Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans
29 października 2019
Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.
Embriogeneza C.elegans trwa około 13 godzin i jest zwykle monitorowana poprzez filmowanie jednego zarodka na raz. Nasz protokół pozwala jednak na jednoczesne obrazowanie poklatkowe 3D od 80 do 100 zarodków. Możliwość zbierania danych dla dużej liczby rozwijających się zarodków C. elegans otwiera nowy zakres eksperymentów, w tym ilościową analizę zdarzeń rozwojowych i badania przesiewowe na dużą skalę.
Protokół ten można łatwo dostosować do uchwycenia różnych procesów rozwojowych lub do obrazowania zarodków wyrażających dowolną kombinację markerów w tkankach będących przedmiotem zainteresowania. Prawidłowe rozproszenie zarodków w studzienkach jest wyzwaniem. Powinny znajdować się blisko siebie, aby umożliwić chwytanie wielu zarodków na pole bez zbijania się w różnych płaszczyznach Z.
Zalecamy skorzystanie z usług dwóch badaczy do równoległej sekcji, na lodzie i blokowania nieużywanych studni. Pokażemy również kilka przydatnych sztuczek, jak szybko ustawić dobrze zainscenizowaną płytkę 384-dołkową. Zacznij od uszczelnienia 384-dołkowej płytki ze szklanym dnem folią samoprzylepną PCR, aby zamaskować niewykorzystane studzienki.
Użyj brzytwy lub skalpela, aby odciąć folię, aby odsłonić podzbiór studzienek do użycia. Dodaj 70 mikrolitrów świeżo przygotowanego TMHC do każdej studzienki i trzymaj talerz na lodzie. Wyklucz dwa zewnętrzne rzędy blachy, aby zapobiec efektom krawędzi.
W celu szybkiego przygotowania próbki zaleca się przeprowadzenie sekcji obok siebie przez dwóch badaczy. Gdy cały roztwór zostanie pokryty, użyj cienkiej pęsety i mikroskopu preparacyjnego, aby przenieść około 10 ciężarnych dorosłych do 150 mikrolitrów lodowatego roztworu TMHC w jednym szkiełku depresyjnym na warunek. Za pomocą pęsety i skalpela rozetnij robaki, aby uwolnić zarodki i załaduj wyciągniętą pipetę kapilarną do aspiratora doustnego.
Za pomocą pipety doustnej przenieś wszystkie zarodki w stadium od dwóch do ośmiu komórek do pojedynczych dołków przygotowanej płytki i zbadaj płytkę, aby potwierdzić, że w żadnej ze studzienek nie ma żadnych agregatów. Po zebraniu wszystkich zarodków należy osadzić próbki przez odwirowanie i użyć chusteczki nasączonej etanolem, aby usunąć wszelkie pozostałości z dna płytki. Umieść płytkę w uchwycie płytki mikroskopu konfokalnego wyposażonego w środowisko o kontrolowanej temperaturze i użyj obiektywu 10X, aby wykonać wstępne skanowanie każdej studzienki w celu zidentyfikowania pól z odpowiednimi zarodkami.
Pod koniec skanowania przełącz się na obiektyw 60X, dostosuj płaszczyznę ogniskowej w każdym punkcie, aby zobrazować od jednego do czterech pól na studzienkę i wykonuj 18 przekrojów Z w odstępach dwóch mikrometrów co 20 minut przez 10 godzin. Po uzyskaniu wszystkich obrazów należy wykonać skan w całym jasnym polu o niskiej jasności, około 20 do 24 godzin po rozpoczęciu nocnego obrazowania, aby ocenić śmiertelność zarodka. Aby uzyskać automatyczne przycinanie za pomocą pliku wykonywalnego embryoCropUI, najpierw pobierz program z Zenodo i pliki testowe.
zip, aby określić, czy program działa poprawnie na platformie. Po pobraniu rozpakuj i przejdź do pliku wykonywalnego embryoCropUI i kliknij dwukrotnie, aby uruchomić program. Wybierz opcję Otwórz, aby załadować pierwsze określone pole widzenia 4D do przycięcia.
Podczas kadrowania serii TIFF z wieloma wymiarami należy załadować do folderu tylko pierwszy obraz z serii. Po załadowaniu wszystkich obrazów określ parametry obrazowania, wybierz korekcję odejmowania i tłumienia tła, a następnie ustaw kolejność zbierania obrazów i liczbę mikronów na piksel. Następnie wybierz uruchom, nowy podfolder oznaczony jako przycięcie zostanie utworzony w tej samej ścieżce co nieprzycięty folder, a przycięte wersje zostaną zapisane w tej lokalizacji.
Aby uzyskać wizualizację, pobierz otwartą i połączoną wtyczkę MSV2 ImageJ oraz instrukcje graficznego interfejsu użytkownika Zenodorepov2. docx od Zenodo i otwórz wtyczkę w IMageJ. Zlokalizuj linie trzecią i czwartą i wprowadź lokalizację, w której foldery obrazów będą przechowywane po przycięciu.
Nazwy folderów z obrazami warunków, które mają być przetworzone, oraz unikalny alfanumeryczny identyfikator dla każdego nocnego eksperymentu. Po wprowadzeniu wszystkich informacji kliknij przycisk Uruchom. Pojawi się okno, w którym pojawi się monit o przejście do zewnętrznego folderu zawierającego foldery z przyciętymi obrazami.
Po wybraniu pojawi się kolejne okno, które pozwoli na określenie parametrów obrazowania. Kliknij w porządku. Rozpocznie się składanie pliku kompozytowego.
Po wygenerowaniu kompozytu przejrzyj pliki, które pozostały otwarte. Zobrazowane w połączeniu z niestandardowymi szczepami reporterowymi zapewniają informacyjne odczyty dla większości głównych wydarzeń rozwojowych. W tym specyfikacja siarczanów, interkalacja grzbietowa, zamknięcie naskórka, wydłużenie i neurogeneza.
24 godziny po wstrzyknięciu to optymalny czas na obrazowanie. Od tego czasu wyczerpanie białek matczynych i hamowanie ekspresji genów zygotycznych są skuteczne, dając wyraźne, wysoce powtarzalne fenotypy sygnaturowe w szerokim spektrum genów zaangażowanych w specyfikację siarczanów i morfogenezę. Ważne jest, aby uzbroić się w cierpliwość na etapie sekcji i selekcji zarodków.
Minimalizacja zbryleń i wybór odpowiednich płaszczyzn ogniskowych są również niezbędne do zapewnienia wysokiej jakości danych. Nasz protokół może być wykonywany z różnymi szczepami markerów fluorescencyjnych oraz w połączeniu z RNAi lub mutantami. Nasze narzędzia do przetwarzania pozwalają na usprawnioną, zautomatyzowaną lub ręczną analizę danych.
Korzystając z opisanych tutaj szczepów, metod i narzędzi, nasza grupa przeprowadziła badanie przesiewowe o wysokiej zawartości RNAi, ukierunkowane na około 2000 genów wymaganych do rozwoju embrionalnego. Metody o niskiej przepustowości były niezbędne dla tego projektu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca opisuje protokół o półwysokiej przepustowości, który umożliwia jednoczesną rejestrację obrazu w czasie (time-lapse) w 3D rozwoju embrionalnego u 80–100 zarodków C. elegans w jednym, całonocnym eksperymencie. Możliwość gromadzenia danych dla dużej liczby rozwijających się zarodków C. elegans otwiera nowy zakres eksperymentów, w tym analizę ilościową zdarzeń rozwojowych.
Kluczowe Elementy Badań
Dziedzina Nauki
- Neurobiologia
- Biologia Rozwojowa
- Techniki Obrazowania
Wprowadzenie
- Rozwój embrionalny C. elegans trwa około 13 godzin.
- Tradycyjne metody obejmują filmowanie pojedynczego zarodka naraz.
- Jednoczesne obrazowanie pozwala na bardziej kompleksowe gromadzenie danych.
- Można wykorzystywać niestandardowe szczepy reporterowe do szczegółowego monitoringu.
Cel Badań
- Opracowanie protokołu do obrazowania w wysokiej przepustowości zarodków C. elegans.
- Umożliwienie analizy ilościowej procesów rozwojowych.
- Ułatwienie przeprowadzania badań przesiewowych rozwoju embrionalnego na dużą skalę.
Wykorzystane Metody
- Protokół obrazowania w czasie (time-lapse) w 3D o półwysokiej przepustowości.
- Narzędzia do przetwarzania obrazu i wizualizacji do analizy danych.
- Niestandardowe szczepy reporterowe do monitorowania specyficznych markerów rozwojowych.
- Dostosowanie protokołu do różnych procesów rozwojowych.
Główne Wyniki
- Pomyślne jednoczesne obrazowanie 80–100 zarodków.
- Usprawniona analiza danych dzięki dedykowanym narzędziom.
- Wzmocniona możliwość szczegółowego monitorowania rozwoju embrionalnego.
- Potencjał adaptacji do różnych potrzeb eksperymentalnych.
Wnioski
- Protokół znacząco zwiększa efektywność badań nad rozwojem embrionalnym.
- Otwiera nowe ścieżki dla analizy ilościowej w biologii rozwoju.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować różne procesy rozwojowe i kombinacje markerów.
Najczęściej Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Semi-high-throughput 3D imaging of C. elegans embryogenesis enables quantitative, multiplexed analysis of developmental phenotypes across multiple genetic or experimental conditions. This capability accelerates early discovery by supporting large-scale, parallelized hypothesis testing and mechanistic de-risking in developmental biology. The approach enhances predictive confidence and portfolio triage for gene function and pathway interrogation in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of gene function during embryonic development.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing phenotypic outcomes across diverse genetic perturbations.
- Facilitates high-content screening for target validation and pathway mapping.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiplexed biological systems for downstream screening workflows.
- Standardizes imaging and data processing for reproducible, quantitative outputs.
- Enables scalable, parallel evaluation of gene knockdowns or compound effects.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phenotypic readouts with disease-relevant developmental processes when using informative reporter strains.
- Provides continuity from genetic discovery to preclinical model validation.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on robust, quantitative phenotyping.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging and analysis workflow bridges early discovery, screening, and preclinical validation by enabling multiplexed, quantitative phenotyping in a model organism system.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through high-content, parallelized imaging.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for large-scale genetic or compound screens.
- Analytics: Provides automated cropping, orientation, and visualization tools for standardized data analysis.
- Translational Research: Connects developmental phenotypes to disease-relevant biological processes when using appropriate markers.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis platform adaptable to diverse experimental needs and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in developmental gene function studies.
- Operational Value: Streamlines data acquisition, processing, and visualization for high-throughput experiments.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by supporting robust, scalable phenotypic screening.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets and pathways for further development.
Implementation Considerations
- Requires microscopy infrastructure with point visiting and temperature control capabilities.
- Demands expertise in embryo handling, imaging, and data analysis workflows.
- Benefits from cross-team standardization of imaging parameters and data processing protocols.
- Adaptable to various fluorescent marker strains and genetic backgrounds.
- Dependent on careful sample preparation to avoid embryo clumping and ensure data quality.
