrionalne neurony móżdżku myszy.

Pierwotna hodowla neuronów wyizolowanych z embrionalnego móżdżku myszy

Ten protokół opisuje dynamiczny system hodowli do produkcji kontrolowanych agregatów ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i dalszego stymulowania różnicowania w organoidach móżdżku w chemicznie zdefiniowanych warunkach i bez karmienia za pomocą jednorazowego bioreaktora.

Skalowalne generowanie dojrzałych organoidów móżdżku z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i charakterystyka za pomocą barwienia immunologicznego

W tym artykule przedstawiamy powtarzalną metodę generowania i utrzymywania długoterminowych wycinków organotypowych rdzenia kręgowego przeszczepionych z nerwowymi komórkami macierzystymi jako model ex vivo do testowania komórkowych terapii zastępczych.

Długoterminowa organotypowa hodowla warstw rdzenia kręgowego myszy jako platforma do walidacji przeszczepu komórek w urazie rdzenia kręgowego

Komórki Purkinjego móżdżku (PC) są szczególnie wrażliwe na braki w odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Przedstawiono protokół do wizualnej oceny dynamiki odpowiedzi PC na uszkodzenie DNA, która polega na barwieniu łańcuchów poli(ADP-rybozy) związanych z białkami w kulturach organotypowych móżdżku.

Wizualizacja odpowiedzi na uszkodzenia DNA w komórkach Purkiniego za pomocą kultur organotypowych móżdżku

Poznaj metodę hodowli organotypowych plasterków móżdżku myszy do badania śmierci komórek Purkiniego i testowania związków neuroprotekcyjnych w warunkach zbliżonych do in vivo.

Przeżywalność komórek Purkiniego w organtypowych kulturach warstwowych móżdżku

Przeglądaj więcej filmów