Name: Transdukcja i ekspansja pierwotnych limfocytów T w ciągu dziewięciu dni z utrzymaniem fenotypu pamięci centralnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj metodę transdukcji i ekspansji limfocytów T makaka rhesus w ciągu dziewięciu dni z zachowaniem fenotypu pamięci centralnej. Protokół umożliwia produkcję komórek immunoterapeutycznych z potencjałem długotrwałej perzystencji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty NIH 5R01AI096966-06S1 (PS, EC, i EB), 1UM1AI26617 (PS, EC i EB), P51OD011106/P51RR000167 (ER), MN REACH grant 5U01HL127479-03 (PS), 1R01A143380-01 (PS i EB), 1UM14126617 (PS i EC), a także fundusze dostarczone przez NIAID Division of Intramural Research i NIH Intramural AIDS Targeted Antiviral Program. Anty-CD3 i anty-CD28 stosowane w tych badaniach zostały dostarczone przez NIH Nonhuman Nonhuman Primate Reagent Resource (R24 OD010976, U24 AI126683). IL-2 wykorzystana w tych badaniach została dostarczona przez The NCI Preclinical Repository. Dziękujemy naszym współpracownikom w projekcie CD4-MBL CAR/CXCR5: dr Elizabeth Connick z University of Arizona, dr Edwardowi A. Bergerowi z NIAID, NIH, dr Evie G Rakasz z Wisconsin National Primate Research Center oraz dr Geoffowi Hartowi i pani Preethi Haran z University of Minnesota, dr Leslie Kean z Harvard Medical School i dr Catherine Bollard z Children's Research Institute. Dziękujemy również dr Scottowi McIvorowi z University of Minnesota, dr Christopherowi Petersonowi z Fred Hutchinson Cancer Center, dr Matthew Trivettowi z NIH, dr Agne Taraseviciute ze Szpitala Dziecięcego w Seattle i dr Conradowi Russellowi Cruzowi z The Children's Research Institute za ich bardzo pomocną pomoc w optymalizacji tego protokołu. Wyrażamy również wdzięczność Paniom Chi Phan i Panu Jhomary Alegria-Berrocal z University of Minnesota za produkcję gammaretrowirusa oraz Pani Kim Weisgrau z University of Wisconsin-Madison za izolację makaka rezusa PBMC.

UWAGA: Ten protokół transdukcji PBMC Rh wymaga użycia wektora gammaretrowirusowego. Należy pamiętać, że gammaretrowirus może być produkowany w laboratorium lub zlecany firmie zajmującej się produkcją wirusów. W laboratorium produkcja może być prowadzona zgodnie z protokołem opisanym w kroku 1, a wirus może być określany zgodnie z opisem w kroku 2. Niezależnie od tego, czy wirus jest produkowany na miejscu, czy przez firmę produkcyjną, należy określić MOI (stosunek zakaźnych wirionów do komórek w hodowli), jak opisano w kroku 3, dla każdego nowo wyprodukowanego preparatu wirusowego i komórek będących przedmiotem zainteresowania.
UWAGA: Praca z wektorami gammaretrowirusowymi lub innymi wektorami retrowirusowymi wymaga odpowiednich środków bezpieczeństwa, takich jak używanie fartuchów laboratoryjnych i podwójnych warstw rękawic. Wszelkie obchodzenie się z wirusem musi odbywać się w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Wszystkie pipety należy odkazić w roztworze 10% wybielacza przez 30 min. Wszystkie płynne odpady zakaźne należy odkazić końcowym stężeniem 10% wybielacza. Do wirowania wymagana jest wtórna hermetyzacja z uszczelką zapobiegającą uwalnianiu aerozoli mikrobiologicznych
1. Produkcja zapasu gammaretrowirusowego
<ol>
	<li>Płytki 293T komórki do transfekcji. Pełne przygotowanie wirusa wymaga 12 kolb T75 o wymiarach 4,5 x 106 komórek/kolbę w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) bez antybiotyków.</li>
	<li>Pozostawić komórki do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C przed transfekcją.</li>
	<li>Rozcieńczyć 60 μl odczynnika do transfekcji w 1,5 ml zredukowanej pożywki surowicy. Przygotować jedną probówkę do każdej kolby. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dla każdej kolby przygotować probówkę zawierającą 1,5 ml zredukowanej pożywki surowicy i następujące plazmidy: 9,0 μg plazmidu transferowego zawierającego gen(y) będący przedmiotem zainteresowania, 3 μg RD114 i 1,2 μg VSV-G (plazmidy otoczkowe) oraz 3 μg gag/pol. 
	UWAGA: Geny otoczki i gag/pol są potrzebne do pakowania retrowirusowego. Do naszej produkcji retrowirusowej dodajemy zarówno otoczkę RD114, jak i, dla zwiększenia stabilności, niewielką ilość otoczki VSV-G.</li>
	<li>Dodać rozcieńczone plazmidy (krok 1.4) do rozcieńczonego odczynnika do transfekcji (krok 1.3). Delikatnie wymieszaj. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Nakarmić komórki 5 ml świeżej, kompletnej pożywki i dodać kroplami 3 ml mieszaniny odczynnika do transfekcji i plazmidu na kolbę i inkubować przez 5–6 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać dodatkowe 5 ml świeżej pożywki do kolb i inkubować przez 42–43 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po całkowitym czasie transfekcji wynoszącym 48 godzin, zebrać pożywkę i odwirować w temperaturze 1282 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek.</li>
	<li>Podzielić na odpowiednie objętości do wykorzystania w przyszłości, błyskawicznie zamrozić wirusa w etanolu/łaźni suchego lodu i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Mianowanie gammaretrowirusa
UWAGA: Do uzyskania prawidłowego miana może być potrzebne kilka rozcieńczeń wirusa.
<ol>
	<li>Umieścić komórki 293T w 600 000 komórek/basenik na płytce 6-dołkowej i inkubować płytki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usuń pożywkę z komórek i dodaj żądaną ilość DMEM + 10% FBS do 293T (2 ml całkowitej objętości wirusa).</li>
	<li>Dodaj wirusa do odpowiedniej studzienki i delikatnie zamieszaj, aby wymieszać. Na przykład dodaj odpowiednio 200 μl, 100 μl, 50 μl i 25 μl do 4 dołków. Dołączyć studzienkę bez wirusa do cytometrii przepływowej (próbna próbka).</li>
	<li>Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Trypsynizuj komórki 293T, dodając 0,5 ml trypsyny-EDTA i inkubując przez 4 minuty w temperaturze 37 °C. Zatrzymaj trypsynę, dodając 1,5 ml DMEM + 10% FBS. Policz komórki i określ żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.
	<ol>
		<li>Aby skorzystać z licznika komórek, dodaj 10 μl komórek do 10 μl błękitu trypanowego, wymieszaj, załaduj szkiełko komory i włóż do licznika. Naciśnij przycisk "przechwytywanie", aby policzyć komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać 0,5–1 x 106 komórek i ocenić poziomy CAR i CXCR5 za pomocą cytometrii przepływowej (patrz krok 9.5). Ekspresja CD4 lub MBL wraz z CXCR5 zidentyfikuje transdukowane komórki 293T współeksprymujące CAR i CXCR5. Patrz przeciwciała reaktywne w kroku 9.5.1.</li>
	<li>Obliczać miano wirusa. 
	UWAGA: Do obliczenia miana należy wybrać próbkę o poziomie transdukcji 20% lub niższym.
	<ol>
		<li>Użyj następującego wzoru, aby obliczyć miano: 
		jednostki transdukcji/ml = (liczba komórek w hodowli)(% transdukowanych komórek)/objętość wirusa dodanego do kultury</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Określanie optymalnego MOI dla nowo wyprodukowanego preparatu wirusowego i komórek będących przedmiotem zainteresowania
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z protokołem transdukcji (sekcje 4-9) z pierwotnymi PBMC i dwukrotnymi rozcieńczeniami preparatu gammaretrowirusowego.</li>
	<li>Oceń poziom ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania za pomocą cytometrii przepływowej (krok 9.5).</li>
	<li>Wybierz takie stężenie wirusa, które pozwala na maksymalną transdukcję bez utraty żywotności komórek.</li>
</ol>
4. Przygotowanie płytek do aktywacji limfocytów T poprzez powlekanie studzienek przeciwciałami anty-CD3
<ol>
	<li>Przygotować przeciwciało przeciwko makakom CD3 (FN18), rozcieńczając materiał podstawowy do 10 μg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).</li>
	<li>Dozować 2 ml/dołek do płytek 6-dołkowych. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Alternatywnie, płytki można inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać PBS i niezwiązane przeciwciała. Przepłukać studzienki dwukrotnie 2 ml PBS i natychmiast użyć do płytki PBMC.</li>
</ol>
5. Stymulowanie PBMC Rh za pomocą anty-CD3 związanego z płytką i rozpuszczalnego anty-CD28
<ol>
	<li>Rozmrozić pierwotne PBMC rezusów w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, delikatnie mieszając, aż pozostanie tylko niewielka ilość lodu.</li>
	<li>W kapturze delikatnie odpipetuj komórki do stożkowej rurki. Przepłukać fiolkę 1 ml pożywki zasadowej i powoli dodawać ją do komórek. Następnie powoli dodaj do komórek dodatkowe 9 ml ciepłej pożywki zasadowej. 
	UWAGA: Ten krok można zwiększyć, ale nigdy nie rozmrażaj więcej niż 4 fiolek jednocześnie.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 22 °C w celu osadzenia komórek. Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad w niewielkiej ilości pożywki wzrostowej. Wybierz taką objętość, aby stężenie komórek przekroczyło w tym momencie 2 x 106 komórek/ml, ponieważ końcowe stężenie powinno wynosić 2 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Wybarwić komórki błękitem trypanowym i policzyć komórki, aby określić liczbę żywotnych komórek. 
	UWAGA: Można to zrobić za pomocą standardowego hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Używamy automatycznego licznika komórek, który wyświetla żywotność i liczbę żywych komórek.
	<ol>
		<li>Aby skorzystać z licznika, dodaj 10 μl komórek do 10 μl błękitu trypanowego, wymieszaj, załaduj szkiełko komory i włóż do licznika. Naciśnij przycisk "przechwytywanie", aby policzyć komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz całkowitą liczbę komórek, mnożąc stężenie komórek przez objętość, a następnie rozcieńcz komórki do 2 x 106 komórek/ml w pożywce wzrostowej. Przed posiewem dodać anty-CD28 do końcowego stężenia 5 μg/ml, aby zapewnić niezbędny sygnał kostymulujący do aktywacji limfocytów T.</li>
	<li>Pipetować komórki do płytek pokrytych anty-CD3. Dodać 3–6 x 106 komórek na studzienkę (dobrym celem jest 4 x 106 komórek w 2 ml pożywki na studzienkę) i inkubować przez 2 dni w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
</ol>
6. Przygotowanie płytek pokrytych fibronektyną
UWAGA: Limfocyty PBMC i T wyrażają receptory integrynowe VLA-4 lub VLA-5 i są dobrymi celami dla transdukcji za pośrednictwem fibronektyny.
<ol>
	<li>Przed pokryciem płytek należy najpierw przygotować odczynnik fibronektyny, rozcieńczając go w stosunku 1:100 w sterylnym PBS.</li>
	<li>Odpipetować 2 ml sterylnego roztworu fibronektyny do każdego dołka na 6-dołkowej płytce. Delikatnie kołysać płyty przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Na tym etapie należy użyć niepoddanych obróbce płytek lub szalek do hodowli tkankowych klasy hodowli komórkowych.</li>
	<li>Usunąć roztwór fibronektyny przez aspirację, a następnie zablokować 1 ml sterylnej 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA, frakcja V) w PBS. Kołysz talerzami w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Odessać roztwór BSA i umyć płytkę 2 ml PBS. Po aspiracji PBS płytki pokryte fibronektyną można uszczelnić folią uszczelniającą i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia. 
	UWAGA: Płytki przygotowujemy zazwyczaj na dzień przed transdukcją.</li>
</ol>
7. Transdukcja aktywowanych PBMC rezusów
UWAGA: Praca z wektorami wirusowymi lub z makakami rezusami wymaga zastosowania odpowiednich środków bezpieczeństwa, takich jak stosowanie fartuchów laboratoryjnych i podwójnych warstw rękawic. Wszelki kontakt z wirusem i komórkami musi odbywać się w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Wszystkie pipety należy odkazić w roztworze 10% wybielacza przez 30 min. Wszystkie płynne odpady zakaźne należy odkazić końcowym stężeniem 10% wybielacza. Do wirowania wymagana jest wtórna hermetyzacja z uszczelką, która zapobiega uwalnianiu aerozoli mikrobiologicznych.
<ol>
	<li>Przymocuj wektor transdukcyjny gammaretrowirusa do studzienki pokrytej fibronektyną.
	<ol>
		<li>Podgrzać wirówkę do temperatury 32 °C, pracując przy 2000 x g przez około 30 minut.</li>
		<li>Podgrzej zarówno surowicę, jak i pożywkę wzrostową w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Rozmrozić wirusa na lodzie lub delikatnie obracając fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż pozostanie tylko niewielka ilość lodu. Aby uniknąć degradacji preparatu wirusowego, nie należy dopuścić do rozgrzania zawartości.</li>
		<li>Rozcieńczyć retrowirusa do z góry określonej optymalnej liczby infekcji (MOI) w podłożu bez surowicy. 
		UWAGA: W przypadku naszego gammaretrowirusa i rezusa PBMC stwierdziliśmy, że MOI wynosi 0,5 i jest optymalny.
		<ol>
			<li>Przykładowe rozcieńczenie: Aby pokryć 4 studzienki wirusem i dodać 1,5 x 106 komórek, (4) (1,5 x 106) (0,5) = 3 x 106 TU są potrzebne. Jeśli miano wirusa wynosi 1,1 j./ml, należy użyć 2,7 ml wirusa w pożywce 5,3 ml, aby uzyskać całkowitą objętość 8 ml.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodać 2 ml rozcieńczonego retrowirusa do każdego dołka płytki pokrytej fibronektyną.</li>
		<li>W przypadku komórek transdukowanych metodą kontroli ujemnej należy dodać samą pożywkę do studzienek pokrytych fibronektyną.</li>
		<li>Umieścić płytki we wstępnie ogrzanej wirówce o temperaturze 32 °C w nośnikach mikropłytek z biobezpiecznymi pokrywami i odwirować przy 2000 x g przez 2 godziny 
		UWAGA: Płytki pokryte wirusem mogą być używane natychmiast lub przechowywane wraz z wirusem w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Do natychmiastowego użycia odessać preparat wirusa ze studzienek i dodać 2 ml pożywki wzrostowej. Nie dopuścić do wyschnięcia studzienek pokrytych wirusem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na płytce umieszczono stymulowane PBMC.
	<ol>
		<li>Sprawdź komórki za pomocą odwróconego mikroskopu. Komórki powinny wyglądać zdrowo, co oznacza, że są okrągłe, jasne i załamują światło. Powinny również wykazywać zbity wygląd wskazujący na stymulację.</li>
		<li>Zbierz komórki docelowe i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Przepłucz studzienkę raz 1 ml pożywki wzrostowej i dodaj do stożkowej probówki. Policz liczbę żywych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek, jak w kroku 5.4. 
		UWAGA: Stymulowane komórki będą zlepiane, a to zlepianie może prowadzić do trudności w dokładnym zliczeniu komórek.</li>
		<li>Osadzać komórki w probówkach przez odwirowywanie w stężeniu 600 x g przez 5 minut w temperaturze 32 °C. Odessać pożywkę z osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w pożywce wzrostowej o stężeniu 1,5 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Do każdej studzienki pokrytej wirusem (przygotowanej w kroku 7.1) dodać 1 ml zawiesiny komórek, co daje w sumie 1,5 x 106 komórek/3 ml. Należy pamiętać, że każda studzienka zawiera już 2 ml pożywki wzrostowej. Wykonaj te same kroki dla komórek transdukowanych pozorowo, ale umieść je w studzienkach pokrytych fibronektyną, które nie otrzymały wirusa.</li>
		<li>Odwirować płytki przy 1000 x g przez 10 minut w temperaturze 32 °C.</li>
		<li>Inkubować płytki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Ekspansja transdukowanych komórek
<ol>
	<li>Pobrać zawartość studzienek w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 5 ml w celu ponownego zawieszenia komórek, a następnie przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodaj 1 ml pożywki wzrostowej do każdej studzienki i pobieraj w górę iw dół sterylną pipetą transferową, aby usunąć przylegające komórki.</li>
	<li>Policz komórki, aby określić całkowitą liczbę komórek i żywotność przy użyciu automatycznego licznika komórek, jak w kroku 5.4.</li>
	<li>W razie potrzeby usuń 1 x 106 komórek do cytometrii przepływowej w celu oceny ekspresji genów i fenotypu. Patrz krok 9.5.1 i tabela materiałów, aby zapoznać się z zalecanymi przeciwciałami i strategią bramkowania.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w pożywce ekspandującej do stężenia 1 x 106 komórek/ml. Wysiewaj każdą przepuszczalną dla gazów studzienkę z 6-dołkowej płytki z 5 ml komórek. Ostrożnie ułóż dodatkowe 25 ml pożywki ekspandacyjnej na dołek. 
	UWAGA: Dodajemy komórki w małej objętości, a następnie nakładamy pozostałe media tak, aby komórki pozostały na dnie studzienki.</li>
	<li>Inkubować komórki w spokoju w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 4 dni.</li>
</ol>
9. Zbiór rozszerzonych komórek i ocena fenotypu transdukowanej populacji komórek
<ol>
	<li>Zbierz komórki ze studni przepuszczalnych dla gazu, usuwając i odrzucając 20 ml pożywki. Należy zachować ostrożność, aby nie zakłócić pracy komórek. 
	UWAGA: Rozszerzamy komórki tylko przez 4 dni i w tym momencie zbieramy komórki. Jeśli jednak pożądane są dodatkowe dni hodowli, usuń 20 ml pożywki bez naruszania komórek i zastąp ją 20 ml świeżej pożywki ekspandatoryjnej.</li>
	<li>Odpipetować pozostałą pożywkę w górę i w dół, aby usunąć komórki. Pożywka powinna być bardzo mętna, jeśli komórki dobrze rosły.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety transferowej przepłukać każdą studzienkę 3 ml pożywki, aby zebrać wszelkie resztki komórek.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą automatycznego licznika lub hemocytometru, aby sprawdzić żywotność i liczbę komórek.</li>
	<li>Wykonaj cytometrię przepływową, aby określić transdukowaną ekspresję genów i fenotyp komórki.
	<ol>
		<li>W tym przykładzie określ fenotyp PBMC makaka rezusa za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko CD4 (M-T477), klonowi, który jest reaktywny zarówno z endogennym rhCD4, jak i rhCD4-MBL CAR; przeciwko CD3 (SP34-2) i CD8 (RPA-T8), które barwią odpowiednio całkowite limfocyty T i limfocyty T CD8; przeciwko receptorowi śmierci CD95 (DX2) i kostymulującej cząsteczce CD28 (CD28.2), które są używane do określenia fenotypu pamięci komórek; oraz przeciwko CXCR5 (MU5UBEE) i MBL (3E7) w celu wykrycia CXCR5 i CD4-MBL CAR na transdukowanych komórkach.</li>
		<li>Ocenę żywotności oceniono za pomocą utrwalonego barwnika żywotności.</li>
		<li>Przygotuj komórki do cytometrii przepływowej.
		<ol>
			<li>Uzupełnić główną mieszaninę przeciwciał dla całkowitej liczby probówek. Zwiększ do całkowitej objętości przy użyciu PBS.</li>
			<li>Dodaj komórki do rurek przepływowych. Umieść 0,5–1 x 106 komórek w probówce. Obejmują kontrole negatywne, takie jak niebarwione komórki, jak również barwione imitowane imitowane komórki.</li>
			<li>Dodać 2 ml PBS do komórek, odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) i zdekantować.</li>
			<li>Dodać 100 μl mieszaniny przeciwciał do probówek i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Dodać 2 ml PBS, odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i zdekantować.</li>
			<li>Dodać 300 μl 1% paraformaldehydu i inkubować przez 15 minut.</li>
			<li>Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i zdekantować. Dodaj 300 μl PBS i wymieszaj.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Na cytometrze przepływowym uzyskaj 150 000 zdarzeń dla każdej próbki.</li>
		<li>Analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy przepływu. 
		UWAGA: Strategia bramkowania została wcześniej opublikowana20.
		<ol>
			<li>Do identyfikacji transdukowanych komórek, komórek bramkowych na limfocytach, singletach, żywych, CD3 + i MBL + CXCR5 +.</li>
			<li>Do identyfikacji populacji pamięci centralnej, komórki bramkowe na limfocytach, singlety, żywe CD3 +, CD8 +, CD28 + CD95 +.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W razie potrzeby użyj komórek. Komórki mogą być używane do testów funkcji in vitro, takich jak test migracji transwell9 lub testy zabijania komórek in vitro5,9. Komórki mogą być używane do infuzji zwierzętom. Alternatywnie, zamrozić pozostałe komórki w 90% FBS z 10% dimetylosulfotlenkiem (DMSO) do późniejszego wykorzystania lub analizy 
	UWAGA: Chociaż dawka docelowa do infuzji adoptywnie przeniesionych komórek do makaka rezusa nie została jeszcze ustalona, opublikowane badania transferu adoptywnego u naczelnych innych niż ludzie wykorzystywały 0,6 do 1,2 x 107 komórek/kg21, 1 do 5 x 108 komórek/kg22 i 1,4 do 8 x 108 komórek/kg10. Mając ten zakres jako wskazówkę, można wyprodukować wystarczającą ilość komórek do infuzji za pomocą tego 9-dniowego protokołu.</li>
</ol>

<ol><li>Klebanoff, C. A., Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+for+gene-engineered+T+cell+immunotherapy+for+solid+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prospects for gene-engineered T cell immunotherapy for solid cancers.</a> Nature Medicine. 22 (1), 26-36 (2016).</li>
<li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li>
<li>Sadelain, M., Rivière, I., Riddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+T+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Therapeutic T cell engineering.</a> Nature. 545 (7655), 423-431 (2017).</li>
<li>Kuhlmann, A., Peterson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T-cell+approaches+to+HIV+cure%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+HIV+and+AIDS%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T-cell approaches to HIV cure.</a> Current Opinion in HIV and AIDS. 13 (5), 446-453 (2018).</li>
<li>Ghanem, M. H., Bolivar-Wagers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+chimeric+antigen+receptors+targeting+the+CD4+binding+site+and+high-mannose+Glycans+of+gp120+optimized+for+anti-human+immunodeficiency+virus+potency+and+breadth+with+minimal+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Bispecific chimeric antigen receptors targeting the CD4 binding site and high-mannose Glycans of gp120 optimized for anti-human immunodeficiency virus potency and breadth with minimal immunogenicity.</a> Cytotherapy. 20, 407-419 (2018).</li>
<li>Folkvord, J. M., Armon, C., Connick, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+Follicles+Are+Sites+of+Heightened+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+%28HIV-1%29+Replication+and+Reduced+Antiretroviral+Effector+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Lymphoid Follicles Are Sites of Heightened Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Replication and Reduced Antiretroviral Effector Mechanisms.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. , (2005).</li>
<li>Connick, E., Mattila, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTL+Fail+to+Accumulate+at+Sites+of+HIV-1+Replication+in+Lymphoid+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CTL Fail to Accumulate at Sites of HIV-1 Replication in Lymphoid Tissue.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 6975-6983 (2007).</li>
<li>Connick, E., Folkvord, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+Simian+Immunodeficiency+Virus+Replication+within+Secondary+Lymphoid+Tissues+of+Rhesus+Macaques+Is+Linked+to+Disease+Stage+and+Inversely+Related+to+Localization+of+Virus-Specific+CTL%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of Simian Immunodeficiency Virus Replication within Secondary Lymphoid Tissues of Rhesus Macaques Is Linked to Disease Stage and Inversely Related to Localization of Virus-Specific CTL.</a> The Journal of Immunology. 193 (11), 5613-5625 (2014).</li>
<li>Haran, K. P., Hajduczki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simian+immunodeficiency+virus+%28SIV%29-specific+chimeric+antigen+receptor-T+cells+engineered+to+target+B+cell+follicles+and+suppress+SIV+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Simian immunodeficiency virus (SIV)-specific chimeric antigen receptor-T cells engineered to target B cell follicles and suppress SIV replication.</a> Frontiers in Immunology. 9 (MAR), 1-12 (2018).</li>
<li>Ayala, V. I., Deleage, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR5-Dependent+Entry+of+CD8+T+Cells+into+Rhesus+Macaque+B-Cell+Follicles+Achieved+through+T-Cell+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">CXCR5-Dependent Entry of CD8 T Cells into Rhesus Macaque B-Cell Follicles Achieved through T-Cell Engineering.</a> Journal of Virology. 91 (11), e02507-e02516 (2017).</li>
<li>Redeker, A., Arens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+adoptive+T+cell+therapy%3A+The+particular+role+of+T+cell+costimulation%2C+cytokines%2C+and+post-transfer+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Improving adoptive T cell therapy: The particular role of T cell costimulation, cytokines, and post-transfer vaccination.</a> Frontiers in Immunology. 7 (SEP), 1-17 (2016).</li>
<li>Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+Through+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Sorting Through Subsets.</a> Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).</li>
<li>Ghassemi, S., Nunez-Cruz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+%28CAR%29+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li>
<li>Minang, J. T., Trivett, M. T., Bolton, D. L., Trubey, C. M., Estes, J. D., Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Adoptively+Transferred+Central+and+Effector+Memory-Derived+Autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8%2B+T+Cell+Clones+in+Rhesus+Macaques+during+Acute+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Adoptively Transferred Central and Effector Memory-Derived Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones in Rhesus Macaques during Acute Infection.</a> The Journal of Immunology. 184 (1), 315-326 (2010).</li>
<li>Bolton, D. L., Minang, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking%2C+persistence%2C+and+activation+state+of+adoptively+transferred+allogeneic+and+autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-specific+CD8%28%2B%29+T+cell+clones+during+acute+and+chronic+infection+of+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+Md.+%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Trafficking, persistence, and activation state of adoptively transferred allogeneic and autologous Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8(+) T cell clones during acute and chronic infection of rhesus macaques.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950). 184 (1), 303-314 (2010).</li>
<li>Patel, S., Jones, R. B., Nixon, D. F., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+therapies+for+HIV+%3A+Preclinical+successes+and+current+clinical+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">T-cell therapies for HIV : Preclinical successes and current clinical strategies.</a> Cytotherapy. 18 (8), 931-942 (2019).</li>
<li>Chambers, C. A., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costimulatory+regulation+of+T+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Costimulatory regulation of T cell function.</a> Current Opinion in Cell Biology. 11 (2), 203-210 (1999).</li>
<li>Schwartz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+culture+model+for+T+lymphocyte+clonal+anergy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy.</a> Science. 248 (4961), 1349-1356 (1990).</li>
<li>Bajgain, P., Mucharla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+production+of+suspension+cells+using+the+G-Rex+M+series%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex M series.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 1, 14015(2014).</li>
<li>Pampusch, M. S., Haran, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+transduction+and+expansion+of+transduced+T+cells+with+maintenance+of+central+memory+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Rapid transduction and expansion of transduced T cells with maintenance of central memory populations.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 16, 1-10 (2019).</li>
<li>Taraseviciute, A., Tkachev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cell-mediated+neurotoxicity+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates.</a> Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).</li>
<li>Berger, C., Sommermeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+of+targeting+ROR1+in+primates+with+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Safety of targeting ROR1 in primates with chimeric antigen receptor-modified T cells.</a> Cancer Immunology Research. 3 (2), 206-216 (2015).</li>
</ol>

Dr Pamela Skinner jest współzałożycielką i dyrektorem naukowym MarPam Pharma.

Protokół ten przedstawia strategię produkcji immunoterapii limfocytów T, która wykorzystuje wektor gammaretrowirusowy do transdukcji PBMC makaka rezus, co prowadzi do populacji limfocytów T, które wyrażają przeciwwirusowy CAR, a także pęcherzykowy receptor naprowadzający, CXCR5. Po łącznie 8 dniach hodowli ex vivo, żywotne, funkcjonalne limfocyty CAR T są wytwarzane w ilości mieszczącej się w opublikowanym zakresie 10,21,22 i wykorzystywane do infuzji u naczelnych innych niż ludzie w celu przedklinicznych testów skuteczności.
Sukces protokołu transdukcji zależy zarówno od zdrowych, stymulowanych PBMC, jak i od wysokiej jakości preparatów gammaretrowirusa. Aby osiągnąć skuteczną stymulację i transdukcję, konieczne jest zachowanie odpowiedniej ostrożności podczas zamrażania i transportu PBMC po pobraniu. Idealnie, jeśli komórki są zbierane poza terenem zakładu, są wysyłane w ciekłym azocie i szybko umieszczane w długotrwałym magazynie ciekłego azotu. PBMC muszą być mitotycznie aktywne, aby mogły zostać skutecznie transdukowane przez gammaretrowirusa. Należy monitorować wzrokowo grupowanie komórek po stymulacji anty-CD3/anty-CD28. Nieprawidłowa aktywacja spowoduje niską wydajność transdukcji. Ważne jest również monitorowanie żywotności stymulowanych komórek. Słaba żywotność po etapie stymulacji zwykle prowadzi do mniej udanej transdukcji. Niezależnie od tego, czy preparaty wirusowe są produkowane w laboratorium, czy zlecane na zewnątrz, powinny być przechowywane w temperaturze -80 °C w jednorazowych podwielokrotnościach, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania, które mogą uszkodzić wirusa i pogorszyć wydajność transdukcji. Wirus musi być określany tak, aby można było użyć stałych ilości wirusa w każdym eksperymencie. W przypadku używania wirusa do transdukcji, należy go szybko rozmrozić i przechowywać na lodzie, aż będzie potrzebny. Wybór białek promotora, wzmacniacza i otoczki może mieć wpływ na wydajność transdukcji i ekspresję transgenu w komórkach docelowych. W związku z tym MOI musi być wyznaczony empirycznie. Ponadto zastosowanie pożywki przeznaczonej do podtrzymywania limfocytów T i płytek z przepuszczalnymi dla gazu studniami do rozprężania doprowadziło do doskonałej ekspansji transdukowanych komórek. Istnieje jednak zmienność tempa ekspansji komórek między zwierzętami. Zalecamy przeprowadzenie badania próbnego w celu określenia zdolności określonego preparatu komórkowego do transdukcji i ekspansji. Poziomy ekspansji są spójne zarówno w transdukcjach na małą, jak i dużą skalę.
Za pomocą tego protokołu wyprodukowaliśmy do 2,5 x 109 komórek do infuzji zwierzętom doświadczalnym. Chociaż stwierdziliśmy, że obecnie nie ma potrzeby zwiększania skali protokołu, użycie płytek 6-dołkowych stanowi ograniczenie w przygotowaniu komórek na dużą skalę, a protokół wymagałby modyfikacji w celu wytworzenia większej liczby komórek. Przykłady potencjalnych modyfikacji obejmują przeprowadzenie transdukcji w torbie hodowlanej pokrytej fibronektyną w celu zwiększenia liczby transdukowanych komórek oraz wykorzystania większego przepuszczalnego dla gazu naczynia hodowlanego do etapu ekspansji. Chociaż nie dokonaliśmy jeszcze tych zmian, wykorzystują one dostępne na rynku produkty i są wykonalnymi modyfikacjami obecnego protokołu.
Za pomocą tej metody wyprodukowaliśmy transdukowane komórki z PBMC wyizolowane od zwierząt niezakażonych, zwierząt zakażonych SIV oraz od zwierząt zakażonych SIV leczonych terapią przeciwretrowirusową (ART). Zauważyliśmy jednak zmniejszenie wydajności transdukcji w komórkach poddanych działaniu ART20. Zmniejszenie to jest prawdopodobnie spowodowane hamowaniem odwrotnej transkryptazy i / lub integrazy przez leki. Transdukcja komórek od zwierząt leczonych ART będzie wymagała modyfikacji tego protokołu, takich jak zmniejszenie wewnątrzkomórkowego poziomu leków ART poprzez zatrzymanie ART na kilka dni przed pobraniem PBMC lub poprzez zastosowanie alternatywnego wektora, na który nie mają wpływu powszechnie stosowane leki ART.
Ważne jest, aby komórki wytwarzane do immunoterapii miały minimalnie zróżnicowany fenotyp, tak aby przetrwały po infuzji12. Chociaż wiele protokołów adoptywnego transferu komórek wymaga długiego czasu hodowli, skrócenie czasu hodowli ex vivo jest skorelowane zarówno ze zmniejszeniem różnicowania, jak i poprawą funkcji komórek CAR T13. Stosunkowo szybkie ramy czasowe tego protokołu transdukcji i ekspansji pozwalają na utrzymanie pożądanego fenotypu pamięci centralnej przy jednoczesnym wytwarzaniu wystarczającej liczby komórek do testowania ich potencjału immunoterapeutycznego20.
Celem strategii produkcji tego produktu do immunoterapii limfocytów T jest wytworzenie limfocytów T, które będą rozpoznawać komórki zakażone SIV, będą przemieszczać się do miejsca replikacji wirusa w pęcherzyku limfocytów B i utrzymają się u zwierzęcia, co skutkuje długotrwałym funkcjonalnym wyleczeniem bez konieczności stosowania leków antyretrowirusowych. W celu translacji na produkt immunoterapii ludzkiej, protokół ten może zostać zmodyfikowany w celu transdukcji ludzkich limfocytów T poprzez zastosowanie przeciwciał i cytokin specyficznych dla człowieka oraz wdrożenie standardów GMP, a ostatecznym celem jest wyprodukowanie funkcjonalnego leku na HIV.

Immunoterapie komórkowe pojawiają się jako nowy sposób leczenia chorób, w tym nowotworów i chorób zakaźnych. Te metody immunoterapii często polegają na genetycznym manipulowaniu komórkami terapeutycznymi w celu ekspresji określonych cząsteczek. Na przykład limfocyty T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) są zaprojektowane tak, aby wyrażać cząsteczkę CAR, która ma domenę zewnątrzkomórkową, która specyficznie wiąże cząsteczki na chorych komórkach i domenę sygnałową, która pobudza komórki odpornościowe do zabicia chorej komórki. Limfocyty CAR T są z powodzeniem stosowane w immunoterapii nowotworów, a szczególnie skuteczne w leczeniu białaczek z komórek B1,2,3. Komórki CAR-T są również opracowywane do leczenia infekcji wirusowych, takich jak HIV. Specyficzne dla HIV CAR celują w białka otoczki na powierzchni komórek zakażonych wirusem4. Komórki immunoterapeutyczne mogą być również modyfikowane w taki sposób, aby wyrażały cząsteczki naprowadzające się na komórki terapeutyczne w określonych lokalizacjach tkanek. Opracowaliśmy wektory, które transdukują zarówno specyficzny dla wirusa CAR, jak i cząsteczkę naprowadzającą pęcherzyki limfoidalne CXCR55.
Wirusowa replikacja niektórych wirusów, w tym ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) i małpiego wirusa niedoboru odporności (SIV), jest skoncentrowana w pęcherzykach komórek B w wtórnych tkankach limfatycznych6. Pęcherzyki limfocytów B są nieco uprzywilejowanymi immunologicznie miejscami, w których niski poziom CTL specyficznego dla wirusa umożliwia ciągłą replikację wirusa7,8. Z tych powodów celowanie w limfocyty T specyficzne dla HIV/SIV do pęcherzyka poprzez ekspresję CXCR5 jest strategią eliminacji rezerwuaru pęcherzykowego komórek zakażonych wirusem9,10. W szczególności celujemy w komórki CAR T specyficzne dla SIV do pęcherzyków komórek B poprzez koekspresję CXCR5.
W tym protokole opisujemy metodę transdukcji CAR/CXCR5 i rozszerzania PBMC w celu wytworzenia limfocytów T CAR/CXCR5 o ilości wystarczającej do infuzji terapeutycznej. Komórki transdukowane tymi metodami utrzymują fenotyp pamięci centralnej. Badania wykazały, że komórki o mniej zróżnicowanym fenotypie, takie jak limfocyty T pamięci centralnej i komórki macierzyste pamięci T, lepiej przetrwają niż komórki bardziej zróżnicowane11,12. Ponadto wiele protokołów zaprojektowanych do produkcji adoptywnie przeniesionych komórek ma stosunkowo długi czas hodowli, co powoduje, że komórki mają bardziej zróżnicowany fenotyp i zmniejszoną trwałość13. Co więcej, adoptywnie przeniesione komórki o długim czasie hodowli gromadziły się w płucach zamiast docelowych tkanek limfatycznych u makaków rezusów14,15. W metodach, które tutaj opisujemy i demonstrujemy, szybko transdukujemy i rozszerzamy PBMC makaków rezusów, aby wytworzyć transdukowane limfocyty T, które utrzymują fenotyp pamięci centralnej.
Zarówno limfocyty T CD4, jak i CD8 są objęte naszym podejściem do immunoterapii. Ta mieszana populacja komórek została wybrana, ponieważ w badaniach klinicznych brak limfocytów T CD4 + w produkcie limfocytów T CD8 + był skorelowany z niepowodzeniem w utrzymaniu się limfocytów T CD8 w infuzji 16. Opisane tutaj metody rozpoczynają się od aktywacji PBMC przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28, które silnie stymulują receptor limfocytów T i dostarczają sygnał kostymulacyjny, aby uniknąć klonalnej anergii17,18.
Po aktywacji, komórki są transdukowane za pomocą wektora gammaretrowirusowego kodującego specyficzny dla wirusa CAR i cząsteczki naprowadzającej limfoidy CXCR5. Transdukowane komórki są następnie namnażane za pomocą płytek przeznaczonych do nieprzylegającej propagacji komórek, które mają u podstawy membranę przepuszczającą gaz. Membrana ta umożliwia wymianę gazową na dnie studni, co prowadzi do zwiększenia przeżywalności komórek i dostępności składników odżywczych19. Korzystając z tych metod, w ciągu 9 dni można wyprodukować wystarczającą ilość funkcjonalnych komórek do badań infuzyjnych in vivo. Chociaż protokół ten jest przeznaczony do transdukcji i namnażania limfocytów T makaków rezusów, z niewielką modyfikacją specyficznych dla gatunku przeciwciał aktywujących, może być stosowany z komórkami innych gatunków. Metody te opierają się na naszych wcześniej opublikowanych badaniach9,20.

<table><tbody><tr><td><silny>Preparat gammaretrowirusa</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,025% Trypsyna, 0,01% EDTA</td><td>Gibco</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>293T komórki</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe, poddane działaniu</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowany termicznie</td><td>Hyklon FBS</td><td>Sh30088.03</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Invitrogen</td><td>31985070</td><td>zredukowane podłoże w surowicy</td></tr><tr><td>pBS-CMV-gagpol</td><td>Addgene</td><td>35614</td><td>Prezent od dr Patricka Salmona</td></tr><tr><td>pMSGV1 zawierający CAR P2A CXCR5</td><td>na zamówienie niestandardowe od GenScript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RD114</td><td></td><td></td><td>Prezent od dr Eda Bergera</td></tr><tr><td>Kolby T75</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-4875</td><td></td></tr><tr><td>VSV-G</td><td></td><td>pMD.G</td><td>Prezent od dr Scotta McIvora</td></tr><tr><td>T stymulacja komórek T</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 dołków, nieleczone</td><td>CytoOne</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik anty-CD28</td><td>NHP Klon</td>: <td>CD28.2</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik CD3</td> NHP przeciw makakom <td> Klon zasobów</td><td>: FN18</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Makak rezus PBMC lub limfocyty T CD8</td><td>WNPRC</td><td></td><td>Komórki pierwotne</td></tr> <tr><td>< silne >Do powlekania fibronektyną < / mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>płytki 6-dołkowe, nieleczone</td><td>CytoOne</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>BSA (frakcja V)</td> <td>HyClone</td><td>SH 30574.02</td><td></td></tr><tr><td>Retronektyna (1 mg / ml)</td><td>TaKaRa</td><td>T100A</td><td></td></tr><tr><td>Do ekspansji limfocytów T</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>G-Rex 6 Well Plate</td> Wilson <td>Wolf</td><td>P/N 80240M</td><td>Płytki z dołkami przepuszczalnymi dla gazu</td></tr><tr><td>Składniki mediów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>b merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowany termicznie</td><td>hyklon</td> FBS <td>Sh30088.03</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>NCI Repozytorium</td><td></td><td></td>przedkliniczne</tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna/Glutamina</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo-15 podłoże</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Odmiany stosowanych pożywek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podłoże podstawowe: </td><td>Pożywka X-Vivo 15, 10% inaktywowany termicznie FBS, 1 x Penicylina/Streptomycyna/L-Glutamina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka ekspandująca:</td><td>Pożywka wzrostowa + 50 mM b merkaptoetanol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka wzrostowa:</td><td>Pożywka podstawowa + 50 j.m./ml IL-2</td><td></td><td>Uzupełnienie pożywki przez dodanie anty-CD28, IL-2 lub b-merkaptoetanolu powinno nastąpić w dniu użycia.</td></tr><tr><td>Cell counting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess komory do liczenia komórek</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Automatyczny licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy, roztwór 0,4%</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Cytometria przepływowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania przeciwciał Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A20186</td><td>do koniugacji przeciwciała MBL</td></tr><tr><td>anty-CD28-BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>562976</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD3-AF700</td><td>BD Biosciences</td><td>557917</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD4-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>556615</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD8-BV788</td><td>BD Biosciences</td><td>563824</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD95-PerCP Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>561655</td><td></td></tr><tr><td>anty-CXCR5-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1985-42</td><td></td></tr><tr><td>anty-MBL</td> Oprogramowanie do analizy przepływu <td>Invitrogen</td><td>MA1-40145-S6</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FlowJo, LLC</td><td>Cytometr przepływowy FlowJo v10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>CytoFlex</td><td></td></tr><tr><td>żywy/martwy w pobliżu IR</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>Inne wyposażenie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aerosolve Kanistry do zatrzymywania wycieków aerozoli</td><td>Beckman</td><td>SX4750</td><td>Sprzęt zabezpieczający</td></tr><tr><td>Beckman Allegra Wirówka</td><td>Beckman</td><td>Sterilgard e3</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Fisher</td><td>Everlast 247</td><td></td></tr><tr><td>Klasa II Okap z przepływem laminarnym</td><td>Baker</td><td>Heracell Vios 160i</td><td></td></tr><tr><td>Extra-Safe Jednorazowy fartuch laboratoryjny</td><td>Fisher Scientific</td><td>359232</td><td>Środki ochrony indywidualnej</td></tr><tr><td>Nośniki mikropłytek z biocertyfikowanymi pokrowcami</td><td>Beckman</td><td>SX4750A</td><td>Sprzęt ochronny</td></tr><tr><td>Platforma bujana</td><td>Benchmark</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Wahadłowy wirnik łyżki</td><td>Rękawice nitrylowe Beckman</td><td>X13-R</td><td></td></tr><tr><td>X-Gen</td><td>Genesee</td><td></td><td>Środki ochrony osobistej</td></tr></tbody></table>

transdukcja i ekspansja pierwotnych limfocytów t w ciągu dziewięciu dni z utrzymaniem fenotypu pamięci centralnej

Transduction and Expansion of Primary T Cells in Nine Days with Maintenance of Central Memory Phenotype

Pojawiające się immunoterapie w leczeniu chorób zakaźnych i nowotworów często obejmują transdukcję populacji komórkowych z genami kodującymi białka ukierunkowane na chorobę. Na przykład limfocyty T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)-T stosowane w leczeniu nowotworów i infekcji wirusowych polegają na transdukcji limfocytów T z syntetycznymi genami kodującymi cząsteczki CAR. Cząsteczki CAR sprawiają, że limfocyty T specyficznie rozpoznają i zabijają komórki rakowe lub zakażone wirusem. Komórki mogą być również kotransdukowane z innymi genami będącymi przedmiotem zainteresowania. Na przykład komórki mogą być kotransdukowane z genami kodującymi białka, które kierują komórki do określonych lokalizacji. W tym miejscu przedstawiamy protokół transdukcji pierwotnych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z genami kodującymi specyficzny dla wirusa CAR i cząsteczkę naprowadzającą pęcherzyki komórek B typu 5 (CXCR5). Procedura ta trwa dziewięć dni i skutkuje transdukowanymi populacjami limfocytów T, które utrzymują fenotyp pamięci centralnej. Wykazano, że utrzymanie pamięci centralnej lub mniej zróżnicowanego fenotypu wiąże się z utrzymywaniem się komórek po infuzji. Co więcej, komórki wyprodukowane tą metodą wykazują wysoki poziom żywotności, wysoki poziom koekspresji dwóch transdukowanych genów oraz wystarczająco dużą ilość komórek do infuzji immunoterapeutycznej. Ten dziewięciodniowy protokół może być szeroko stosowany w immunoterapii komórek CAR-T i innych metodach immunoterapii limfocytów T. Opisane tu metody oparte są na badaniach przedstawionych w naszych poprzednich publikacjach.

Produkcja komórek 
Wyniki przedstawione w niniejszej publikacji są zbliżone do tych opisanych w naszych poprzednich pracach9,20. Stosując zaprezentowany tutaj protokół, spodziewamy się co najmniej 8-krotnej ekspansji komórek między 5. a 9. dniem (mediana 11,1-krotna, zakres 8,7–13-krotny). Do studni przepuszczalnych dla gazów wprowadzono komórki z początkową gęstością 5 x 106 komórek i po 4 dniach wzrostu osiągnięto medianę gęstości na poziomie 55,6 x 106 komórek na studnię (zakres 43,5–64,8 x 106) (Rysunek 1A). Liczenie komórek z wykluczeniem błękitu trypanu wykazuje, że komórki utrzymują wysoką żywotność przez cały czas trwania protokołu (mediana w 9. dniu 85,8%, zakres 83–95%) (Rysunek 1B). Odnotowaliśmy zmienność międzyosobniczą zwierząt w zakresie zdolności komórek do ekspansji; jednak przy początkowej populacji 50–100 x 106 komórek w 1. dniu, wykorzystaliśmy ten protokół do wyprodukowania liczby komórek wystarczającej do infuzji u makaków rezus w dawce 1–2 x 108 komórek/kg.
Współekspresję przetransdukowanych genów monitorowano za pomocą cytometrii przepływowej (Rycina 2A). Ekspresja CAR i CXCR5 na powierzchni przetransdukowanych komórek była stosunkowo stabilna między 5. a 9. dniem tego protokołu ekspansji. W 5. dniu mediana 42,8% (zakres 36,5–46,9%) komórek została przetransdukowana zarówno CD4-MBL CAR, jak i CXCR5, natomiast w 9. dniu mediana ekspresji wyniosła 47,6% (zakres 44,5–64,5%) przy jednej rundzie transdukcji (Rycina 2B). Chociaż niektóre protokoły wymagają drugiej rundy transdukcji, nie zauważono korzyści w postaci zwiększenia całkowitej liczby przetransdukowanych komórek po zakończeniu protokołu (dane niepokażane).
Fenotyp komórek 
Komórki po transdukcji analizowano za pomocą cytometrii przepływowej w celu monitorowania ich fenotypu pamięci. Przed transdukcją i ekspansją zidentyfikowano populacje naiwne, pamięci centralnej oraz pamięci efektorowej (dane niepokazane), jednak populacja naiwna zanikła w trakcie hodowli, a komórki w 5. dniu (Rysunek 3A) i 9. dniu (Rysunek 3B) były przede wszystkim komórkami pamięci centralnej, co zidentyfikowano na podstawie ekspresji CD95+ CD28+. Zastosowanie tego szybkiego protokołu transdukcji i ekspansji pozwoliło uzyskać komórki będące głównie komórkami pamięci centralnej, co zwiększa prawdopodobieństwo ich proliferacji i przetrwania po wlewie do zwierzęcia testowego.
<img alt="Wykresy wzrostu i żywotności hodowli komórkowych; liczba komórek i żywotność w kolejnych dniach hodowli; wykresy liniowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60400/60400fig01.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Protokół transdukcji i ekspansji pozwala na uzyskanie licznych komórek ztransdukowanych o wysokiej żywotności. (A) Ekspansja komórek ztransdukowanych od 6 różnych zwierząt od 5 do 9 dnia w naczyniach przepuszczalnych dla gazów oraz (B) żywotność ztransdukowanych PBMC od tych samych 6 zwierząt. Do monitorowania liczby i żywotności komórek wykorzystano metodę wykluczania błękitu trypanu z użyciem automatycznego licznika komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60400/60400fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Diagram cytometrii przepływowej CD28 vs. CD95, wykres konturowy, analiza populacji komórek, ekspresja danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60400/60400fig02.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Protokół transdukcji wytwarza komórki zachowujące koekspresję dwóch transdukowanych genów. (A) Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej PBMC małp rhesus w 9. dniu protokołu transdukcji i ekspansji, wykazujący ekspresję zarówno CAR CD4-MBL, jak i CXCR5. (B) Ekspresja CAR CD4-MBL i CXCR5 w transdukowanych PBMC małp rhesus od 6 różnych zwierząt w 5. i 9. dniu hodowli, zmierzona za pomocą cytometrii przepływowej. Bramki ustawiono na żywe komórki CD3+. Komórki transdukowane zidentyfikowano jako MBL+ CXCR5+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60400/60400fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza danych z cytometrii przepływowej; schemat ekspresji CXCR5/MBL i wykres trendu koekspresji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60400/60400fig03.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Większość komórek uzyskanych w 9-dniowym protokole wykazuje fenotyp pamięci centralnej. Reprezentatywne wykresy z cytometrii przepływowej dla PBMC małp rezus transdukowanych CAR/CXCR5 w (A) 5. dniu i (B) 9. dniu. Bramkowanie ustawiono dla żywych komórek CD3+, CD8+. Pamięć centralną zdefiniowano jako CD28+ CD95+. Pamięć efektorową zdefiniowano jako CD28-, CD95+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60400/60400fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Przedstawiamy 9-dniowy protokół transdukcji i ekspansji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej makaków rezusów, który daje komórki o doskonałej koekspresji interesujących genów w liczbie wystarczającej do badań infuzyjnych skuteczności komórek.

Transdukcja i ekspansja pierwotnych limfocytów T w ciągu dziewięciu dni z utrzymaniem fenotypu pamięci centralnej

Emerging immunotherapies to treat infectious diseases and cancers often involve transduction of cellular populations with genes encoding disease-targeting ...

Niniejszy protokół opisuje produkcję immunoterapeutycznych limfocytów T małpy rhesus, które wykazują ekspresję dwóch białek: przeciwwirusowego chimerycznego receptora antygenowego oraz receptora chemokin CXCR5, który kieruje komórki do mieszków limfatycznych. Ta stosunkowo szybka, dziewięciodniowa procedura pozwala na uzyskanie limfocytów T o słabiej zróżnicowanym fenotypie pamięci centralnej, co stwarza potencjał do ich długotrwałego utrzymywania się w organizmie po infuzji u zwierząt. Adaptacja tej metody do komórek ludzkich umożliwi produkcję immunoterapeutycznych limfocytów T z potencjałem do indukowania trwałej remisji HIV bez konieczności podawania leków przeciwretrowirusowych.Metodę tę można szeroko stosować do produkcji limfocytów T małp rhesus wykazujących ekspresję innych białek zainteresowania, a po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji może ona służyć do generowania transdukowanych limfocytów T u innych gatunków, w tym u ludzi.Sukces transdukcji zależy od stanu zdrowia stymulowanych komórek PBMC. Należy zachować szczególną staranność podczas ich pobierania, transportu i przechowywania. Przed przystąpieniem do transdukcji ważne jest przeprowadzenie wizualnej oceny stymulacji komórek.Zacznij od rozmrożenia pierwotnych PBMC małpy rhesus. Inkubuj komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przy delikatnym mieszaniu, aż pozostanie jedynie niewielka ilość lodu. Ostrożnie przenieś komórki pipetą do probówki stożkowej. Następnie wypłucz fiolkę jednym mililitrem podłoża podstawowego i powoli dodaj go do komórek. Powoli dodaj do komórek kolejne dziewięć mililitrów ciepłego podłoża podstawowego. Umieść probówkę w pojemniku odpornym na aerozole i wiruj przy 600 ×g przez pięć minut w temperaturze 22 °C. Odessaj nadsącz i resuspenduj osad w niewielkiej ilości podłoża wzrostowego.Aby policzyć komórki, dodaj 10 µL zawiesiny komórek do 10 µL błękitu trypanu. Napełnij szkiełko z komorą i włóż je do licznika. Naciśnij przycisk przechwytywania, aby policzyć komórki. Oblicz całkowitą liczbę komórek, mnożąc stężenie komórek przez objętość, a następnie rozcieńcz je w pożywce wzrostowej do stężenia dwóch milionów komórek na mL. Dodaj przeciwciało anty-CD28 do stężenia końcowego 5 µg/mL. Następnie pipetuj od trzech do sześciu milionów komórek na dołek do płytek pokrytych przeciwciałem anty-CD3.Inkubować płytki przez dwa dni w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide.Podgrzej wirówkę do 32 °C, uruchamiając ją przy 2 000 ×g przez około 30 minut. W międzyczasie podgrzej zarówno medium bezsurowicze, jak i medium wzrostowe w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C oraz rozmroź wirusa, delikatnie obracając probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.Następnie umieść próbkę na lodzie. Rozcieńcz wirusa do wcześniej określonej optymalnej wielokrotności infekcji w medium bezzsrytkowym. Do każdej studzienki płytki pokrytej fibronektyną dodaj 2 mL rozcieńczonego retrowirusa, stosując samo medium dla komórek kontrolnych ujemnych.Umieść płytki w nośnikach do mikropłytek w podgrzanej wcześniej wirówce i wiruj je z przyspieszeniem 2 000 ×g przez dwie godziny.W przypadku natychmiastowego użycia, odessać preparat wirusa z dołków i dodać dwa mililitry pożywki wzrostowej. Sprawdzić stymulowane PBMC pod mikroskopem odwróconym. Komórki powinny być okrągłe, jasne i załamywać światło. Powinny również tworzyć skupiska, co wskazuje na stymulację. Zebrać komórki docelowe i przenieść je do konicznej probówki o pojemności 50 mililitrów.Każdy dołek należy wypłukać raz za pomocą 1 mL pożywki wzrostowej i przenieść ją do probówki. Następnie należy policzyć komórki zgodnie z wcześniejszą instrukcją. Komórki należy osadzić poprzez wirowanie z prędkością 600 ×g przez 5 minut w temperaturze 32 °C. Z osadu należy odessać pożywkę, a następnie resuspendować komórki w pożywce wzrostowej do stężenia 1,5 mln komórek/mL. Do każdego dołka pokrytego wirusem należy dodać 1 mL zawiesiny komórek, a do dołków pokrytych fibronektyną, które nie otrzymały wirusa, dodać komórki MAC transduce. Płytki należy wirować z prędkością 1 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 32 °C, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin.Praca z komórkami małp rhesus oraz gamma-retrowirusami wymaga stosowania środków ochrony indywidualnej, takich jak fartuchy laboratoryjne i rękawiczki, a wszelkie czynności muszą być wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Wszystkie pipety i roztwory muszą zostać poddane dekontaminacji. Zawartość każdego dołka pipetować w górę i w dół za pomocą pipety 5 ml, aby resuspendować komórki, a następnie przenieść je do stożkowej probówki 50 ml. Do każdego dołka dodać 1 ml pożywki wzrostowej i pipetować w górę i w dół, aby usunąć komórki adherentne. Następnie policzyć komórki zgodnie z wcześniejszym opisem. Wirować komórki przy 600 ×g przez 10 minut w temperaturze 25 °C. Następnie odessać pożywkę i resuspendować komórki w pożywce do ekspansji do stężenia 1 milion komórek/ml. Przenieś pięć mililitrów komórek do każdego przepuszczalnego dla gazów dołka płytki sześciodołkowej i ostrożnie nałóż dodatkowe 25 mililitrów pożywki do ekspansji na dołek. Następnie inkubuj komórki bez zakłóceń w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez cztery dni.Aby zebrać komórki z dołków, należy usunąć i odrzucić 20 ml pożywki, uważając, aby nie naruszyć komórek. Pozostałą pożywkę należy pipetować w górę i w dół, aby oderwać komórki. Za pomocą sterylnej pipety transferowej należy wypłukać każdy dołek trzema ml pożywki i zebrać pozostałe komórki. Następnie należy je przeliczyć, aby sprawdzić liczbę i żywotność komórek. Protokół ten został zastosowany do transdukcji i ekspansji komórek pochodzących od sześciu różnych zwierząt. Dołki przepuszczalne dla gazów zaszczepiono z gęstością początkową wynoszącą pięć milionów komórek, a po czterech dniach wzrostu osiągnięto medianę gęstości na poziomie 55,6 miliona komórek na dołek.Żywotność komórek monitorowana za pomocą wykluczania błękitu trypanu utrzymywała się na poziomie od 83 do 95% przez cały czas trwania protokołu.Do obserwacji koekspresji przetransdukowanych genów wykorzystano cytometrię przepływową. W piątym dniu mediana 42,8% komórek została przetransdukowana zarówno CD4-MBL-CAR, jak i CXCR5. Natomiast w dziewiątym dniu mediana ekspresji przy jednej rundzie transdukcji wyniosła 47,6%.Cytometrii przepływowej użyto również do monitorowania fenotypu pamięci. Przed transdukcją i ekspansją zidentyfikowano populacje naiwnych komórek pamięci centralnej oraz komórek pamięci efektorowej.Populacja naiwna została utracona w wyniku hodowli, a do piątego i dziewiątego dnia komórki były przede wszystkim komórkami pamięci centralnej.Sukces transdukcji zależy od zastosowania wysokiej jakości odczynników, komórek o wysokiej żywotności i miareczonego wirusa, a także od rygorystycznego przestrzegania ram czasowych protokołu. Komórki można wykorzystać w testach funkcjonalnych, w tym w badaniach migracji i supresji wirusowej, a także do infuzji u zwierząt w badaniach przedklinicznych w celu przetestowania skuteczności immunoterapii.Przeszliśmy do testów przedklinicznych limfocytów T CAR i CXCR5 na zwierzętach i mamy nadzieję, że wkrótce przetestujemy tę immunoterapię u osób zakażonych HIV.

transduction-expansion-primary-t-cells-nine-days-with-maintenance

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Transdukcja i ekspansja pierwotnych komórek T w ciągu dziewięciu dni z utrzymaniem fenotypu centralnej pamięci

Aby śledzić przebieg odpowiedzi immunologicznej w czasie u tej samej myszy, węzły chłonne można usuwać sekwencyjnie drogą chirurgiczną. W niniejszym materiale opisujemy sposób wykonania tej techniki.

Chirurgiczne usuwanie powierzchownych węzłów chłonnych u myszy

Opisujemy metodę generowania limfocytów T regulatorowych, pamięci oraz naiwnych od jednego ludzkiego dawcy krwi. Spolaryzowane limfocyty Treg mogą być następnie porównywane z innymi subpopulacjami w różnych zastosowaniach genetycznych i funkcjonalnych przy zachowaniu homogeniczności genetycznej, w tym w teście supresji, który również został tutaj szczegółowo opisany.

Generowanie indukowanych limfocytów T regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci

Generowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) stanowi alternatywne podejście do wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych w immunoterapii opartej na limfocytach T. Metoda ta wykazuje, że dzięki zastosowaniu systemu indukcji in vitro lub in vivo, komórki iPS są zdolne do różnicowania się zarówno w konwencjonalne, jak i antygenowo swoiste limfocyty T.

Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

W tym filmie opisujemy protokół aktywacji ludzkich pierwotnych limfocytów T. Inkubacja naiwnych limfocytów T z kulkami magnetycznymi pokrytymi przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28, a następnie leczenie interleukiną-2 lub interleukiną-15, prowadzi do aktywacji naiwnych limfocytów T oraz ich różnicowania i proliferacji do efektorowych lub pamięciowych limfocytów T.

Hodowla aktywowanych limfocytów T z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

Transfer genu adenowirusowego do naiwnych limfocytów T CD4 z transgeniczną ekspresją receptora adenowirusa Coxsackie umożliwia molekularną analizę różnicowania regulatorowych limfocytów T in vitro.

Transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów T CD4 w celu zbadania różnicowania limfocytów Treg

Naiwne limfocyty T CD4+ polaryzują się na różne podzbiory w zależności od środowiska w momencie aktywacji.  Różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + do różnych podzbiorów efektorowych można osiągnąć in vitro poprzez dodanie bodźców receptora limfocytów T i specyficznych sygnałów cytokin.

Naiwna izolacja mysich limfocytów T CD4 + i różnicowanie in vitro w podzbiory limfocytów T

Tutaj zapewniamy zoptymalizowany protokół izolacji i klonowania rzadkiej jednostki limfocytów T obwodowych komórek T Vδ1+CD4+, która jest, jak wykazaliśmy ostatnio, pozatymicznym progenitorem limfocytów T αβ. Technika ta pozwala na ilościowe wyizolowanie, sklonowanie i efektywną ekspansję tych komórek w hodowli ex vivo.

Izolacja i hodowla ex vivo limfocytów T Vδ1+CD4+γδ, pozatymicznego progenitora komórek αβT

Wiele eksperymentalnych systemów zostało wykorzystanych do zrozumienia mechanizmów regulujących rozwój i funkcję limfocytów T w odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano podejście genetyczne wykorzystujące transdukcję retrowirusową, które jest ekonomiczne, efektywne czasowo, a co najważniejsze, bardzo pouczające w identyfikacji szlaków regulacyjnych.

Transdukcja retrowirusowa limfocytów T pomocniczych jako genetyczne podejście do badania mechanizmów kontrolujących ich różnicowanie i funkcję

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Ten protokół opisuje kluczowe kroki uprawy pierwotnych komórek T, w tym ich izolację, aktywację, ekspansję oraz przejściową transfekcję przez elektroporację mRNA. Dodatkowo proponowany jest przepływ pracy i panel przeciwciał do analizy cytometrycznej fenotypu, markerów aktywacji, żywotności oraz ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych (CAR).

Izolacja, hodowla i przejściowa transfekcja pierwotnych ludzkich komórek T w celu wygenerowania komórek T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)

Poznaj metodę transdukcji i ekspansji limfocytów T makaka rhesus w ciągu dziewięciu dni z zachowaniem fenotypu pamięci centralnej. Protokół umożliwia produkcję komórek immunoterapeutycznych z potencjałem długotrwałej perzystencji.

Transdukcja i ekspansja pierwotnych limfocytów T w ciągu dziewięciu dni z utrzymaniem fenotypu pamięci centralnej

Przeglądaj więcej filmów