Name: Natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym Analiza immunoblot endogennej dimeryzacji IRF5 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Poznaj natywną elektroforezę Western blot do analizy endogennej dimeryzacji IRF5 w liniach komórkowych dendrytycznych. Ta metoda pozwala badaczom badać aktywację czynnika transkrypcyjnego w kontekście immunologicznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez fundusze Fundacji Crouchera i funduszy start-upowych Uniwersytetu Miejskiego. Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Chow za pomoc w eksperymencie i krytyczną lekturę manuskryptu.

UWAGA: Opisany tutaj protokół wykorzystuje linię komórkową pDC CAL-1 potraktowaną resikwimodem (R848), agonistą TLR7/8. Protokół ten został zastosowany do innych typów komórek ludzkich i mysich, w tym RAW 264.7 (mysia linia makrofagów), THP-1 (ludzka linia komórek monocytowych), BJAB (ludzka linia komórek B), Ramos (ludzka linia komórek B) i MUTZ-3 (ludzka linia komórek dendrytycznych)23.
1. Stymulacja komórek CAL-1
<ol>
	<li>Utrzymuj hodowle komórek CAL-1 w kolbie T75 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w sterylnych warunkach z 20−25 ml pożywki RPMI 1640 zawierającej 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 25 mM HEPES i 1x merkaptoetanolu (tj. kompletnej pożywki RPMI 1640).</li>
	<li>Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. 
	nuta: Komórki CAL-1 nie przylegają. W przypadku przylegających typów komórek można przeprowadzić standardową trypsynizację w celu pobrania komórek.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 8 ml kompletnej pożywki RPMI 1640, aby uzyskać jednorodną zawiesinę jednokomórkową.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Zasiać komórki o gęstości 1 x 106 komórek na studzienkę na płytce 6-dołkowej z 4 ml podgrzanej, kompletnej pożywki RPMI 1640 w każdym dołku. Inkubować przez 20-24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , aby konfluencja osiągnęła 90%-95% (co odpowiada około 1,5 x 106 komórek).</li>
	<li>Stymuluj komórki, dodając 4 μl 1 mg/ml R848 na dołek płytki 6-dołkowej (końcowe stężenie 1 μg/ml). Skonfiguruj również niestymulowaną studzienkę kontrolną z komórkami bez leczenia R848.</li>
	<li>Upewnij się, że R848 jest równomiernie rozprowadzony, delikatnie kołysząc płytką na boki. Następnie inkubować komórki przez 2-16 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
2. Ekstrakcja białek komórkowych
<ol>
	<li>Przenieść zawiesiny komórek z płytki 6-dołkowej do probówek wirówkowych o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny jednokomórkowej.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować krótko w temperaturze 12 000 x g przez 0,5−1 min w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Przygotować bufor do lizy zawierający 6,25 ml 1 M Tris-HCl pH 7,4 (końcowe stężenie 25 mM), 7,5 ml 5 M NaCl (końcowe stężenie 150 mM), 0,5 ml 0,5 M EDTA (końcowe stężenie 1 mM), 2,5 ml NP-40 (końcowe stężenie 1%) i 7,5 ml glicerolu (końcowe stężenie 5%) w 250 ml wody dejonizowanej (ddH2O). Dodaj jednorazowy koktajl 100x inhibitora proteazy do końcowego stężenia 1x do buforu do lizy tuż przed użyciem. Przygotowany bufor do lizy należy przechowywać na lodzie. 
	nuta: Bufor do lizy bez proteazy może być przechowywany w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 30 μl lodowatego buforu do lizy i mieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez 15−20 min.</li>
	<li>Klarować lizat przez odwirowanie w temperaturze 12 000 x g przez 15−20 min w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Utrzymuj ekstrakty na lodzie przez cały czas. 
	nuta: Lizaty komórkowe mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C. Nie gotować próbek.</li>
	<li>Zmierz stężenie białka za pomocą odczynnika Bradforda.</li>
</ol>
3. Analiza dimeryzacji IRF5 według natywnej STRONY
<ol>
	<li>Przygotować do elektroforezy w górnej (-) i dolnej (+) komorze. Bufor górnej komory składa się z 0,3% deoksycholanu sodu (NaDOC) w 1x natywnym buforze do pracy PAGE, a dolna komora składa się tylko z 1x natywnego bufora uruchomionego PAGE. 
	nuta: Przygotuj świeży bufor górnej komory dla każdego nowego przebiegu.</li>
	<li>Dokładnie spłucz 3%-12% natywny żel PAGE wodą, nie zniekształcając studzienek. Umieść żel w mini zbiorniku na żel i wyjmij grzebień. Żel należy rozprowadzić w chłodni o temperaturze 4 °C lub na lodzie pod napięciem 150 V przez 30 minut 
	nuta: Wstępne uruchamianie usuwa nadmiar jonów amoniaku i nadsiarczanowych, które mogą zakłócać działanie żelu.</li>
	<li>Podczas przebiegu wstępnego przygotuj próbki do obciążenia, mieszając białka komórkowe trzymane na lodzie z 4x natywnym buforem próbki.</li>
	<li>Po przebiegu wstępnym załadować 10−15 μg białka o końcowej objętości 10−15 μl na próbkę. 
	nuta: Przeciążenie białkiem może powodować rozmazywanie.</li>
	<li>Uruchom żel pod napięciem 85 V przez 30 minut, a następnie 150 V przez 2 godziny. 
	nuta: Biorąc pod uwagę różnice w sprzęcie i liniach komórkowych używanych przez różne laboratoria, niewielkie modyfikacje stężenia próbek białek, napięcia i czasu pracy mogą być odpowiednie do optymalizacji tego protokołu. Obniżenie napięcia przed uruchomieniem i podczas pracy przy jednoczesnym wydłużeniu czasu pracy może pomóc w poprawie rozdzielczości dimerów i spójności wyników.</li>
	<li>Namocz żel w buforze do biegania SDS (25 mM Tris pH 8,3, 250 mM glicyny, 0,1% SDS) przez 30 minut w temperaturze RT. 
	nuta: Nie jest wymagane mieszanie. Czasami intensywność pasma może nie być proporcjonalna do ilości załadowanego białka z powodu nieefektywnego transferu w obecności deoksycholanu (DOC), który wpływa głównie na monomeryczną formę IRF5. Moczenie żelu w buforze SDS przed transferem rozwiązuje ten problem. Żel jest delikatny. Z pelencją należy obchodzić się ze szczególną ostrożnością od dolnego (tj. o wyższym procencie) końca żelu.</li>
</ol>
4. Analiza immunoblot IRF5
<ol>
	<li>Aktywuj membranę z polifluorku winylidenu (PDVF), mocząc ją w metanolu na około 5 minut.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w jednym rogu membrany, aby wskazać jej orientację. Zmontuj kanapkę transferową zgodnie z sekwencyjną kolejnością wyszczególnioną w protokole producenta ze szczególną ostrożnością, aby upewnić się, że nie zostały w niej uwięzione pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Umieść kasetę transferową w zbiorniku i przelewaj pod napięciem 20 V przez 1 godzinę na lodzie. 
	nuta: Wszystkie inkubacje i mycia wykonuj w kolejnych krokach za pomocą wytrząsarki na biegunach.</li>
	<li>Usuń membranę z kasety za pomocą plastikowych kleszczyków po zakończeniu przenoszenia. Zablokuj membranę w buforze blokującym (TBS) na 45 minut przy RT. 
	nuta: Bufor TBS z 5% BSA może być również używany jako bufor blokujący.</li>
	<li>Inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem wymienionym w Tabeli 1. Umyj membranę 1x buforem myjącym TBST (20 mM Tris, pH 7,0, 150 mM NaCl i 0,1% Tween 20) przez 3 minuty podczas kołysania. Powtórz pranie 2x.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rozcieńczenie</td>
			<td>Bufor rozcieńczający</td>
			<td>Inkubacja</td>
			<td>Komentarze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przeciwciało pierwszorzędowe (anty-IRF5)</td>
			<td>1/1 000</td> szt.
			<td>Bufor blokujący TBS</td>
			<td>Noc w temperaturze 4 °C lub 2 h w temperaturze pokojowej</td>
			<td>Rozcieńczone przeciwciała mogą być ponownie użyte kilka razy, jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C w obecności 0,02% azydku sodu.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przeciwciało drugorzędowe (anty-królik)</td>
			<td>1/10 000</td>
			<td>Bufor blokujący TBS</td>
			<td>45 min w RT</td>
			<td>Rozcieńczone przeciwciała mogą być ponownie użyte kilka razy, jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C w obecności 0,02% azydku sodu.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">UWAGA: Rozcieńczanie musi być zoptymalizowane, ponieważ różni się w zależności od producenta.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Specyfikacja przeciwciał stosowanych w procedurze immunoblottingu.
<ol start="6">
	<li>Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym wymienionym w tabeli 1. Myć membrany przez 3 minuty w 1x buforze myjącym TBST. Powtórz pranie 2x.</li>
	<li>Zeskanuj blot za pomocą odpowiedniego systemu dokumentacji żelu.</li>
</ol>

<ol><li>Takaoka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+role+of+IRF-5+in+the+gene+induction+programme+activated+by+Toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors.</a> Nature. 434 (7030), 243-249 (2005).</li>
<li>Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKKbeta+is+an+IRF5+kinase+that+instigates+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17438-17443 (2014).</li>
<li>Negishi, H., Taniguchi, T., Yanai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interferon+%28IFN%29+Class+of+Cytokines+and+the+IFN+Regulatory+Factor+%28IRF%29+Transcription+Factor+Family%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">The Interferon (IFN) Class of Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 10 (11), (2018).</li>
<li>Clark, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+Promoters+of+IRF5+Respond+Distinctly+to+Stimuli+and+are+Affected+by+Autoimmune-Risk+Polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Four Promoters of IRF5 Respond Distinctly to Stimuli and are Affected by Autoimmune-Risk Polymorphisms.</a> Frontiers in Immunology. 4, 360(2013).</li>
<li>Bo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+arthritis+patient+antibodies+highly+recognize+IL-2+in+the+immune+response+pathway+involving+IRF5+and+EBV+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid arthritis patient antibodies highly recognize IL-2 in the immune response pathway involving IRF5 and EBV antigens.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1789(2018).</li>
<li>Duffau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+Inflammatory+Arthritis+by+Interferon+Regulatory+Factor+5+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatolpgy%22%5BJournal%5D)">Promotion of Inflammatory Arthritis by Interferon Regulatory Factor 5 in a Mouse Model.</a> Arthritis and Rheumatolpgy. 67 (12), 3146-3157 (2015).</li>
<li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irf5-deficient+mice+are+protected+from+pristane-induced+lupus+via+increased+Th2+cytokines+and+altered+IgG+class+switching%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Irf5-deficient mice are protected from pristane-induced lupus via increased Th2 cytokines and altered IgG class switching.</a> European Journal of Immunology. 42 (6), 1477-1487 (2012).</li>
<li>Richez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN+regulatory+factor+5+is+required+for+disease+development+in+the+FcgammaRIIB-%2F-Yaa+and+FcgammaRIIB-%2F-+mouse+models+of+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IFN regulatory factor 5 is required for disease development in the FcgammaRIIB-/-Yaa and FcgammaRIIB-/- mouse models of systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 184 (2), 796-806 (2010).</li>
<li>Tada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+5+is+critical+for+the+development+of+lupus+in+MRL%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 5 is critical for the development of lupus in MRL/lpr mice.</a> Arthritis and Rheumatology. 63 (3), 738-748 (2011).</li>
<li>Weiss, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF5+controls+both+acute+and+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">IRF5 controls both acute and chronic inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 11001-11006 (2015).</li>
<li>Schoenemeyer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interferon+regulatory+factor%2C+IRF5%2C+is+a+central+mediator+of+toll-like+receptor+7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The interferon regulatory factor, IRF5, is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (17), 17005-17012 (2005).</li>
<li>Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regulation+of+MyD88-activated+interferon+regulatory+factor+5+by+K63-linked+polyubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional regulation of MyD88-activated interferon regulatory factor 5 by K63-linked polyubiquitination.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (24), 7296-7308 (2008).</li>
<li>Lopez-Pelaez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+IKK%CE%B2-catalyzed+phosphorylation+of+IRF5+at+Ser462+induces+its+dimerization+and+nuclear+translocation+in+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Protein kinase IKKβ-catalyzed phosphorylation of IRF5 at Ser462 induces its dimerization and nuclear translocation in myeloid cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17432-17437 (2014).</li>
<li>McGettrick, A. F., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localisation+and+trafficking+of+Toll-like+receptors%3A+an+important+mode+of+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+Immunology%22%5BJournal%5D)">Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation.</a> Current Opinion Immunology. 22 (1), 20-27 (2010).</li>
<li>Baccala, R., Hoebe, K., Kono, D. H., Beutler, B., Theofilopoulos, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-dependent+and+TLR-independent+pathways+of+type+I+interferon+induction+in+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity.</a> Nature Medicine. 13 (5), 543-551 (2007).</li>
<li>Gilliet, M., Cao, W., Liu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells%3A+sensing+nucleic+acids+in+viral+infection+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (8), 594-606 (2008).</li>
<li>Kawai, T., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+Receptors+and+Their+Crosstalk+with+Other+Innate+Receptors+in+Infection+and+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity.</a> Immunity. 34 (5), 637-650 (2011).</li>
<li>Liu, Z., Davidson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taming+lupus-a+new+understanding+of+pathogenesis+is+leading+to+clinical+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Taming lupus-a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances.</a> Nature Medicine. 18 (6), 871-882 (2012).</li>
<li>del Fresno, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-beta+production+via+Dectin-1-Syk-IRF5+signaling+in+dendritic+cells+is+crucial+for+immunity+to+C.+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Interferon-beta production via Dectin-1-Syk-IRF5 signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C. albicans.</a> Immunity. 38 (6), 1176-1186 (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+Levels+of+Interferon+Regulatory+Factor+5+%28IRF5%29+and+Related+Inflammatory+Cytokines+Associated+with+Severity%2C+Prognosis%2C+and+Causative+Pathogen+in+Patients+with+Community-Acquired+Pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Science+Monitor%22%5BJournal%5D)">Expression Levels of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) and Related Inflammatory Cytokines Associated with Severity, Prognosis, and Causative Pathogen in Patients with Community-Acquired Pneumonia.</a> Medical Science Monitor. 24, 3620-3630 (2018).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+recognition+by+GEF-H1+controls+IKKepsilon+mediated+activation+of+IRF5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microbial recognition by GEF-H1 controls IKKepsilon mediated activation of IRF5.</a> Nature Communications. 10 (1), 1349(2019).</li>
<li>Almuttaqi, H., Udalova, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+targeting+IRF5%2C+a+key+regulator+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation.</a> FEBS Journal. 286 (9), 1624-1637 (2019).</li>
<li>Chow, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+and+Overlapping+Immune+Programs+Regulated+by+IRF3+and+IRF5+in+Plasmacytoid+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential and Overlapping Immune Programs Regulated by IRF3 and IRF5 in Plasmacytoid Dendritic Cells.</a> The Journal of Immunology. 201 (10), 3036-3050 (2018).</li>
<li>Cheng, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Activation+of+IFN+Regulatory+Factor+%28IRF%29-3+and+IRF-5+Transcription+Factors+during+Viral+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential Activation of IFN Regulatory Factor (IRF)-3 and IRF-5 Transcription Factors during Viral Infection.</a> The Journal of Immunology. 176 (12), 7462-7470 (2006).</li>
<li>Chang Foreman, H. C., Van Scoy, S., Cheng, T. F., Reich, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+interferon+regulatory+factor+5+by+site+specific+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Activation of interferon regulatory factor 5 by site specific phosphorylation.</a> PLoS One. 7 (3), 33098(2012).</li>
<li>Lin, R., Yang, L., Arguello, M., Penafuerte, C., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRM1-dependent+nuclear+export+pathway+is+involved+in+the+regulation+of+IRF-5+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A CRM1-dependent nuclear export pathway is involved in the regulation of IRF-5 subcellular localization.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (4), 3088-3095 (2005).</li>
<li>Stone, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+5+activation+in+monocytes+of+systemic+lupus+erythematosus+patients+is+triggered+by+circulating+autoantigens+independent+of+type+I+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 5 activation in monocytes of systemic lupus erythematosus patients is triggered by circulating autoantigens independent of type I interferons.</a> Arthritis and Rheumatology. 64 (3), 788-798 (2012).</li>
<li>De, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+Cell-Intrinsic+Role+for+IRF5+in+TLR9%2FBCR-Induced+Human+B+Cell+Activation%2C+Proliferation%2C+and+Plasmablast+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B Cell-Intrinsic Role for IRF5 in TLR9/BCR-Induced Human B Cell Activation, Proliferation, and Plasmablast Differentiation.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1938(2017).</li>
<li>Fabie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF-5+Promotes+Cell+Death+in+CD4+T+Cells+during+Chronic+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">IRF-5 Promotes Cell Death in CD4 T Cells during Chronic Infection.</a> Cell Reports. 24 (5), 1163-1175 (2018).</li>
<li>Cushing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRAK4+kinase+activity+controls+Toll-like+receptor-induced+inflammation+through+the+transcription+factor+IRF5+in+primary+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">IRAK4 kinase activity controls Toll-like receptor-induced inflammation through the transcription factor IRF5 in primary human monocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (45), 18689-18698 (2017).</li>
<li>Li, C., Arakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+protein+analysis%3A+Bovine+serum+albumin+as+a+model+protein%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Application of native polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis: Bovine serum albumin as a model protein.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 125, 566-571 (2019).</li>
<li>Iwamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IRF-3%2F-7+kinase+and+NF-kappaB+in+response+to+double-stranded+RNA+and+virus+infection%3A+common+and+unique+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways.</a> Genes to Cells. 6 (4), 375-388 (2001).</li>
<li>Subhadarshanee, B., Mohanty, A., Jagdev, M. K., Vasudevan, D., Behera, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+charge+dependent+separation+of+modified+and+hybrid+ferritin+in+native+PAGE%3A+Impact+of+lysine+104%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Surface charge dependent separation of modified and hybrid ferritin in native PAGE: Impact of lysine 104.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1865 (10), 1267-1273 (2017).</li>
<li>Reynolds, J. A., Tanford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Dodecyl+Sulfate+to+Proteins+at+High+Binding+Ratios+-+Possible+Implications+for+State+of+Proteins+in+Biological+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios - Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (3), 1002(1970).</li>
<li>Manning, M., Colon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+protein+kinetic+stability%3A+resistance+to+sodium+dodecyl+sulfate+suggests+a+central+role+for+rigidity+and+a+bias+toward+beta-sheet+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure.</a> Biochemistry. 43 (35), 11248-11254 (2004).</li>
<li>Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKKalpha+negatively+regulates+IRF-5+function+in+a+MyD88-TRAF6+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">IKKalpha negatively regulates IRF-5 function in a MyD88-TRAF6 pathway.</a> Cellular Signalling. 22 (1), 117-127 (2010).</li>
<li>Paun, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+murine+interferon+regulatory+factor+5+%28IRF-5%29+and+its+role+in+the+innate+antiviral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of murine interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and its role in the innate antiviral response.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (21), 14295-14308 (2008).</li>
<li>Yasuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+dendritic+cell+type+I+IFN+production+induced+by+human+IgG-RNA+immune+complexes+is+IFN+regulatory+factor+%28IRF%295+and+IRF7+dependent+and+is+required+for+IL-6+production%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Murine dendritic cell type I IFN production induced by human IgG-RNA immune complexes is IFN regulatory factor (IRF)5 and IRF7 dependent and is required for IL-6 production.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 6876-6885 (2007).</li>
<li>Steinhagen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF-5+and+NF-kappaB+p50+co-regulate+IFN-beta+and+IL-6+expression+in+TLR9-stimulated+human+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IRF-5 and NF-kappaB p50 co-regulate IFN-beta and IL-6 expression in TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells.</a> European Journal of Immunology. 43 (7), 1896-1906 (2013).</li>
<li>Gratz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+production+induced+by+Streptococcus+pyogenes-derived+nucleic+acids+is+required+for+host+protection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1001345(2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół jest zmodyfikowaną natywną STRONĄ, która rozróżnia zarówno monomeryczne, jak i dimeryczne formy endogennego IRF5. Przeprowadzono niewiele badań donoszących o wykryciu endogennej aktywacji IRF5 przy użyciu specjalistycznej techniki obrazowania cytometrii przepływowej 23,27,28,30. Protokół ten wykorzystuje powszechną technikę oraz powszechne odczynniki i narzędzia do oceny ...

Czynnik regulacyjny interferonu 5 (IRF5) jest ważnym regulatorem transkrypcji, który odgrywa znaczącą rolę w regulacji odpowiedzi immunologicznej, szczególnie w uwalnianiu cytokin prozapalnych i interferonów typu I (IFN)1,2,3. Nieprawidłowa regulacja IRF5 jest czynnikiem przyczyniającym się do wielu chorób autoimmunologicznych, o czym świadczą różne polimorfizmy w locus IRF5, które są związane z toczniem rumieniowatym układowym, stwardnieniem rozsianym, reumatoidalnym zapaleniem stawów itp.4,5,6,7,8,9,10. W związku z tym solidny test wykrywania endogennego stanu aktywacji IRF5 ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia szlaków regulacyjnych i dalszych skutków IRF5 w fizjologicznie istotnym kontekście komórkowym.
IRF5 ulega konstytutywnej ekspresji w monocytach, komórkach dendrytycznych (DC), komórkach B i makrofagach1,11. Podobnie jak w przypadku innych czynników transkrypcyjnych z rodziny IRF, IRF5 znajduje się w cytoplazmie w stanie utajonym. Po aktywacji IRF5 ulega fosforylacji i tworzy homodimery, które następnie przemieszczają się do jądra i wiążą się ze specyficznymi elementami regulatorowymi genów kodujących IFN typu I i cytokiny prozapalne, ostatecznie indukując ekspresję tych genów1,2,11,12,13. IRF5 reguluje wrodzone odpowiedzi immunologiczne za różnymi receptorami Toll-podobnymi (TLR), takimi jak TLR7, TLR 8 i TLR 9, które są zlokalizowane w endosomach i wykorzystują MyD88 do sygnalizacji1,11,14. Te TLR rozpoznają przede wszystkim obce gatunki kwasów nukleinowych, takie jak jednoniciowy RNA (ssRNA) i niemetylowane DNA CpG, które są objawami infekcji15,16,17,18. Wykazano, że IRF5 reguluje odpowiedź immunologiczną przeciwko infekcjom bakteryjnym, wirusowym i grzybiczym19,20,21. Biorąc pod uwagę wpływową i zróżnicowaną rolę IRF5 w układzie odpornościowym, wzmacnianie lub tłumienie aktywności IRF5 może służyć jako nowa droga do rozwoju środków terapeutycznych22. W związku z tym tak ważne jest opracowanie protokołu monitorowania stanu aktywacji endogennego IRF5, aby umożliwić dokładne zbadanie szlaków i mechanizmów regulujących aktywność IRF5 w różnych typach komórek.
Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, przed opracowaniem tego protokołu nie opublikowano żadnego biochemicznego lub żelowego testu elektroforetycznego dla endogennej aktywacji IRF5. Wykazano, że fosforylacja jest ważnym pierwszym etapem aktywacji IRF5 i opracowano fosfospecyficzne przeciwciało IRF5, które doprowadziło do odkrycia i potwierdzenia reszty seryny ważnej dla aktywności IRF513. Jednakże, podczas gdy przeciwciało wyraźnie wykrywa fosforylowany IRF5, gdy jest immunoprecypitowany lub nadmiernie eksprymowany23, nie wykrywa fosforylacji IRF5 w lizacie całego komórkowego w naszych rękach (dane nie pokazane). Dimeryzacja jest kolejnym krokiem aktywacji IRF5, a wiele ważnych badań do tej pory badających ten etap opierało się na nadekspresji IRF5 znakowanego epitopem, często w nieistotnych typach komórek, które normalnie nie wyrażają IRF511,12,24,25. Wcześniejsze badania wykazały, że dimeryzowany IRF5 nie zawsze może translokować się do jądra, a zatem niekoniecznie jest w pełni aktywowany25,26. Opracowano test endogennej lokalizacji jądrowej IRF5 w celu oceny aktywacji IRF5 za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej27. Test ten został zastosowany w badaniach, które miały kluczowe znaczenie dla zrozumienia aktywności IRF5, zwłaszcza w pierwotnych lub rzadkich typach komórek28,29 i znacznie poszerzyły wiedzę w tej dziedzinie. Jednak test ten opiera się na specjalistycznym instrumencie, który nie jest powszechnie dostępny dla badaczy. Co więcej, często konieczne jest zbadanie początkowych etapów aktywacji podczas analizowania szlaków regulacyjnych IRF5 i identyfikowania regulatorów i komponentów szlaku. Badanie to zapewnia solidny i wiarygodny test biochemiczny dla wczesnych zdarzeń aktywacji IRF5, który można przeprowadzić w laboratoriach wyposażonych w narzędzia biologii molekularnej. Opisany tutaj protokół będzie bardzo przydatny w badaniu ścieżek i mechanizmów działania IRF5, zwłaszcza w połączeniu z testami ortogonalnymi, takimi jak obrazowa analiza cytometryczna przepływu lokalizacji jądrowej IRF523,27,28,30.
Natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (natywna STRONA) jest powszechnie stosowaną metodą analizy kompleksów białkowych31,32. W przeciwieństwie do elektroforezy w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), natywna PAGE rozdziela białka na podstawie ich kształtu, wielkości i ładunku. Zachowuje również natywną strukturę białka bez denaturacji31,33,34,35. Prezentowany protokół wykorzystuje te cechy natywnego PAGE i wykrywa zarówno monomeryczne, jak i dimeryczne formy IRF5. Metoda ta jest szczególnie ważna w wykrywaniu wczesnych zdarzeń aktywacji, ponieważ nie ma odpowiedniego dostępnego na rynku przeciwciała, które mogłoby wykryć endogenny fosforylowany IRF5. Wcześniej w kilku opublikowanych badaniach wykorzystano natywną PAGE do oceny dimeryzacji IRF5. Jednak większość tych badań opierała się na nadekspresji egzogennego IRF5 znakowanego epitopem w celu analizy stanu aktywacji2,13,24,36,37. W niniejszej pracy przedstawiono krok po kroku protokół analizy endogennej dimeryzacji IRF5 za pomocą zmodyfikowanej natywnej techniki PAGE w linii ludzkich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC), w której wykazano, że aktywność IRF5 jest kluczowa dla jej funkcji1,38,39,40. Ta sama technika została zastosowana do innych linii komórkowych23.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Life Technologies, HK</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz 300 W/250 V 230 V AC</td><td>Life Technologies, HK</td><td>PS0301</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-IRF5</td><td>Bethyl Laboratories, USA</td><td>A303-385</td><td></td></tr><tr><td>BIOSAN Rocker Shaker (bezpieczny w chłodniach)</td><td>EcoLife, HK</td><td>MR-12</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Buffer, pH 8, 0,5 M 4x 100 mL</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>15575020</tr><tr><td>Glicerol 500 ml</td><td>Life Technologies</td><td>15514011</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Life Technologies, HK</td><td>15527013</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało przeciw mysim IgG DyLight 800 Sprzężone przeciwciało</td><td>LAB-A-PORTER/Rockland, HK</td><td>610-145-002-0,5</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG DyLight 800</td><td>LAB-A-PORTER/Rockland, HK</td><td>611-145-002-0,5</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy Halt (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific, HK</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies, HK</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS)</td><td>Gene Company, HK</td><td>927-50000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw modułów Mini Tank blot; Moduł transferowy, akcesoria</td><td>Life Technologies, HK</td><td>NW2000</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3-12% żele, zestaw 10 dołków</td><td>Life Technologies, HK</td><td>BN1001BOX</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Running Buffer 20x</td><td>Life Technologies, HK</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Sample Buffer 4x</td><td>Life Technologies, HK</td><td>BN2003</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethyle Glycol</td><td>Tin Hang/ Calbiochem, HK#</td><td>492016-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PBS 7.4</td><td>Life Technologies, HK</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Biogen z membraną z polifluorku winylidenu (PVDF)</td><td>/Merck Millipore, HK</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek II (BSA)</td><td>Bio-Rad, HK</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>R848</td><td>Invivogen, HK</td><td>tlrl-r848</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies, HK</td><td></td><td></td>61870127</tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>ThermoFisher</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu &ge; 97% (miareczkowanie)</td><td>Tin Hang/Sigma, HK</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Life Technologies, HK</td><td>15504020</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Tin Hang/Sigma, HK</td><td>#P9416-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym analiza immunoblot endogennej dimeryzacji irf5

Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analysis of Endogenous IRF5 Dimerization

Czynnik regulacyjny interferonu 5 (IRF5) jest kluczowym czynnikiem transkrypcyjnym regulującym odpowiedź immunologiczną. Jest aktywowany poniżej szlaku sygnałowego genu odpowiedzi pierwotnej 88 receptora szpikowego Toll-like (TLR-MyD88). Aktywacja IRF5 obejmuje fosforylację, dimeryzację, a następnie translokację z cytoplazmy do jądra, co z kolei indukuje ekspresję genów różnych cytokin prozapalnych. Test detekcji aktywacji IRF5 jest niezbędny do badania funkcji IRF5 i jego odpowiednich szlaków. W tym artykule opisano solidny test do wykrywania endogennej aktywacji IRF5 w linii ludzkich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) CAL-1. Protokół składa się ze zmodyfikowanego testu elektroforezy niedenaturującej, który może odróżnić IRF5 w postaci monomerów i dimerów, zapewniając w ten sposób niedrogie i czułe podejście do analizy aktywacji IRF5.

Immunoblot (IB) z użyciem przeciwciała anty-IRF5 przeprowadzono na komórkach CAL-1 niepobudzonych lub pobudzonych 1 µg/mL R848 przez 2 h (Rysunek 1). Przygotowano lizaty komórkowe i przeprowadzono natywną elektroforezę w żelu PAGE. W niepobudzonych komórkach CAL-1 IRF5 wykryto jako pojedynczy prążek w natywnej elektroforezie PAGE, odpowiadający jego formie monomerycznej. Po potraktowaniu komórek CAL-1 związkiem R848 przez 2 h poziom monomeru IRF5 spadł, przy jednoczesnym wzroście akumulacji ...

Opisano natywną metodę Western blot do analizy dimeryzacji endogennego czynnika regulacyjnego interferonu 5 w linii komórek dendrytycznych plazmocytoidu CAL-1. Protokół ten można również zastosować do innych linii komórkowych.

Natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym Analiza immunoblot endogennej dimeryzacji IRF5

Interferon regulatory factor 5 (IRF5) is a key transcription factor for regulating the immune response. It is activated downstream of the Toll-like ...

Protokół ten wykorzystuje szeroko stosowaną technikę wraz z odczynnikami i narzędziami, które można pozyskać komercyjnie, aby ocenić endogenną aktywację IRF5 podczas wczesnych zdarzeń stymulacji. Można go łatwo zastosować do badania biologii IRF5 w innym kontekście komórkowym. Chociaż natywna strona jest powszechnie stosowaną techniką, uzyskanie jasnych, solidnych, możliwych do zinterpretowania i powtarzalnych wyników może być technicznie trudne.Korzystanie z komercyjnego bufora biegowego i systemu żelowego pomaga zminimalizować zmienność. A zwracanie uwagi na szczegóły jest niezbędne, a doświadczenie jest kluczem do sukcesu w uzyskiwaniu dobrych wyników. Ten zmodyfikowany natywny protokół PAGE składa się z wielu kroków z subtelnymi szczegółami, które są kluczem do sukcesu.Demonstracja wizualna może pokazać te szczegóły, które byłyby korzystne dla badaczy. Utrzymuj hodowlę komórek CAL-1 w kolbie T75 w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, z pełną pożywką RPMI 1640. Gdy będziesz gotowy do stymulacji komórek, przenieś je do 50-mililitrowej stożkowej probówki i odwiruj je przy 200 x g przez pięć minut.Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce, aby uzyskać jednorodną zawiesinę jednokomórkową. Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru i zasiew je z gęstością 1 000 000 komórek na dołek na sześciodołkowej płytce z czterema mililitrami wstępnie podgrzanego podłoża w każdym dołku. Inkubuj komórki przez 20 do 24 godzin, aby zbieg osiągnął 90 do 95%Następnego dnia stymuluj komórki, dodając cztery mikrolitry po jednym miligramie na mililitr R848 na studzienkę, upewniając się, że pozostawiłeś studzienkę kontrolną z komórkami i bez leczenia R848.Delikatnie kołysz płytką z boku na bok, aby równomiernie rozprowadzić R848, a następnie inkubuj komórki przez 2 do 16 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po inkubacji przenieść zawiesiny komórkowe z płytki do 5-mililitrowych probówek wirówkowych. Odwirować komórki przy 200 x g przez pięć minut, następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PBS.Przenieś zawiesinę komórek do 1,5-mililitrowej probówki i wiruj ją w temperaturze 12 000 x g przez 30 do 60 sekund w temperaturze 4 stopni Celsjusza, a następnie ostrożnie usuń supernatant. Przygotuj bufor do lizy zgodnie ze wskazówkami rękopisu i trzymaj go na lodzie do momentu użycia gotowego do użycia. Ponownie zawiesić osad komórek w 30 mikrolitrach lodowatego buforu do lizy i pipetować w górę iw dół, aby wymieszać.Następnie inkubuj probówkę na lodzie przez 15 do 20 minut. Klarować lizat przez odwirowanie przy 12 000 x g przez 15 do 20 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza i przenieść supernatant do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra, upewniając się, że ekstrakty są zawsze na lodzie. Następnie zmierz stężenie białka za pomocą odczynnika Bradforda.Przygotuj do elektroforezy w górnej i dolnej komorze zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i dokładnie spłucz 3-12% natywny żel PAGE wodą, nie zniekształcając studzienek Należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z deoksycholanem sodu. Do obchodzenia się z substancją chemiczną wymagane są środki ochrony osobistej, takie jak fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i maska. Następnie umieść żel w mini zbiorniku żelu, wyjmij grzebień, dodaj przygotowane do elektroforezy górnej i dolnej komory i uruchom go w chłodni o temperaturze 4 stopni Celsjusza lub na lodzie przy napięciu 150 woltów przez 30 minut.W międzyczasie przygotuj próbki do załadunku, mieszając białka komórkowe na lodzie z 4-krotnym natywnym buforem próbki. Po zakończeniu cyklu wstępnego załaduj od 10 do 15 mikrogramów białka do każdej studzienki i uruchom żel przez 30 minut przy napięciu 85 woltów, a następnie dwie godziny przy napięciu 150 woltów. Następnie namocz żel w buforze do biegania SDS na 30 minut w temperaturze pokojowej.Aktywuj membranę z polifluorku winylidenu, mocząc ją w metanolu na około pięć minut. Wykonaj nacięcie w jednym rogu membrany, aby wskazać jej orientację, i zmontuj kanapkę transferową zgodnie z protokołem producenta. Umieść kasetę transferową w zbiorniku i przenoś pod napięciem 20 woltów przez godzinę na lodzie.Następnie wyjmij membranę z kasety za pomocą plastikowych kleszczyków i zablokuj membranę w buforze blokującym w temperaturze pokojowej na 45 minut na kołyszącym się shakerze. Następnie inkubować błonę z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc lub w temperaturze pokojowej przez dwie godziny i przemywać ją buforem myjącym 1XTBST przez trzy minuty podczas kołysania. Następnie ponownie inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym, używając buforu myjącego 1XTBST w temperaturze pokojowej przez 45 minut, powtarzając płukanie.Następnie zeskanuj plamę za pomocą odpowiedniego systemu dokumentacji żelu. Korzystając z tego protokołu, komórki CAL-1, które były stymulowane lub niestymulowane R848, analizowano za pomocą immunoblot. W niestymulowanych komórkach CAL-1 IRF5 wykryto jako pojedyncze prążko na natywnej PAGE odpowiadające jego formie monomerycznej.W przypadku stymulowanych komórek poziom monomeru IRF5 zmniejszył się, podczas gdy poziom dimeru wzrósł. Immunoblot z przeciwciałem anty-IRF5 przeprowadzono na IRF5 z nadmierną ekspresją 293 limfocytów T transfekowanych różnymi konstruktami. Nie wykryto IRF5 w nietransfekowanej kontroli, co świadczy o swoistości przeciwciała anty-IRF5.Pojedyncze pasmo odpowiadające monomerycznemu IRF5 wykryto tylko w 293 limfocytach T z nadmierną ekspresją IRF5. Gdy konstrukty kodujące białka aktywujące IRF5 zostały poddane kotransfekcji, pojawiło się wolno migrujące pasmo odpowiadające dimerycznej formie IRF5. Jednak NMDA5, białko pokrewne RIG-I, nie indukowało dimeryzacji IRF5.Zastosowanie żeli gradientowych Bis-Tris jest kluczowe, prawdopodobnie ze względu na specyficzne pH i skład chemiczny tych układów elektroforetycznych tego żelu, które umożliwiły rozdzielenie monomerycznych i dimerycznych form IRF5. Ponadto liza i konserwacja lizatów komórkowych w niedenaturującym natywnym buforze próbki zachowuje natywne struktury białkowe. Tutaj użyliśmy dostępnego na rynku takiego, który jest dostosowany do natywnych kwasów PAGE.Dodatkową metodą, która bardzo się z tym uzupełnia, jest wykorzystanie systemu obrazowania cytometrii przepływowej ImageStream do oceny translokacji jądrowej IRF5, czyli substancji, która ulega aktywacji IRF5 po dimeryzacji. W połączeniu z naszym protokołem, służy jako inny rodzaj testu do walidacji kroków związanych z aktywacją IRF5. Będąc kluczowym regulatorem odpowiedzi zapalnej, IRF5 odgrywa ważną rolę w infekcjach i odporności, chorobach autoimmunologicznych, nowotworach i wielu innych chorobach ważnych dla zdrowia człowieka.Podejmowane są również wysiłki w celu opracowania środków terapeutycznych ukierunkowanych na IRF5 i pokrewne czynniki transkrypcyjne. Protokół ten pozwoli naukowcom z różnych dziedzin zrozumieć i zbadać biologię IRF5.

native-polyacrylamide-gel-electrophoresis-immunoblot-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ilościowe, wysokoprzepustowe, w czasie rzeczywistym i bez znakowania wykrywanie biomolekuł (DNA, białek itp.) na powierzchniach SiO2 można osiągnąć za pomocą prostej techniki interferometrycznej, która opiera się na oświetleniu LED, minimalnej liczbie komponentów optycznych i kamerze. Sensor obrazowania odbiciowego interferometrycznego (IRIS) jest niedrogi, prosty w obsłudze i dostosowany do formatów mikromacierzy.

Detekcja biomolekularna z wykorzystaniem interferometrycznego czujnika obrazowania odbiciowego (IRIS)

Wrodzona obrona przed infekcjami wirusowymi jest wywoływana przez receptory rozpoznawania wzorców (PRR). Dwa cytoplazmatyczne PR, RIG-I I PKR, wiążą się z sygnaturą wirusa RNA, zmieniają konformację, oligomeryzują i aktywują sygnalizację przeciwwirusową. Opisano metody, które pozwalają wygodnie monitorować przełączanie konformacyjne i oligomeryzację tych cytoplazmatycznych PRR.

Monitorowanie aktywacji receptorów rozpoznawania wzorców przeciwwirusowych RIG-I i PKR przez ograniczone trawienie proteazy i natywne PAGE

Tutaj prezentujemy protokół do analizy interakcji RNA/białko. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) opiera się na zróżnicowanej migracji kompleksów RNA/białko i wolnego RNA podczas natywnej elektroforezy żelowej. Za pomocą znakowanej radioaktywnie sondy RNA, kompleksy RNA/białko można uwidocznić za pomocą autoradiografii.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) do badania interakcji RNA-białko: przykład IRE/IRP

Tutaj opisujemy procedurę pozwalającą na szczegółową analizę zależnej od fosforylacji aktywacji czynnika transkrypcyjnego IRF3. Osiąga się to poprzez połączenie SDS-PAGE o wysokiej rozdzielczości i natywnej PAGE sprzężonej z immunoblotami przy użyciu wielu przeciwciał fosfospecyficznych.

Metoda wysokiej rozdzielczości do monitorowania aktywacji IRF3 zależnej od fosforylacji

Oligomeryzacja receptora ryanodyny, homo-tetramerycznego kanału jonowego pośredniczącego w uwalnianiu Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów, jest krytyczna dla skurczu mięśnia szkieletowego i sercowego. W tym artykule przedstawiono komplementarne metody in vivo i in vitro do wykrywania samoasocjacji białek i wyznaczania stechiometrii homo-oligomerów.

Genetyczne i biochemiczne podejścia do oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro: studium przypadku receptora ryanodyny

Opisujemy izolację macierzy zewnątrzkomórkowej serca od myszy kontrolnych C57Bl/6J, myszy o napiętej skórze i myszy o napiętej skórze leczonych peptydem hamującym IRF5. Opisujemy również badania rozszerzenia naczyń krwionośnych na izolowanych naczyniach od C57Bl / 6J, myszy o napiętej skórze i myszy o napiętej skórze leczonych peptydem hamującym IRF5.

Rozszerzenie naczyń krwionośnych izolowanych naczyń krwionośnych i izolacja macierzy zewnątrzkomórkowej myszy o napiętej skórze

Przedstawione tutaj są dwie techniki badań interakcji białko-białko oparte na przeciwciałach: immunofluorescencja i immunoprecypitacja. Techniki te nadają się do badania fizycznych interakcji między białkami w celu odkrycia nowych składników komórkowych szlaków sygnałowych i zrozumienia dynamiki białek.<br...

Badanie interakcji białko-białko w badaniach nad autofagią

Rekombinowana integraza retrowirusowa i oligomery DNA naśladujące końcówki DNA wirusa mogą tworzyć enzymatycznie aktywny kompleks znany jako intasom. Intasomy mogą być wykorzystywane do badań biochemicznych, strukturalnych i kinetycznych. Protokół ten szczegółowo opisuje, jak składać i oczyszczać prototypowe pieniste intasomy wirusa.

Montaż i oczyszczanie prototypowych pienistych intasomów wirusowych

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Interakcje białko-białko są ważne dla wyjaśnienia funkcji docelowych białek, a koimmunoprecypitacja (co-IP) może łatwo potwierdzić IPP. Przejściowo transfekowaliśmy plazmid kodujący białko znakowane epitopem do komórek HEK-293 i opracowaliśmy metodę immunoprecypitacji, aby łatwo potwierdzić wiązanie dwóch białek docelowych.

Immunoprecypitacja za pomocą żelu powinowactwa do znaczników antyepitopowych w celu zbadania interakcji białko-białko

Poznaj natywną elektroforezę Western blot do analizy endogennej dimeryzacji IRF5 w liniach komórkowych dendrytycznych. Ta metoda pozwala badaczom badać aktywację czynnika transkrypcyjnego w kontekście immunologicznym.

Natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym Analiza immunoblot endogennej dimeryzacji IRF5

Przeglądaj więcej filmów