Genotypowanie DNA mikrosatelitarnego i cytometria przepływowa Analizy ploidalne tkanek trzonowców bąblowcowych utrwalonych w formalinie

Główną zaletą naszego protokołu genotypowania jest to, że minimalizuje on zanieczyszczenie matczynym DNA, co jest głównym wyzwaniem podczas genotypowania tkanek trzonowych utrwalonych w formalinie, zanurzonych w parafinie. Cytometria przepływowa to szybka i niedroga metoda, która znacznie ułatwia diagnostykę pieprzyków bąblowcowych. Dla każdego produktu poczęcia utrwalonego w parafinie utrwalonym w formalinie lub FFPE należy przygotować wycinek barwnika hematoksyliną i eozyną o grubości czterech mikronów, jak opisano w tym filmie, do oceny morfologicznej za pomocą mikroskopii.

Umieść bloki FFPE na lodzie na 15 minut, aby ułatwić cięcie. Dostosuj mikrotom, aby wyciąć odcinki o grubości czterech mikronów w celu mikroskopowej oceny morfologicznej. Umieść zimny blok w mikrotomie i wytnij po jednym fragmencie z każdego bloku do barwienia H&E.

Za pomocą kleszczy przenieś każdą sekcję do łaźni wodnej o temperaturze 45 stopni Celsjusza. Pobrać ołówkiem wycinek z łaźni wodnej za pomocą dodatnio naładowanego szkiełka uprzednio oznaczonego numerem identyfikacyjnym próbki. Umieść szkiełka zawierające sekcje w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza, aby sekcje przylegały do szkiełek.

Trzymaj szkiełka w piekarniku przez 25 minut. Wykonaj barwienie H&E, zanurzając szkiełka w odpowiednich słoikach do barwienia na odpowiedni okres czasu, zgodnie z tabelą w protokole tekstowym. Zamontuj czteromikronowe sekcje do analizy morfologicznej za pomocą podłoża montażowego.

I przykryj szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. Korzystając ze szkiełek podstawowych i mikroskopu świetlnego, wybierz blok FFPE, który ma największą ilość kosmków kosmówkowych. A jeśli to możliwe, blok, który ma kosmki kosmówkowe oddzielone i nie zmieszane z tkankami matczynymi.

Dostosuj mikrotom, aby wyciąć odcinki o grubości 10 mikronów w celu ekstrakcji DNA. Wytnij od 10 do 30 odcinków, w zależności od ilości kosmków kosmówkowych w bloku. Po zebraniu sekcji ze szkiełkami jak poprzednio, umieść szkiełka zawierające sekcje w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza, aby sekcje przylegały do szkiełek.

Trzymaj szkiełka w piekarniku przez 20 minut. Wykonaj barwienie H&E, zanurzając szkiełka w odpowiednich słoikach do barwienia na odpowiedni okres czasu, zgodnie z tabelą w protokole tekstowym. Pozostaw szkiełka pod wyciągiem na co najmniej trzy godziny, aby toksyczne zapachy ksylenu zniknęły.

Za pomocą kleszczy oderwij mały kawałek papieru z wilgotnej chusteczki papierowej. Pod lekkim mikroskopem stereoskopowym użyj kleszczyków i małych kawałków papierowych chusteczek zwilżonych wodą, aby zeskrobać wszystkie niechciane tkanki matki z plam H&E o grubości 10 mikronów. Kluczem do tego kroku jest cierpliwość, szczególnie w przypadku trudnych bloków.

Ważne jest również, aby ktoś inny przyjrzał się temu, aby upewnić się, że żadne tkanki matki nie zostaną pominięte. Teraz oderwij nowy kawałek papieru z zwilżonych chusteczek papierowych i użyj go do zebrania kosmków kosmówkowych. Umieść kawałki chusteczek papierowych z dołączonymi kosmkami kosmówkowymi w oznaczonej tubce o pojemności 1,5 ml.

Zminimalizuj ilość chusteczek papierowych używanych na tym etapie, ponieważ zbyt duża ilość może zatkać kolumnę do ekstrakcji DNA, a w konsekwencji zmniejszyć końcową ilość pobranego DNA. Postępuj zgodnie z protokołem ekstrakcji DNA z zestawu FFPE, aby przeprowadzić ekstrakcję DNA. Za pomocą spektrofotometru laboratoryjnego załaduj 1 mikrolitr DNA i zmierz absorbancję przy 216 nm w celu określenia ilościowego.

Załaduj 1 mikrolitr DNA na 2% żel agarozowy i uruchom elektroforezę żelową pod napięciem od 80 do 100 woltów w celu oceny jakościowej. Na podstawie wyników oceny DNA wybierz objętość DNA, która ma być użyta w multipleksowej krótkiej tandemowej amplifikacji PCR. Staraj się użyć co najmniej 1000 nanogramów DNA.

Przejdź do amplifikacji PCR, elektroforezy kapilarnej i analizy danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby wybrać idealny blok FFPE, użyj szkiełek podstawowych i elektronicznych na mikroskopie świetlnym, aby wybrać blok FFPE, który ma około 50 do 70% tkanek składających się z kosmków kosmówkowych. W przypadku bloków, które nie mają idealnej ilości kosmków kosmówkowych, należy je wzbogacić o kosmki kosmówkowe podczas wykonywania sekcji.

Aby to zrobić, określ, po której stronie świeżo ściętych odcinków znajduje się więcej kosmków kosmówkowych, zgodnie z odpowiadającym im szkiełkiem H&E. Następnie użyj ostrza, aby odciąć drugą połowę, którą należy wyrzucić, aby wzbogacić kosmki kosmówkowe. Aby wykonać cięcie najlepszego możliwego bloku FFPE, wytnij cztery sekcje o grubości 50 mikronów za pomocą mikrotomu.

W przypadku, gdy idealny blok FFPE nie jest dostępny, staraj się mimo to utrzymać stosunek kosmków kosmówkowych do tkanki matki. Na przykład, jeśli tylko 30% bloku składa się z kosmków kosmówkowych, podczas gdy reszta ma tkanki matczyne, usuń co najmniej połowę sekcji zawierającej tkanki matczyne i użyj więcej odcinków, aby to skompensować. Umieść sekcje w oznaczonych probówkach o pojemności 15 ml.

W celu odparafinowania i ponownego nawodnienia należy pracować w dygestoriach, aby dodać każdy odczynnik i odczekać odpowiedni okres czasu, zgodnie z tabelą w protokole tekstowym. Następnie usuń odczynnik przez odsysanie próżniowe za pomocą pipety Pasteura. Następnie dodaj roztwór cytrynianu o czterech stopniach Celsjusza do probówek o pojemności 15 ml.

Po umieszczeniu w łaźni wodnej o temperaturze 80 stopni Celsjusza na dwie godziny, pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej. Usunąć roztwór cytrynianu przez odsysanie próżniowe. Dodaj sześć mililitrów 1x PBS, wiruj i odczekaj od jednej do dwóch minut, aby tkanki osiadły na dnie.

W razie potrzeby odwirować próbki z prędkością 1000 obr./min przez 30 sekund. Usuń 1X PBS przez odsysanie próżniowe. Teraz dodaj jeden ml podgrzanego roztworu pepsyny i umieść w suchej łaźni o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut.

Wiruj co 10 minut. Przygotować roztwór rybonukleazy jodku propidyny A w ciągu ostatnich 10 minut tej inkubacji. Dodaj kolejne sześć ml 1x PBS, wiruj i odczekaj jedną do dwóch minut, aby tkanki osiadły na dnie.

Ponownie usuń 1x PBS przez odsysanie próżniowe. Dodać 550 mikrolitrów roztworu rybonukleazy jodku propidyny A i umieścić próbki w suchej łaźni o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut. Za pomocą kleszczy umieść kawałek siatki filtracyjnej o wymiarach 48 mikronów o wymiarach pięć cm na pięć cm w górnej części polistyrenowych rurek z okrągłym dnem do użytku z cytometrem przepływowym.

Przefiltrować roztwór, pipetując płyn przez siatkę i do probówki. Próbki są teraz gotowe do badania na cytometrze przepływowym. Trzymaj je zawinięte w folię, aż będą gotowe do uruchomienia.

Na koniec wykonaj cytometrię przepływową i analizę danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Genotypowanie mikrosatelitarne częściowego pieprzyka bąblowcowego, wraz z DNA pacjentki i jej partnera, ujawnia, że pieprzyk pacjenta jest triploidalny dyspermiczny. Pierwszy 1. marker pokazuje dwa piki w produkcie poczęcia.

Pierwszy pik pochodzi od matki, ponieważ tylko matka ma pik tej wielkości. Idąc tym samym tokiem rozumowania, drugi pik pochodzi od ojca, ponieważ ma on ten sam allel. Zauważ, że drugi pik jest znacznie wyższy niż pierwszy, co wskazuje, że prawdopodobnie w tym szczycie znajdują się dwie dawki tego samego allelu ojcowskiego.

Zanieczyszczenie matczyne jest bardzo minimalne w tym produkcie poczęcia, ponieważ wykazuje bardzo mały pik w pozycji drugiego allelu matki. Drugi znacznik pokazuje trzy piki w produkcie poczęcia. Dwa z tych szczytów pochodzą od ojca, a jeden od matki.

Trzeci i czwarty marker są podobne do pierwszego markera, a także pokazują dwa allele pochodzące od ojca i jeden od matki. Ponieważ wszystkie cztery markery konsekwentnie pokazują trzy allele, dwa pochodzące od ojca i jeden od matki, można wywnioskować, że ten produkt poczęcia jest triploidalny dispermiczny i potwierdza diagnozę częściowego pieprzyka. W celu interpretacji wyników genotypowania ważne jest, aby zdawać sobie sprawę z poziomu zanieczyszczenia na podstawie notatek sporządzonych podczas etapów czyszczenia.

W niektórych przypadkach nie jesteśmy w stanie dojść do wniosku przy użyciu tych dwóch metod. W takich przypadkach stosujemy inne metody, takie jak FISH, aby odkryć prawdziwe genotypy. Genotypowanie mikrosatelitarne pozwoliło na dokładną diagnozę molowców i utorowało drogę do lepszego zrozumienia genotypów, które są związane z różnymi cechami pieprzyków bąblowcowych.