Name: Generowanie organoidów jąder świń o architekturze specyficznej dla jąder przy użyciu hodowli mikrostudzienek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Poznaj generowanie organoidów jąder świń o architekturze specyficznej dla jąder przy użyciu systemu hodowli mikrostudzienek. Ta metoda umożliwia badanie morfogenezy jąder oraz przesiewowe testy toksyczności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH/NICHD HD091068-01 dla dr Ina Dobrinski.

UWAGA: Jądra od 1-tygodniowych prosiąt zostały uzyskane z komercyjnej hodowli świń jako produkt uboczny kastracji komercyjnych świń. Pozyskiwanie jąder zostało zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie w Calgary.
1. Przygotowanie roztworów enzymatycznych do trawienia tkanek
UWAGA: Potrzebne są trzy różne roztwory enzymatyczne, które obejmują dwa różne roztwory kolagenazy IV (roztwór A, B) i roztwór deoksyrybonukleazy I (DNaza I).
<ol>
	<li>Aby przygotować roztwór A, rozpuścić 20 mg kolagenazy IV S (tabela materiałów) i 40 mg kolagenazy IV W (tabela materiałów) w 25 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy. Następnie przefiltruj sterylizację filtrem 0,22 μm. Dodać 0,4 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do roztworu A, aby zahamować aktywność trypsyny.</li>
	<li>Aby przygotować roztwór B, rozpuścić 80 mg kolagenazy IV W (tabela materiałów) w 40 ml DMEM. Następnie przefiltruj sterylizację filtrem 0,22 μm.</li>
	<li>Aby przygotować roztwór DNazy I (7 mg/ml), rozpuścić 70 mg DNazy I w 10 ml DMEM. Następnie przefiltruj sterylizację filtrem 0,22 μm. 
	UWAGA: Przedstawione tutaj stężenie enzymu w roztworach kolagenazy IV różni się od stężeń (2 mg/ml) podanych w oryginalnym artykule14. Obecny protokół daje komórki o nieco wyższej żywotności. Jednak komórki wyizolowane za pomocą obu protokołów wytwarzają organoidy o identycznej architekturze tkankowej.</li>
</ol>
2. Trawienie enzymatyczne w tkance jądra
<ol>
	<li>Zebrać jądra do sterylnej zlewki i przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 1% penicyliny/streptomycyny (P/S). Po umyciu przenieś jądra do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm z PBS zawierającym 1% P/S i usuń osłonkę pochwy i najądrza za pomocą autoklawowanych nożyczek i kleszczy. Przenieść wyizolowane jądra do nowego naczynia o średnicy 100 mm i dokładnie przemyć PBS zawierającym 1% P/S.</li>
	<li>Aby utrzymać bezpłodność, użyj innego zestawu sterylnych nożyczek i kleszczy, aby oderwać miąższ jądra z osłonki białawej. Przetnij jądra wzdłuż osi podłużnej bezpośrednio pod tuniką. Następnie obierz jądra z tuniki za pomocą dwóch kleszczy i umieść w nowym naczyniu o średnicy 100 mm zawierającym 1 ml DMEM z 1% P / S.</li>
	<li>Obrane jądra zmielić sterylnymi nożyczkami na 1-2 mm kawałki tkanki. Po posiekaniu za pomocą sterylnych kleszczy usuń białe fragmenty tkanki łącznej.</li>
	<li>Przenieść kawałki tkanki mielonej do roztworu A i uzupełnić do 50 ml DMEM, aby uzyskać stężenie 0,4 mg/ml dla kolagenazy IV S (tabela materiałów) i stężenie 0,8 mg/ml dla kolagenazy IV W (tabela materiałów). Umieścić roztwór A zawierający kawałki tkanki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut, delikatnie odwracać probówki co 5 minut i sprawdzić wzrokowo, czy nie doszło do uwolnienia DNA.
	<ol>
		<li>Dodać 500 μl DNazy I, jeśli zaobserwowano wolne pływające DNA. Po 30 minutach odwirować probówkę o sile 90 x g z hamulcami w temperaturze 25 °C przez 1,5 minuty i wyrzucić supernatant. 
		UWAGA: DNA wyglądałoby jak mętna substancja. Kiedy probówki są potrząsane, kawałki tkanki osiadają, podczas gdy DNA pozostaje na powierzchni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać roztwór B do probówki i uzupełnić do 50 ml DMEM, aby uzyskać stężenie 1,2 mg/ml kolagenazy IV W (tabela materiałów). Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut i delikatnie odwracać probówkę co 5 minut. Dodać 500 μl DNazy I, jeśli zaobserwowano wolne pływające DNA.</li>
	<li>Po 30 minutach odwirować probówkę o sile 90 x g z hamulcami w temperaturze 25 °C przez 1,5 minuty. Następnie wyrzucić supernatant i przemyć raz PBS z 1% P/S. 
	UWAGA: Odrzucone supernatanty zarówno z roztworu A, jak i B będą zawierały głównie komórki śródmiąższowe.</li>
	<li>Uzupełnij probówkę PBS do 50 ml. Ostrożnie zebrać kanaliki od góry i umieścić w nowej probówce o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Duże niestrawione fragmenty tkanek szybko osiadają na dnie, podczas gdy strawione kanaliki nasienne pozostaną w zawiesinie. Nie należy pobierać dużych fragmentów tkanek. Procedurę tę można powtórzyć kilka razy, aż roztwór w oryginalnej probówce będzie prawie klarowny i pozostaną tylko niestrawione fragmenty tkanek, które można wyrzucić.</li>
	<li>Odwirować kanaliki w temperaturze 90 x g z hamulcami w temperaturze 25 °C przez 1,5 minuty i odrzucić supernatant. Dodaj świeży PBS i ponownie odwiruj. Powtórz ten krok prania dwukrotnie.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu PBS usunąć supernatant i ponownie zawiesić kanaliki nasienne w 5 ml PBS. Następnie dodaj 15 ml 0,25% kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do kanalików. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i delikatnie odwracać co 2 minuty. Jeśli zaobserwuje się dużo swobodnie pływającego DNA, dodaj 500 μl DNazy I z 5 ml DMEM.</li>
	<li>Oceń trawienie enzymatyczne kanalików do pojedynczych komórek pod mikroskopem (najpierw po 5 minutach, a następnie co 2 minuty). Jeśli można wykryć głównie pojedyncze komórki, zatrzymaj reakcję za pomocą 5 ml FBS i przefiltruj przez siatkę 70 μm, a następnie przez siatkę 40 μm. 
	UWAGA: Należy zwrócić uwagę, aby nakrętki na probówkach o pojemności 50 ml używanych do trawienia (roztwór A, B i 0,25% trypsyna-EDTA) były prawidłowo dokręcone. Jeśli zanieczyszczenie w łaźni wodnej jest problemem, folia parafinowa może być owinięta wokół nakrętki, aby zapewnić sterylność.</li>
	<li>Odwirować pojedyncze komórki przy 500 x g z hamulcami w temperaturze 25 °C przez 5 minut, ponownie zawiesić w pożywce wzbogacającej (Dulbecco Modified Eagle Medium F/12 (DMEM/F12) zawierającej 5% FBS i 1% P/S) i policzyć liczbę żywotnych komórek. To jest początkowa populacja komórek. Utrwal 100 x 103 komórki i wykonaj immunocytochemię dla markera komórek rozrodczych UCHL1 (Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L1) zgodnie z opisem12 i określ procent komórek rozrodczych w tej początkowej populacji komórek. 
	UWAGA: Marker komórek rozrodczych Białaczka promielocytowa białko palca cynkowego (PLZF)15 może być również stosowany jako odpowiednia alternatywa dla UCHL1. W wyjściowej populacji komórek oczekiwana wydajność komórek wynosi około 700-800 x 109/g tkanki. Procent komórek rozrodczych w tej populacji komórek powinien wynosić 4-5%.</li>
	<li>Umieścić około 20 x 106 tej początkowej populacji komórek na dwóch szalkach Petriego o bardzo niskim naczepieniu 100 mm (10 x 106 komórek zawieszonych w 10 ml DMEM/F12 zawierających 1% P/S w każdej szalce) na 2 dni w inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2, 21% tlenu). Wykonaj wzbogacanie komórek rozrodczych pozostałymi komórkami. 
	UWAGA: Aby zapewnić optymalną żywotność i jakość komórek, podczas wzbogacania komórek rozrodczych i późniejszej kwantyfikacji, wyjściową populację komórek umieszcza się w hodowli na szalkach do hodowli tkankowych o bardzo niskim przyczepie na 2 dni.</li>
</ol>
3. Wzbogacanie komórek rozrodczych
UWAGA: Procedura opisana powyżej daje przede wszystkim komórki Sertoliego i komórki rozrodcze. Różne właściwości adhezyjne pozwalają na oddzielenie komórek Sertoliego od komórek rozrodczych poprzez różnicowanie posiewu.
<ol>
	<li>Wysiew: 20-25 x 106 komórek wyjściowej populacji komórek na 100 mm naczynie do hodowli tkankowej w całkowitej objętości 8 ml pożywki wzbogacającej (DMEM/F12 z 5% FBS i 1% P/S) do posiewu różnicowego. Umieścić komórki w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 , 21% O2) i po 1,5 godziny upewnić się, że większość komórek Sertoliego przyczepia się do płytki.</li>
	<li>Zebrać i połączyć supernatant (zawierający głównie komórki rozrodcze) z 2 płytek na jedną nową płytkę o średnicy 100 mm i umieścić ją z powrotem w inkubatorze. Po 1 godzinie ponownie połączyć supernatant z 2 płytek z nową płytką o średnicy 100 mm. Umieść płytki z powrotem w inkubatorze na noc. 
	UWAGA: Połączone supernatanty będą zawierały przede wszystkim komórki rozrodcze. Przylegające komórki, które są wyrzucane wraz z płytkami, to przede wszystkim komórki somatyczne jąder, takie jak Sertoli i okołorurkowe komórki mięśniowe.</li>
	<li>Zbierz wzbogacone komórki rozrodcze w dwóch frakcjach w następujący sposób. 
	UWAGA: Wzbogacone komórki rozrodcze przylegają inaczej, frakcja nieprzylegająca i frakcja lekko przylegająca. Obie te frakcje razem tworzą wzbogaconą populację komórek rozrodczych
	<ol>
		<li>Frakcja nieprzylegająca: zebrać supernatant.</li>
		<li>Frakcja lekko przylegająca: delikatnie umyć płytki PBS, potraktować 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA w rozcieńczeniu 1:20 przez 5 minut w temperaturze pokojowej, zatrzymać reakcję 2 ml pożywki wzbogacającej i zebrać w tej samej probówce, co frakcja nieprzylegająca. 
		UWAGA: 0,25% trypsyny-EDTA należy rozcieńczyć PBS, aby uzyskać roztwór trypsyny w stosunku 1:20.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Policz całkowitą liczbę komórek za pomocą licznika komórek, utrwal 100 x 103 komórki i wykonaj immunocytochemię dla markera komórek rozrodczych UCHL1 zgodnie z opisem12 i określ procent komórek rozrodczych w tej wzbogaconej populacji komórek. 
	UWAGA: Procent komórek rozrodczych w tej populacji komórek powinien wynosić co najmniej 60-70%. Ponieważ immunocytochemia do oceny ilościowej wymagałaby 1 dnia, wzbogacone komórki należy umieścić na szalce Petriego o bardzo niskim nakładzie 100 mm z DMEM/F12 uzupełnionym 1% P/S na czas trwania w celu zapewnienia optymalnej jakości i żywotności komórek.</li>
</ol>
4. Przygotowanie komórek do wysiewu
<ol>
	<li>Aby zebrać początkową komórkę preparacyjną, należy zebrać supernatant w probówce o pojemności 50 ml z szalek o bardzo niskim nasadce 100 mm. Energicznie umyć płytki PBS, aby zebrać przylegające komórki. Nie jest potrzebne trawienie enzymatyczne. 
	UWAGA: Niektóre komórki jąder, głównie komórki Sertoliego, mogą nieznacznie przylegać do bardzo niskich płytek mocujących.</li>
	<li>Połączyć preparat komórek wyjściowych i wzbogacone komórki rozrodcze, aby uzyskać działający preparat komórkowy zawierający 25% komórek rozrodczych. Wirować przy 500 x g z hamulcem w temperaturze 25 °C przez 5 min, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce do tworzenia organoidów (DMEM/F12 uzupełniony insuliną 10 μg/ml, transferyna 5,5 μg/ml, selen 6,7 ng/ml, 20 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu, 1% P/S). Dostosuj gęstość komórek do 2,4 x 106 na ml. 
	UWAGA: Każda studzienka w użytych płytkach mikrostudzienkowych13 w tym protokole zawierała 1200 mikrostudzienek.</li>
	<li>Użyj poniższego wzoru, aby obliczyć liczbę komórek na studzienkę, jak opisano poniżej. 
	Liczba komórek w basenie = liczba mikrostudzienek x liczba komórek, które mają być zgrupowane dla każdego organoidu.</li>
	<li>Aby wygenerować organoidy z 1,000 komórek każdy, zasiej każdy z nich (1,200 x 1,000 komórek każdy =) 1,2 x 106 komórek. Dostosuj gęstość komórek w zawiesinie komórek w taki sposób, aby komórki były wysiane w objętości 0,5 ml pożywki. W przypadku organoidów utworzonych z 1,000 komórek każdy należy użyć gęstości 2,4 x 106 komórek na ml (1,2 x 106 komórek w 0,5 ml).</li>
</ol>
5. Przygotowanie mikrostudzienek do odbioru komórek
UWAGA: Aby upewnić się, że komórki nie przylegają do powierzchni mikrostudzienki, potraktuj roztworem do płukania środka powierzchniowo czynnego, który jest dostępny do zakupu przez producenta.
<ol>
	<li>Dodaj 0,5 ml roztworu płuczącego do każdej studzienki. Upewnij się, że w studni nie są uwięzione pęcherzyki powietrza. W celu usunięcia pęcherzyków powietrza, jeśli występują, odwirować płytkę o sile 2 000 x g z hamulcami w temperaturze 25 °C przez 2 minuty.</li>
	<li>Obserwuj płytkę pod odwróconym mikroskopem o małym powiększeniu, aby sprawdzić, czy pęcherzyki zostały usunięte z mikrostudzienek. W przypadku zaobserwowania uwięzionych pęcherzyków, należy ponownie odwirować przy 2 000 x g z hamulcami w temperaturze 25 °C przez 2 minuty w celu usunięcia pozostałych pęcherzyków.</li>
	<li>Przykryj płytkę pokrywką i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu zabiegu należy usunąć roztwór płuczący i natychmiast umyć płytkę sterylną wodą lub PBS. Upewnij się, że płytka nie wyschnie po zabiegu z użyciem roztworu do płukania.</li>
</ol>
6. Generowanie organoidów jąder
<ol>
	<li>Dodać 0,5 ml pożywki do tworzenia organoidów (bez żadnych komórek) do każdej studzienki i odwirować przy 2 000 x g z hamulcami w temperaturze 25 °C przez 2 minuty w celu usunięcia wszelkich uwięzionych pęcherzyków powietrza. Obserwuj studnię pod odwróconym mikroskopem o małym powiększeniu, aby sprawdzić, czy pęcherzyki powietrza zostały usunięte. W przypadku zaobserwowania uwięzionych pęcherzyków, należy ponownie odwirować przy 2 000 x g z hamulcami w temperaturze 25 °C przez 2 minuty w celu usunięcia pozostałych pęcherzyków.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml zawiesiny komórek roboczych i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Wirować przy 500 x g z hamulcem w temperaturze 25 °C przez 5 min. Użyj odwróconego mikroskopu, aby sprawdzić, czy komórki skupiły się w mikrostudzienkach.</li>
	<li>Przenieś płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych i hoduj przez 5 dni. Zmieniaj połowę podłoża co drugi dzień.
	<ol>
		<li>Aby zmienić pożywkę bez utraty organoidów, przyłóż końcówkę pipety do ścianki studzienki i delikatnie opuść, aby dotknąć menisku i powoli wciągnij pożywkę. Upewnij się, że podążasz za łąkotką, gdy opada. Aby dodać świeżą pożywkę, przyłóż końcówkę pipety do ścianki studzienki po tej samej stronie, po której pobrano pożywkę i delikatnie dodaj świeżą pożywkę do ścianki studzienki, pozwalając jej powoli spływać po ściance.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby odzyskać organoidy, delikatnie pipetuj pożywkę w górę iw dół za pomocą pipety z szerokim otworem. Pozwoliłoby to organoidom wydostać się z mikrostudzienek.</li>
	<li>Zebrać organoidy, przemyć PBS, utrwalić i przeprowadzić immunocytochemię dla markera komórek rozrodczych (UCH-L1), markera komórek Sertoliego (białko wiążące GATA 4-GATA4), markera okołokanalikowych komórek mięśniowych (α-aktyna mięśni gładkich-αSMA) i markera komórek Leydiga (cytochrom P450-CYP450) zgodnie z opisem12 i wizualizować pod mikroskopem konfokalnym.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Quadrato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+diversity+and+network+dynamics+in+photosensitive+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids.</a> Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).</li>
<li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture%3A+biology%27s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).</li>
<li>Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+testicular+organoid%3A+a+novel+tool+for+the+study+of+human+spermatogenesis+and+gonadotoxicity+in+vitrodagger%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger.</a> Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).</li>
<li>Strange, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+testicular+organoid+system+as+a+novel+tool+to+study+Zika+virus+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis.</a> Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 82-82 (2018).</li>
<li>Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testicular+organoid+generation+by+a+novel+in+vitro+three-layer+gradient+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system.</a> Biomaterials. 130, 76-89 (2017).</li>
<li>Baert, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Human+Testicular+Cells+Self-Organize+into+Organoids+with+Testicular+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).</li>
<li>Sakib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+organotypic+testicular+organoids+in+microwell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture.</a> Biology of Reproduction. , (2019).</li>
<li>Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Large+Numbers+of+Size-controlled+Tumor+Spheroids+Using+Microwell+Plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), 50665(2013).</li>
<li>Sakib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+organotypic+testicular+organoids+in+microwell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture.</a> Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).</li>
<li>González, R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+Mouse+Monopoly%3A+Studying+the+Male+Germ+Line+in+Domestic+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models.</a> ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).</li>
<li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+germline+stem+cell+niche+unit+in+mammalian+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The germline stem cell niche unit in mammalian testes.</a> Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).</li>
<li>Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Gdnf+Gene+in+peritubular+myoid+cells+disrupts+undifferentiated+spermatogonial+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).</li>
</ol>

Dr Ungrin jako wynalazca ma interes finansowy w technologii AggreWell.

Opracowaliśmy prostą metodę, która pozwala na spójne, powtarzalne generowanie dużej liczby organoidów jąder o architekturze tkankowej podobnej do jądra in vivo12. Chociaż podejście to zostało opracowane z wykorzystaniem komórek jąder świń, ma ono szersze zastosowanie również w przypadku jąder myszy i naczelnych innych niż człowiek12. Opisano wiele różnych metod wytwarzania organoidów jąder 8,9,10,11.<sup ...

W ostatnich latach nastąpił ponowny wzrost zainteresowania trójwymiarowymi (3D) organoidami. Różne narządy, takie jak intestine1, żołądek2, trzcreas3,4, liver5 i brain6 zostały z powodzeniem wprowadzone do systemów organoidowych 3D. Organoidy te mają architektoniczne i funkcjonalne podobieństwa do organów in vivo i są bardziej biologicznie istotne dla badania mikrośrodowiska tkanek niż systemy hodowli jednowarstwowych7. W rezultacie, organoidy jąder również zaczęły wzbudzać zainteresowanie8,9,10,11,12. Większość zgłoszonych do tej pory metod to złożone, niewymagające wysokiej przepustowości metody10 i wymagają dodania białek ECM8,10. Ta złożoność prowadzi również do problemów z odtwarzalnością. Potrzebna jest prosta i powtarzalna metoda, która pozwoli na generowanie organoidów jąder z asocjacjami komórkowymi, które są podobne do jąder in vivo.
Niedawno zgłosiliśmy system, który spełnia te wymagania12. Wykorzystując tłok jako model, zastosowaliśmy podejście oparte na odśrodkowej agregacji wymuszonej w systemie mikrostudzienek. W systemie mikrostudzienek każda studzienka zawiera dużą liczbę identycznych mniejszych studzienek13. Pozwala to na generowanie licznych sferoid o jednolitej wielkości. System mikrostudzienek umożliwił wygenerowanie dużej liczby jednolitych organoidów o architekturze specyficznej dla jąder. System jest prosty i nie wymaga dodawania białek ECM.

<table><tbody><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 100 mm o bardzo niskim mocowaniu</td><td>Corning</td><td>#CLS3262</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 100 mm</td><td>Corning</td><td>#353803</td><td></td></tr><tr><td>Aggrwell 400</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#34411</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do płukania zapobiegający przywieraniu</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07010</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IV z Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C5138</td><td>określana jako Kolagenaza IV S</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IV Worthington</td><td>Worthington-Biochem</td><td>#LS004189</td><td>określana jako Kolagenaza IV W</td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium/F12</td><td>Gibco</td><td>#11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium - wysoki poziom glukozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D6429</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D8537</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>R& D Systems</td><td>#236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Filtry siatkowe Falcon 70 & mikro; m</td><td>FisherScientific</td><td>#352350</td><td></td></tr><tr><td>Sitka komórkowe Falcon 40 i mikro; m</td><td>FisherScientific</td><td>#352340</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu ThermoFisher Scientific</td><td>#12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen</td><td>Gibco</td><td>#41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P4333</td><td></td></tr><tr><td>Tkanka jąder świń</td><td>Sunterra Farms Ltd (Alberta, Kanada)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP Sterylna górna jednostka filtrująca w probówce wirówkowej</td><td>Millipore</td><td>#SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>#T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie organoidów jąder świń o architekturze specyficznej dla jąder przy użyciu hodowli mikrostudzienek

Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture

Organoidy to trójwymiarowe struktury złożone z wielu typów komórek, które są zdolne do rekapitulacji architektury tkanek i funkcji organów in vivo. Powstawanie organoidów otworzyło różne drogi badań podstawowych i translacyjnych. W ostatnich latach organoidy jąder wzbudziły zainteresowanie w dziedzinie biologii rozrodu mężczyzn. Organoidy jąder pozwalają na badanie interakcji komórka-komórka, rozwoju tkanek i mikrośrodowiska niszy komórek rozrodczych oraz ułatwiają wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków i toksyczności. Potrzebna jest metoda wiarygodnego i powtarzalnego generowania organoidów jąder o specyficznej dla jąder architekturze tkankowej. System hodowli mikrostudzienek zawiera gęsty zestaw mikrostudzienek w kształcie piramidy. Komórki jąder pochodzące z jąder przed okresem dojrzewania są odwirowywane do tych mikrostudzienek i hodowane w celu wytworzenia organoidów jąder o specyficznej dla jąder architekturze tkankowej i asocjacjach komórkowych. W tym procesie można wygenerować tysiące jednorodnych organoidów. Przedstawiony tutaj protokół będzie cieszył się szerokim zainteresowaniem badaczy zajmujących się rozrodem samców.

Izolowane komórki z jąder świni w wieku 1 tygodnia, hodowane w mikrowydłubach, samoorganizowały się w sferoidy (Rysunek 1A, Rysunek 2), z wyraźnie wydzielonymi zewnętrznymi (nabłonek cewkowy) i wewnętrznymi (śródmięśnie) przedziałami (Rysunek 1B, Rysunek 2). Oba przedziały były oddzielone błoną podstawną Collagen IV+ve. Komórk...

Tutaj prezentujemy protokół powtarzalnego generowania organoidów jąder świń z architekturą tkanek specyficzną dla jąder przy użyciu dostępnego na rynku systemu hodowli mikrostudzienek.

Generowanie organoidów jąder świń o architekturze specyficznej dla jąder przy użyciu hodowli mikrostudzienek

Organoids are three dimensional structures composed of multiple cell types that are capable of recapitulating tissue architecture and functions of organs ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala na generowanie organoidów jąder, które mogą być wykorzystywane jako platforma do badania morfogenezy jąder oraz do badań przesiewowych leków i toksyczności o wysokim poziomie tropo. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest wysoce powtarzalna, wymaga stosunkowo niewielkiej liczby komórek i może być wykorzystana do wygenerowania dużej liczby organoidów jąder o architekturze specyficznej dla jąder. Metoda ta może być stosowana do badania innych układów, takich jak pluripotencjalne komórki macierzyste lub komórki wysp trzustkowych z niezbędnymi optymalizacjami.Procedurę enzymatycznego trawienia tkanki jąder zademonstruje Anna Voigt, doktorantka z mojego laboratorium. Zebrać jądro do sterylnej zlewki i przemyć PBS zawierającym 1% penicyliny streptomycyny. Po umyciu przenieść jądro do 100-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej z PBS zawierającym 1% penicyliny streptomycyny.Użyj autoklawowanych nożyczek i kleszczy, aby usunąć osłonkę pochwy i najądrza. Przenieś izolowane jądro do nowego 100 milimetrowego naczynia i dokładnie umyj PBS zawierającym 1% penicyliny streptomycyny. Przetnij jądro wzdłuż osi podłużnej bezpośrednio pod tuniką.Następnie obierz jądro z tuniki za pomocą dwóch kleszczy i umieść je w nowym 100-milimetrowym naczyniu zawierającym 1 mililitr DMEM z 1% streptomycyną penicyliny. Zmiel obrane jądro sterylnymi nożyczkami na jeden do dwóch milimetrowych kawałków tkanki. Po rozdrobnieniu użyj sterylnych kleszczyków, aby usunąć białe fragmenty tkanki łącznej.Przenieś kawałki tkanki mielonej do roztworu A w probówce o pojemności 50 mililitrów i uzupełnij do 50 mililitrów DMEM, aby uzyskać stężenie 0,4 miligrama na mililitr dla kolagenazy 4S i stężenie 0,8 miligrama na mililitr dla kolagenazy 4W. Umieść probówkę zawierającą kawałki tkanki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut. Delikatnie odwracaj rurkę co pięć minut.Po 30 minutach odwirować probówkę o sile 90 razy G z przerwami w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 1,5 minuty. Odrzucić supernatant dodać 40 mililitrów roztworu B i uzupełnić do 50 mililitrów DMEM, aby uzyskać stężenie 1,2 miligrama na mililitr kolagenazy 4W. Umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut i delikatnie odwracaj probówkę co pięć minut.Odwirować probówkę przy 90 razy G z przerwami w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 1,5 minuty. Następnie odrzuć supernatant i przemyj raz PBS z 1% penicyliną streptomycyną. Ostrożnie zbierz kanaliki od góry i umieść w nowej 50-mililitrowej tubie.Uzupełnij probówkę PBS do 50 mililitrów. Odwirować kanaliki w temperaturze 90 razy G z przerwami w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 1,5 minuty. Odrzucić supernatant i dodać świeży PBS do przemycia jeszcze dwa razy.Po ostatnim płukaniu PBS usunąć supernatant i ponownie zawiesić kanaliki nasienne w pięciu mililitrach PBS. Następnie dodaj 15 mililitrów 0,25% trypsyny EDTA do kanalików. Umieść rurkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i delikatnie odwracaj co dwie minuty.Po pięciu minutach oceń trawienie enzymatyczne kanalików do pojedynczych komórek pod mikroskopem z 10 mikrolitrami próbki na płytce do hodowli tkankowej. Co dwie minuty umieszczaj próbkę pod mikroskopem w celu obserwacji. Jeśli można wykryć głównie pojedyncze komórki, przerwij reakcję za pomocą pięciu mililitrów FBS i przefiltruj przez siatkę o wielkości 70 mikronów, a następnie przez siatkę o wielkości 40 mikronów.Odwirować pojedyncze komórki w temperaturze 500 razy G z przerwami w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć minut. Ponownie zawiesić w 50 mililitrach pożywki wzbogacającej i policzyć liczbę żywotnych komórek za pomocą hemocytometru. Przenieś 20 milionów tej początkowej populacji komórek do każdej z dwóch 100-milimetrowych szalek Petriego o bardzo niskim przyłączeniu i inkubuj w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 21% tlenu przez dwa dni.Scedować od 20 do 25 milionów komórek pozostałej początkowej populacji komórek na 100-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowej w całkowitej objętości ośmiu mililitrów pożywki wzbogacającej. Umieść naczynie w inkubatorze i po 1,5 godziny upewnij się, że większość komórek Sertoliego jest przymocowana do płytki. Lekko przechylić dwie płytki, aby zebrać i połączyć supernatanty w jedną nową 100-milimetrową płytkę i umieścić ją z powrotem w inkubatorze.Po godzinie ponownie połącz supernatanty z dwóch płytek na nową płytkę o średnicy 100 milimetrów. Umieść płytki z powrotem w inkubatorze na noc. Następnie zbierz wzbogacone komórki rozrodcze w dwie frakcje, frakcję nieprzylegającą i frakcję lekko przylegającą.Zebrać supernatant jako frakcję nieprzylegającą. Aby uzyskać lekko przylegającą frakcję, delikatnie umyj płytki PBS i potraktuj dwoma mililitrami rozcieńczenia od 1 do 20 0,25% trypsyny EDTA przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zatrzymaj reakcję, dodając dwa mililitry pożywki wzbogacającej i zbierz w probówce z frakcją nieprzylegającą.Połączyć początkowy preparat komórkowy i wzbogacone komórki rozrodcze w probówce, aby otrzymać działający preparat komórkowy zawierający 25% komórek rozrodczych. Wirować w temperaturze 500 razy G z przerwami w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 20 mililitrach pożywki do tworzenia organoidów, aby osiągnąć stężenie 2,4 miliona komórek na mililitr.W nowej probówce dodać jeden mililitr roztworu zawierającego komórki. Dodaj 0,5 mililitra roztworu do płukania środka powierzchniowo czynnego do każdej studzienki na płytce mikrodołkowej. Upewnij się, że w studni nie są uwięzione pęcherzyki powietrza.Aby usunąć pęcherzyki powietrza, odwirować płytkę pod ciśnieniem 2 000 razy G z przerwami w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Obserwuj płytkę pod odwróconym mikroskopem o małym powiększeniu, aby sprawdzić, czy pęcherzyki zostały usunięte z mikrostudzienek. Przykryj płytkę pokrywką i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Po zakończeniu zabiegu należy usunąć roztwór do płukania i natychmiast umyć płytkę sterylną wodą lub PBS. Dodaj 0,5 mililitra pożywki do tworzenia organoidów do każdej studzienki i odwiruj w temperaturze 2 000 razy G z przerwami w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwie minuty, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza. Obserwuj studnię pod odwróconym mikroskopem o małym powiększeniu, aby sprawdzić, czy pęcherzyki powietrza zostały usunięte.Dodać 0,5 mililitra zawiesiny ogniw roboczych i delikatnie wymieszać, pipetując w górę iw dół. Wirować w temperaturze 500 razy G z przerwami w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć minut. Użyj odwróconego mikroskopu, aby sprawdzić, czy komórki skupiły się w mikrostudzienkach.Przenieść płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych i hodować przez pięć dni. Zmieniaj połowę podłoża co drugi dzień. Aby odzyskać organoidy, użyj pipety z szeroką końcówką, aby delikatnie pipetować pożywkę w górę iw dół.Dzięki temu organoidy wydostają się z mikrostudzienek. Zbierz organoidy, utrwal i wykonaj immunocytochemię dla markera komórek rozrodczych, markera komórek Sertoliego, markera okołokanalikowych komórek mięśniowych i markera komórek Leydiga i wizualizuj pod mikroskopem konfokalnym. W tym badaniu wyizolowano komórki z jednotygodniowych jąder świń, które były hodowane w mikrostudzienkach samoorganizujących się w sferoidy z wytyczonymi i wyraźnymi przedziałami zewnętrznymi i wewnętrznymi.Dwa przedziały oddzielono błoną podstawną kolagenu IV dodatniego. GATA4-dodatnie komórki Sertoliego i UCHL1-dodatnie komórki rozrodcze znajdowały się w zewnętrznym przedziale błony podstawnej. Okołokanalikowe komórki mięśniowe aSMA były zlokalizowane wzdłuż wewnętrznej strony błony podstawnej, podczas gdy komórki Leydiga z dodatnim CYP450 znajdowały się w środku śródmiąższu.Struktura ta jest podobna do warunków In Situ, w których komórki Leydiga, okołokanalikowe komórki mięśniowe, znajdują się w śródmiąższu, w przedziale śródmiąższowym i komórkach rozrodczych, komórki Sertoliego znajdują się w nabłonku nasiennym. Ważne jest, aby upewnić się, że komórki wykorzystywane do wytwarzania organoidów mają optymalną jakość. Należy zwrócić szczególną uwagę na etapie trypsynizacji trawienia enzymatycznego.Po tej procedurze organoidy mogą być hodowane długoterminowo w celu zbadania różnicowania komórek rozrodczych lub analizy ekspresji genów i wydzielanych białek lub hormonów. Zdolność do tworzenia organoidów z asocjacjami komórkowymi specyficznymi dla jądra zapewnia nowatorski system in vitro do badania interakcji komórka-komórka ważnych dla rozwoju jąder i funkcji komórek rozrodczych.

generation-porcine-testicular-organoids-with-testis-specific

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Pokazujemy metodę sekcji zwłok i sekcji mysich modeli raka prostaty, skupiając się na sekcji guza prostaty. Przedstawiono również protokół krok po kroku generowania organoidów guza gruczołu krokowego u myszy.

Generowanie organoidów nowotworowych z genetycznie modyfikowanych mysich modeli raka prostaty

Gruczoł sutkowy to dwuwarstwowa struktura, składająca się z zewnętrznych komórek nabłonka mięśniowego i wewnętrznego nabłonka światła. Przedstawiono protokół otrzymywania organoidów z wykorzystaniem trypsynizacji różnicowej. Ta skuteczna metoda pozwala naukowcom oddzielnie manipulować tymi dwoma typami komórek w celu zbadania pytań dotyczących ich roli w formie i funkcji gruczołu sutkowego.

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Tutaj opisane są cztery metody generowania organoidów jąder z pierwotnych komórek jąder myszy noworodków, tj. macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) oraz środowiska hodowli 2D i 3D wolne od ECM. Techniki te mają wiele zastosowań badawczych i są szczególnie przydatne do badania rozwoju jąder i fizjologii in vitro.

Pozakomórkowe i pozakomórkowe wolne od macierzy komórkowej wytwarzanie mysich organoidów jąder

Ten artykuł przedstawia protokół produkcji nowego typu substratu hodowlanego z setkami mikropojemników namm2, w których organoidy mogą być hodowane i obserwowane za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Szczegółowo opisano również protokoły wysiewu komórek i barwienia immunologicznego.

Wysokoprzepustowa platforma do hodowli i obrazowania 3D organoidów

Tutaj opisujemy protokół hodowli organoidów 3D jelit świń z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych. Opisujemy również metodę tworzenia monowarstw komórkowych pochodzących z organoidów 3D, umożliwiających dostęp do wierzchołkowej strony komórek nabłonkowych.

Hodowla organoidów 3D jelit prosiąt z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych i tworzenie monowarstw komórkowych

Ten protokół przedstawia metodę generowania organoidów naczyniowych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie organoidów naczyniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D organoidów wieprzowych pochodzących z jelita cienkiego i grubego. Wzrost tych monowarstw charakteryzuje się rosnącymi wartościami TEER, co wskazuje na solidną integralność nabłonka. Dodatkowo, te monowarstwy wykazują fizjologiczne reakcje wydzielnicze w eksperymentach w komorze Ussing po zastosowaniu forskoliny.

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Opisujemy metody izolowywania komórek somatycznych jajnika mysiego z frakcji stromy wzbogaconej jajnika oraz generowania organoidów somatycznych jajnika mysiego przy użyciu podejścia bez scaffoldu.

Badanie mikrośrodowiska jajnika: metody izolacji, hodowli 2D i hodowli organoidalnej komórek somatycznych jajnika mysiego

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSCs) mają potencjał do leczenia wielu różnych chorób. Użyteczność tych komórek wynika z faktu, że mogą one różnicować się w każdy typ komórek w organizmie. W niniejszym materiale opisujemy test teratomiowy, który służy do wykazania pluripotencji hPSCs.

Generowanie potworniaków w torebce jądra

Poznaj generowanie organoidów jąder świń o architekturze specyficznej dla jąder przy użyciu systemu hodowli mikrostudzienek. Ta metoda umożliwia badanie morfogenezy jąder oraz przesiewowe testy toksyczności.

Generowanie organoidów jąder świń o architekturze specyficznej dla jąder przy użyciu hodowli mikrostudzienek

Przeglądaj więcej filmów