Name: Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Poznaj metodę obrazowania półwysokoprzepustowego do analizy embriogenezy C. elegans. Protokół umożliwia jednoczesne 3D time-lapse 80–100 embrionów, co wspiera ilościowe badania biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.D.O. był wspierany przez sponsorowaną przez National Institute of General Medical Sciences nagrodę University of California San Diego Institutional Research and Academic Career Development Award (NIH/IRACDA K12 GM068524). A.D. i K.O. byli wspierani przez Ludwig Institute for Cancer Research, który również zapewnił im fundusze na badania wykorzystane do wsparcia tej pracy. Jesteśmy wdzięczni Andrew Chisholmowi za jego rady we wczesnych fazach tego projektu, Ronaldowi Biggsowi za wkład w ten projekt po początkowej fazie rozwoju metody, a także Dave'owi Jenkinsowi i Andy'emu Shiau za wsparcie i dostęp do systemu obrazowania o wysokiej zawartości grupy Small Molecule Discovery.

<ol><li>Armenti, S. T., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adherens+junctions+in+C.+elegans+embryonic+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sub-Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis.</a> Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).</li>
<li>Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+epidermis+as+a+model+skin.+I%3A+development%2C+patterning%2C+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).</li>
<li>Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-catenin-dependent+Wnt+signaling+in+C.+elegans%3A+teaching+an+old+dog+a+new+trick%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+In+Biology%22%5BJournal%5D)">beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948(2012).</li>
<li>Lamkin, E. R., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+morphogenesis+of+neurons+and+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Coordinated morphogenesis of neurons and glia.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).</li>
<li>Loveless, T., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin+complexity%3A+recent+insights+into+cadherin+superfamily+function+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).</li>
<li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li>
<li>Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multipotency-to-commitment+transition+in+Caenorhabditis+elegans-implications+for+reprogramming+from+cells+to+organs%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs.</a> FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).</li>
<li>Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+Embryonic+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">elegans Embryonic Morphogenesis.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).</li>
<li>Wang, J. T., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Germ cell specification.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content+imaging+approach+to+profile+C.+elegans+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development.</a> Development. 146 (7), (2019).</li>
<li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+S+%22Dryad+Digital+Repository%22">Dryad Digital Repository</a>. , (2019).</li>
<li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+S+%22Zenodo%22">Zenodo</a>. , (2018).</li>
<li>Khaliullin, R. N. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/renatkh/embryo_crop">https://github.com/renatkh/embryo_crop</a> (2018).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Epidermal morphogenesis.</a> WormBook. , 1-22 (2005).</li>
<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).</li>
<li>Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+chromatin+organization+during+foregut+development+mediated+by+the+organ+selector+gene+PHA-4%2FFoxA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA.</a> PLoS Genetics. 6 (8), (2010).</li>
<li>Zhong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+binding+sites+defines+distinct+functions+for+Caenorhabditis+elegans+PHA-4%2FFOXA+in+development+and+environmental+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response.</a> PLoS Genetics. 6 (2), 1000848(2010).</li>
<li>Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+genes+identified+in+a+large-scale+RNAi+screen+using+the+RNAi-hypersensitive+Caenorhabditis+elegans+strain+nre-1%28hd20%29+lin-15b%28hd126%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).</li>
<li>Canny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+approach+to+edge+detection%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+transactions+on+pattern+analysis+and+machine+intelligence%22%5BJournal%5D)">A computational approach to edge detection.</a> IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).</li>
<li>Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+milestones+punctuate+gene+expression+in+the+Caenorhabditis+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).</li>
<li>Packer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage-resolved+molecular+atlas+of+C.+elegans+embryogenesis+at+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution.</a> BioRxiv. , (2019).</li>
<li>Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOegema%2C+K+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-40 (2006).</li>
<li>Insley, P., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+C.+elegans+embryo+alignments+reveal+brain+neuropil+position+invariance+despite+lax+cell+body+placement%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement.</a> PLoS One. 13 (3), 0194861(2018).</li>
</ol>

Praca ta opisuje zestaw narzędzi i metod, które zostały opracowane, aby umożliwić wysiłki na większą skalę w celu profilowania funkcji genów w rozwoju embrionalnym u C. elegans. Nasza metoda półwysokoprzepustowa umożliwia obrazowanie poklatkowe 3D rozwoju embrionalnego w rozdzielczości 20 minut dla 80–100 zarodków w jednym eksperymencie. Chociaż protokół ten można dostosować do stosowania z dowolnym pożądanym szczepem markerowym (szczepami), niniejsza praca pokazuje potencjał metody wykorzystującej dwa niestanda...

Zarodek C. elegans jest ważnym systemem modelowym dla mechanistycznej biologii komórki i analizy specyfikacji losu komórki oraz wydarzeń morfogenetycznych napędzających rozwój embrionalny1,2,3,4,5,6,7,8,9. Do tej pory wiele cech charakterystyki zarówno zdarzeń na poziomie komórkowym, jak i specyfikacji losu komórki w zarodku osiągnięto przy użyciu eksperymentów obrazowania w stosunkowo wysokiej rozdzielczości czasowej pojedynczo (tj. akwizycji co 10-100 s) zarodków wykazujących ekspresję markerów fluorescencyjnych. Chociaż podejście to dobrze nadaje się do zdarzeń rzędu sekund do dziesiątek minut, staje się technicznie ograniczające dla charakteryzowania dłuższych procesów, rzędu godzin do dni. Rozwój zarodka od pierwszego rozszczepienia do końca wydłużenia trwa około 10 godzin. W tej skali czasowej metody o niskiej przepustowości, które pozwoliłyby na jednoczesne obrazowanie w niższej rozdzielczości czasowej (tj. akwizycja w odstępach czasowych 5–20 minut) większych kohort zarodków z różnych warunków, otworzyłyby nowy zakres eksperymentów; Na przykład umożliwienie systematycznych badań przesiewowych na dużą skalę i analizy wystarczającej liczby zarodków w celu porównania konsekwencji zaburzeń molekularnych.
Tutaj opisujemy metodę monitorowania embriogenezy C. elegans o średniej przepustowości, która umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D rozwoju 80-100 zarodków, z maksymalnie 14 różnych stanów, w ciągu jednej nocy. Protokół jest prosty do wdrożenia i może być przeprowadzony przez każde laboratorium z dostępem do mikroskopu z możliwością wizyty punktowej. Główne kroki w tym protokole są opisane w Rysunek 1. Krótko mówiąc, zarodki są preparowane od ciężarnych dorosłych osobników wykazujących ekspresję markerów fluorescencyjnych będących przedmiotem zainteresowania i przenoszone są młode zarodki (stadium 2-8 komórek) do studzienek na płytce 384-dołkowej w celu obrazowania. W tym formacie, stosunkowo mały rozmiar studzienki kieruje zarodki do wąskiego obszaru, co ułatwia identyfikację pól zawierających wiele zarodków do obrazowania poklatkowego. Aby utrzymać z grubsza synchroniczny rozwój w całej kohorcie zarodków, sekcje przeprowadza się w schłodzonych pożywkach, a płytka jest utrzymywana na lodzie, co zapobiega znacznemu rozwojowi w godzinnym oknie czasowym sekcji. Płytka jest przenoszona do mikroskopu, a zarodki są filmowane w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze przez noc, w odstępach 20-minutowych, przy użyciu soczewki 1,35 NA z 60-krotnym zanurzeniem w olejku, aby zebrać pełny zakres z w krokach co 2 μm. Pięćdziesiąt pól, z których każde zawiera od 1 do 5 zarodków, jest obrazowanych w ciągu jednej nocy. W zależności od pożądanego eksperymentu, rozdzielczość czasowa może być zwiększona (na przykład obrazowanie w odstępach 5–10 minut) poprzez proporcjonalne zmniejszenie liczby obrazowanych pól.
Dzięki temu protokołowi, nawet pojedynczy nocny bieg generuje znaczną ilość danych (80-100 embrionów rozrzuconych na 50 polach), a większe eksperymenty mogą szybko stać się niemożliwe do przeprowadzenia w odniesieniu do analizy danych. Aby ułatwić przetwarzanie, wizualizację i usprawnić analizę tych danych, zbudowano program do wycinania i orientowania zarodków oraz wykonywania etapów wstępnego przetwarzania (opcjonalnie), a także makro ImageJ, które kompiluje dane w celu uproszczenia przeglądania. Programy te mogą być używane do przetwarzania obrazów zebranych przy użyciu konwencjonalnych metod, ponieważ są niezależne od metody obrazowania i wymagają tylko jednej płaszczyzny jasnego pola. Pierwszy program pobiera pole 4D zawierające wiele zarodków (opcja GUI lub kod źródłowy embryoCrop.py) lub wiele pól 4D zawierających wiele zarodków (screenCrop.py), ściśle przycina zarodki i orientuje je w konfiguracji przednio-tylnej. Programy te dają również użytkownikom możliwość wykonywania odejmowania tła, korekcji dryfu i korekcji tłumienia. Powstałe pliki są jednolicie wstępnie przetworzonymi, ciasno przyciętymi stosami tiff dla każdego zarodka, które można dostosować do automatycznej analizy obrazu. Aby ułatwić przeglądanie wszystkich zarodków dla każdego schorzenia, napisano makro ImageJ (OpenandCombine_embsV2.ijm), które gromadzi wszystkie zarodki z danego stanu w jeden stos TIFF i układa obrazy w jasnym polu i nakładki kolorów projekcji o maksymalnej intensywności (RGB), obok siebie, dla każdego zarodka. Metody te zostały zweryfikowane poprzez wykorzystanie ich do scharakteryzowania rozwoju embrionalnego po wyeliminowaniu 40 wcześniej opisanych genów rozwojowych w parze specjalnie zbudowanych szczepów eksprymujących markery fluorescencyjne zoptymalizowane pod kątem wizualizacji kluczowych aspektów specyfikacji listka zarodkowego i morfogenezy10,11. Protokół obrazowania zarodków o wysokiej przepustowości i narzędzia do przetwarzania obrazów umożliwią eksperymenty z większą liczbą próbek i zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe mające na celu zrozumienie procesów rozwojowych. Ponadto szczepy te zapewnią również skuteczny sposób badania wpływu zaburzeń molekularnych na embriogenezę.

<table><tbody><tr><td>Zespół rurki aspiratora</td><td>Drummond Scientific</td><td>2-000-000</td><td></td></tr><tr><td>Skalibrowana pipeta (25 ml)</td><td>Drummond Scientific</td><td>2-000-025</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Cell Voyager</td><td>Yokogawa Electric Corp</td> w zestawie z rurką stożkową <td>CV1000</td><td></td></tr><tr><td>(15 ml)</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0501</td><td></td></tr><tr><td>CV1000 Mikroskop</td><td>Yokogawa Electric Corp</td><td>CV1000</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko depresyjne (3-dołkowe)</td><td>Erie Scientific</td><td>1520-006</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Nikon</td><td>SMZ-645</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Eppendorf 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 07336</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/FIJI</td><td>Open Source</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td></td></tr><tr><td>M9 Buffer</td><td>Lab przygotowany</td><td>https://openwetware.org/wiki/M9_salts</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek (1,5 ml)</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Microseal F-foil Seal</td><td>Bio-Rad</td><td>MSF1001</td><td></td></tr><tr><td>NGM</td><td>Plates Lab Przygotowane</td><td>http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214</td><td></td></tr><tr><td>skalpela #15</td><td>Bard Parker</td><td>REF 371615</td><td></td></tr><tr><td>Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Szklane dno</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781855</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tetramizolu</td><td>Sigma Aldirch</td><td>T1512-10G</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta, Dumont #3</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>0109-3-PO</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw U-PlanApo (10 razy; 0,4 NA)</td><td>Olympus</td><td>1-U2B823</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw U-PlanApo (60 i razy; 1,35 NA)</td><td>Olympus</td><td>1-U2B832</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego c. elegans

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans to najlepszy system do systematycznej analizy specyfikacji losów komórek i zdarzeń morfogenetycznych podczas rozwoju embrionalnego. Jednym z wyzwań jest to, że embriogeneza rozwija się dynamicznie w okresie około 13 godzin; Ta półdniowa skala czasowa ograniczyła zakres eksperymentów, ograniczając liczbę embrionów, które można zobrazować. W tym miejscu opisujemy protokół o niskiej przepustowości, który pozwala na jednoczesne obrazowanie poklatkowe 3D rozwoju 80-100 zarodków w umiarkowanej rozdzielczości czasowej, z maksymalnie 14 różnych stanów, w jednym ciągu nocy. Protokół jest prosty i może być wdrożony przez każde laboratorium z dostępem do mikroskopu z możliwością odwiedzin punktowych. Użyteczność tego protokołu została zademonstrowana poprzez wykorzystanie go do zobrazowania dwóch niestandardowych szczepów eksprymujących markery fluorescencyjne zoptymalizowane pod kątem wizualizacji kluczowych aspektów specyfikacji listka zarodkowego i morfogenezy. Aby przeanalizować dane, zbudowano niestandardowy program, który przycina poszczególne zarodki z szerszego pola widzenia we wszystkich kanałach, krokach z i punktach czasowych oraz zapisuje sekwencje dla każdego zarodka w osobnym stosie tiff. Program, który zawiera przyjazny dla użytkownika graficzny interfejs użytkownika (GUI), usprawnia przetwarzanie danych poprzez izolację, wstępne przetwarzanie i jednolitą orientację poszczególnych zarodków w ramach przygotowań do wizualizacji lub automatycznej analizy. Dostarczane jest również makro ImageJ, które kompiluje indywidualne dane zarodków w wielopanelowy plik, który wyświetla projekcję fluorescencji o maksymalnej intensywności i obrazy jasnego pola dla każdego zarodka w każdym punkcie czasowym. Protokoły i narzędzia opisane w niniejszym dokumencie zostały zwalidowane poprzez wykorzystanie ich do scharakteryzowania rozwoju embrionalnego po wyeliminowaniu 40 wcześniej opisanych genów rozwojowych; Analiza ta uwidoczniła wcześniej opisane fenotypy rozwojowe i ujawniła nowe. Podsumowując, praca ta szczegółowo opisuje metodę obrazowania o niskiej przepustowości w połączeniu z programem do przycinania i narzędziem do wizualizacji ImageJ, które w połączeniu ze szczepami wykazującymi ekspresję informacyjnych markerów fluorescencyjnych znacznie przyspiesza eksperymenty mające na celu analizę rozwoju embrionalnego.

Znaczącym wyzwaniem w charakteryzacji wpływu zaburzeń molekularnych na rozwój embrionalny C. elegans jest fakt, że embriony potrzebują około 10 h, aby przejść od pierwszego podziału do końca elongacji w temperaturze 20°C16. Metoda półwysokoprzepustowa, w której można jednocześnie obrazować duże grupy embrionów, jest przydatna w przypadku zdarzeń o takiej skali czasowej, ponieważ umożliwia równoległe obrazowanie wielu warunków przy zachowaniu wystarczającej liczebności próby dla każdego z ...

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Embriogeneza C.elegans trwa około 13 godzin i jest zwykle monitorowana poprzez filmowanie jednego zarodka na raz. Nasz protokół pozwala jednak na jednoczesne obrazowanie poklatkowe 3D od 80 do 100 zarodków. Możliwość zbierania danych dla dużej liczby rozwijających się zarodków C. elegans otwiera nowy zakres eksperymentów, w tym ilościową analizę zdarzeń rozwojowych i badania przesiewowe na dużą skalę.Protokół ten można łatwo dostosować do uchwycenia różnych procesów rozwojowych lub do obrazowania zarodków wyrażających dowolną kombinację markerów w tkankach będących przedmiotem zainteresowania. Prawidłowe rozproszenie zarodków w studzienkach jest wyzwaniem. Powinny znajdować się blisko siebie, aby umożliwić chwytanie wielu zarodków na pole bez zbijania się w różnych płaszczyznach Z.Zalecamy skorzystanie z usług dwóch badaczy do równoległej sekcji, na lodzie i blokowania nieużywanych studni. Pokażemy również kilka przydatnych sztuczek, jak szybko ustawić dobrze zainscenizowaną płytkę 384-dołkową. Zacznij od uszczelnienia 384-dołkowej płytki ze szklanym dnem folią samoprzylepną PCR, aby zamaskować niewykorzystane studzienki.Użyj brzytwy lub skalpela, aby odciąć folię, aby odsłonić pod

a-semi-high-throughput-imaging-method-data-visualization-toolkit-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Niniejszy artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych etapów embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Tutaj pokazano, jak śledzić i określać ilościowo procesy rozwojowe u C. elegans. Przedstawione metody oparte są na narzędziach open-source, które można łatwo wdrożyć. Pokazano, jak rekonstruować modele 3D w kształcie komórki, jak ręcznie śledzić struktury subkomórkowe i jak analizować korowy przepływ skurczowy.

Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i montażu zarodków Caenorhabditis elegans, rejestrowania rozwoju pod mikroskopem 4D i śledzenia linii komórkowej.

Mikroskopia 4D: odkrywanie rozwoju embrionalnego Caenorhabditis elegans za pomocą mikroskopii Nomarskiego

Ten protokół opisuje obrazowanie poklatkowe C. elegans oparte na mikroprzepływach w całym rozwoju postembrionalnym.

Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

Tutaj przedstawiamy instrukcje dotyczące skutecznego wykorzystania SegElegans, systemu głębokiego uczenia, który opracowaliśmy do automatycznego segmentowania pojedynczych robaków na mikroskopii szerokopolowej, do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu do analizy obrazów, takiego jak ImageJ. Oferujemy możliwości korzystania z systemu zarówno online, jak i offline.

Automatyczna analiza obrazów fluorescencyjnych C. elegans z użyciem SegElegans

Organizacja komórkowa kości twarzoczaszki od dawna była przedmiotem hipotezy, ale nigdy nie została bezpośrednio zwizualizowana. Wielospektralne znakowanie komórek i obrazowanie na żywo in vivo umożliwiają wizualizację dynamicznego zachowania komórek w dolnej szczęce danio pręgowanego. Tutaj szczegółowo opisujemy protokół manipulowania transgenicznymi rybami Zebrabow i bezpośrednio obserwujemy interkalację komórek i zmiany morfologiczne chondrocytów w chrząstce Meckla.

Wizualizacja interkalacji chondrocytów i proliferacji kierunkowej za pomocą analizy komórek klonalnych Zebrabow w embrionalnej chrząstce Meckla

Technologia mikromacierzy umożliwia ilościowe pomiary i profilowanie ekspresji genów transkryptów na poziomie całego genomu. W związku z tym protokół ten zapewnia zoptymalizowaną procedurę techniczną w dwukolorowej, niestandardowej matrycy bydlęcej przy użyciu zarodków bydlęcych dnia 7, aby wykazać wykonalność użycia niewielkiej ilości całkowitego RNA.

Profilowanie transkryptomu zarodków bydlęcych wyprodukowanych in vivo przed implantacją przy użyciu dwukolorowej platformy mikromacierzy

Poznaj metodę obrazowania półwysokoprzepustowego do analizy embriogenezy C. elegans. Protokół umożliwia jednoczesne 3D time-lapse 80–100 embrionów, co wspiera ilościowe badania biologii rozwoju.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Przeglądaj więcej filmów