Name: Przeszczep komórek nabłonkowych sutka szczura do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Poznaj metodę przeszczepu nabłonkowych komórek gruczołu mlekowego szczura do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami. Ta technika pozwala badać rozwój nabłonka bez konieczności usuwania endogennego nabłonka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Hollings Cancer Center's Cancer Center Support Grant P30 CA138313 finansowanie badań pilotażowych z National Institutes of Health (<a href="https://www.nih.gov/" target="_blank">https://www.nih.gov/</a>), oraz fundusze z Wydziału Patologii i Medycyny Laboratoryjnej Uniwersytetu Medycznego Południowej Karoliny. Chcielibyśmy podziękować Marijne Smiths za nagranie wypowiedzi z wywiadu.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje technikę przeszczepu komórek nabłonka sutka zoptymalizowaną pod kątem pracy ze szczurami. Izolowane organoidy nabłonka sutka od szczurów dawców (w wieku 3-5 tygodni) są szczepione w białą poduszeczkę tłuszczową między łopatkami szczurów biorców (również w wieku 3-5 tygodni). Wyniki można zinterpretować już po 4-6 tygodniach, przy użyciu mikroskopii świetlnej w celu zbadania przeszczepionej tkanki; Jednak optymalna ilość czasu między przeszczepem a poświęceniem musi zostać określona przed przeprowadze...

Poporodowy rozwój gruczołu sutkowego i morfogeneza przewodowa to procesy, na które duży wpływ ma sygnalizacja hormonalna na początku okresu dojrzewania. U myszy i szczurów, powszechnie stosowanych organizmów modelowych biologii gruczołów mlecznych, proces ten rozpoczyna się około 3 tygodnia życia, gdzie szybka proliferacja i różnicowanie prowadzą do powstania dojrzałego miąższu. Dojrzały gruczoł sutkowy może przechodzić liczne rundy ekspansji i inwolucji, co jest badane od początkuXX wieku. W kontekście hiperproliferacji i rozwoju nowotworów, techniki przeszczepu gruczołu sutkowego zostały opracowane w latach 19501 i ulepszone przez metodologię ilościową opracowaną przez Goulda i wsp. w 19772,3,4. Udoskonalenie techniki przeszczepiania u gryzoni przyczyniło się do znacznych postępów w zrozumieniu prawidłowej biologii gruczołu sutkowego, które są nadal szeroko stosowane do badania wpływu różnych metod leczenia i manipulacji genetycznych na prawidłowy rozwój gruczołu sutkowego i stany chorobowe.
Wiele hipotez zostało wygenerowanych, a następnie przetestowanych za pomocą przeszczepu gruczołu sutkowego, po raz pierwszy opisanych przez DeOme et al. w 1959 roku1. Eksperymenty przeprowadzone przez kilka dziesięcioleci wykazały skłonność tkanki przewodowej wyciętej z gruczołów sutkowych dawcy do ponownego zasiedlenia całej poduszeczki tłuszczowej5,6,7 i wskazały, że krytyczny składnik rozwoju gruczołu sutkowego znajduje się w tych strukturach nabłonkowych. Późniejsze badania na myszach wykazały, że pojedyncza komórka macierzysta sutka może ponownie zasiedlić oczyszczoną poduszeczkę tłuszczową i przyczyniły się do odkrycia pojedynczego, wspólnego przodka podstawowych i luminalnych komórek nabłonka sutka8,9,10. Zgodnie z tymi wnioskami zasugerowano, że przeszczep zwiększa pulę komórek z potencjałem do ponownego zasiedlenia wielu linii w wyniku plastyczności, umożliwiając przeszczepionym komórkom wyhodowanie funkcjonalnego gruczołu sutkowego7,10,11,12,13. Co ważne, zastosowanie technik transplantacji u gryzoni pozwala przezwyciężyć ograniczenia związane z nieprawidłowościami wywołanymi przez hodowlę komórkową14 i często zapewnia wyniki w ciągu zaledwie kilku tygodni.
Chociaż procedura była pierwotnie opisana w kontekście zmian przednowotworowych u myszy, wkrótce została rozszerzona na szczury i stosowana w połączeniu z leczeniem rakotwórczym, aby ustalić mnogość jako miarę podatności na raka15, ale popularność technik transplantacyjnych poszła w parze z rozwojem narzędzi genetycznych dla każdego gatunku. Chociaż badania na myszach obejmujące przeszczep przyczyniły się do wielu odkryć translacyjnych, miąższ gruczołu sutkowego szczura bardziej przypomina człowieka16,17 i oferuje wyraźne korzyści w badaniu raka piersi z dodatnim receptorem estrogenowym (ER+). Guzy sutka są indukowalne u obu gatunków, ale różnią się wrażliwością hormonalną i profilami ekspresji genów. Podstawowa różnica polega na tym, że guzy sutka u szczurów wyrażają się i zależą od funkcji receptorów hormonów jajnikowych i przysadkowych, a mianowicie estrogenu i progesteronu (PR), podobnie jak podtyp luminal-A ludzkiego raka piersi. Rzeczywiście, przeszczep komórek nabłonka sutka, opisany w tym protokole, został wykorzystany do badania wariantów genetycznych zaangażowanych w raka piersi i określenia autonomii komórkowej wpływu na komórki nabłonka sutka18.
Oprócz biologii guza, nabłonek przewodowy normalnego gruczołu sutkowego szczura wykazuje wyższy poziom rozgałęzienia i jest otoczony grubszą warstwą zrębu niż u myszy. Znaczenie zrębu jest dobrze udokumentowane w badaniach nad przeszczepem nabłonka sutka. Nabłonek sutka musi wchodzić w interakcje ze zrębem tłuszczowym, a najlepiej z własnym mezenchymem, aby przejść charakterystyczną dla siebie morfogenezę19,20. Wszczepienie tkanki do gruczołu sutkowego biorcy zapewnia optymalne środowisko; Jednak obecność endogennego nabłonka może zakłócać wyniki. Wstępne oczyszczanie gruczołu sutkowego z endogennego nabłonka jest powszechnie wykonywane w testach transplantacji myszy i wymaga chirurgicznego wycięcia endogennej tkanki sutka i/lub usunięcia sutka1,21,22. Chociaż jest to możliwe, wstępne oczyszczanie nabłonka sutka u szczurów po odsadzeniu nie jest tak szeroko wykonywane, głównie ze względu na nieskuteczność oczyszczania rosnącego drzewa sutkowego u szczurów po odsadzeniu. Ponieważ wykazano, że obszary tkanki tłuszczowej w innych częściach ciała mogą wspierać wzrost przeszczepionego nabłonka sutka21,23,24, procesu wstępnego oczyszczania można łatwo uniknąć u szczurów, przeszczepiając tkankę do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami.
Metoda transplantacji opisana w tym artykule polega na wstrzyknięciu enzymatycznie zdysocjowanych organoidów gruczołu sutkowego (fragmenty nabłonka gruczołu sutkowego i innych typów komórek zdolnych do morfogenezy) lub komórek monorozproszonych do międzyłopatkowej poduszeczki tłuszczowej w wsobnych, izogenicznych lub kongenicznych szczepach szczurów laboratoryjnych2. Ponieważ poduszeczka tłuszczowa między łopatkami jest zwykle pozbawiona tkanki sutkowej, zapewnia odpowiednie środowisko dla wielu miejsc przeszczepu bez konieczności wstępnego oczyszczania endogennego nabłonka. W rezultacie endogenne brzuszno-pachwinowe gruczoły sutkowe zwierzęcia gospodarza nie podlegają manipulacjom chirurgicznym, rozwijają się normalnie i nie mogą zakłócać interpretacji wyników. Dodatkowo, nienaruszone gruczoły sutkowe mogą być wykorzystane do porównania w celu oceny wpływu gospodarza i dawcy na rozwój nabłonka sutka i nowotworzenie 18,25. Chociaż ponowne zasiedlenie gruczołu sutkowego z pojedynczej komórki macierzystej jest dostępne dla myszy, nie zostało jeszcze opracowane dla szczurów, głównie z powodu braku dostępności przeciwciał do selekcji komórek macierzystych sutka szczura25,26,27. Mimo to przeszczepienie monorozproszonych komórek nabłonka sutka w celu ilościowego określenia potencjału ponownego zasiedlenia może być z powodzeniem przeprowadzone, a komórki te będą się normalnie rozwijać po wszczepieniu do odpowiedniego schematu2,3,4. Podczas gdy organoidy są dobre do wielu celów, komórki monorozproszone są wymagane do zastosowań ilościowych, na przykład do określenia liczby komórek nabłonka sutka wymaganych do inicjacji raka po leczeniu promieniowaniem jonizującym28 lub do porównania charakterystyki populacji komórek nabłonka sutka wybranych cytometrycznie przepływowo29.
Do tej pory opisana tutaj procedura jest najbardziej solidną metodą przeszczepu gruczołu sutkowego u szczura, której ogólnym celem jest zbadanie rozwoju gruczołu sutkowego i mechanizmów leżących u podstaw rozwoju raka piersi. Często zwierzęta dawcy i/lub biorcy są narażone na różne zmienne przed, w trakcie lub po przeszczepieniu nabłonka. Przykłady obejmują badania pojedynczych genów obejmujące chemiczną kancerogenezę30, radiation28,31,32, manipulacja genetyczna genomu gospodarza/dawcy18 oraz manipulacja hormonalna12. Główną zaletą dysocjacji enzymatycznej opisanej w tym protokole jest możliwość wyizolowania organoidów nabłonkowych lub komórek monorozproszonych do uzupełniających eksperymentów obejmujących cytometrię przepływową, hodowlę 3D, edycję genów i inne. Przyszłe zastosowania tej techniki będą obejmowały dodatkową manipulację tkanką dawcy i/lub gospodarza za pomocą inżynierii genetycznej. Na przykład komórki dawcy mogą być genetycznie modyfikowane ex vivo w dowolnie wybranym locus genomowym przy użyciu systemu edycji genów CRISPR-Cas9. Podobnie, szczury biorcy mogą być również modyfikowane genetycznie w celu zbadania interakcji między czynnikami genetycznymi modyfikowanymi przez dawcę i biorcę.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mikro; Filtry strzykawkowe Fisher</td><td>Scientific</td><td>09-715G</td><td>sterylno-filtrujące pożywki do trawienia kolagenazy</td></tr><tr><td>1,5 - 2,0 ml mikroprobówki wirówkowe (sterylne)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>zawierające zawieszone komórki i/lub mieszaninę homogenatu mózgu</td></tr><tr><td>100 i mikro; Sitka do komórek</td><td>M Corning</td><td>431752</td><td>filtrujące homogenate</td></tr><tr><td>strzykawki gazoszczelne 100 uL z igłami o rozmiarze 25 Hamilton</td><td></td><td>81001 i 90525</td><td>Do wstrzykiwania mieszaniny do przeszczepów zwierzętom biorcom (1 na genotyp/warunek dawcy)</td></tr> <tr><td>Końcówki do pipet 1000 μL + pipeta</td> <td>-</td><td></td> <td>przenoszenie komórek/mieszanin/tkanek</td></tr><tr><td>Probówka polipropylenowa 15 ml</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352196</td><td>Przechowywanie mieszaniny homogenatu mózgu lub komórki: mieszanina homogenacyjna do przeszczepu</td></tr><tr><td>40 i mikro; Sitka do komórek M</td><td>Corning</td><td>431750</td><td>organoidy filtrujące po umyciu granulatu komórkowego</td></tr><tr><td>50 ml probówki polipropylenowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-6</td><td>do trawienia kolagenazy tkanki gruczołu sutkowego dawcy</td></tr><tr><td>Szalki 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>130181</td><td>do mielenia tkanki</td></tr><tr><td>Ałun Siarczan potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>243361/237086</td><td>barwienie gruczołu sutkowego całe mocowanie </td></tr><tr><td>Slajdy Waporyzator anestezjologiczny do użytku weterynaryjnego</td> <td>-</td><td></td> <td>postępuj zgodnie z protokołem instytucjonalnym</td></tr><tr><td>Beta-dine lub jod</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>probówka do hodowli ze szkła borokrzemianowego do homogenizacji</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-26</td><td>do homogenizacji mózgu (użyj odpowiedniej rurki do homogenizatora)</td></tr> <tr><td>Carmine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6152/1022</td><td>barwienie gruczołu sutkowego szkiełka z całym mocowaniem</td></tr><tr><td>Aparat do liczenia komórek</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Czyste klatki dla zwierząt do rekonwalescencji</td> <td>-</td><td></td> <td>postępuj zgodnie z protokołem instytucjonalnym</td></tr><tr><td>Kolagenaza Typ 3</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LS004183</td><td>trawienie enzymatyczne mielonej tkanki gruczołu sutkowego od szczurów dawców</td></tr><tr><td>woda dejonizowana</td> <td>-</td><td></td> <td>do roztworów chemicznych</td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>GIBCO</td><td>11320033</td><td>do mielenia tkanki, pożywki do trawienia kolagenazy i mieszaniny komórek nabłonkowych</td></tr><tr><td>EDTA</td> <td>-</td><td></td> <td>mieszanina monodyspersyjna</td></tr><tr><td>Etanol, 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2705/2701</td><td>Utrwalacz do szkiełek sutkowych, Szkiełko sutkowe do mycia całego mocowania, Czyszczenie miejsc nacięć chirurgicznych (rozcieńczony)</td></tr> <tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td></td> <td>Roztwór do inaktywacji</td> <td>hyklonu</td></tr> <tr><td>Gaza</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td>do utrwalacza szkiełka sutkowego całego mocowania (1:4 lodowaty kwas octowy w 100% etanolu)</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO</td><td>-</td><td>mieszanina monodyspersyjna</td></tr><tr><td>Poduszki grzewcze</td> <td>-</td><td>-</td><td>postępuj zgodnie z protokołem instytucjonalnym</td></tr><tr><td>Wiadra na lód (x2)</td> <td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z rotacją orbitalną</td><td>-</td><td>-</td><td>musi być w stanie utrzymać 37&deg; C, wytrząsanie z prędkością 220-225 obr./min (do trawienia tkanki sutka kolagenazą)</td></tr> <tr><td>Znieczulenie izofluranem</td> <td>-</td><td></td> <td>postępuj zgodnie z protokołem instytucjonalnym</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny lub kamera cyfrowa</td> <td>-</td><td></td> <td>wizualizacja całego zamontowanego nabłonka sutka i / lub pozyskiwanie obrazów</td></tr><tr><td>Homogenizator mechaniczny</td><td>Fisher</td><td></td> <td>Scientific-TissueMiser lub modele alternatywne</td></tr><tr><td>Olej mineralny, czysty</td><td>Sigma-Aldrich / ACROS Organics</td><td>8042-47-5</td><td>długotrwałe przechowywanie oczyszczonego gruczołu sutkowego całe mocowania</td></tr><tr><td>Zbiorniki tlenu do parownika anestezjologicznego</td> <td>-</td><td></td> <td>postępuj zgodnie z protokołem instytucjonalnym</td></tr><tr><td>Ręczniki papierowe lub delikatne chusteczki do zadań</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Dodatnio naładowane szkiełka mikroskopowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>P4981-001</td><td>całe mocowania tkanki gruczołu sutkowego</td></tr><tr><td>Pooperacyjne przeciwbólowy</td> <td>-</td><td></td> <td>Protokół instytucjonalny</td></tr><tr><td>Waga</td><td></td><td></td><td>pomiary masy ciała zwierząt, właściwe dawkowanie leków przeciwbólowych</td></tr><tr><td>Golarka</td> <td>-</td><td></td> <td>elektryczne maszynki do strzyżenia lub inne</td></tr><tr><td>słoiki do barwienia</td> <td>-</td><td></td> <td>minimum 1 na mycie chemiczne, rozmiar odpowiedni do liczby szkiełek, preferowane szkło</td></tr><tr><td>Sterylne zasłony polowe</td><td>IMCO</td><td>4410-IMC</td><td>używany podczas przeszczepu</td></tr><tr><td>Sterylne nożyczki i kleszcze x3 (autoklawowane)</td> <td>-</td><td></td> <td>autoklawowe narzędzia chirurgiczne używane dla dawców i biorców</td></tr><tr><td>Strzykawki: 5 ml (lub więcej)</td> <td>-</td><td></td> <td>do sterylnej filtracji pożywki do trawienia kolagenazy</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Mieszanina monodyspersji</td><td>Worthingtona</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik na odpady na płyny (nalewane lub zasysane)</td><td>- </td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator do spinania ran, klipsy i narzędzie do usuwania</td><td>Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td>Zamykanie nacięcia skóry nad białą podkładką międzyłopatkową</td></tr><tr><td>Ksyleny</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>oczyszczanie gruczołu sutkowego całe mocowanie ślizgów po barwieniu</td></tr></tbody></table>

przeszczep komórek nabłonkowych sutka szczura do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Już w latach siedemdziesiątych naukowcy z powodzeniem przeszczepili komórki nabłonka sutka do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami szczurów. Przeszczepienie nabłonka sutka przy użyciu technik transplantacji wykorzystuje środowisko hormonalne zapewniane przez młodocianego żywiciela gryzoni. Badania te idealnie nadają się do zbadania wpływu różnych manipulacji biologicznych na rozwój gruczołu sutkowego i przeanalizowania wielu aspektów biologii gruczołu sutkowego. Powszechną, ale ograniczającą cechą jest to, że przeszczepione komórki nabłonkowe są pod silnym wpływem otaczającego zrębu i konkurują z endogennym nabłonkiem; Aby wykorzystać natywną tkankę sutka, biała poduszeczka tłuszczowa brzuszno-pachwinowa musi zostać oczyszczona w celu usunięcia nabłonka sutka gospodarza przed przeszczepem. Główną przeszkodą podczas korzystania z organizmu modelowego szczura jest to, że usuwanie rozwijającego się drzewa sutkowego u szczurów po odsadzeniu nie jest skuteczne. Po przesadzeniu do poduszek tłuszczowych wolnych od gruczołów, komórki nabłonka dawcy mogą ponownie zasiedlić oczyszczoną poduszeczkę tłuszczową gospodarza i utworzyć funkcjonalny gruczoł sutkowy. Międzyłopatkowa poduszeczka tłuszczowa jest alternatywnym miejscem dla tych przeszczepów. Główną zaletą jest to, że nie ma struktur przewodowych, ale zapewnia normalny zrąb, który jest niezbędny do promowania wzrostu nabłonka i jest łatwo dostępny u szczura. Kolejną ważną zaletą tej techniki jest to, że jest minimalnie inwazyjna, ponieważ eliminuje konieczność kauteryzacji i usuwania rosnącego endogennego drzewa sutkowego. Dodatkowo międzyłopatkowa poduszeczka tłuszczowa zawiera przyśrodkowe naczynie krwionośne, które można wykorzystać do oddzielenia miejsc do przeszczepu. Ponieważ gruczoły endogenne pozostają nienaruszone, technika ta może być również stosowana do badań porównujących endogenny gruczoł sutkowy z przeszczepionym gruczołem. W pracy opisano metodę przeszczepiania komórek nabłonka sutka do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami szczurów.

Gruczoły mlekowe dawcy i biorcy 
Kroki izolacji i przygotowania nabłonkowych komórek gruczołu mlekowego szczura do transplantacji przedstawiono na Rysunku 1A. W 4. tygodniu życia endogenny gruczoł mlekowy szczura-dawcy rozpoczyna proces dojrzewania, a nabłonek można zwizualizować na preparatach całych preparatów barwionych karminem ałunowym (Rysunek 1B</str...

Ten artykuł opisuje metodę przeszczepiania komórek nabłonka sutka szczura dawcy do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami u zwierząt biorców. Metoda ta może być stosowana do badania wpływu gospodarza i/lub dawcy na rozwój nabłonka sutka i eliminuje potrzebę wstępnego oczyszczania, zwiększając w ten sposób przydatność tej techniki.

Przeszczep komórek nabłonkowych sutka szczura do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Protokół ten jest stosowany od ponad 40 lat i pozostaje jedyną wiarygodną metodą testów przeszczepu komórek sutka u szczurów. Metoda ta jest szeroko stosowana do badania efektów autonomicznych komórek sutka w porównaniu z efektami gospodarza w badaniach nad podatnością na raka piersi. Poprzez szczepienie w międzyłopatkowej poduszce tłuszczowej, metoda ta omija konieczność usuwania endogennego nabłonka błonowego, co nie jest skuteczne u szczurów.Metoda jest zatem mniej inwazyjna, a endogenne gruczoły sutkowe mogą być stosowane jako kontrola wewnętrzna. Aby rozpocząć tę procedurę, połóż uśpioną samicę szczura na plecach i zabezpiecz ją szpilkami. Spryskaj całą powierzchnię brzuszną 70% etanolem.Wykonaj strzałkowe nacięcie w kształcie litery Y, umożliwiające dostęp do gruczołów sutkowych klatki piersiowej, brzucha i pachwin. Użyj nożyczek, aby wyciąć całą tkankę gruczołu sutkowego od szczura dawcy i usunąć wszystkie widoczne węzły chłonne. Następnie użyj kleszczy, aby usunąć tkankę sutka.Umieść go w oznaczonym 60-milimetrowym naczyniu zawierającym 500 mikrolitrów pożywki DMEM F12 bez surowicy i trzymaj na lodzie. Następnie użyj nożyczek, aby drobno zmielić tkankę sutka. Najpierw ostrożnie odwróć ciało zwierzęcia dawcy, aby ułożyć je w pozycji leżącej i zabezpiecz szpilkami.Spryskaj głowę i górną część pleców 70% etanolem. Zlokalizuj podstawę czaszki i wykonaj nacięcie pod kłykciami potylicznymi, włóż ostre nożyczki pod skórę i odetnij skórę od czaszki, w tym boki głowy. Następnie użyj noży do kości lub mocnych nożyczek, aby przeciąć czaszkę wzdłuż linii środkowej od kości potylicznej do czołowej, upewniając się, że ostrze jest jak najbardziej powierzchowne i ustawione pod kątem w górę, aby zapobiec zniszczeniu leżącej pod spodem tkanki mózgowej.Użyj Rongeurs lub mocnych kleszczy, aby oderwać kość. Włóż narzędzie bocznie do móżdżku, aby złamać kość po obu stronach. Przeciąć połączenia z oponami mózgowymi, całkowicie odsłaniając kanał słuchowy.Użyj zakrzywionych kleszczy z cienką końcówką, aby wyjąć mózg z czaszki i zarejestrować jego wagę. Wykorzystaj nowy początek zapasów, aby uzyskać dodatkowe mózgi dawców. Natychmiast przenieś go do 15-mililitrowej probówki zawierającej taką samą ilość pożywki, która jest przechowywana na lodzie.Homogenizuj mózg przez 10 do 15 sekund na niskiej prędkości. Następnie przefiltruj homogenat, aby usunąć duże kawałki. Przechowuj płyn na lodzie, aż będzie potrzebny.Najpierw odetnij jeden centymetr od końca końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów i ręcznie umieść ją na pipetorze. Użyj przeciętej końcówki pipety, aby przenieść zmieloną tkankę dawcy z każdej 60-milimetrowej płytki do probówki do trawienia kolagenazy. Delikatnie wymieszaj zmieloną chusteczkę, pipetując ją w górę i w dół jeden lub dwa razy.Następnie zabezpiecz próbki w pozycji poziomej w inkubatorze z wytrząsaniem. Pozostawić próbki do trawienia przez 1,5 do dwóch godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością od 200 do 220 obr./min. Gdy tkanka gruczołu sutkowego dawcy jest w pełni strawiona, odwirować zawiesinę w temperaturze 1 200 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Po upewnieniu się, że utworzyła się osadka, należy użyć pipety, aby usunąć warstwę tłuszczu lub ostrożnie wylać supernatant. Delikatnie zawiesić granulat w 10 mililitrach świeżego podłoża DMEM F12. Powtórz ten proces, aby dokładnie umyć komórki.Przygotuj jedną 50-mililitrową probówkę z sitkiem o średnicy 40 mikrometrów dla każdego zwierzęcia dawcy. Wstępnie zwilż sitko co najmniej jednym mililitrem pożywki DMEM F12. Następnie za pomocą pipety przepuść zawiesinę komórek przez filtr w celu zebrania fragmentów przewodów lub organoidów.W przypadku organoidów należy przechowywać tylko te komórki, które pozostały w filtrze. Odwróć sitko do komórek na nowej probówce o pojemności 50 mililitrów i spłucz dowolną objętością sterylnego podłoża wymaganą do zebrania wszystkich komórek. Następnie ponownie zagnieździć komórki i ponownie zawiesić w niewielkiej objętości pożywki do zliczenia.Przygotuj pojedyncze partie materiału dawcy dla wszystkich biorców przeszczepu, łącząc równe objętości zawiesiny komórkowej z 50% homogenatem mózgu dla każdego miejsca przeszczepu. Najpierw zidentyfikuj podstawę czaszki i początek kręgosłupa u zwierzęcia biorcy. Około jednej trzeciej drogi w dół kręgosłupa ogol obszar o wymiarach trzy centymetry na dwa centymetry w górnej części klatki piersiowej pleców.Następnie przygotuj sterylne pole, które będzie używane do operacji i ułóż wszystkie potrzebne materiały. Przepłukać strzykawki Hamilton sterylnym podłożem DMEM F12, aby zapobiec utracie komórek. Załadować całą objętość materiału dawcy do osobnej strzykawki dla każdego schorzenia.Po pełnym załadowaniu strzykawki należy ją odwrócić i lekko nacisnąć tłok, aby usunąć pęcherzyki powietrza z końcówki igły. Strzykawkę należy trzymać na lodzie przez cały czas trwania zabiegu. Upewnij się, że zwierzę nie reaguje na głębokie bodźce za pomocą mocnego uszczypnięcia palca.Następnie użyj ostrego ostrza chirurgicznego, aby wykonać małe nacięcie międzyłopatkowe. Zlokalizuj przyśrodkowe naczynie krwionośne w celu orientacji i użyj kleszczy, aby podnieść skórę po jednej stronie nacięcia. Trzymaj skórę z dala od poduszeczki tłuszczowej i unikaj brązowej tkanki tłuszczowej znajdującej się pod nią podczas wykonywania przeszczepu.Następnie włóż igłę w miejsce przeszczepu. Ostrożnie wstrzyknąć 40 mikrolitrów mieszaniny komórek do tkanki białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami. Powoli wyjmować igłę.Przytrzymaj tkankę na miejscu i pozwól przeszczepionym komórkom osiąść przez trzy do pięciu sekund. Powtórzyć całą procedurę wstrzyknięcia, jak opisano wcześniej, w drugim miejscu przeszczepienia. Następnie zamknij ranę pooperacyjną za pomocą klipsów lub szwów, a następnie przerwij znieczulenie.Po złożeniu zwierzęcia w ofierze przygotuj je do sekcji. Zidentyfikuj przyśrodkowe naczynie krwionośne, które oddziela miejsca przeszczepu w poduszce tłuszczowej między łopatkami. Wytnij całą podkładkę jako pojedynczy kawałek tkanki.Umieść tkankę na dodatnio naładowanym szkiełku mikroskopowym dla całego mocowania. Umieść szkiełka w 70% etanolu na siedem do 10 dni, aby odtłuścić tkankę. Następnie przygotuj bejcę z ałunu karminowego i przetwórz szkiełka, gdy tkanka jest wystarczająco nieprzezroczysta.Po zakończeniu przetwarzania i oczyszczeniu tkanki na szkiełku użyj mikroskopii świetlnej o małej mocy lub fotografii cyfrowej o wysokiej rozdzielczości, aby uzyskać obrazy szkiełek do analizy. W tym badaniu komórki nabłonka sutka są przeszczepiane przy użyciu techniki zoptymalizowanej do pracy ze szczurami, w której izolowane organoidy nabłonka sutka od szczurów dawców są szczepione do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami szczurów biorców. Obecność, brak lub obfitość nabłonka można ocenić w celu określenia sukcesu eksperymentu, a także autonomii efektów związanych ze zmiennymi eksperymentalnymi.Eksperyment z przeszczepem wzajemnym, w którym każdy czynnik ma dwa poziomy, takie jak typ dziki i nokaut, utworzy cztery grupy przeszczepów do testowania hipotez. Pokazana tu reprezentatywna cała międzyłopatkowa poduszeczka tłuszczowa zawiera dodatni przerost nabłonka w obu miejscach przeszczepienia. Podczas analizy preparatów brak nabłonka w poduszce tłuszczowej między łopatkami w wielu próbkach może wskazywać na problem techniczny z zabiegiem i powinien być traktowany jako wynik negatywny.Przerost nabłonka dawcy można również porównać z endogennym gruczołem sutkowym i może to ułatwić wyciągnięcie dodatkowych wniosków. W przedstawionym przykładzie wyniki wzajemnego przeszczepu przy użyciu szczurów typu dzikiego i szczurów z nokautem CDKN1B sugerowały autonomiczny wpływ komórek sutkowych na rozwój gruczołu sutkowego. Należy pamiętać, że komórki nabłonkowe dawcy i organoidy muszą być starannie przygotowane i utrzymywane przy życiu do momentu wstrzyknięcia zwierzęciu-biorcy.Konieczne jest planowanie z wyprzedzeniem i wykonanie zabiegu ostrożnie i bez żadnych przerw. Pierwotne testy kancerogenezy można wykonać po przeszczepieniu w celu zbadania autonomii komórek sutka w etiologii lub leczeniu raka piersi. Edycja genów może być również włączona do inżynierii genetycznej komórek dawcy lub szczura biorcy.Jako jedyna metoda przeszczepiania komórek nabłonka sutka u szczurów, procedura ta ułatwia rozwój gruczołu sutkowego, a także badania kancerogenezy. Technika ta jest szczególnie ważna w badaniach interakcji między komórkami raka piersi i/lub komórkami nabłonka sutka a mikrośrodowiskiem gospodarza. Umożliwia badania nad rozwojem gruczołu sutkowego, a także badania nad rakiem piersi.Osoby, które próbują tej techniki po raz pierwszy, powinny zoptymalizować preparaty komórek dawcy, aby zapewnić maksymalną wydajność i żywotność komórek, a następnie przeprowadzić małe eksperymenty pilotażowe, aby przećwiczyć procedury chirurgiczne i określić liczbę komórek do wstrzyknięcia, a także określić czas inkubacji po operacji wymagany do eksperymentów.

rat-mammary-epithelial-cell-transplantation-into-interscapular-white

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy artykuł prezentuje procedurę opracowaną przez DeOme KB et al. (1959) oraz procedurę oszczędzającą opracowaną przez Brill B et al. (2008), służące do oczyszczania 4. podskórnej tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego w pachwinie u myszy w okresie dojrzewania, w celu przygotowania do transplantacji fragmentów gruczołu mlekowego, komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego lub komórek nowotworowych gruczołu mlekowego.

Procedura transplantacji nabłonka gruczołu mlekowego

W niniejszym raporcie prezentujemy system izolacji i hodowli komórek donora z gruczołu mlekowego myszy oraz ich ortotopowego przeszczepienia do myszy biorców w celu analizy interakcji zrąb-nabłonek podczas rozwoju guza piersi.

Przeszczepienie komórek zrębowych i komórek raka do gruczołu mlekowego u myszy C57BL/6J

W tym artykule omawiamy, jak stworzyć model raka piersi u samic myszy poprzez wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka. Przykładowy protokół demonstruje iniekcję ortotopową.

Wstrzyknięcie ortotopowe do poduszeczki tłuszczowej sutka: ustalenie raka piersi u myszy

Film demonstruje technikę ortotopowej inokulacji raka piersi na modelu mysim. Technika ta zapewnia wysoki wskaźnik nowotworzenia przy mniejszej zmienności wielkości i kształtu guza w porównaniu z wstrzyknięciem podskórnym lub niechirurgicznym.

Wstrzyknięcie ortotopowe: wszczepianie komórek rakowych specyficznych tkankowo dorosłej myszy

Rak jest złożoną chorobą, na którą wpływ ma tkanka otaczająca guz, a także lokalne mediatory pro- i przeciwzapalne. Dlatego ortotropowe modele iniekcyjne, a nie modele podskórne, mogą być przydatne do badania progresji raka w sposób, który lepiej naśladuje ludzką patologię.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy w celu zbadania wzrostu guza.

Ten protokół opisuje metody oczyszczania, ilościowego i charakteryzowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV)/egzosomów z nieprzylegających/mezenchymalnych komórek nabłonka sutka oraz ich wykorzystania do transferu zdolności tworzenia gruczołów sutkowych do komórek nabłonka sutka świetlnego. EV / egzosomy pochodzące z komórek nabłonka sutka podobnych do łodyg mogą przenosić tę właściwość komórek do komórek, które spożywają EV / egzosomy.

Przenoszenie zdolności tworzenia gruczołu sutkowego między komórkami podstawnego nabłonka sutka a komórkami luminalnymi sutka za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów

Ta praca demonstruje nowatorskie podejście do oceny proliferacji, różnicowania i potencjału tworzenia naczyń krwionośnych komórek macierzystych śródbłonka (VESCs) poprzez przeszczep poduszeczki tłuszczowej sutka, a następnie przygotowanie całej tkanki do obserwacji mikroskopowej. Przedstawiono również strategię śledzenia linii w celu zbadania zachowania VESC in vivo.

Nowatorska technika przeszczepu poduszeczki tłuszczowej sutka w celu wizualizacji wytwarzania naczyń krwionośnych śródbłonka

Tutaj prezentujemy protokół wszczepiania komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej w prosty, mniej inwazyjny i łatwy w obsłudze sposób, a ten mysi ortotopowy model raka piersi z odpowiednim środowiskiem poduszeczki tłuszczowej może być wykorzystany do badania różnych aspektów raka.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy

Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) oraz genetycznie modyfikowane modele myszy do przeszczepu wiernie odwzorowują ludzką chorobę i są preferowanymi modelami do podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem piersi. W tym miejscu opisano metodę ortotopowego przeszczepiania fragmentów guza piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka w celu zbadania biologii guza i oceny odpowiedzi na lek.

Ortotopowe przeszczepy guzów piersi jako modele przedkliniczne raka piersi

Brakuje modeli przedklinicznych oceniających terapię adjuwantową ukierunkowaną na przerzuty raka piersi. Aby temu zaradzić, opracowaliśmy mysi model przerzutów de novo gruczolakoraka sutka do płuc, w którym terapie stosowane w trybie adjuwantowym (pooperacyjna resekcja guzów pierwotnych) mogą być oceniane pod kątem skuteczności w oddziaływaniu na wcześniej zasiane przerzuty do płuc.

Procedury chirurgiczne i metodyka przedklinicznego mysiego modelu przerzutów raka sutka de novo

Poznaj metodę przeszczepu nabłonkowych komórek gruczołu mlekowego szczura do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami. Ta technika pozwala badać rozwój nabłonka bez konieczności usuwania endogennego nabłonka.

Przeszczep komórek nabłonkowych sutka szczura do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami

Przeglądaj więcej filmów