Name: Wytwarzanie wielokomórkowych ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania wielokomórkowych ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych z komórek nabłonkowych i międzykomórkowych. Ten model 3D umożliwia badanie odpowiedzi hormonalnych i testowanie leków w warunkach fizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez NIEHS/NIH/NCATS UG3 grant (ES029073) oraz Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge Fund (JJK). Chcielibyśmy podziękować Northwestern Pathology Core Facility za przetwarzanie utrwalonych organoidów do zatapiania parafiny. Chcielibyśmy podziękować całemu zespołowi UG3, w tym laboratoriom Woodruff, Burdette i Urbanek, za wnikliwe dyskusje i współpracę.

Próbki endometrium zostały pobrane od kobiet przed menopauzą poddanych rutynowej histerektomii z powodu łagodnych chorób macicy w Northwestern University Prentice Women's Hospital, zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Institutional Review Board. Uzyskano pisemną zgodę od wszystkich kobiet włączonych do badania.
1. Przygotowanie form agarozowych
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem izolacji komórek należy odlać i zrównoważyć 1,5% mikroformy agarozowe (tabela materiałów), aby pomieścić organoidy zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
2. Generacja organoidów endometrialnych
<ol>
	<li>Zbierz pierwotne komórki zrębu i nabłonka
	<ol>
		<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu techniki aseptycznej przygotować roztwór enzymu (2,5 mg/ml kolagenazy typu I + 0,1 mg/ml DNazy I w 10 ml dypazy [500 jednostek]) w temperaturze 37 °C i sterylnie przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu techniki aseptycznej zeskrob endometrium z biopsji macicy i zmiel tkankę pod kapturem na bardzo małe kawałki za pomocą skalpela. 
		nuta: Tkanka endometrium o wymiarach co najmniej 20 mm x 10 mm x 1 mm jest wymagana do wytworzenia wystarczającej liczby organoidów.</li>
		<li>Umieść świeżo zmieloną tkankę w roztworze enzymu w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Zamknij nakrętkę i owiń górę folią woskową (tabela materiałów), aby zapobiec zanieczyszczeniu.</li>
		<li>Umieścić probówkę z chusteczką w łaźni wodnej lub inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut, delikatnie wstrząsając (80−100 obr./min).</li>
		<li>Ułóż sitko o pojemności 100 μm na sitku o pojemności 20 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Przefiltrować roztwór przez dwa sitka, a następnie przepłukać stożkową probówkę o pojemności 15 ml 10 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS; Tabela materiałów) i przełóż płukanie przez sitko, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane. 
		nuta: Płyn przepływowy zawiera komórki zrębu i czerwone krwinki (łącznie ~20 ml). Komórki nabłonka zbiera się na sitku o średnicy 20 μm. Kawałki niestrawionej tkanki pozostają na wierzchu sitka o średnicy 100 μm. Wyrzuć niestrawioną tkankę do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne.</li>
		<li>Odwrócić sitko o wielkości 20 μm z kroku 2.1.5 do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zmyć komórki nabłonka z sitka za pomocą 20 ml pożywki organoidowej (tabela materiałów) uzupełnionej 1% wstrzykiwaczem/paciorkowiec.</li>
		<li>Odwirować stożkowe probówki z etapów 2.1.5 i 2.1.6 przy 500 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Z zebranymi komórkami zrębu usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad z 10 ml buforu do lizy czerwonych krwinek. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10-15 min. Odwirować stożkową probówkę przy 500 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad z 200−300 μl pożywki organoidowej (dalsze instrukcje znajdują się w kroku 2.2.2).</li>
		<li>Po zebraniu komórek nabłonka usunąć supernatant i ponownie zawiesić ze 100 μl pożywki organoidowej (dalsze instrukcje znajdują się w kroku 2.2.2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki wysiewające
	<ol>
		<li>Po zrównoważeniu 1,5% form agarozy w studzienkach (1 pleśń na studzienkę) płytki 24-dołkowej, należy usunąć pożywkę organoidową na zewnątrz form agarozowych i przechylić płytkę do hodowli tkankowej tak, aby można było również ostrożnie usunąć pożywkę z komory wysiewu komórek szalek agarozowych.</li>
		<li>Zobacz zawiesiny komórek nabłonka (od kroku 2.1.9) i zrębu (od kroku 2.1.8) pod mikroskopem. Dodaj więcej pożywki organoidowej do zawiesin komórek nabłonka lub zrębu po 100 μl na raz, tak aby zawiesiny miały mniej więcej równą gęstość. 
		nuta: Komórki nabłonkowe będą się zlepiać ze sobą i nie zaleca się trawienia/trypsynizacji komórek nabłonka w zawiesiny pojedynczych komórek.</li>
		<li>Połącz objętościowo 1 część komórek zrębu z 3 częściami komórek nabłonkowych.</li>
		<li>Odpipetować 50 μl (60 000 komórek) zawiesiny połączonych komórek do komory wysiewu komórek formy agarozowej.</li>
		<li>Gdy formy agarozy zostaną wypełnione komórkami, ostrożnie dodaj 400 μl świeżej pożywki organoidowej do dołka 24-dołkowej płytki. 
		nuta: Pożywka sięga tuż pod powierzchnię szalek agarozowych i nie spowoduje wypływania komórek z pleśni. Po 2-3 dniach komórki osiądną i zaczną tworzyć organoidy.</li>
		<li>Zmieniaj pożywkę co drugi dzień z 500 μl pożywki organoidowej.</li>
		<li>Po 2-3 dniach zmień podłoże na takie, które jest uzupełnione 0,1 nM estradiolu (E) i 0,8 nM testosteronu (T), aby promować organizację komórek nabłonka i zrębu. 
		nuta: Chociaż organizacja komórek nabłonkowych i zrębowych może zachodzić z hormonami lub bez nich, więcej organoidów zorganizuje się w obecności hormonów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pozyskiwanie organoidów endometrialnych do eksperymentów
UWAGA: Po zakończeniu eksperymentu, organoidy endometrialne mogą być przetwarzane do analizy histologicznej lub RNA. Poniższe kroki opisują, jak przetwarzać organoidy.
<ol>
	<li>histologia
	<ol>
		<li>Rozpuścić 1,5% agarozy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez gotowanie. Pozostawić płynną agarozę do ostygnięcia do temperatury około 50 °C.</li>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym przechylić 24-dołkową płytkę i ostrożnie odpipetować pożywkę z zewnętrznej strony formy agarozowej. Ostrożnie odpipetować pożywkę z wnętrza formy agarozowej, aby uniknąć uszkodzenia organoidów.</li>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie odpipetować 70-75 μl ciepłej (50 °C) 1,5% agarozy do komory naczynia z agarozą. Uważaj, aby nie naruszyć organoidów.</li>
		<li>Pozostawić do ostygnięcia w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Dodać 4% paraformaldehydu (PFA) do każdego dołka na płytce 24-dołkowej i przymocować całą szczelną formę agarozy zawierającą organoidy na noc w temperaturze 4 °C. Następnie przechowywać w 70% etanolu w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowy do przetworzenia w celu zatopienia parafiny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja RNA
	<ol>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym przechylić 24-dołkową płytkę i ostrożnie odpipetować pożywkę z komory formy agarozowej.</li>
		<li>Na siłę odpipetować 1 ml świeżej pożywki organoidowej bezpośrednio do formy agarozowej, aby organoidy zostały wypłukane z mikrostudzienek. Uważaj, aby nie stworzyć zbyt wielu bąbelków.</li>
		<li>Powtórzyć pipetowanie ponownie z tym samym podłożem z kroku 3.2.2.</li>
		<li>Zebrać całą pożywkę zawierającą organoidy. Wirować z maksymalną prędkością, aby zebrać organoidy i przystąpić do ekstrakcji RNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocrine+and+paracrine+control+of+menstruation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The endocrine and paracrine control of menstruation.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidualization+of+the+human+endometrium%3A+mechanisms%2C+functions%2C+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+decidualization+of+the+human+endometrium+in+reproductive+health+and+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure.</a> Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiproliferative+action+of+progesterone+in+uterine+epithelium+is+mediated+by+Hand2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2.</a> Science. 331 (6019), 912-916 (2011).</li>
<li>Wetendorf, M., DeMayo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progesterone+receptor+regulates+implantation%2C+decidualization%2C+and+glandular+development+via+a+complex+paracrine+signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).</li>
<li>Turco, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+hormone-responsive+organoid+cultures+of+human+endometrium+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).</li>
<li>Kurita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+progesterone+receptors+mediate+the+inhibitory+effects+of+progesterone+on+estrogen-induced+uterine+epithelial+cell+deoxyribonucleic+acid+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis.</a> Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).</li>
<li>Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+action+in+endometrial+cancer%2C+endometriosis%2C+uterine+fibroids%2C+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer.</a> Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).</li>
<li>Bui, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+serum+testosterone+during+the+menstrual+cycle+evaluated+by+daily+measurements+with+an+ID-LC-MS%2FMS+method+and+a+2nd+generation+automated+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay.</a> Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).</li>
<li>Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+endometrial+organoids+respond+to+excess+androgens+associated+with+polycystic+ovarian+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Uzyskaliśmy ludzkie organoidy endometrialne składające się z komórek nabłonka i zrębu błony śluzowej macicy bez użycia egzogennych materiałów rusztowaniowych. Chociaż wykazano już, że pierwotne komórki nabłonka endometrium mogą tworzyć organoidy 6,7, komórki te zostały osadzone w galaretowatej matrycy białek wydzielanych przez komórki mięsaka myszy (patrz tabela materiałów), aby pomóc w tworzeniu struktur podobnych do sferoid. Ponadto brakowało k...

Ludzki endometrium wyściela jamę macicy i służy jako pierwszy kontakt dla zarodka podczas implantacji. Endometrium składa się z komórek nabłonka światła i gruczołowego, podporowych fibroblastów zrębu, komórek śródbłonka i komórek odpornościowych. Razem te typy komórek tworzą tkankę endometrium, która jest jedną z najbardziej wrażliwych tkanek na hormony steroidowe płci 1. Zmiany, które zachodzą podczas każdego cyklu miesiączkowego, są uderzające. Odpowiedni wzrost i przebudowa błony śluzowej macicy, aby umożliwić zagnieżdżenie się zarodka. Nieprawidłowa reakcja na estrogen i progesteron może skutkować opornym na leczenie endometrium, które nie pozwala na pomyślne zajście w ciążę, a nawet może prowadzić do chorób, w tym neoplazji endometrium.
W celu zbadania odpowiedzi hormonalnych i istotnych zmian zachodzących w endometrium, komórki z tkanek endometrium pobranych od pacjentek podczas operacji lub biopsji endometrium zostały namnażone w hodowli komórkowej. Komórki zrębu endometrium preferencyjnie proliferują i łatwo się rozmnażają, a proces różnicowania indukowany przez progesteron można podsumować in vitro. W rezultacie, wiele się nauczyliśmy podczas tego procesu różnicowania, określanego jako decydualizacja2,3. Drugi główny typ komórek w endometrium, komórki nabłonka światła i gruczołowe, nie rosną jednak dobrze jako tradycyjne monowarstwy, tracąc polarność, starzejąc się i mając ograniczony potencjał proliferacyjny. W rezultacie mniej wiadomo o ich biologii i roli w ludzkim endometrium. Ponieważ wiele nowotworów wywodzi się z komórek nabłonkowych, mechanizmy związane z hiperplazją lub transformacją w komórki rakowe pozostają do pełnego zdefiniowania. Ponadto badania wykazały, że odpowiedź hormonalna obejmuje intymne działania parakrynne między komórkami nabłonkowymi i zrębowymi endometrium4,5.
Niedawno, trójwymiarowa (3D) hodowla organoidów komórek nabłonka endometrium została założona przez dwie niezależne grupy6,7, które są pierwszymi doniesieniami o organoidach utworzonych z tkanki endometrium. Organoidy te składały się z komórek nabłonka endometrium osadzonych w macierzy białkowej (tabela materiałów) i nie zawierały ważnego przedziału hormonalnego endometrium, fibroblastów zrębu. Ponieważ białka macierzy mogą się różnić w zależności od partii i mogą uruchamiać szlaki sygnałowe, które niekoniecznie występują w tkance, idealnym rozwiązaniem byłoby zastąpienie białek macierzy składnikami endometrium. W niniejszym badaniu przedstawiono protokół generowania wolnych od rusztowań ludzkich organoidów endometrialnych komórek nabłonka i zrębu ludzkiego endometrium. Obecność komórek zrębu nie tylko zapewnia wsparcie dla komórek nabłonkowych, ale także zapewnia niezbędne działania parakrynne, które zostały uznane za ważne dla odpowiedzi hormonalnej endometrium4,8,9.
Nowy wielokomórkowy organoid endometrium oferuje system modelowy endometrium, który jest prosty do wygenerowania i który zawiera zarówno komórki nabłonkowe, jak i zrębowe. Te organoidy mogą być wykorzystywane do badania długoterminowych zmian hormonalnych i wczesnych zdarzeń chorobowych, takich jak nowotworzenie z powodu braku równowagi hormonalnej lub egzogennych urazów. Złożoność tych organoidów może ostatecznie zostać rozszerzona o inne typy komórek, w tym komórki śródbłonka i układu odpornościowego z prawdopodobnie komórkami mięśniówki macicy, aby naprawdę naśladować fizjologię tkanek ludzkich.

<table><tbody><tr><td>Agaroza HS, klasa biologii molekularnej</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Formy agarozowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z764043</td><td>(https://www.microtissues.com/)</td></tr><tr><td>Chlorek amonu (NH4Cl)</td><td>Amresco</td><td>0621</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2257</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza, typ II, proszek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Corning</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna Stain</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>Receptor estrogenowy (SP1), królicze przeciwciało monoklonalne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-9101-S</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield z DAPI, podłoże do montażu histologicznego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td>1x bez czerwieni wapniowej, magnezowej i fenolowej</td></tr><tr><td>Roztwór barwienia hematokaliny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3530-32</td><td>Zmodyfikowana formuła Harrisa, bezrtęciowy</td></tr><tr><td>roztwór heparyny</td><td>STEMCELL Technologie</td><td>07980</td><td>dodany do pożywki MammoCult</td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy hydrokortyzonu</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07925</td><td>dodany do podłoża MammoCult</td></tr><tr><td>Pożywki organoidowe - Mammocult</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05620</td><td>uzupełniony o 2 &mikro; L/ml heparyny i 5 &mikro; L/ml hydrokortyzon</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 16% roztwór</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem, pH 7,4</td> Receptor progesteronowy <td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>, PgR 1294, niesprzężony, supernatant kultury</td><td>Agilent Technologies</td><td>M356801-2</td><td></td></tr><tr><td>matryca białkowa - Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone mysie przeciwciało anty-E-kadheryny</td><td>BD Biociences</td><td>610181</td><td>Clone 36</td></tr><tr><td>Rekombinowane przeciwciało anty-wimentynowe [EPR3776]</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do lizy i izolacji RNA</td><td>Zymo Research</td><td>R2060</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Testosteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86500</td><td></td></tr><tr><td>Plama trójchromowa</td><td>Abcam</td><td>ab150686</td><td></td></tr><tr><td>Film woskowy - Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie wielokomórkowych ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Ludzka endometrium jest jedną z najbardziej reagujących hormonalnie tkanek w organizmie i jest niezbędna do zajścia w ciążę. Tkanka ta może również ulec chorobie i spowodować zachorowalność, a nawet śmierć. Systemy modelowe do badania biologii endometrium człowieka zostały ograniczone do systemów hodowli in vitro pojedynczych typów komórek. Ponadto komórki nabłonkowe, jeden z głównych typów komórek endometrium, nie rozmnażają się dobrze ani nie zachowują swoich cech fizjologicznych w hodowli, a zatem nasza wiedza na temat biologii endometrium pozostaje ograniczona. Po raz pierwszy udało nam się wygenerować organoidy endometrialne, które składają się zarówno z komórek nabłonkowych, jak i zrębowych ludzkiego endometrium. Te organoidy nie wymagają żadnych egzogennych materiałów rusztowań i specjalnie organizują się tak, że komórki nabłonkowe obejmują strukturę podobną do sferoidy i stają się spolaryzowane z komórkami zrębu w środku, które wytwarzają i wydzielają kolagen. Receptory estrogenowe, progesteronowe i androgenowe ulegają ekspresji w komórkach nabłonka i zrębu, a leczenie fizjologicznymi poziomami estrogenu i testosteronu sprzyja organizacji organoidów. Ten nowy system modelowy może być wykorzystany do badania prawidłowej biologii i chorób endometrium w sposób, który wcześniej nie był możliwy.

Schemat protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Tkanka macicy została pobrana podczas operacji po badaniu patomorfologicznym. Wyściółka endometrium została oddzielona od mięśnia macicy poprzez skrobanie, a następnie tkanka endometrium została poddana trawieniu enzymatycznemu do pojedynczych komórek zgodnie z opisem w protokole. Komórki nabłonkowe i zrębowe wprowadzono do mikrootworów w formach agarowych. Po 7 dniach hodowli organoidy poddano działaniu E i T przez dodatkowe 7−14 dni.
<p cla...

Przedstawiono protokół generowania ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych, które składają się z komórek nabłonkowych i zrębowych oraz zachowują cechy natywnej tkanki endometrium. Protokół ten opisuje metody od pozyskania tkanki macicy do histologicznego przetwarzania organoidów endometrialnych.

Wytwarzanie wielokomórkowych ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Endometrium to tkanka, która zmienia się co miesiąc w odpowiedzi na hormony. Brak równowagi hormonalnej może zapobiegać przyczepianiu się zarodka, a także powodować choroby, takie jak rak. Nasz protokół odbudowuje błonę śluzową macicy, dzięki czemu można ją badać poza organizmem kobiety w sposób fizjologiczny.Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona trójwymiarową strukturę komórek składającą się z dwóch hormonalnie reagujących typów komórek, komórek nabłonka i zrębu, które specyficznie organizują się i zachowują tak, jak w organizmie. Ponieważ organoidy mogą lepiej naśladować zachowanie tkanek, ostatecznie można je wykorzystać do testowania różnych leków. Organoidy endometrium mogą być wykorzystywane do badania bezpośredniego wpływu obecnie znanych czynników ryzyka raka, w tym otyłości i zespołu policystycznych jajników.Nasze organoidy podkreślają znaczenie działania parakrynnego między dwoma typami komórek. Ważne jest, aby zacząć od odpowiedniej ilości tkanki. Uzyskanie odpowiedniej gęstości komórek nabłonkowych i zrębowych może być trudne.Ponadto organoidy są dość małe i mogą być trudne do uwidocznienia za pomocą barwienia IHC. Wizualizacja tej procedury jest ważna, ponieważ istnieją pewne kroki, które będą znacznie łatwiejsze do zrozumienia po ich zobaczeniu. Obejmują one uzyskanie odpowiedniej warstwy tkankowej macicy, uzyskanie odpowiedniej gęstości komórek do połączenia i wysiew pleśni agarozy.Przed rozpoczęciem izolacji komórek odlać i zrównoważyć 1,5% mikroformy agarozy zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi przechowywania organoidów. W komorze bezpieczeństwa biologicznego należy zastosować techniki aseptyki, aby przygotować roztwór enzymu w temperaturze 37 stopni Celsjusza i sterylnie przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 0,2 mikrometra do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Za pomocą skalpela zeskrob endometrium z biopsji macicy i zmiel tkankę na bardzo małe kawałki.Umieść świeżo zmieloną tkankę w 15-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej roztwór enzymu. Zamknij nakrętkę i owiń górną część tubki folią woskową, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Umieść probówkę w łaźni wodnej lub inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, delikatnie wstrząsając.Następnie ułóż sitko o średnicy 100 mikronów na sitku o średnicy 20 mikronów na stożkowej probówce o średnicy 50 mililitrów. Przefiltrować roztwór przez dwa sitka. Przepłucz 15-mililitrową stożkową rurkę HBSS i przelej ten płyn przez sitko, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane.Następnie odwróć sitko komórkowe o średnicy 20 mikronów na nową stożkową rurkę o pojemności 50 mililitrów i zmyj komórki nabłonka z sitka za pomocą 20 mililitrów pożywki organoidowej uzupełnionej 1% penicyliną i streptomycyną. Odwirować stożkowe probówki o stężeniu 500 G przez pięć minut. W przypadku pobranych komórek zrębu należy usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut. Odwirować te komórki w temperaturze 500 G przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą 200 do 300 mikrolitrów pożywki organoidowej.W przypadku pobranych komórek nabłonka należy usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach pożywki organoidowej. Po wyrównaniu 1,5% form agarozy usuń pożywki organoidowe na zewnątrz form agarozowych i przechyl płytkę do hodowli tkankowej, aby można było również ostrożnie usunąć pożywkę z komory wysiewu komórek szalek agarozowych. Zobacz zawiesiny komórek nabłonka i zrębu pod mikroskopem i dodaj więcej pożywek organoidowych do zawiesin, upewniając się, że dodajesz tylko 100 mikrolitrów na raz, aby zawiesina miała mniej więcej równą gęstość.Następnie połącz jedną część komórek zrębu z trzema częściami komórek nabłonka objętościowo. Odpipetować 50 mikrolitrów połączonej zawiesiny komórkowej do komory wysiewu komórek formy agarozowej. Gdy formy agarozy zostaną wypełnione komórkami, ostrożnie dodaj 400 mikrolitrów świeżych pożywek organoidowych do dołków 24-dołkowej płytki.Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, pamiętając o zmianie pożywki co drugi dzień za pomocą 500 mikrolitrów pożywki organoidowej. Po siedmiu dniach zmień podłoże na takie, które jest uzupełnione 0,1 nanomolowym estradiolem i 0,8 nanomolowym testosteronem, aby promować organizację komórek nabłonka i zrębu. Najpierw rozpuść 1,5% agarozy w PBS przez gotowanie.Umieść płynną agarozę w zlewce z gorącą wodą i pozwól jej ostygnąć do około 50 stopni Celsjusza. Pod mikroskopem preparacyjnym przechylić 24-dołkową płytkę i ostrożnie odpipetować pożywkę z zewnętrznej strony formy agarozowej. Następnie ostrożnie odpipetować pożywkę z wnętrza formy agarozowej, aby uniknąć uszkodzenia organoidów.Ostrożnie dodaj od 70 do 75 mikrolitrów ciepłej, 1,5% agarozy do komory naczynia z agarozą, uważając, aby nie naruszyć organoidów. Pozwól talerzowi ostygnąć w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodaj 4% paraformaldehydu do każdego dołka 24-dołkowej płytki i utrwal całą zapieczętowaną formę agarozy na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia przechowuj płytkę w 70% etanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do przetworzenia w celu zatopienia parafiny. Aby rozpocząć izolację RNA, obejrzyj płytkę pod mikroskopem preparacyjnym. Przechylić płytkę i ostrożnie odpipetować pożywkę z komory formy agarozowej.Na siłę odpipetuj jeden mililitr świeżej pożywki organoidowej bezpośrednio do formy agarozy, aby organoidy zostały wypłukane z mikrodołków, uważając, aby nie utworzyć zbyt wielu pęcherzyków. Powtórz ten intensywny proces pipetowania jeden raz, używając tego samego podłoża. Następnie zbierz całą pożywkę zawierającą organoidy.Odwirować przy 500 G w celu zebrania organoidów i przystąpić do ekstrakcji RNA. W tym badaniu ludzkie organoidy endometrium składające się z komórek nabłonka i zrębu błony śluzowej macicy są generowane bez użycia egzogennych materiałów rusztowaniowych. W celu przetwarzania histologicznego formy agarozy zawierające organoidy endometrium są uszczelniane agarozą, a następnie utrwalane 4% paraformaldehydem przez noc.Formy te są przetwarzane do standardowego zatapiania parafiny, cięte i barwione do histologii, immunofluorescencji lub immunohistochemii. Hematoksylina w barwieniu eozyną ujawnia sferoidalną strukturę z pojedynczą warstwą komórek wyściełających na zewnątrz i komórki pośrodku. Markery specyficzne dla komórek endometrium, nabłonka i zrębu ujawniają komórki nabłonkowe otaczające organoid z komórkami zrębu pośrodku.Markery fizjologii endometrium potwierdzają, że organoidy endometrialne zachowały pewne cechy tkanki natywnej. Barwienie trójchromowe, które barwi kolagen na niebiesko, a komórki na czerwono, pokazuje obecność kolagenu w środku, w którym znajdowały się komórki zrębu, wykazując aktywną produkcję i wydzielanie kolagenu przez komórki zrębu podobne do tkanki natywnej. Ponadto barwienie immunohistochemiczne ujawnia obecność receptorów estrogenowych, receptorów androgenowych i receptorów progesteronowych zarówno w komórkach nabłonka, jak i zrębu.Ważne jest, aby gęsto platerować komórki, aby mieć wystarczającą ilość organoidów do dalszych eksperymentów. Będzie to wymagało trochę praktyki. Organoidy endometrium mogą być hodowane w różnych warunkach, a następnie zbierane do eksperymentów, takich jak immunohistochemia lub barwienie immunofluorescencyjne w celu zbadania ekspresji białek, lub zbierane do RNA w celu zbadania ekspresji genów.Nasze laboratorium bada, w jaki sposób endometrium reaguje na zmieniony poziom hormonów, co może prowadzić do przerostu endometrium i raka. Możemy wykorzystać te organoidy do długotrwałego leczenia hormonów i dodać stany patologiczne, takie jak nadmiar testosteronu znajdujący się w zespole policystycznych jajników lub sygnały z adipocytów do badania zmian endometrium wywołanych otyłością. Tkanki ludzkie są uważane za niebezpieczne biologicznie i ważne będzie podjęcie odpowiednich środków ostrożności.

generation-of-multicellular-human-primary-endometrial-organoids

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Cała struktura 3D i zawartość komórkowa organoidów, jak również ich fenotypowe podobieństwo do oryginalnej tkanki, mogą być uchwycone za pomocą opisanego tutaj protokołu obrazowania 3D o rozdzielczości pojedynczej komórki. Protokół ten może być stosowany do szerokiej gamy organoidów różniących się pochodzeniem, rozmiarem i kształtem.

Trójwymiarowe obrazowanie nienaruszonych organoidów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Tutaj opisane są cztery metody generowania organoidów jąder z pierwotnych komórek jąder myszy noworodków, tj. macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) oraz środowiska hodowli 2D i 3D wolne od ECM. Techniki te mają wiele zastosowań badawczych i są szczególnie przydatne do badania rozwoju jąder i fizjologii in vitro.

Pozakomórkowe i pozakomórkowe wolne od macierzy komórkowej wytwarzanie mysich organoidów jąder

Przedstawiamy protokół rozwoju kultur organoidów nabłonkowych, zaczynając od ludzkiego zęba. Organoidy są bardzo rozprężalne i rekapitulują nabłonkowe komórki macierzyste zęba, w tym ich zdolność do różnicowania ameloblastów. Unikalny model organoidowy stanowi obiecujące narzędzie do badania biologii ludzkiej uzębienia (komórek macierzystych) z perspektywami podejścia regeneracyjnego zębów.

Ustanowienie organoidów z ludzkiego zęba jako potężnego narzędzia w kierunku badań mechanistycznych i terapii regeneracyjnej

Ten protokół opisuje metodologie tworzenia organoidów nabłonka endometrium myszy do ekspresji genów i analiz histologicznych.

Ustalanie organoidów endometrialnych 3D z macicy myszy

Protokół ten opisuje wytwarzanie szybkich i powtarzalnych endodermalnych organoidów wątrobowych (eHEPO). Dzięki temu protokołowi eHEPO mogą być produkowane w ciągu 2 tygodni i rozwijać się w dłuższej perspektywie (ponad 1 rok) bez utraty swojego zróżnicowania i funkcjonalności.

Wytwarzanie funkcjonalnych endodermalnych organoidów wątroby

Ten protokół opisuje tworzenie trójwymiarowych (3D) organoidów tkankowych z pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka powierzchniowego jajnika (hOSE). Protokół obejmuje izolację hOSE ze świeżo pobranych jajników, ekspansję komórkową hOSE, procedury krioprezerwacji-rozmrażania oraz wyprowadzanie organoidów. Uwzględniono immunofluorescencję, analizę ilościową i prezentację użyteczności jako platformy przesiewowej.

Organoidy nabłonka powierzchni jajników człowieka jako platforma do badania regeneracji tkanek

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli komórek macierzystych nabłonka endometrium szczurów (reESC), generując organoidy endometrialne szczurów. Metoda ta ułatwia badania in vitro chorób endometrium, umożliwiając edycję genów i inne manipulacje komórkowe.

Generowanie i charakterystyka organoidów macicy szczura z komórek macierzystych nabłonka endometrium szczura

Przedstawiamy szczegółowy protokół ustanowienia i genetycznej modyfikacji ludzkich organoidów szyjnych szyjki macicy.

Generowanie i manipulacja genetyczna ludzkich organoidów szyjnych

Ten protokół opisuje określoną metodę opartą na hydrożelu do generowania ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają kluczowe cechy morfogenezy sutka w kontrolowanym trójwymiarowym układzie kultury.

Zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka

Modelowanie rozwoju ludzkiego mózgu zostało utrudnione z powodu bezprecedensowej złożoności tkanki nabłonka nerwowego. W tym artykule opisano metodę wytwarzania organoidów mózgowych w celu wyznaczenia wczesnych zdarzeń rozwoju ludzkiego mózgu i modelowania małogłowia in vitro.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu pochodzących z iPSC w celu modelowania wczesnych zaburzeń neurorozwojowych

Poznaj metodę wytwarzania wielokomórkowych ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych z komórek nabłonkowych i międzykomórkowych. Ten model 3D umożliwia badanie odpowiedzi hormonalnych i testowanie leków w warunkach fizjologicznych.

Wytwarzanie wielokomórkowych ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych

Przeglądaj więcej filmów