Name: Produkcja zespołów motorycznych dyneiny i kinezyny na nanostrukturach DNA origami do obserwacji pojedynczych cząsteczek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Poznaj metodę tworzenia zespołów motorycznych dyneiny i kinezyny na nanostrukturach DNA origami do obserwacji pojedynczych cząsteczek. Protokół umożliwia badanie mechanizmów transportu ładunków w komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy K. Chau, J. Morganowi i A. Drillerowi-Colangelo za wkład w techniki segmentowanego podwozia origami DNA. Dziękujemy również byłym członkom laboratoriów Reck-Peterson i Shih za pomocne dyskusje i wkład w oryginalny rozwój tych technik. Dziękujemy J. Wopereisowi i Smith College Center for Microscopy and Imaging oraz L. Bierwert i Smith College Center for Molecular Biology. Z wdzięcznością dziękujemy za program NSF MRI za zakup mikroskopu TIRF.

<ol><li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+motor+toolbox+for+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular motor toolbox for intracellular transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li>
<li>Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+regulation+of+cytoplasmic+dynein%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).</li>
<li>Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+mechanics+of+dynein+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functions and mechanics of dynein motor proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).</li>
<li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kinesin-1+Chemomechanical+Cycle%3A+Stepping+Toward+a+Consensus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus.</a> Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).</li>
<li>McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+dynamics+of+processive+cytoskeletal+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Collective dynamics of processive cytoskeletal motors.</a> Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).</li>
<li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+cargo+transport%3A+moving+beyond+tug+of+war%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).</li>
<li>Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tug-of-war+in+motor+protein+ensembles+revealed+with+a+programmable+DNA+origami+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold.</a> Science. 338 (6107), 662-665 (2012).</li>
<li>Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+rigidity+affects+the+sensitivity+of+dynein+ensembles+to+individual+motor+pausing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing.</a> Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).</li>
<li>Torisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoinhibition+and+cooperative+activation+mechanisms+of+cytoplasmic+dynein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein.</a> Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).</li>
<li>Urnavicius, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+shows+how+dynactin+recruits+two+dyneins+for+faster+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement.</a> Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).</li>
<li>Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+dynein+is+autoinhibited+by+trapping+of+its+mechanical+and+track-binding+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).</li>
<li>Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+collective+transport+by+defined+numbers+of+processive+and+nonprocessive+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).</li>
<li>Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+interference+dominates+collective+transport+of+kinesin+motors+in+the+absence+of+load%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).</li>
<li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+dynein-dynactin+complex+is+a+strong+opponent+to+kinesin+in+a+tug-of-war+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition.</a> Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).</li>
<li>Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+dynein+transport+to+the+microtubule+plus+end+by+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin.</a> eLife. 3, e02641(2014).</li>
<li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li>
<li>Gennerich, A., Reck-Peterson, S. L. Chapter 4, Probing the force generation and stepping behavior of cytoplasmic Dynein. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGennerich%2C+A+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. , 63-80 (2011).</li>
<li>Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+defined+motor+ensembles+with+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Engineering defined motor ensembles with DNA origami.</a> Methods in Enzymology. 540, 169-188 (2014).</li>
<li>Rao, L., Hülsemann, M., Gennerich, A. Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRao%2C+L+%22Single+Molecule+Analysis.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology</a>. 1665, Humana Press. New York, NY. (2018).</li>
<li>Qiu, W., Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+achieves+processive+motion+using+both+stochastic+and+coordinated+stepping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).</li>
<li>Gietz, R. D. Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGietz%2C+RD+%22Yeast+Genetics.+Methods+in+Molecular+Biology+%28Methods+and+Protocols%29%22">Yeast Genetics. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols)</a>. 1205, Humana Press. New York, NY. (2014).</li>
<li>Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+lever+arm+directs+collective+motion+on+cellular+actin+network%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).</li>
<li>Krementsova, E. B., Furuta, K., Oiwa, K., Trybus, K. M., Ali, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+teams+of+myosin+Vc+motors+coordinate+their+stepping+for+efficient+cargo+transport+on+actin+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small teams of myosin Vc motors coordinate their stepping for efficient cargo transport on actin bundles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (26), 10998-11008 (2017).</li>
<li>Hariadi, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+coordination+in+motor+ensembles+revealed+using+engineered+artificial+myosin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Mechanical coordination in motor ensembles revealed using engineered artificial myosin filaments.</a> Nature Nanotechnology. 10 (8), 696-700 (2015).</li>
<li>Hu, J. J., Morgan, J., Yang, Y., Lin, C., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spherical+DNA+Origami+as+a+Programmable+Cargo+Structure+for+Investigating+the+Emergent+Motility+of+Dynein+and+Kinesin+Ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Spherical DNA Origami as a Programmable Cargo Structure for Investigating the Emergent Motility of Dynein and Kinesin Ensembles.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 408A(2019).</li>
<li>Wagenbauer, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+We+Make+DNA+Origami%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">How We Make DNA Origami.</a> Chembiochem. 18 (19), 1873-1885 (2017).</li>
<li>Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+DNA-origami+nanostructures+by+rate-zonal+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), e40(2013).</li>
<li>Ke, Y., Voigt, N. V., Gothelf, K. V., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+DNA+origami+packed+on+hexagonal+and+hybrid+lattices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Multilayer DNA origami packed on hexagonal and hybrid lattices.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 1770-1774 (2012).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+molecules+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).</li>
<li>Derr, N. D. Interactions of Multiple Dynein Motors Studied Using DNA Scaffolding. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDerr%2C+ND+%22Handbook+of+Dynein%22">Handbook of Dynein</a>. , 2nd Edition, Stanford Publishing. (2019).</li>
<li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Techniki budowy molekularnej origami DNA zapewniają unikalny sposób konstruowania zespołów motorycznych o zdefiniowanych architekturach, liczbach motorycznych i typach, umożliwiając badanie, w jaki sposób emergentne zachowanie powstaje z określonych konfiguracji motorycznych31. W miarę jak badania strukturalne i komórkowe nadal wyjaśniają przykłady silników cytoszkieletu pracujących w zespołach, techniki izolowania i badania biofizycznych i biochemicznych mechanizmów motorycznych w zespołach stają...

Dyneina i kinezyna to białka motoryczne cytoszkieletu odpowiedzialne za niezliczone funkcje w komórkach eukariotycznych1. Przekształcając energię chemiczną hydrolizy ATP w produktywną pracę, silniki te przemieszczają się na mikrotubulach, aby ciągnąć i rozprowadzać różne ładunki wewnątrzkomórkowe. Koordynują się również w masywnych rearanżacjach wewnątrzkomórkowych związanych z mitozą, gdzie wykazują zaaranżowane siły, które przyczyniają się do pozycjonowania i separacji chromosomów. Testy strukturalne, biochemiczne i biofizyczne, w tym obserwacje pojedynczych cząsteczek, ujawniły mechanizmy działania tych silników na poziomie indywidualnym (dobrze zrecenzowane w poprzednich pracach2,3,4). Jednak wiele zadań silników wymaga od nich pracy w małych zespołach zarówno podobnych, jak i mieszanych typów silników. Stosunkowo mniej wiadomo o mechanizmach, które koordynują aktywność i ostateczną ruchliwość emergentną tych zespołów5,6. Ta luka w wiedzy wynika po części z trudności w tworzeniu zespołów z kontrolowanymi cechami, takimi jak typ motoryczny i liczba kopii. W ciągu ostatniej dekady techniki budowy molekularnej origami DNA zostały wykorzystane do rozwiązania tego problemu. W przypadku silników opartych na mikrotubulach niektóre przykłady takich badań obejmują obserwacje pojedynczych cząsteczek zespołów cytoplazmatycznych dynein-17,8,9, dyneina wewnątrzwiciowa11, różne silniki kinezynowe12,13, oraz mieszaniny zarówno dynein, jak i kinesins7,14,15. W tym miejscu podajemy szczegółowe informacje na temat oczyszczania i znakowania oligonukleotydami silników z drożdży7,16,17,18,19,20, składanie i oczyszczanie segmentowanego origami DNA z możliwością regulacji zgodności8, oraz obrazowanie silników drożdżowych napędzających struktury podwozia7,18.
Konstruowanie zespołów motorycznych do obserwacji pojedynczych cząsteczek in vitro wymaga trzech podstawowych wysiłków. Pierwszym z nich jest ekspresja, oczyszczanie i etykietowanie konstruktów motorycznych nadających się do dołączenia do origami DNA. Drugim jest produkcja i oczyszczanie zdefiniowanych struktur origami DNA (często określanych jako "podwozie"). Trzecim jest sprzężenie silników ze strukturą podwozia, a następnie obserwacja za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF). W tym miejscu przedstawiamy ustalone protokoły tego procesu dla rekombinowanych silników opartych na mikrotubulach oczyszczonych z drożdży Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18,19. Zespoły motoryczne oparte na origami DNA zostały zbadane przy użyciu zarówno rekombinowanych kinezin15, jak i dynein7,8,18 konstruktów wytworzonych w tym systemie ekspresji drożdży16,17,18,19. Protokół ten jest ważny dla tych konstruktów, biorąc pod uwagę, że są one kontrolowane przez promotor indukowany galaktozą i łączone z tymi samymi znacznikami białkowymi w celu oczyszczenia (łącznik proteazy ZZ i TEV) oraz koniugacji oligonukleoty DNA (SNAPtag).
Specyficzne szczepy drożdży wytwarzają specyficzne konstrukcje motoryczne. Na przykład dyneina używana do badania roli podatności ładunku została oczyszczona ze szczepu RPY10847,8. Ogólnie rzecz biorąc, szczepy zawierające konstrukty motoryczne z odpowiednimi modyfikacjami genetycznymi w celu ekspresji i oczyszczenia można zamówić w laboratoriach, które opublikowały informacje o zastosowaniu tych silników. Konstrukty z nowymi atrybutami, takimi jak mutacje lub znaczniki, mogą być tworzone przy użyciu rekombinowanych technik genetycznych, takich jak transformacja octanu litu21 i zestawy komercyjne. Opublikowano szczegółowe protokoły tworzenia zmodyfikowanych białek motorycznych w drożdżach do badań nad pojedynczymi cząsteczkami19. Oprócz silników połączonych ze znacznikiem SNAPtag, oligonukleotydy używane do oznaczania silników muszą być sprzężone z substratem SNAP, benzyloguaniną (BG); Wcześniej opublikowane protokoły opisują powstawanie i oczyszczanie koniugatów BG-oligo18. Opisana tutaj ogólna strategia została również zastosowana w silnikach opartych na aktynie (przykłady w poprzednich pracach22,23,24) oraz silnikach oczyszczonych z innych organizmów i systemów ekspresji (przykłady można znaleźć w poprzednich pracach7,9,10,11,12,13,14).
Spolimeryzowane mikrotubule (MT) są używane w tych eksperymentach w dwóch różnych procedurach. Oczyszczanie motoryków funkcjonalnych pod kątem powinowactwa MT wymaga MT, które nie są znakowane innymi grupami funkcyjnymi, podczas gdy test TIRF ruchliwości zespołu motorycznego wymaga MT znakowanych biotyną i fluoroforami. We wszystkich przypadkach MT są stabilizowane taksolem, aby zapobiec denaturacji. Etap oczyszczania powinowactwa MT służy do usuwania wszelkich nieruchomych silników o wysokim powinowactwie MT, ponieważ silniki te mogą zmieniać ruchliwość zespołu, jeśli są sprzężone z podwoziem. Podczas tego procesu aktywne silniki rozwiązują MT i pozostają w roztworze, podczas gdy silniki mocno wiążące obracają się w pelecie MT. Pomaga to zapewnić, że wszystkie silniki w podwoziu pochodzą z aktywnej populacji.
Do badania zespołów motorycznych cytoszkieletu wykorzystano różne struktury origami DNA. Wraz ze wzrostem mechanistycznego zrozumienia transportu zespołowego, struktury origami DNA stosowane w eksperymentach stały się coraz bardziej złożone. W zasadzie każda struktura może być dostosowana do tego celu, pod warunkiem, że zostanie zmodyfikowana tak, aby zawierała miejsca przyczepiania jednoniciowego DNA dla silników i fluoroforów. Konkretne konstrukcje i atrybuty podwozia mogą być przydatne do badania konkretnych pytań dotyczących pojawiającego się zachowania zespołów silnikowych. Na przykład, sztywne pręty zostały wykorzystane do rozwinięcia podstawowej wiedzy na temat tego, jak liczba kopii wpływa na transport przez zespoły dynein i kinesyn7,15,18, a platformy 2D zostały wykorzystane do zbadania zespołowej nawigacji miozyny w sieciach aktynowych22. Struktury o zmiennej lub przestrajalnej elastyczności zostały wykorzystane do zrozumienia roli elastycznego sprzężenia między silnikami i do zbadania, w jaki sposób synchronizacja krokowa wpływa na ruchliwość8,24. Ostatnio struktury sferyczne są wykorzystywane do uzyskania wglądu w to, jak ograniczenia geometryczne do wiązania toru motorycznego wpływają na dynamikę ruchliwości25.
W tym protokole oferujemy konkretne kroki do eksperymentów zespołowych na podwoziu segmentowym o zmiennej sztywności. Miejsca wiązania na podwoziu są czasami określane jako "uchwyty", podczas gdy komplementarne sekwencje DNA, które wiążą te uchwyty, są nazywane "antyuchwytami". Liczba silników w tych podwoziach zależy od tego, które segmenty zawierają zszywki z przedłużonym uchwytem o komplementarności do oligo zapobiegającego uchwytowi w silnikach z oznaczeniem oligo. Zastosowanie różnych sekwencji uchwytów na różnych segmentach pozwala na powiązanie różnych typów silników z określonymi miejscami na podwoziu. Opisana tutaj obudowa składa się z 7 sekwencyjnych sztywnych segmentów, z których każdy składa się z 12 dwuniciowych helis DNA ułożonych w 2 koncentryczne pierścienie8. Sztywne segmenty zawierają uchwyty silnika i są połączone przez regiony, które mogą być elastycznym jednoniciowym DNA lub sztywnym dwuniciowym DNA, w zależności od braku lub obecności, odpowiednio, zszywek "łącznikowych". Zgodność konstrukcji podwozia jest zatem określana przez obecność lub brak tych zszywek "łącznikowych". Zobacz poprzednie raporty, aby uzyskać więcej informacji i szczegółowe sekwencje DNA8. Ponadto do oczyszczania chassis26 można użyć wielu metod. Metoda wirowania gradientu glicerolu w strefach szybkościowych27 jest opisana tutaj.

<table><tbody><tr><td>2 ml rurka z okrągłym dnem</td><td>USA Scientific</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>Białko tubulinowe znakowane biotyną: mózg świni, >99% czystego</td><td>Cytoskeleton.com</td><td>T333P-A</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna-BSA</td><td>Sigma</td><td>A8549-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Zespół butelki, poliwęglan, 250 mL, 62 x 120 mm</td> Butelka <td>356013</td><td></td><td>redlic Beckman</td></tr><tr><td>, z zespołem nakrętki, poliwęglan, 10,4 mL, 16 x 76 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>355603</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL</td><td>GE Healthcare</td><td>17096901</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny do chromatografii mikro Bio-Spin, puste</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204EDU</td><td></td></tr><tr><td>P8064 Rusztowanie</td><td>Tilibit</td><td>2 ml przy 400nM</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep Kolumny chromatograficzne</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>ProTev Proteaza</td><td>Promega</td><td>V6101</td><td></td></tr><tr><td>Taśma dwustronna szkocka z dozownikiem</td><td>amazon.com</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Sephacryl S-500 HR</td><td>GE Healthcare</td><td>17061310</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna</td><td>Thermo Fisher</td><td>434302</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Bezpieczne barwienie DNA</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Białko tubuliny (>99% czystości): mózg świni</td><td>Cytoskeleton.com</td><td>T240-B</td><td></td></tr><tr><td>Tubulina, HiLyte 647</td><td>Cytoskeleton.com</td><td>TL670M-A</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-przezroczyste probówki wirówkowe</td><td>Beckman Coulter</td><td>344090</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja zespołów motorycznych dyneiny i kinezyny na nanostrukturach dna origami do obserwacji pojedynczych cząsteczek

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Silniki cytoszkieletu są odpowiedzialne za szeroki zakres funkcji w komórkach eukariotycznych, w tym mitozę, transport ładunków, ruchliwość komórek i inne. Wiele z tych funkcji wymaga, aby silniki działały w zespołach. Pomimo bogatej wiedzy na temat mechanizmów działania poszczególnych silników cytoszkieletu, stosunkowo mniej wiadomo o mechanizmach i wyłaniających się zachowaniach zespołów motorycznych, których przykładami są zmiany procesowości i prędkości zespołu wraz ze zmieniającą się liczbą motoryczną, lokalizacją i konfiguracją. Strukturalna nanotechnologia DNA i specyficzna technika origami DNA umożliwia molekularną konstrukcję dobrze zdefiniowanych architektur zespołów motorycznych. Kształt konstrukcji ładunkowych, a także rodzaj, liczba i rozmieszczenie silników na konstrukcji mogą być kontrolowane. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły wytwarzania tych zespołów i obserwacji ich za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Chociaż techniki te zostały specjalnie zastosowane w przypadku silników cytoszkieletu, metody te można uogólnić na inne białka, które łączą się w kompleksy, aby wykonać swoje zadania. Ogólnie rzecz biorąc, metoda origami DNA do tworzenia dobrze zdefiniowanych zespołów białek motorycznych stanowi potężne narzędzie do analizowania mechanizmów, które prowadzą do wyłaniających się zachowań ruchliwych.

Pomyślność oczyszczania silników i struktur podwozia oceniono za pomocą elektroforezy żelowej. Analiza SDS-PAGE potwierdziła skuteczną ekstrakcję dyneiny z drożdży (Rysunek 2), ponieważ końcowy filtrat zebrany w kroku 2.3.7 wykazał wyraźny, ostry prążek na pozycji ~350 kDa. Zgodnie z oczekiwaniami, prążek dyneiny nie występował w frakcji przepływowej oraz w płukaniu, które usunęły niepożądane białka, ani w kuleczkach, z których dyneina została odcięta. Obserw...

Celem tego protokołu jest tworzenie zespołów silników molekularnych na nanostrukturach origami DNA i obserwowanie ruchliwości zespołu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem.

Produkcja zespołów motorycznych dyneiny i kinezyny na nanostrukturach DNA origami do obserwacji pojedynczych cząsteczek

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Nasz protokół ma na celu zbadanie biofizycznych mechanizmów rządzących transportem ładunków przez zespoły identycznych lub przeciwnie skierowanych białek motorycznych cytoszkieletu. Wykorzystując origami DNA do budowy molekularnej, metoda ta może wybrać typ, liczbę i lokalizację silników na precyzyjnie określonych kształtach ładunku. Chociaż protokół ten koncentruje się na silnikach opartych na mikrotubulach, dyneinie i kinezynie, można go dostosować do miozyny motorycznej opartej na aktynie, a także do innych systemów białkowych, które działają wspólnie.Jednym z wyzwań związanych z tym protokołem jest utrzymanie integralności i aktywności białek motorycznych w całym procesie oczyszczania, ponieważ są one wrażliwe na ciepło i siłę mechaniczną. Aby indukować wzrost i ekspresję białek motorycznych za pomocą promotora galaktozy, użyj sterylnej różdżki do zaszczepiania, aby rozprowadzić zamrożony szczep drożdży na płytce kultury drożdży, peptonu i dekstrozy na trzy do czterech dni inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza. W czwartym dniu hodowli, gdy gęstość optyczna przy 600 nanometrach wynosi od 1,5 do dwóch, zbierz komórki drożdży przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w wodzi

production-dynein-kinesin-motor-ensembles-on-dna-origami

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje metodę wizualizacji montażu kondensatów białek fuzyjnych na cząsteczkach DNA w określonych loci za pomocą obrazowania pojedynczych cząsteczek. Kondensaty te powstają w wyniku oddziaływań LCD-LCD i LCD-DBD, które pozwalają na rekrutację polimerazy RNA II i zwiększoną transkrypcję genów.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w celu wizualizacji łączenia kondensatów białek fuzyjnych na zasłonach DNA

Origami DNA to potężna metoda wytwarzania precyzyjnych obiektów w nanoskali poprzez programowanie samoorganizacji cząsteczek DNA. Tutaj opisujemy, w jaki sposób origami DNA można wykorzystać do zaprojektowania robota zdolnego do wyczuwania sygnałów biologicznych i reagowania poprzez zmianę kształtu, a następnie przekazywanego do pożądanego efektu.

Projektowanie bioresponsywnego robota z DNA Origami

Origami DNA to potężna metoda wytwarzania precyzyjnych obiektów w nanoskali poprzez programowanie samoorganizacji cząsteczek DNA. Tutaj opisujemy protokół składania robota reagującego biologicznie z origami DNA, jego oczyszczania i barwienia ujemnego do obrazowania pod mikroskopem elektronowym transmisyjnym (TEM).

Składanie i charakterystyka bioresponsywnego robota z DNA Origami

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Opisujemy szczegółowy protokół projektowania, symulacji, eksperymentów w laboratorium mokrym i analizy dla rekonfigurowalnego stojaka harmonijkowego DNA o oczkach 6 na 6.

Projekt i synteza rekonfigurowalnego stojaka na akordeon DNA

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół ligacji T4 i denaturacji PAGE oczyszczania małych kolistych cząsteczek DNA, wyżarzania i natywnej analizy PAGE okrągłych płytek, montażu i obrazowania AFM nanostruktur DNA 1D i 2D, a także elektroforezy w żelu agarozowym i wirowania oczyszczania skończonych nanostruktur DNA.

Stabilne motywy DNA, nanostruktury 1D i 2D zbudowane z małych kolistych cząsteczek DNA

Prezentujemy protokół budowy molekularnych wahadłowców, gdzie przylegające do powierzchni białka motoryczne kinezyny napędzają mikrotubule znakowane barwnikiem. Słabe oddziaływania kinezyn z powierzchnią umożliwiają ich odwracalne przywiązanie do niej. W ten sposób powstaje system w nanoskali, który wykazuje dynamiczny montaż i demontaż swoich elementów przy zachowaniu swojej funkcjonalności.

Montaż molekularnych wahadłowców zasilanych przez odwracalnie przyłączone kinezyny

Tutaj opisujemy protokół tworzenia dyskretnych i dokładnych nieorganicznych nanostruktur na podłożach, używając kształtów origami DNA jako szablonów prowadzących. Metoda jest demonstrowana poprzez tworzenie plazmonicznych złotych anten w kształcie muszki na przezroczystym podłożu (szafirze).

Nanowzorce substratów DNA origami struktur nieorganicznych do zastosowań detekcyjnych

Dwukierunkowa mitoza kinezyna-5 Cin8 gromadzi się w klastrach, które rozdzielają się i łączą podczas swojej ruchliwości. Akumulacja w gromadach zmienia również prędkość i kierunkowość Cin8. W tym miejscu opisano protokół oznaczania ruchliwości z oczyszczonym Cin8-GFP oraz analizy właściwości ruchliwych pojedynczych cząsteczek i klastrów Cin8.

Ruchliwość pojedynczych cząsteczek i klastrów dwukierunkowej kinezyny-5 Cin8 oczyszczonej z komórek S. cerevisiae

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

To badanie szczegółowo opisuje oczyszczanie KIF1A(1-393LZ), członka rodziny kinezyny-3, przy użyciu systemu ekspresji Sf9-bakulowirusa. Analiza in vitro pojedynczych cząsteczek i wielu silników ślizgowych tych oczyszczonych silników wykazała silne właściwości ruchliwości porównywalne z silnikami z lizatu komórkowego ssaków. W ten sposób system Sf9-bakulowirusa jest podatny na ekspresję i oczyszczanie białka motorycznego będącego przedmiotem zainteresowania.

Analiza pojedynczych cząsteczek oczyszczonych superprocesyjnych silników z rodziny Kinesin-3 Sf9

Poznaj metodę tworzenia zespołów motorycznych dyneiny i kinezyny na nanostrukturach DNA origami do obserwacji pojedynczych cząsteczek. Protokół umożliwia badanie mechanizmów transportu ładunków w komórkach.

Produkcja zespołów motorycznych dyneiny i kinezyny na nanostrukturach DNA origami do obserwacji pojedynczych cząsteczek

Przeglądaj więcej filmów