Name: Genotypowanie DNA mikrosatelitarnego i cytometria przepływowa Analizy ploidalne tkanek trzonowców bąblowcowych utrwalonych w formalinie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Poznaj protokoły genotypowania mikrosatelitarnego DNA i cytometrii przepływowej do diagnostyki trzonowców bąblowcowych z tkanek utrwalonych w formalinie. Metody te minimalizują zanieczyszczenie DNA matczynym i poprawiają dokładność wyników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Sophie Patrier i Marianne Parésy za udostępnienie oryginalnego protokołu cytometrii przepływowej, a także Promega i Qiagen za dostarczenie materiałów i odczynników. Prace te były wspierane przez Réseau Québécois en Reproduction i Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem (MOP-130364) na rzecz R.S.

<ol><li>Szulman, A. E., Surti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+syndromes+of+hydatidiform+mole.+II.+Morphologic+evolution+of+the+complete+and+partial+mole%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole.</a> American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).</li>
<li>Fukunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interobserver+and+intraobserver+variability+in+the+diagnosis+of+hydatidiform+mole%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).</li>
<li>Gupta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+reproducibility+of+hydatidiform+moles%3A+ancillary+techniques+%28p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping%29+improve+morphologic+diagnosis+for+both+recently+trained+and+experienced+gynecologic+pathologists%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).</li>
<li>Howat, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+histopathologists+reliably+diagnose+molar+pregnancy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?</a> Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).</li>
<li>Banet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+hydatidiform+moles%3A+analysis+of+a+prospective+series+with+p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping.</a> Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).</li>
<li>Lipata, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+DNA+genotyping+diagnosis+of+hydatidiform+mole%5BTitle%5D)+AND+%22Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole.</a> Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).</li>
<li>Buza, N., Hui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+hydatidiform+mole%3A+histologic+parameters+in+correlation+with+DNA+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Gynecologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).</li>
<li>Fisher, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+heterozygous+complete+hydatidiform+moles%2C+estimated+by+locus-specific+minisatellite+and+Y+chromosome-specific+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes.</a> Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).</li>
<li>Murdoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+NALP7+cause+recurrent+hydatidiform+moles+and+reproductive+wastage+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans.</a> Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).</li>
<li>Parry, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+causing+familial+biparental+hydatidiform+mole+implicate+c6orf221+as+a+possible+regulator+of+genomic+imprinting+in+the+human+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).</li>
<li>Nguyen, N. M., Slim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+Epigenetics+of+Recurrent+Hydatidiform+Moles%3A+Basic+Science+and+Genetic+Counselling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Obstetrics+and+Gynecology+Reports%22%5BJournal%5D)">Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling.</a> Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).</li>
<li>Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathological+features+of+biparental+complete+hydatidiform+moles+in+women+with+NLRP7+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations.</a> Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).</li>
<li>Nguyen, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genotype-phenotype+correlations+between+NLRP7+mutations+and+the+balance+between+embryonic+tissue+differentiation+and+trophoblastic+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).</li>
<li>Brown, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+pregnancy+loss+in+a+woman+with+NLRP7+mutation%3A+not+all+molar+pregnancies+can+be+easily+classified+as+either+%22partial%22+or+%22complete%22+hydatidiform+moles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Gynecologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).</li>
<li>Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Reappraisal+of+the+Incidence+of+Placental+Hydatidiform+Mole+Using+Selective+Molecular+Genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Gynecological+Cancer%22%5BJournal%5D)">A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping.</a> The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).</li>
<li>Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genotyping+of+hydatidiform+moles%3A+analytic+validation+of+a+multiplex+short+tandem+repeat+assay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

HM to nieprawidłowe ciąże ludzkie o heterogennych etiologiach, występujące w różnych typach histologicznych i genotypowych, co sprawia, że ich dokładna klasyfikacja i diagnoza są trudne. Ocena morfologiczna histopatologiczna często okazywała się nieprecyzyjna i dlatego sama w sobie jest niewiarygodna w klasyfikacji HM na CHM i PHM oraz w odróżnianiu ich od niepęcherzykowych poronień. W związku z tym dokładna diagnoza HM wymaga zastosowania innych metod, takich jak multipleksowe genotypowanie DNA mikrosatelitarnego, anali...

Pieprzyk bąblowy (HM) to nieprawidłowa ciąża u człowieka, charakteryzująca się nieprawidłowym rozwojem embrionalnym, nadmierną proliferacją trofoblastu i hydropowym zwyrodnieniem kosmków kosmówkowych (CV). Historycznie rzecz biorąc, HM był podzielony na dwa typy, kompletny HM (CHM) i częściowy HM (PHM) oparty tylko na ocenie morfologicznej1. Wykazano jednak, że sama ocena morfologiczna nie jest wystarczająca do zaklasyfikowania HM do dwóch podtypów (CHM i PHM) i odróżnienia ich od poronień nietrzonowych2,3,4.
Ponieważ CHM i PHM mają różne skłonności do nowotworów złośliwych, dlatego ważne jest dokładne określenie typu genotypowego HM, aby zapewnić odpowiednią obserwację i leczenie pacjentów. W związku z tym w ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano i rozwinięto kilka metodologii w celu zidentyfikowania wkładu rodzicielskiego w tkanki trzonowe i osiągnięcia prawidłowej klasyfikacji HM. Należą do nich analiza kariotypu, polimorfizm prążkowania chromosomów, typowanie serologiczne ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA), polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych, zmienna liczba powtórzeń tandemowych, genotypowanie mikrosatelitarne, cytometria przepływowa i immunohistochemia p57KIP2. Umożliwiło to dokładny podział poczęć HM na podstawie wkładu rodziców w ich genomy, w następujący sposób: CHM, które są diploidalnymi androgenami monospermicznymi lub diploidalnymi androgenami dyspermicznymi, oraz PHM, które są triploidalne, dispermiczne w 99% i monospermiczne w 1% przypadków5,6,7,8. Co więcej, istnieje inny genotypowy typ HM, który pojawił się w ciągu ostatnich dwóch dekad, który jest diploidalny dwurodzicielski. Ta ostatnia choroba jest najczęściej nawracająca i może dotyczyć jednego członka rodziny (przypadki simpleksowe) lub co najmniej dwóch członków rodziny (przypadki rodzinne). Te diploidalne dwurodzicielskie pieprzyki są najczęściej spowodowane recesywnymi mutacjami w NLRP7 lub KHDC3L u pacjentów9,10,11,12. Diploidalne oburodzicielskie HM u pacjentów z recesywnymi mutacjami NLRP7 może być zdiagnozowane jako CHM lub PHM na podstawie analizy morfologicznej i wydaje się, że jest to związane z ciężkością mutacji u pacjentów13,14. Oprócz klasyfikacji HM według ich genotypów, wprowadzenie i zastosowanie kilku metod genotypowania pozwoliło na odróżnienie różnych jednostek trzonowych od poronień nietrzonowych, takich jak aneuploidalne diploidalne poczęcia dwurodzicielskie i inne rodzaje poczęć5,15. Takie koncepcje mogą mieć pewną proliferację trofoblastów i nieprawidłową morfologię kosmków, które naśladują, do pewnego stopnia, niektóre cechy morfologiczne HM.
Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowych protokołów do multipleksowego genotypowania i cytometrii przepływowej tkanek zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie, a także kompleksowe analizy wyników tych metod i ich integracji z innymi metodami dla prawidłowej i rozstrzygającej diagnozy tkanek trzonowych.

<table><tbody><tr><td>BD FACS Canto II</td><td>BD BioSciences</td><td>338960</td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd do elektroforezy kapilarnej: Genomes Applied Biosystems 3730xl Analizator DNA</td><td>Applied Biosystems</td><td>313001R</td><td>Usługa oferowana przez Centrum Genomiki Stosowanej (http://www.tcag.ca)</td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60, podłoże do montażu histopatologicznego</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>23244257</tr><tr><td>Roztwór podstawowy Eozyny Y (1%)</td><td>Fisher</td><td>SE23-500D</td><td></td></tr><tr><td>FCSalyzer - oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej</td><td>SourceForge-https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>FFPE Zestaw Qiagen</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td>Do cięcia i czyszczenia</td></tr><tr><td>Lodowcowy Kwas octowy (skoncentrowany)</td><td>Sigma</td><td>A6283-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane: Szkło nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td>12-541a</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Fisher</td><td>CS401-1D</td><td></td></tr><tr><td>Wysoce dejonizowany formamid: Hi-Di Formamid</td><td>Thermofisher</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>platforma IHC: Benchmark Ultra</td><td></td><td></td> Roche-Kimwipes <td></td></tr><tr><td></td><td>Ultident</td><td>30-34120</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza mikrotomu</td><td>Fisher</td><td>12-634-1C</td><td></td></tr><tr><td>Siatka filtrująca Nitex, 48 &mu; </td><td>m Filmar</td><td>74011</td><td>http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; każdy inny filtr jest odpowiedni, ale jest to niedroga i skuteczna opcja od firmy niebadawczej</td></tr><tr><td>p57 przeciwciało Cell</td><td>Marque</td><td>457M</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>VWR</td><td>53499-632</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do PCR</td><td>Perkin Elmer, Applied Biosystems</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>PeakScanner 1.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4381867</td><td>Oprogramowanie do analizy genotypowania.</td></tr><tr><td>Pepsyna z błony śluzowej żołądka świń</td><td>Sigma</td><td>P7012</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowe rurki okrągłodenne</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Dodatnio naładowane prowadnice: Superfrost Plus 25x75mm</td><td>Fisher</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>PowerPlex 16 HS System</td><td>Promega Corporation</td><td>DC2102</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>Rybonukleaza A z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>R4875</td><td></td></tr><tr><td>Matryca separacyjna: POP-7 Polimer</td><td>Thermofisher</td><td>4352759</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza</td><td>Fisher</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Fisher</td><td>X3P1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

genotypowanie dna mikrosatelitarnego i cytometria przepływowa analizy ploidalne tkanek trzonowców bąblowcowych utrwalonych w formalinie

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Pieprzyk bąblowy (HM) to nieprawidłowa ciąża ludzka, charakteryzująca się nadmierną proliferacją trofoblastyczną i nieprawidłowym rozwojem embrionalnym. Istnieją dwa typy HM oparte na mikroskopowej ocenie morfologicznej, całkowite HM (CHM) i częściowe HM (PHM). Można je dalej podzielić na podstawie wkładu rodziców w genomy trzonowców. Taka charakterystyka HM, za pomocą analiz morfologii i genotypu, ma kluczowe znaczenie dla postępowania z pacjentem i dla podstawowego zrozumienia tej intrygującej patologii. Jest dobrze udokumentowane, że analiza morfologiczna HM podlega dużej zmienności między obserwatorami i sama w sobie nie jest wystarczająca do dokładnej klasyfikacji HM na CHM i PHM oraz odróżnienia ich od hydropowych poronień nietrzonowych. Analiza genotypowania jest najczęściej wykonywana na DNA i tkankach pochodzących z produktów zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie, które mają jakość niższą niż optymalna i w konsekwencji mogą prowadzić do błędnych wniosków. W artykule przedstawiono szczegółowe protokoły genotypowania multipleksowego i analiz cytometrii przepływowej tkanek trzonowych FFPE, wraz z interpretacją wyników tych metod, ich rozwiązywaniem problemów oraz integracją z oceną morfologiczną, immunohistochemiąp57 KIP2 i fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu uzyskania prawidłowej i solidnej diagnozy. W tym miejscu autorzy dzielą się metodami i wnioskami wyciągniętymi w ciągu ostatnich 10 lat z analizy około 400 produktów poczęcia.

Złożoność tkanek moli oraz fakt, że mogą one posiadać różne genotypy, wymagają rygorystycznej analizy i zastosowania wielu metod, takich jak ocena morfologiczna, immunohistochemia p57, genotypowanie mikrosatelitarne, cytometria przepływowa oraz FISH. Na przykład jedna pacjentka (1790) została skierowana z dwiema PHM, które w analizie microarray z samych POC okazały się triploidalne. W związku z tym u pacjentki zdiagnozowano nawracające PHM. Genotypowanie mikrosatelitarne dwóch jej „PHM” w...

Pieprzyki bąblowce to nieprawidłowe ciąże ludzkie o niejednorodnej etiologii, które można sklasyfikować według ich cech morfologicznych i wkładu rodziców w genomy trzonowców. W tym miejscu szczegółowo opisano protokoły multipleksowego mikrosatelitarnego genotypowania DNA i cytometrii przepływowej tkanek trzonowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie, wraz z interpretacją i integracją wyników.

Genotypowanie DNA mikrosatelitarnego i cytometria przepływowa Analizy ploidalne tkanek trzonowców bąblowcowych utrwalonych w formalinie

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

Główną zaletą naszego protokołu genotypowania jest to, że minimalizuje on zanieczyszczenie matczynym DNA, co jest głównym wyzwaniem podczas genotypowania tkanek trzonowych utrwalonych w formalinie, zanurzonych w parafinie. Cytometria przepływowa to szybka i niedroga metoda, która znacznie ułatwia diagnostykę pieprzyków bąblowcowych. Dla każdego produktu poczęcia utrwalonego w parafinie utrwalonym w formalinie lub FFPE należy przygotować wycinek barwnika hematoksyliną i eozyną o grubości czterech mikronów, jak opisano w tym filmie, do oceny morfologicznej za pomocą mikroskopii.Umieść bloki FFPE na lodzie na 15 minut, aby ułatwić cięcie. Dostosuj mikrotom, aby wyciąć odcinki o grubości czterech mikronów w celu mikroskopowej oceny morfologicznej. Umieść zimny blok w mikrotomie i wytnij po jednym fragmencie z każdego bloku do barwienia H&E.Za pomocą kleszczy przenieś każdą sekcję do łaźni wodnej o temperaturze 45 stopni Celsjusza. Pobrać ołówkiem wycinek z łaźni wodnej za pomocą dodatnio naładowanego szkiełka uprzednio oznaczonego numerem identyfikacyjnym próbki. Umieść szkiełka zawierające sekcje w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza, aby sekcje przylegały do szkiełek.Trzymaj szkiełka w piekarniku przez 25 minut. Wykonaj barwienie H&E, zanurzając szkiełka w odpowiednich słoikach do barwienia na odpowiedni okres czasu, zgodnie z tabelą w protokole tekstowym. Zamontuj czteromikronowe sekcje do analizy morfologicznej za pomocą podłoża montażowego.I przykryj szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. Korzystając ze szkiełek podstawowych i mikroskopu świetlnego, wybierz blok FFPE, który ma największą ilość kosmków kosmówkowych. A jeśli to możliwe, blok, który ma kosmki kosmówkowe oddzielone i nie zmieszane z tkankami matczynymi.Dostosuj mikrotom, aby wyciąć odcinki o grubości 10 mikronów w celu ekstrakcji DNA. Wytnij od 10 do 30 odcinków, w zależności od ilości kosmków kosmówkowych w bloku. Po zebraniu sekcji ze szkiełkami jak poprzednio, umieść szkiełka zawierające sekcje w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza, aby sekcje przylegały do szkiełek.Trzymaj szkiełka w piekarniku przez 20 minut. Wykonaj barwienie H&E, zanurzając szkiełka w odpowiednich słoikach do barwienia na odpowiedni okres czasu, zgodnie z tabelą w protokole tekstowym. Pozostaw szkiełka pod wyciągiem na co najmniej trzy godziny, aby toksyczne zapachy ksylenu zniknęły.Za pomocą kleszczy oderwij mały kawałek papieru z wilgotnej chusteczki papierowej. Pod lekkim mikroskopem stereoskopowym użyj kleszczyków i małych kawałków papierowych chusteczek zwilżonych wodą, aby zeskrobać wszystkie niechciane tkanki matki z plam H&E o grubości 10 mikronów. Kluczem do tego kroku jest cierpliwość, szczególnie w przypadku trudnych bloków.Ważne jest również, aby ktoś inny przyjrzał się temu, aby upewnić się, że żadne tkanki matki nie zostaną pominięte. Teraz oderwij nowy kawałek papieru z zwilżonych chusteczek papierowych i użyj go do zebrania kosmków kosmówkowych. Umieść kawałki chusteczek papierowych z dołączonymi kosmkami kosmówkowymi w oznaczonej tubce o pojemności 1,5 ml.Zminimalizuj ilość chusteczek papierowych używanych na tym etapie, ponieważ zbyt duża ilość może zatkać kolumnę do ekstrakcji DNA, a w konsekwencji zmniejszyć końcową ilość pobranego DNA. Postępuj zgodnie z protokołem ekstrakcji DNA z zestawu FFPE, aby przeprowadzić ekstrakcję DNA. Za pomocą spektrofotometru laboratoryjnego załaduj 1 mikrolitr DNA i zmierz absorbancję przy 216 nm w celu określenia ilościowego.Załaduj 1 mikrolitr DNA na 2% żel agarozowy i uruchom elektroforezę żelową pod napięciem od 80 do 100 woltów w celu oceny jakościowej. Na podstawie wyników oceny DNA wybierz objętość DNA, która ma być użyta w multipleksowej krótkiej tandemowej amplifikacji PCR. Staraj się użyć co najmniej 1000 nanogramów DNA.Przejdź do amplifikacji PCR, elektroforezy kapilarnej i analizy danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby wybrać idealny blok FFPE, użyj szkiełek podstawowych i elektronicznych na mikroskopie świetlnym, aby wybrać blok FFPE, który ma około 50 do 70% tkanek składających się z kosmków kosmówkowych. W przypadku bloków, które nie mają idealnej ilości kosmków kosmówkowych, należy je wzbogacić o kosmki kosmówkowe podczas wykonywania sekcji.Aby to zrobić, określ, po której stronie świeżo ściętych odcinków znajduje się więcej kosmków kosmówkowych, zgodnie z odpowiadającym im szkiełkiem H&E. Następnie użyj ostrza, aby odciąć drugą połowę, którą należy wyrzucić, aby wzbogacić kosmki kosmówkowe. Aby wykonać cięcie najlepszego możliwego bloku FFPE, wytnij cztery sekcje o grubości 50 mikronów za pomocą mikrotomu.W przypadku, gdy idealny blok FFPE nie jest dostępny, staraj się mimo to utrzymać stosunek kosmków kosmówkowych do tkanki matki. Na przykład, jeśli tylko 30% bloku składa się z kosmków kosmówkowych, podczas gdy reszta ma tkanki matczyne, usuń co najmniej połowę sekcji zawierającej tkanki matczyne i użyj więcej odcinków, aby to skompensować. Umieść sekcje w oznaczonych probówkach o pojemności 15 ml.W celu odparafinowania i ponownego nawodnienia należy pracować w dygestoriach, aby dodać każdy odczynnik i odczekać odpowiedni okres czasu, zgodnie z tabelą w protokole tekstowym. Następnie usuń odczynnik przez odsysanie próżniowe za pomocą pipety Pasteura. Następnie dodaj roztwór cytrynianu o czterech stopniach Celsjusza do probówek o pojemności 15 ml.Po umieszczeniu w łaźni wodnej o temperaturze 80 stopni Celsjusza na dwie godziny, pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej. Usunąć roztwór cytrynianu przez odsysanie próżniowe. Dodaj sześć mililitrów 1x PBS, wiruj i odczekaj od jednej do dwóch minut, aby tkanki osiadły na dnie.W razie potrzeby odwirować próbki z prędkością 1000 obr./min przez 30 sekund. Usuń 1X PBS przez odsysanie próżniowe. Teraz dodaj jeden ml podgrzanego roztworu pepsyny i umieść w suchej łaźni o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut.Wiruj co 10 minut. Przygotować roztwór rybonukleazy jodku propidyny A w ciągu ostatnich 10 minut tej inkubacji. Dodaj kolejne sześć ml 1x PBS, wiruj i odczekaj jedną do dwóch minut, aby tkanki osiadły na dnie.Ponownie usuń 1x PBS przez odsysanie próżniowe. Dodać 550 mikrolitrów roztworu rybonukleazy jodku propidyny A i umieścić próbki w suchej łaźni o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut. Za pomocą kleszczy umieść kawałek siatki filtracyjnej o wymiarach 48 mikronów o wymiarach pięć cm na pięć cm w górnej części polistyrenowych rurek z okrągłym dnem do użytku z cytometrem przepływowym.Przefiltrować roztwór, pipetując płyn przez siatkę i do probówki. Próbki są teraz gotowe do badania na cytometrze przepływowym. Trzymaj je zawinięte w folię, aż będą gotowe do uruchomienia.Na koniec wykonaj cytometrię przepływową i analizę danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Genotypowanie mikrosatelitarne częściowego pieprzyka bąblowcowego, wraz z DNA pacjentki i jej partnera, ujawnia, że pieprzyk pacjenta jest triploidalny dyspermiczny. Pierwszy 1. marker pokazuje dwa piki w produkcie poczęcia.Pierwszy pik pochodzi od matki, ponieważ tylko matka ma pik tej wielkości. Idąc tym samym tokiem rozumowania, drugi pik pochodzi od ojca, ponieważ ma on ten sam allel. Zauważ, że drugi pik jest znacznie wyższy niż pierwszy, co wskazuje, że prawdopodobnie w tym szczycie znajdują się dwie dawki tego samego allelu ojcowskiego.Zanieczyszczenie matczyne jest bardzo minimalne w tym produkcie poczęcia, ponieważ wykazuje bardzo mały pik w pozycji drugiego allelu matki. Drugi znacznik pokazuje trzy piki w produkcie poczęcia. Dwa z tych szczytów pochodzą od ojca, a jeden od matki.Trzeci i czwarty marker są podobne do pierwszego markera, a także pokazują dwa allele pochodzące od ojca i jeden od matki. Ponieważ wszystkie cztery markery konsekwentnie pokazują trzy allele, dwa pochodzące od ojca i jeden od matki, można wywnioskować, że ten produkt poczęcia jest triploidalny dispermiczny i potwierdza diagnozę częściowego pieprzyka. W celu interpretacji wyników genotypowania ważne jest, aby zdawać sobie sprawę z poziomu zanieczyszczenia na podstawie notatek sporządzonych podczas etapów czyszczenia.W niektórych przypadkach nie jesteśmy w stanie dojść do wniosku przy użyciu tych dwóch metod. W takich przypadkach stosujemy inne metody, takie jak FISH, aby odkryć prawdziwe genotypy. Genotypowanie mikrosatelitarne pozwoliło na dokładną diagnozę molowców i utorowało drogę do lepszego zrozumienia genotypów, które są związane z różnymi cechami pieprzyków bąblowcowych.

microsatellite-dna-genotyping-flow-cytometry-ploidy-analyses-formalin

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niniejszy artykuł opisuje dobór odpowiednich sond do techniki single-cell FISH, metody preparowania jąder blastomerów, a także hybrydyzację in situ i ocenę sygnałów w kontekście diagnostyki przedimplantacyjnej (PGD) stosowanej w warunkach klinicznych.

FISH w diagnostyce preimplantacyjnej

Opisano wydajną metodę otrzymywania wysokiej czystości żywych frakcji meiotycznych z jądra myszy, która łączy udoskonalony protokół dysocjacji komórek z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS). Metoda ta wykorzystuje różnice w zawartości DNA oraz gęstości jąder poszczególnych frakcji meiotycznych.

Oczyszczanie komórek meiotycznych myszy metodą cytometrii przepływowej

Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do pobierania próbek, umożliwiające efektywne gromadzenie próbek sierści od płochliwych małych ssaków, co zaprezentowano na przykładzie piki amerykańskiej. Wykazujemy użyteczność tej metody poprzez ekstrakcję DNA z pobranej sierści oraz amplifikację kilku typów markerów molekularnych powszechnie stosowanych w badaniach nad ekologią i ochroną dzikiej przyrody.

Nieinwazyjna technika pobierania próbek sierści w celu pozyskania wysokiej jakości DNA od trudnych do uchwycenia małych ssaków

PCR w połączeniu z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA) jest pokazane jako szybka i skuteczna metoda genotypowania danio pręgowanego.

Szybkie i wydajne genotypowanie danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości

Prezentujemy solidną, opłacalną i elastyczną metodę pomiaru zmian w liczbie hepatocytów i ploidalności jądrowej w stałych/kriokonserwowanych próbkach tkanek, która nie wymaga cytometrii przepływowej. Nasze podejście zapewnia potężną sygnaturę cytologii wątroby obejmującą całą próbkę, idealną do śledzenia postępu uszkodzenia wątroby i choroby.

Wysokoprzepustowa metoda in situ do szacowania ploidalności jądrowej hepatocytów u myszy

Markery epigenetyczne są używane do podtypowania białych krwinek (WBC) poprzez kwantyfikację wzorców metylacji DNA. Protokół ten przedstawia metodę reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (mdPCR) przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego na bazie elastomeru termoplastycznego (TPE) do generowania kropel, co pozwala na precyzyjną i specyficzną dla metylacji multipleksową docelową kwantyfikację różnic WBC.

Specyficzny dla metylacji multipleksowy PCR kropelkowy przy użyciu generatora kropel polimerowych do diagnostyki hematologicznej

Połączenie preparatów halo DNA z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ umożliwia analizę interakcji genomowych z nukleoszkieletem w wysokiej rozdzielczości. Przyłączony genom prowadzi do zhybrydyzowanych sygnałów fluorescencyjnych zlokalizowanych w resztkowych wyekstrahowanych jądrach, podczas gdy nieprzyłączony genom znajduje się w halo DNA otaczającym resztkowe jądra.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ na preparatach DNA Halo w celu ujawnienia całych chromosomów, telomerów i loci genów

Obecny protokół dostarcza praktycznego rozwiązania, które pozwala na pomiar apoptozy, potencjału błony mitochondrialnej i uszkodzeń DNA w plemnikach ludzkich za pomocą pojedynczego cytometru.

Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów do wykrywania wad funkcjonalnych plemników ludzkich

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru bezwzględnej liczby kopii mitochondrialnego (mt)DNA i poziomów heteroplazmii delecji mtDNA w pojedynczych komórkach.

Pomiar liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA pojedynczej komórki za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Testy pirosekwencjonowania umożliwiają solidne i szybkie genotypowanie polimorfizmów pojedynczego nukleotydu mitochondrialnego DNA w heteroplazmatycznych komórkach lub tkankach.

Genotypowanie polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w genomie mitochondrialnym metodą pirosekwencjonowania

Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący projektowania multipleksowego panelu przeciwciał immunofluorescencyjnych do obrazowania mysich tkanek czerniaka FFPE na podstawie kodów kreskowych. Opisujemy również proces analizy obrazu przy użyciu narzędzi typu open source do generowania przestrzennych wglądów proteomicznych w mikrośrodowisku immunologicznym mysiego czerniaka.

Multipleksowe obrazowanie immunofluorescencyjne oparte na kodach kreskowych DNA do analizy próbek FFPE z genetycznie przeprogramowanego mysiego czerniaka

Poznaj protokoły genotypowania mikrosatelitarnego DNA i cytometrii przepływowej do diagnostyki trzonowców bąblowcowych z tkanek utrwalonych w formalinie. Metody te minimalizują zanieczyszczenie DNA matczynym i poprawiają dokładność wyników.

Genotypowanie DNA mikrosatelitarnego i cytometria przepływowa Analizy ploidalne tkanek trzonowców bąblowcowych utrwalonych w formalinie (Wideo) | JoVE Journal

Genotypowanie DNA mikrosatelitarnego i cytometria przepływowa Analizy ploidalne tkanek trzonowców bąblowcowych utrwalonych w formalinie

Przeglądaj więcej filmów