Natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym Analiza immunoblot endogennej dimeryzacji IRF5

Protokół ten wykorzystuje szeroko stosowaną technikę wraz z odczynnikami i narzędziami, które można pozyskać komercyjnie, aby ocenić endogenną aktywację IRF5 podczas wczesnych zdarzeń stymulacji. Można go łatwo zastosować do badania biologii IRF5 w innym kontekście komórkowym. Chociaż natywna strona jest powszechnie stosowaną techniką, uzyskanie jasnych, solidnych, możliwych do zinterpretowania i powtarzalnych wyników może być technicznie trudne.

Korzystanie z komercyjnego bufora biegowego i systemu żelowego pomaga zminimalizować zmienność. A zwracanie uwagi na szczegóły jest niezbędne, a doświadczenie jest kluczem do sukcesu w uzyskiwaniu dobrych wyników. Ten zmodyfikowany natywny protokół PAGE składa się z wielu kroków z subtelnymi szczegółami, które są kluczem do sukcesu.

Demonstracja wizualna może pokazać te szczegóły, które byłyby korzystne dla badaczy. Utrzymuj hodowlę komórek CAL-1 w kolbie T75 w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, z pełną pożywką RPMI 1640. Gdy będziesz gotowy do stymulacji komórek, przenieś je do 50-mililitrowej stożkowej probówki i odwiruj je przy 200 x g przez pięć minut.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce, aby uzyskać jednorodną zawiesinę jednokomórkową. Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru i zasiew je z gęstością 1 000 000 komórek na dołek na sześciodołkowej płytce z czterema mililitrami wstępnie podgrzanego podłoża w każdym dołku. Inkubuj komórki przez 20 do 24 godzin, aby zbieg osiągnął 90 do 95%Następnego dnia stymuluj komórki, dodając cztery mikrolitry po jednym miligramie na mililitr R848 na studzienkę, upewniając się, że pozostawiłeś studzienkę kontrolną z komórkami i bez leczenia R848.

Delikatnie kołysz płytką z boku na bok, aby równomiernie rozprowadzić R848, a następnie inkubuj komórki przez 2 do 16 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po inkubacji przenieść zawiesiny komórkowe z płytki do 5-mililitrowych probówek wirówkowych. Odwirować komórki przy 200 x g przez pięć minut, następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PBS.

Przenieś zawiesinę komórek do 1,5-mililitrowej probówki i wiruj ją w temperaturze 12 000 x g przez 30 do 60 sekund w temperaturze 4 stopni Celsjusza, a następnie ostrożnie usuń supernatant. Przygotuj bufor do lizy zgodnie ze wskazówkami rękopisu i trzymaj go na lodzie do momentu użycia gotowego do użycia. Ponownie zawiesić osad komórek w 30 mikrolitrach lodowatego buforu do lizy i pipetować w górę iw dół, aby wymieszać.

Następnie inkubuj probówkę na lodzie przez 15 do 20 minut. Klarować lizat przez odwirowanie przy 12 000 x g przez 15 do 20 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza i przenieść supernatant do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra, upewniając się, że ekstrakty są zawsze na lodzie. Następnie zmierz stężenie białka za pomocą odczynnika Bradforda.

Przygotuj do elektroforezy w górnej i dolnej komorze zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i dokładnie spłucz 3-12% natywny żel PAGE wodą, nie zniekształcając studzienek Należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z deoksycholanem sodu. Do obchodzenia się z substancją chemiczną wymagane są środki ochrony osobistej, takie jak fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i maska. Następnie umieść żel w mini zbiorniku żelu, wyjmij grzebień, dodaj przygotowane do elektroforezy górnej i dolnej komory i uruchom go w chłodni o temperaturze 4 stopni Celsjusza lub na lodzie przy napięciu 150 woltów przez 30 minut.

W międzyczasie przygotuj próbki do załadunku, mieszając białka komórkowe na lodzie z 4-krotnym natywnym buforem próbki. Po zakończeniu cyklu wstępnego załaduj od 10 do 15 mikrogramów białka do każdej studzienki i uruchom żel przez 30 minut przy napięciu 85 woltów, a następnie dwie godziny przy napięciu 150 woltów. Następnie namocz żel w buforze do biegania SDS na 30 minut w temperaturze pokojowej.

Aktywuj membranę z polifluorku winylidenu, mocząc ją w metanolu na około pięć minut. Wykonaj nacięcie w jednym rogu membrany, aby wskazać jej orientację, i zmontuj kanapkę transferową zgodnie z protokołem producenta. Umieść kasetę transferową w zbiorniku i przenoś pod napięciem 20 woltów przez godzinę na lodzie.

Następnie wyjmij membranę z kasety za pomocą plastikowych kleszczyków i zablokuj membranę w buforze blokującym w temperaturze pokojowej na 45 minut na kołyszącym się shakerze. Następnie inkubować błonę z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc lub w temperaturze pokojowej przez dwie godziny i przemywać ją buforem myjącym 1XTBST przez trzy minuty podczas kołysania. Następnie ponownie inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym, używając buforu myjącego 1XTBST w temperaturze pokojowej przez 45 minut, powtarzając płukanie.

Następnie zeskanuj plamę za pomocą odpowiedniego systemu dokumentacji żelu. Korzystając z tego protokołu, komórki CAL-1, które były stymulowane lub niestymulowane R848, analizowano za pomocą immunoblot. W niestymulowanych komórkach CAL-1 IRF5 wykryto jako pojedyncze prążko na natywnej PAGE odpowiadające jego formie monomerycznej.

W przypadku stymulowanych komórek poziom monomeru IRF5 zmniejszył się, podczas gdy poziom dimeru wzrósł. Immunoblot z przeciwciałem anty-IRF5 przeprowadzono na IRF5 z nadmierną ekspresją 293 limfocytów T transfekowanych różnymi konstruktami. Nie wykryto IRF5 w nietransfekowanej kontroli, co świadczy o swoistości przeciwciała anty-IRF5.

Pojedyncze pasmo odpowiadające monomerycznemu IRF5 wykryto tylko w 293 limfocytach T z nadmierną ekspresją IRF5. Gdy konstrukty kodujące białka aktywujące IRF5 zostały poddane kotransfekcji, pojawiło się wolno migrujące pasmo odpowiadające dimerycznej formie IRF5. Jednak NMDA5, białko pokrewne RIG-I, nie indukowało dimeryzacji IRF5.

Zastosowanie żeli gradientowych Bis-Tris jest kluczowe, prawdopodobnie ze względu na specyficzne pH i skład chemiczny tych układów elektroforetycznych tego żelu, które umożliwiły rozdzielenie monomerycznych i dimerycznych form IRF5. Ponadto liza i konserwacja lizatów komórkowych w niedenaturującym natywnym buforze próbki zachowuje natywne struktury białkowe. Tutaj użyliśmy dostępnego na rynku takiego, który jest dostosowany do natywnych kwasów PAGE.

Dodatkową metodą, która bardzo się z tym uzupełnia, jest wykorzystanie systemu obrazowania cytometrii przepływowej ImageStream do oceny translokacji jądrowej IRF5, czyli substancji, która ulega aktywacji IRF5 po dimeryzacji. W połączeniu z naszym protokołem, służy jako inny rodzaj testu do walidacji kroków związanych z aktywacją IRF5. Będąc kluczowym regulatorem odpowiedzi zapalnej, IRF5 odgrywa ważną rolę w infekcjach i odporności, chorobach autoimmunologicznych, nowotworach i wielu innych chorobach ważnych dla zdrowia człowieka.

Podejmowane są również wysiłki w celu opracowania środków terapeutycznych ukierunkowanych na IRF5 i pokrewne czynniki transkrypcyjne. Protokół ten pozwoli naukowcom z różnych dziedzin zrozumieć i zbadać biologię IRF5.