Generowanie organoidów jąder świń o architekturze specyficznej dla jąder przy użyciu hodowli mikrostudzienek

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala na generowanie organoidów jąder, które mogą być wykorzystywane jako platforma do badania morfogenezy jąder oraz do badań przesiewowych leków i toksyczności o wysokim poziomie tropo. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest wysoce powtarzalna, wymaga stosunkowo niewielkiej liczby komórek i może być wykorzystana do wygenerowania dużej liczby organoidów jąder o architekturze specyficznej dla jąder. Metoda ta może być stosowana do badania innych układów, takich jak pluripotencjalne komórki macierzyste lub komórki wysp trzustkowych z niezbędnymi optymalizacjami.

Procedurę enzymatycznego trawienia tkanki jąder zademonstruje Anna Voigt, doktorantka z mojego laboratorium. Zebrać jądro do sterylnej zlewki i przemyć PBS zawierającym 1% penicyliny streptomycyny. Po umyciu przenieść jądro do 100-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej z PBS zawierającym 1% penicyliny streptomycyny.

Użyj autoklawowanych nożyczek i kleszczy, aby usunąć osłonkę pochwy i najądrza. Przenieś izolowane jądro do nowego 100 milimetrowego naczynia i dokładnie umyj PBS zawierającym 1% penicyliny streptomycyny. Przetnij jądro wzdłuż osi podłużnej bezpośrednio pod tuniką.

Następnie obierz jądro z tuniki za pomocą dwóch kleszczy i umieść je w nowym 100-milimetrowym naczyniu zawierającym 1 mililitr DMEM z 1% streptomycyną penicyliny. Zmiel obrane jądro sterylnymi nożyczkami na jeden do dwóch milimetrowych kawałków tkanki. Po rozdrobnieniu użyj sterylnych kleszczyków, aby usunąć białe fragmenty tkanki łącznej.

Przenieś kawałki tkanki mielonej do roztworu A w probówce o pojemności 50 mililitrów i uzupełnij do 50 mililitrów DMEM, aby uzyskać stężenie 0,4 miligrama na mililitr dla kolagenazy 4S i stężenie 0,8 miligrama na mililitr dla kolagenazy 4W. Umieść probówkę zawierającą kawałki tkanki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut. Delikatnie odwracaj rurkę co pięć minut.

Po 30 minutach odwirować probówkę o sile 90 razy G z przerwami w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 1,5 minuty. Odrzucić supernatant dodać 40 mililitrów roztworu B i uzupełnić do 50 mililitrów DMEM, aby uzyskać stężenie 1,2 miligrama na mililitr kolagenazy 4W. Umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut i delikatnie odwracaj probówkę co pięć minut.

Odwirować probówkę przy 90 razy G z przerwami w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 1,5 minuty. Następnie odrzuć supernatant i przemyj raz PBS z 1% penicyliną streptomycyną. Ostrożnie zbierz kanaliki od góry i umieść w nowej 50-mililitrowej tubie.

Uzupełnij probówkę PBS do 50 mililitrów. Odwirować kanaliki w temperaturze 90 razy G z przerwami w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 1,5 minuty. Odrzucić supernatant i dodać świeży PBS do przemycia jeszcze dwa razy.

Po ostatnim płukaniu PBS usunąć supernatant i ponownie zawiesić kanaliki nasienne w pięciu mililitrach PBS. Następnie dodaj 15 mililitrów 0,25% trypsyny EDTA do kanalików. Umieść rurkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i delikatnie odwracaj co dwie minuty.

Po pięciu minutach oceń trawienie enzymatyczne kanalików do pojedynczych komórek pod mikroskopem z 10 mikrolitrami próbki na płytce do hodowli tkankowej. Co dwie minuty umieszczaj próbkę pod mikroskopem w celu obserwacji. Jeśli można wykryć głównie pojedyncze komórki, przerwij reakcję za pomocą pięciu mililitrów FBS i przefiltruj przez siatkę o wielkości 70 mikronów, a następnie przez siatkę o wielkości 40 mikronów.

Odwirować pojedyncze komórki w temperaturze 500 razy G z przerwami w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć minut. Ponownie zawiesić w 50 mililitrach pożywki wzbogacającej i policzyć liczbę żywotnych komórek za pomocą hemocytometru. Przenieś 20 milionów tej początkowej populacji komórek do każdej z dwóch 100-milimetrowych szalek Petriego o bardzo niskim przyłączeniu i inkubuj w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 21% tlenu przez dwa dni.

Scedować od 20 do 25 milionów komórek pozostałej początkowej populacji komórek na 100-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowej w całkowitej objętości ośmiu mililitrów pożywki wzbogacającej. Umieść naczynie w inkubatorze i po 1,5 godziny upewnij się, że większość komórek Sertoliego jest przymocowana do płytki. Lekko przechylić dwie płytki, aby zebrać i połączyć supernatanty w jedną nową 100-milimetrową płytkę i umieścić ją z powrotem w inkubatorze.

Po godzinie ponownie połącz supernatanty z dwóch płytek na nową płytkę o średnicy 100 milimetrów. Umieść płytki z powrotem w inkubatorze na noc. Następnie zbierz wzbogacone komórki rozrodcze w dwie frakcje, frakcję nieprzylegającą i frakcję lekko przylegającą.

Zebrać supernatant jako frakcję nieprzylegającą. Aby uzyskać lekko przylegającą frakcję, delikatnie umyj płytki PBS i potraktuj dwoma mililitrami rozcieńczenia od 1 do 20 0,25% trypsyny EDTA przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zatrzymaj reakcję, dodając dwa mililitry pożywki wzbogacającej i zbierz w probówce z frakcją nieprzylegającą.

Połączyć początkowy preparat komórkowy i wzbogacone komórki rozrodcze w probówce, aby otrzymać działający preparat komórkowy zawierający 25% komórek rozrodczych. Wirować w temperaturze 500 razy G z przerwami w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 20 mililitrach pożywki do tworzenia organoidów, aby osiągnąć stężenie 2,4 miliona komórek na mililitr.

W nowej probówce dodać jeden mililitr roztworu zawierającego komórki. Dodaj 0,5 mililitra roztworu do płukania środka powierzchniowo czynnego do każdej studzienki na płytce mikrodołkowej. Upewnij się, że w studni nie są uwięzione pęcherzyki powietrza.

Aby usunąć pęcherzyki powietrza, odwirować płytkę pod ciśnieniem 2 000 razy G z przerwami w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Obserwuj płytkę pod odwróconym mikroskopem o małym powiększeniu, aby sprawdzić, czy pęcherzyki zostały usunięte z mikrostudzienek. Przykryj płytkę pokrywką i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Po zakończeniu zabiegu należy usunąć roztwór do płukania i natychmiast umyć płytkę sterylną wodą lub PBS. Dodaj 0,5 mililitra pożywki do tworzenia organoidów do każdej studzienki i odwiruj w temperaturze 2 000 razy G z przerwami w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwie minuty, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza. Obserwuj studnię pod odwróconym mikroskopem o małym powiększeniu, aby sprawdzić, czy pęcherzyki powietrza zostały usunięte.

Dodać 0,5 mililitra zawiesiny ogniw roboczych i delikatnie wymieszać, pipetując w górę iw dół. Wirować w temperaturze 500 razy G z przerwami w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć minut. Użyj odwróconego mikroskopu, aby sprawdzić, czy komórki skupiły się w mikrostudzienkach.

Przenieść płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych i hodować przez pięć dni. Zmieniaj połowę podłoża co drugi dzień. Aby odzyskać organoidy, użyj pipety z szeroką końcówką, aby delikatnie pipetować pożywkę w górę iw dół.

Dzięki temu organoidy wydostają się z mikrostudzienek. Zbierz organoidy, utrwal i wykonaj immunocytochemię dla markera komórek rozrodczych, markera komórek Sertoliego, markera okołokanalikowych komórek mięśniowych i markera komórek Leydiga i wizualizuj pod mikroskopem konfokalnym. W tym badaniu wyizolowano komórki z jednotygodniowych jąder świń, które były hodowane w mikrostudzienkach samoorganizujących się w sferoidy z wytyczonymi i wyraźnymi przedziałami zewnętrznymi i wewnętrznymi.

Dwa przedziały oddzielono błoną podstawną kolagenu IV dodatniego. GATA4-dodatnie komórki Sertoliego i UCHL1-dodatnie komórki rozrodcze znajdowały się w zewnętrznym przedziale błony podstawnej. Okołokanalikowe komórki mięśniowe aSMA były zlokalizowane wzdłuż wewnętrznej strony błony podstawnej, podczas gdy komórki Leydiga z dodatnim CYP450 znajdowały się w środku śródmiąższu.

Struktura ta jest podobna do warunków In Situ, w których komórki Leydiga, okołokanalikowe komórki mięśniowe, znajdują się w śródmiąższu, w przedziale śródmiąższowym i komórkach rozrodczych, komórki Sertoliego znajdują się w nabłonku nasiennym. Ważne jest, aby upewnić się, że komórki wykorzystywane do wytwarzania organoidów mają optymalną jakość. Należy zwrócić szczególną uwagę na etapie trypsynizacji trawienia enzymatycznego.

Po tej procedurze organoidy mogą być hodowane długoterminowo w celu zbadania różnicowania komórek rozrodczych lub analizy ekspresji genów i wydzielanych białek lub hormonów. Zdolność do tworzenia organoidów z asocjacjami komórkowymi specyficznymi dla jądra zapewnia nowatorski system in vitro do badania interakcji komórka-komórka ważnych dla rozwoju jąder i funkcji komórek rozrodczych.