Name: Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Poznaj metodę profilowania ubikwityny i modyfikacji potranslacyjnych w liniach komórkowych. Technika wykorzystuje lentiwirusy i podwójne znaczniki do identyfikacji zmian związanych z chorobami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez La Ligue Contre le Cancer dla HV i MS, oraz ARC (association pour la recherche sur le cancer) dla PS, INCa (institute national du cancer) i Canceropole PACA dla JI. Zakład spektrometrii mas Marseille Proteomics (marseille-proteomique.univ-amu.fr) wspierany przez IBISA (Infrastructures Biologie Santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, Cancéropôle PACA, Provence-Alpes-Côte d'Azur Région, Institut Paoli-Calmettes oraz Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.

1. Generowanie stabilnych linii komórkowych wykazujących ekspresję 6His-Flag-Ubl
UWAGA: Ko-transfekcja komórek HEK-293T z pCCL-6HF-Ubl, pVSVG i delta-Helper.
<ol>
	<li>Dzień 0: Wysiać komórki 293T na płytkę 6-dołkową, aby uzyskać 50-70% konfluencji następnego dnia.</li>
	<li>Dzień 1: Przeprowadzić kotransfekcję komórek o 50-70% konfluencji mieszanką 1 µg pCCL-6HF-Ubl lub pCCL-GFP, 1 µg pVSVG oraz 1 µg wektorów delta-Helper, stosując odczynnik i protokół transfekcyjny przeznaczony do produkcji lentiwirusów. Po 6 h od transfekcji wymienić pożywkę na świeżą, odpowiadającą typowi komórek przeznaczonych do transdukcji. Wysiać komórki do transdukcji na płytkę 6-dołkową, aby uzyskać 10-20% konfluencji następnego dnia (w dniu rozpoczęcia transdukcji).</li>
	<li>Dzień 2: 24 h po transfekcji zebrać pożywkę zawierającą cząstki lentiwirusowe i przefiltrować ją przez filtry 0,45 µm. W razie potrzeby w tym momencie dodać świeżą pożywkę, aby uzyskać drugą partię lentiwirusów. Wymienić pożywkę komórek przeznaczonych do transdukcji (10-20% konfluencji) na pożywkę zawierającą lentiwirusy. 
	UWAGA: Pożywka lentiwirusowa może być przechowywana w temperaturze +4 °C przez kilka dni przed transdukcją lub w -80 °C przez wiele miesięcy.</li>
	<li>Inkubować komórki z lentiwirusami od 24 h do 72 h w standardowym inkubatorze (37 °C, 5% CO2), a następnie wymienić pożywkę na świeżą pożywkę standardową. Jeśli to możliwe, sprawdzić ekspresję GFP za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby ocenić wydajność transdukcji: odsetek komórek wykazujących ekspresję oraz względny poziom ekspresji na komórkę. Jeśli nie wykryto fluorescencji, odczekać dodatkowe 2-3 dni, ponieważ ekspresja może trwać dłużej w zależności od typu transdukowanych komórek.</li>
	<li>W przypadku pozytywnej kontroli GFP hodować wszystkie komórki do czasu uzyskania ilości wystarczającej do przeprowadzenia kontroli ekspresji 6HF-Ubl za pomocą immunofluorescencji i Western blotu z zastosowaniem przeciwciała anty-Flag.</li>
</ol>
2. Podwójne oczyszczanie zmodyfikowanych białek
UWAGA: Bufor 1: 6 M Guanidinium-HCl, 0,1 M Na2HPO4/NaH2PO4, pH 8,0, 0,5% Triton X-10. 
Bufor 2: 50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% glicerolu, pH 8,0. 
Bufor 3: 10 mM NH4HCO3, pH 8,0.
<ol>
	<li>Lizaza komórek: Po przygotowaniu opłukać naczynia hodowlane co najmniej raz solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) w temperaturze pokojowej (RT) i przystąpić do lizy komórek lub alternatywnie zamrozić gwałtownie w ciekłym N2 i przechowywać w temperaturze -80 °C. W celu lizy dodać 2 mL Buforu 1 na naczynie o średnicy 15 cm w RT. Użyć skrobaka do komórek, aby zebrać wszystkie lizaty do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 mL (objętość końcowa około 20 mL).</li>
	<li>Poddać lizaty sonikacji trzy razy po 30 s, z 1 min przerwy pomiędzy cyklami.</li>
	<li>Odwirować sonikowane lizaty przy 15 0 x g przez 15 min.</li>
	<li>Przenieść nadsącz do nowej probówki, używając sita komórkowego (40 µm).</li>
	<li>Wyznaczyć stężenie próbek i w razie potrzeby dostosować je, aby uzyskać taką samą ilość białek i taką samą objętość. Użyć całkowitej ilości białka od 50 do 10 mg (10 naczyń o średnicy 15 cm dla komórek MiaPaCa-2).</li>
	<li>Dodać kuleczki Ni2+-NTA, stosując 2 µL kuleczek na 1 mg białka.</li>
	<li>Inkubować na rotatorze przy 30 rpm przez 2,5 h w RT.</li>
	<li>Odwirować kuleczki przy 500 x g przez 5 min.</li>
	<li>Przepłukać kuleczki 1 mL Buforu 1, przenosząc próbki do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL, a następnie umieścić probówki na lodzie. Wszystkie kolejne kroki wykonywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przepłukać dwukrotnie 1 mL schłodzonego do 4 °C Buforu 2 zawierającego 10 mM imidazolu.</li>
	<li>Aby eluować związane białka, dodać 60 µL Buforu 2 zawierającego 250 mM imidazolu i inkubować na rotatorze przez 2 h w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować kuleczki przy 50 x g przez 1 min. Przenieść nadsącze do nowych, schłodzonych wcześniej probówek o pojemności 1,5 mL i dodać 50 µL kuleczek sprzężonych z przeciwciałem anty-Flag M2.</li>
	<li>Inkubować na rotatorze przy 30 rpm przez 2,5 h w temperaturze 4 °C, następnie przepłukać 2 razy 50 µL Buforu 2, a potem 2 razy 50 µL Buforu 3.</li>
	<li>W celu końcowej elucji dodać 10 µL Buforu 3 zawierającego peptyd Flag w stężeniu 0,1 µg/µL i inkubować na rotatorze w temperaturze 4 °C przez 1,5 h.</li>
	<li>Odwirować przy 50 x g przez 1 min i przenieść nadsącze do nowych, schłodzonych wcześniej probówek.</li>
	<li>Pobrać 10% (10 µL) do nałożenia na żel SDS-PAGE i przeprowadzić barwienie srebrem w celu kontroli jakości oczyszczania. Jeśli oczyszczanie przebiegło pomyślnie, pozostałe 90% przeanalizować metodą LC-MS/MS.</li>
</ol>
3. Przetwarzanie danych spektrometrii masowej w celu wygenerowania profili PTM Ub/Ubl oraz identyfikacji istotnych różnic między nimi
UWAGA: Wyniki analizy MS zawierają wiele informacji, w tym całkowitą liczbę peptydów, a także wartości powierzchni piku (średnia powierzchni 3 najważniejszych peptydów)10) dla każdego białka zidentyfikowanego w każdej próbce. Dane te można przetwarzać, wykorzystując liczbę peptydów, wartości pól powierzchni pików lub obie te metody. W przypadku obliczeń z wykorzystaniem pól powierzchni pików, ponieważ wartości te zazwyczaj mieszczą się w zakresie 106należy podzielić je według tego porządku przed zastosowaniem tych samych wzorów, które podano poniżej. Wyniki uzyskane obiema metodologiami liczenia powinny wykazywać silną korelację, co zazwyczaj ma miejsce. Dla każdego zidentyfikowanego białka należy zastosować następujące wzory, gdzie: 
v1 <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg" alt="Schemat równowagi statycznej; ΣFx=0, ΣFy=0; analiza sił z wektorami strzałek." data-altupdatedat="1788282455000"> wartości peptydów w niepoddanej działaniu leku próbce ubikwityny (np. Ub – lek) 
v2 <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg" alt="Schemat równowagi statycznej; ΣFx=0, ΣFy=0; analiza sił z wektorami strzałkowymi." data-altupdatedat="1788282455000"> wartości peptydów w próbce ubikwityny traktowanej gemcytabiną (np. Ub + lek) 
k1 <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg" alt="Schemat równowagi statycznej; ΣFx=0, ΣFy=0; analiza sił z wektorami strzałkowymi." data-altupdatedat="1788282455000"> wartości peptydów w nieleczonej próbce kontrolnej GFP (np. GFP – lek) 
k2 <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg" alt="Schemat równowagi statycznej; ΣFx=0, ΣFy=0; analiza sił z wektorami." data-altupdatedat="1788282455000"> wartości peptydów w próbce kontrolnej GFP traktowanej gemcytabiną (np. GFP + lek).
<ol>
	<li>Normalizacja: Znormalizuj wartości pomiędzy komórkami traktowanymi lekiem a komórkami nietraktowanymi dla ubikwityny i GFP, stosując następujące wzory. Wartość znormalizowana v = V oraz wartość znormalizowana k = K. 
	V1=v1.(∑v1+ ∑v2) / (2. ∑v1) ; V2=v2.(∑v1+ ∑v2) / (2. ∑v2) 
	K1=k1.(∑k1+ ∑k2) / (2. ∑k1) ; K2=k2.(∑k1+ ∑k2) / (2. ∑k2)</li>
	<li>Usuwanie tła: Korzystając z następujących wzorów, należy odjąć wartości z próbki kontrolnej (GFP) od wartości w próbce ubikwityny, aby uzyskać wartości specyficzne (V'1 i V'2) dla każdego zidentyfikowanego białka w obu warunkach. 
	V'1=V1-K1, jeśli V1-K1≥0; V'1=0, jeśli V1-K1 < 0&lt;0 
	V'2=V2-K2, jeśli V2-K2≥0; V'2 =0, jeśli V2-K2 < 0&lt;0</li>
	<li>Wariancja (Var) ubikwitynacji. Aby uzyskać wynik (w zakresie od -10 do +10) dla wariancji pozytywnych i negatywnych modyfikacji potranslacyjnych (PTM) indukowanych przez lek, należy zastosować następujący wzór, w którym różnicę między konkretnymi wartościami próbek traktowanych i nietraktowanych dzieli się przez sumę wszystkich wartości, wliczając te z grupy kontrolnej (aby ukarać białka zidentyfikowane również w kontroli GFP), a następnie mnoży przez 10. 
	Var = (V'2-V'1)/(V1+K1+V2+K2)*10 ; -10&lt;Var&lt;100 ; 
	Odchylenia poniżej -50 (represja PTM) lub powyżej 50 (indukcja PTM) są zazwyczaj uznawane za istotne.</li>
	<li>Poziom ufności (Conf). Aby uzyskać wartość ufności w zakresie od 0 do 10%, należy zastosować następujący wzór: 
	Conf = ((V1+V2)2/(1+V1+V2+K1+K2)2)*10 - 10/(1+V'1+V'2) ; =0 jeśli &lt;0 
	Wartości powyżej 50 są zazwyczaj uznawane za wiarygodne.</li>
	<li>Aby uzyskać korzystniejszy rozkład wartości indukcji/represji oraz uwzględnić parametry wariancji i ufności, należy pomnożyć wartości Var i Conf, stosując następujący wzór, w którym V <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg" alt="Schemat równowagi statycznej; ΣFx=0, ΣFy=0; analiza sił z wektorami strzałkowymi." data-altupdatedat="1788282455000"> Var i C <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg" alt="Schemat równowagi statycznej; ΣFx=0, ΣFy=0; analiza sił za pomocą strzałek wektorowych." data-altupdatedat="1788282455000"> Konfiguracja 
	=JEŻELI(V2&gt;0;((V2*C2)^2)/(10^6);-((V2*C2)^2)/(10^6)) 
	UWAGA: Ponieważ wartości powierzchni piku są zazwyczaj dokładniejsze niż zliczanie peptydów, możliwe jest zastosowanie specjalistycznego oprogramowania przeznaczonego do interpretacji tego rodzaju danych, takiego jak Perseus (https://www.biochem.mpg.de/51810/perseus), zgodnie z zaleceniami dotyczącymi użytkowania.</li>
</ol>

<ol><li>Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modification%3A+Nature%27s+escape+from+genetic+imprisonment+and+the+basis+for+dynamic+information+encoding%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Systems+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).</li>
<li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).</li>
<li>Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+identification+of+ubiquitinated+proteins+from+human+cells+expressing+His-tagged+ubiquitin%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin.</a> Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li>
<li>Matsumoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+the+human+ubiquitin-related+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome.</a> Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).</li>
<li>Hjerpe, R., Rodríguez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+approaches+for+characterizing+ubiquitinated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).</li>
<li>Bonacci, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+mechanisms+of+cellular+response+to+chemotherapy+by+tracking+changes+in+post-translational+modifications+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).</li>
<li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).</li>
<li>Hoeller, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+ubiquitin+system+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.</a> Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).</li>
<li>Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+proteins+by+LCMSE%3A+a+virtue+of+parallel+MS+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition.</a> Molecular & Cellular Proteomics. , (2006).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opracowaliśmy solidną i wiarygodną metodologię generowania profili białek modyfikowanych przez głównych członków rodziny ubikwityny. Rzeczywiście, z powodzeniem zastosowaliśmy ten protokół do generowania profili PTM za pomocą ubikwityny, a także przez SUMO i Nedd8, oraz do wykrywania zmian związanych z leczeniem7, w odpowiedzi na nadekspresję lub knockdown określonego genu (dane nie pokazane) oraz w komórkach, które uzyskały fenotyp oporny na różne leki chemioterapeutyczne.
<p class="jove_cont...

Proponowana tutaj metoda jest dedykowana do badania PTM, w których pośredniczą członkowie rodziny ubikwityny z hodowanych komórek ssaków, w celu zidentyfikowania potencjalnych zmian związanych z konkretnym stanem (leczenie, różnicowanie, itp.). PTM reprezentują ostatni etap regulacji funkcji białek1. Rzeczywiście, po wytworzeniu przez maszynerię translacyjną, większość, jeśli nie wszystkie białka przechodzą różne rodzaje PTM, które modulują ich aktywność, interakcje molekularne i lokalizację wewnątrzkomórkową1. Wśród mnóstwa PTM znajdują się te, w których pośredniczy rodzina białek ubikwityny, sama ubikwityna i wszystkie ubikwityny podobne, mają potencjał do regulowania wszystkich białek wewnątrzkomórkowych lub częściowo cytoplazmatycznych2. Ponieważ same w sobie są białkami, mogą być sprzężone ze sobą, tworząc jednorodne i heterogeniczne łańcuchy o różnych topologiach, z których każda jest związana z określonymi funkcjami regulacyjnymi2. Potrzebne są narzędzia, które pozwolą rozszyfrować i zrozumieć tę skomplikowaną maszynerię. Na całym świecie opracowano wiele podejść, które mają swoje zalety i wady, a tutaj proponujemy jedno o wysokiej wydajności, odpowiednie dla hodowanych komórek.
Główną zaletą tej metody jest jej dokładność. Rzeczywiście, czystość izolowanych zmodyfikowanych białek jest znacznie poprawiona przez kombinatoryczne użycie dwóch znaczników (6His i Flag) oraz procedury dwuetapowej, a zatem jest znacznie bardziej selektywna niż fuzja pojedynczego znacznika Ub/Ubl3,4. Obecność znacznika 6His umożliwia pierwszy etap oczyszczania w stanie pełnej denaturacji, unikając w ten sposób jakiegokolwiek współoczyszczania białek zawierających domeny wiążące ubikwitynę lub innych białek wiążących się z ubikwitynowanymi. Jest to problem techniczny, na który napotyka kilka innych podejść opartych na oczyszczaniu powinowactwa ubikwitynowanych proteomów przy użyciu specyficznych przeciwciał5 lub tandemowych elementów wiążących ubikwitynę (TUBEs)6. Co ważne, technika ta nie jest stronnicza na korzyść oczyszczania określonego rodzaju ubikwitynacji, jak może to mieć miejsce w przypadku niektórych innych podejść, ponieważ zidentyfikowano zarówno mono, jak i różne rodzaje poliubikwitynacji7. W związku z tym, raz znaleziona zmiana ubikwitynacji będzie musiała zostać zbadana bardziej szczegółowo za pomocą standardowych metod biochemicznych w celu zidentyfikowania dokładnego rodzaju ubikwitynacji.
Na koniec, kolejną techniczną zaletą tego protokołu jest użycie lentiwirusów, które łatwo i szybko tworzą stabilne linie komórkowe o rozsądnym poziomie ekspresji oznaczonego modyfikatora, nie zakłócając normalnego zachowania komórki.
Podczas gdy jedną z ważnych ról ubikwitynacji jest ukierunkowanie białek na degradację proteasomalną, obecnie wiadomo, że ma ona wiele innych właściwości regulacyjnych dla potencjalnie większości białek wewnątrzkomórkowych lub częściowo wewnątrzkomórkowych1. Liczba tych funkcji jest dodatkowo zwiększona przez istnienie wielu białek podobnych do ubikwityny, tworzących rodzinę białek regulujących prawie wszystkie mechanizmy komórkowe1. Ich zmiany mogą mieć drastyczny wpływ na biologię komórki i mogą prowadzić do patologicznych sytuacji lub brać w nich udział8, takich jak rak9. W związku z tym potrzebne są narzędzia do zbadania tego rozległego krajobrazu i zidentyfikowania zmian związanych ze stanem patologicznym, które mogą służyć jako nowe cele terapeutyczne.
Ten protokół jest dedykowany komórkom w hodowli, ponieważ muszą one być transdukowane, aby wyrażały egzogenne oznaczone jako Ub/Ubl. Po utworzeniu, te stabilne linie komórkowe mogą być wykorzystane do generowania profili Ubl z hodowli w 2D lub 3D lub ksenoprzeszczepów, rozszerzając w ten sposób horyzont różnych modeli eksperymentalnych, które można zastosować do badania profili PTM.

<table><tbody><tr><td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220-5ML</td><td>wiąże wszystkie białka znakowane flagą</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-Flag M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165</td><td>w celu wykrycia ekspresji znakowanej 6His-Flag filtra siatkowego komórek ub / ubl</td></tr><tr><td>40 i mikro; m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>do usuwania pływającego osadu z komórek lizowanych guanidyną</td></tr><tr><td>Peptyd flagowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3290</td><td>elucja flagi oznaczane białka z koralików antyflagowych</td></tr><tr><td>Chlorowodorek guanidyny Środek</td> chaotropowy <td>Sigma-Aldrich</td><td>50933</td><td>stosowany do denaturacji wszystkich białek w lizacie komórkowym</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td>eliminuje białka wiązania 6His z kulek Ni-NTA</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>ThermoFisher</td><td>L3000015</td><td>do transfekcji komórek HEK-293T w celu produkcji lentiwirusów</td></tr><tr><td>Probówki Lobind</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666491</td><td>zapobiega wchłanianiu cennego materiału</td></tr><tr><td>Filtr membranowy, 0,45 i mikro; m</td><td>Millipore</td><td>HAWP04700F1</td><td>do filtrowania lentiwirusowego supernantantu</td></tr><tr><td>Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>oczyszczanie znacznika 6His</td></tr></tbody></table>

profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Zależne od ubikwityny (ub) i ubikwityny (ubl) potranslacyjne modyfikacje białek odgrywają fundamentalne biologiczne role regulacyjne w komórce, kontrolując stabilność, aktywność, interakcje i lokalizację wewnątrzkomórkową. Umożliwiają one komórce reagowanie na sygnały i dostosowywanie się do zmian w jej otoczeniu. Zmiany w tych mechanizmach mogą prowadzić do poważnych sytuacji patologicznych, takich jak choroby neurodegeneracyjne i nowotwory. Celem opisanej tutaj techniki jest szybkie i dokładne ustalenie profili PTM zależnych od ub/ubls na podstawie hodowanych linii komórkowych. Porównanie różnych profili uzyskanych w różnych warunkach pozwala na identyfikację konkretnych zmian, takich jak te wywołane na przykład przez leczenie. Transdukcja komórkowa za pośrednictwem lentiwirusa jest wykonywana w celu wytworzenia stabilnych linii komórkowych wyrażających dwuznacznikową (6His i Flag) wersję modyfikatora (ubikwityny lub ubl, takiego jak SUMO1 lub Nedd8). Znaczniki te umożliwiają oczyszczanie komórek z ubikwityny, a tym samym z ubikwitynowanych białek. Odbywa się to poprzez dwuetapowy proces oczyszczania: pierwszy jest wykonywany w warunkach denaturacji przy użyciu tagu 6His, a drugi w warunkach natywnych przy użyciu znacznika Flag. Prowadzi to do wysoce specyficznej i czystej izolacji zmodyfikowanych białek, które są następnie identyfikowane i częściowo oznaczane ilościowo za pomocą chromatografii cieczowej, a następnie technologii tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS). Łatwa analiza informatyczna danych MS za pomocą oprogramowania Excel umożliwia tworzenie profili PTM poprzez eliminację sygnałów tła. Profile te są porównywane między każdym schorzeniem w celu zidentyfikowania konkretnych zmian, które następnie zostaną zbadane bardziej szczegółowo, zaczynając od ich walidacji za pomocą standardowych technik biochemicznych.

Transdukcja hodowli komórek ssaków w celu stworzenia komórek wykazujących ekspresję GFP oraz 6HF-Ub 
Aby wytworzyć lentiwirusy, które zostaną później użyte do transdukcji komórek MiaPaCa-2, komórki HEK-293T o 70% konfluencji poddaje się kotransfekcji równą ilością trzech wektorów: pCCL-6HF-Ubiquitin lub GFP/Delta-Helper/pvSvG. Po 24 h produkcji odzyskuje się i filtruje pożywkę zawierającą cząsteczki lentiwirusowe. Na tym etapie możliwe jest sprawdzenie wydajności trans...

Ten protokół ma na celu ustalenie proteomów specyficznych dla ubikwityny (Ub) i ubikwitynopodobnych (Ubls) w celu identyfikacji zmian tego rodzaju modyfikacji potranslacyjnych (PTM), związanych z konkretnym stanem, takim jak leczenie lub fenotyp.

Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Protokół ten jest łatwym sposobem generowania profili ubikwityny i modyfikacji potranslacyjnych podobnych do ubikwityny poprzez identyfikację i częściową kwantyfikację określonych zidentyfikowanych białek. Główną zaletą tej techniki jest zastosowanie lentiwirusów do stworzenia stabilnej linii ekspresji komórek w ciągu tygodnia oraz zastosowanie dwóch znaczników do specyficznego oczyszczania białek. W rzeczywistości tego rodzaju modyfikacje potranslacyjne są zaangażowane w większość funkcji biologicznych, a zmiany w tym mechanizmie występują w większości chorób.Dlatego identyfikacja tych zmian może służyć jako prognoza i/lub diagnoza i oczywiście jako cele molekularne. Ubikwityna jest jednym z najbardziej konserwatywnych białek w komórkach eukariotycznych i jest niezbędna do ich przetrwania. Dlatego tego rodzaju metodę można zastosować do każdego modelu eukariotycznego, od ssaków po drożdże.Jednak nasz układ lentiwirusowy jest ograniczony do badania komórek. Ponieważ cała procedura jest dość długa, a czas inkubacji czasami długi, można ją wykonać w ciągu dwóch dni zamiast jednego. Eluat z kulek niklowych można zamrozić w temperaturze minus 20 i przed dodaniem kulek flagowych.Protokół ten zawiera wiele etapów, z których niektóre są krytyczne, aby zagwarantować końcowy sukces oczyszczania, a tym samym dokładne ustalenie profilu modyfikacji potranslacyjnej. Demonstrację procedury przeprowadzą Mirna Swayden i Aurelie Dobric, dwie doktorantki laboratorium. Na początek dodaj 0,5 razy 10 do szóstej komórki HEK 293T na sześciodołkowej płytce z dwoma mililitrami na dołek DMEM z 10% FBS do wysiewu i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 100% wilgotności.Następnego dnia osiąga się 50 do 70% zbieżności. Kotransfekcja komórek mieszanką jednego mikrograma pCCL-6HF ubikwityny lub pCCL-GFP, jednego mikrograma PBS VG i jednego mikrograma wektorów pomocniczych delta przy użyciu odczynnika transfekcji i protokołu do produkcji lentiwirusa. Po sześciu godzinach od transfekcji zmień pożywkę na świeżą, odpowiadającą pożywce komórek, które mają być transdukowane.Zasiej komórki, które mają być transdukowane, na sześciodołkowej płytce ze standardowymi pożywkami hodowlanymi, aby uzyskać 10 do 20% konfluencji następnego dnia. 24 godziny po transfekcji odzyskaj pożywkę zawierającą cząstki lentiwirusa i przefiltruj za pomocą filtrów 0,45 mikrona. Zastąpić pożywkę komórek, która ma być poddana transdukcji, przefiltrowaną pożywką zawierającą lentiwirusy.Inkubuj komórki z lentiwirusami przez 24 do 72 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, a następnie zmień pożywkę na świeżą, standardową. Sprawdź ekspresję GFP za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby ocenić skuteczność transdukcji. Jeśli nie zostanie wykryta fluorescencja, odczekaj dodatkowe dwa do trzech dni.Jeśli kontrola GFP jest dodatnia z zieloną fluorescencją, hoduj wszystkie komórki, aż będą wystarczające do przeprowadzenia kontroli ekspresji ubikwityny podobnej do 6-His-FLAG przez immunofluorescencję, jak pokazano tutaj, i western blot przy użyciu przeciwciała anty-FLAG. Po wyhodowaniu komórek w 15-centymetrowych naczyniach umyj naczynia hodowlane co najmniej raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanami w temperaturze pokojowej. Aby rozpocząć lizę komórek, dodaj dwa mililitry buforu po jednym do każdego 15-centymetrowego naczynia w temperaturze pokojowej.Użyj skrobaka do komórek, aby odzyskać wszystkie lizaty do 50-mililitrowych stożkowych probówek wirówkowych. Sonikuj listany trzy razy przez 30 sekund, oddzielone jednominutową przerwą. Odwirować sonikowane lizaty 15 000 razy g przez 15 minut.Przenieść supernatant do nowej probówki przez sitko do komórek o średnicy 40 mikronów. Bardzo ważne jest, aby filtrować lizaty po sonikacji i odwirowaniu. Zaniechanie tego może skutkować kooczyszczaniem wielu białek nieswoistych, zwiększając tym samym tło i znacznie zmniejszając rozmiar profilu PTM.Przenieś równą ilość białka od 50 do 100 miligramów do nowych probówek Falcona. Dodaj kulki NTA z jonami niklu do każdej probówki w ilości dwóch mikrolitrów kulek na jeden miligram białka. Umieść rurki na rotatorze, aby obracały się z prędkością 30 obr./min przez 2 1/2 godziny w temperaturze pokojowej.Następnie granuluj kulki 500 razy g przez pięć minut. Umyj kulki jednym mililitrem buforowym i przenieś próbki do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Umieść rurkę na lodzie.Przemyć dwukrotnie jednym mililitrem lodowatego buforu dwa zawierające dziesięciomilimolowy imidazol. Aby eluować białka związane, dodaj 600 mikrolitrów buforu dwa zawierającego 250-milimolowy imidazol i obracaj przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po granulowaniu kulek przez odwirowanie w ilości 500 razy g przez jedną minutę, przenieść supernatant do nowej wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra i dodać 50 mikrolitrów kulek sprzężonych z przeciwciałem anty-FLAG M2.Obracaj z prędkością 30 obr./min przez 2 1/2 godziny w czterech stopniach Celsjusza. Następnie przemyć dwukrotnie 500 mikrolitrami buforu drugiego, a następnie dwukrotnie 500 mikrolitrami buforu trzeciego. Aby uzyskać ostateczną elucję, dodaj 100 mikrolitrów buforu trzeciego zawierającego peptyd FLAG w ilości 0,01 mikrograma na mikrolitr i obracaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 1 1/2 godziny.Po odwirowaniu w ilości 500 razy g przez jedną minutę, przenieść supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki. Weź 10 mikrolitrów, aby załadować na SDS-PAGE i wykonaj barwienie żelu srebrem, aby kontrolować jakość oczyszczania. Jeśli oczyszczanie wygląda dobrze, przeanalizuj 90% pozostawione przez LC-MS.Aby przeprowadzić normalizację, użyj formuł do normalizacji wartości ubikwityny i GFP między komórkami leczonymi lekiem a komórkami nieleczonymi. Aby usunąć tło, odejmij wartości w próbce kontrolnej GFP od wartości w próbkach ubikwityny, aby uzyskać określone wartości dla każdego zidentyfikowanego białka w obu warunkach. Aby uzyskać zmienność ubikwitynacji, należy uzyskać wynik od minus 100 do plus 100 dla pozytywnych i ujemnych zmian PTM indukowanych przez lek.Różnicę między wartościami właściwymi próbek poddanych działaniu substancji i niepoddanych działaniu substancji dzieli się przez sumę wszystkich wartości, w tym wartości w próbie kontrolnej, i mnoży przez 100. Odchylenia poniżej minus 50, reprezentujące tłumienie PTM, lub powyżej 50, reprezentujące indukcję PTM, są uważane za znaczące. Użyj tej formuły, aby uzyskać wartość ufności z zakresu od zera do 100%Wartości powyżej 50 są zwykle uważane za pewne.Aby uzyskać ładniejszy rozkład wartości indukcji i represji oraz uwzględnić zarówno parametry zmienności, jak i ufności, użyj tej formuły w celu pomnożenia wartości wariancji i ufności. W tym badaniu osiągnięto transdukcję komórek ssaków hodowlanych w celu wytworzenia komórek wyrażających ubikwitynę GFP i 6-histydyny FLAG. Skuteczność transdukcji lentiwirusowej po raz pierwszy kontrolowano, przyglądając się fluorescencji GFP komórek transdukowanych GFP.Ekspresja FLAG-ubikwityny została dokonana przez barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu przeciwciała anty-FLAG, które pokazuje procent transdukowanych komórek. W celu kontrolowania poziomu ekspresji egzogennej ubikwityny FLAG, lizaty z transdukowanych komórek analizowano za pomocą SDS-PAGE, a następnie western blot z przeciwciałem anty-FLAG. Po oczyszczeniu ubikwitynowanych białek, 10% końcowej elucji wykorzystano do kontroli ilości i integralności oczyszczonego materiału za pomocą SDS-PAGE i barwienia srebrem żelu.Za pomocą odejmowania próbki GFP zidentyfikowano 364 białka istotnie ubikwitynowane z wynikiem powyżej 50%Przeprowadzono analizę wzbogacenia zestawu genów tych ubikwitynowanych białek w celu podkreślenia procesów biologicznych, w których były one zaangażowane. Potencjalne oddziałujące sieci utworzone przez wywołane gemcytabiną zmiany ubikwitynacji. Doprowadziło to do zidentyfikowania funkcjonalnych sieci oddziałujących silnie pod wpływem zwiększonej lub zmniejszonej ubikwitynacji zaangażowanych białek.Potwierdzono również, że ubikwitynacja PCNA zwiększyła się po leczeniu gemcytabiną. Bardzo ważne jest, aby unikać przenoszenia niektórych kulek po obu etapach elucji, ponieważ może to spowodować znaczny wzrost tła. Procedura ta wygeneruje specyficzne modyfikacje potranslacyjne, które poprzez porównanie różnych warunków umożliwią identyfikację konkretnych zmian.Pierwszym kolejnym krokiem będzie walidacja co najmniej interesujących zmian w oparciu o podejścia biochemiczne. Opracowaliśmy tę metodę, aby zbadać modyfikacje potranslacyjne oparte na ubikwitynie w celu zidentyfikowania nowych sposobów i mechanizmów komórek raka trzustki. Od tego czasu ten protokół i inne opracowane na całym świecie są z powodzeniem stosowane do rozszyfrowywania różnych procesów biologicznych.Lentiwirusy muszą być używane co najmniej w laboratorium BL-2. Guanidyna jest silnym środkiem denaturującym i musi być stosowana ostrożnie. Sonikator może być również szkodliwy dla uszu i musi być używany zgodnie z zaleceniami.

profiling-ubiquitin-ubiquitin-like-dependent-post-translational

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ubikwitynacja jest kluczową modyfikacją potranslacyjną przeprowadzaną przez zestaw trzech enzymów. Mutacje genów zaangażowanych w tę modyfikację są powiązane z wieloma różnymi chorobami ludzi. W niniejszej pracy opisujemy protokoły wykrywania ubikwitynacji białek w hodowlach komórkowych in vivo oraz w probówkach in vitro.

Wykrywanie ubikwitynacji białek

Obecny protokół szczegółowo opisuje metodę pomiaru aktywności funkcjonalnie homologicznych enzymów deubikwitynujących. Specjalistyczne sondy kowalencyjnie modyfikują enzym i pozwalają na jego wykrycie. Metoda ta ma potencjał w zakresie identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Metoda pomiaru aktywności enzymów deubikwitynujących w liniach komórkowych i próbkach tkanek

Badanie wielu, endogennych modyfikacji potranslacyjnych dla docelowego białka może być niezwykle trudne. Opisane tutaj techniki wykorzystują zoptymalizowany bufor do lizy i system filtrów opracowany ze specyficznymi matrycami powinowactwa do kierowania PTM, do wykrywania modyfikacji acetylacji, ubikwitynacji, SUMOylacji 2/3 i fosforylacji tyrozyny dla białka docelowego przy użyciu jednego, usprawnionego systemu.

Wykorzystanie kompleksowego systemu wzbogacania immunoprecypitacji w celu zidentyfikowania endogennego profilu modyfikacji potranslacyjnej dla białek docelowych

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Ubikwitynacja to modyfikacja potranslacyjna, która odgrywa ważną rolę w procesach komórkowych i jest ściśle koordynowana przez deubikwitynację. Defekty w obu reakcjach leżą u podstaw ludzkich patologii. Udostępniamy protokoły do przeprowadzania reakcji ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro z wykorzystaniem oczyszczonych składników.

Testy ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro histonów nukleosomalnych

Ta metoda opisuje ocenę globalnych zmian w topologii łańcucha ubikwityny. Ocena jest przeprowadzana poprzez zastosowanie ukierunkowanego podejścia proteomicznego opartego na spektrometrii mas.

Analiza łańcucha ubikwityny za pomocą równoległego monitorowania reakcji

Ten przepływ pracy opisuje wydajność efektywnego czasowo i kosztowo wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM) jednocześnie dla ilościowej globalnej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje wzbogacanie PTM na poziomie peptydów wieloma sprzężonymi przeciwciałami, a następnie niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu uzyskania biologicznego wglądu w przesłuchy PTM.

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Udostępniamy szczegółowy protokół testu ubikwitylacji specyficznego substratu i ligazy ubikwityny E3 w komórkach ssaków. HEK293T linie komórkowe wykorzystano do nadekspresji białek, poliubikwitylowany substrat oczyszczono z lizatów komórkowych metodą immunoprecypitacji i rozdzielono w SDS-PAGE. Do wizualizacji tej modyfikacji potranslacyjnej wykorzystano immunoblotting.

Ocena ubikwitylacji substratu przez ligazę ubikwityny E3 w lizatach komórek ssaków

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Eksperyment wykorzystany tutaj pokazuje metodę dokowania molekularnego w połączeniu z technologiami sond do przewidywania i walidacji interakcji między małymi cząsteczkami tradycyjnej medycyny chińskiej a celami białkowymi.

Badania przesiewowe związków tradycyjnej medycyny chińskiej pod kątem hamowania aktywności UCHL3 w oparciu o technologię molekularnego dokowania i deubikwitynacji sondy enzymatycznej

Ubikwitynacja jest kluczowym regulatorem funkcji białek wewnątrzkomórkowych. Tutaj opisujemy dwie metody lizy komórek do wykrywania poziomów ubikwitynacji białek substratowych w komórkach ssaków oraz porównujemy ich skuteczność w analizie poziomów ubikwitynacji. Nadekspresja białek w HEK293T komórkach została wywołana przejściową transfekcją, a białka ubikwitynowane wykryto analizą western blota.

Porównawcze strategie wykrywania ubiquitynacji w lizatach komórek ssaków z wykorzystaniem SMAD2/SMURF2 jako modelu

Poznaj metodę profilowania ubikwityny i modyfikacji potranslacyjnych w liniach komórkowych. Technika wykorzystuje lentiwirusy i podwójne znaczniki do identyfikacji zmian związanych z chorobami.

Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Przeglądaj więcej filmów