Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Protokół ten jest łatwym sposobem generowania profili ubikwityny i modyfikacji potranslacyjnych podobnych do ubikwityny poprzez identyfikację i częściową kwantyfikację określonych zidentyfikowanych białek. Główną zaletą tej techniki jest zastosowanie lentiwirusów do stworzenia stabilnej linii ekspresji komórek w ciągu tygodnia oraz zastosowanie dwóch znaczników do specyficznego oczyszczania białek. W rzeczywistości tego rodzaju modyfikacje potranslacyjne są zaangażowane w większość funkcji biologicznych, a zmiany w tym mechanizmie występują w większości chorób.

Dlatego identyfikacja tych zmian może służyć jako prognoza i/lub diagnoza i oczywiście jako cele molekularne. Ubikwityna jest jednym z najbardziej konserwatywnych białek w komórkach eukariotycznych i jest niezbędna do ich przetrwania. Dlatego tego rodzaju metodę można zastosować do każdego modelu eukariotycznego, od ssaków po drożdże.

Jednak nasz układ lentiwirusowy jest ograniczony do badania komórek. Ponieważ cała procedura jest dość długa, a czas inkubacji czasami długi, można ją wykonać w ciągu dwóch dni zamiast jednego. Eluat z kulek niklowych można zamrozić w temperaturze minus 20 i przed dodaniem kulek flagowych.

Protokół ten zawiera wiele etapów, z których niektóre są krytyczne, aby zagwarantować końcowy sukces oczyszczania, a tym samym dokładne ustalenie profilu modyfikacji potranslacyjnej. Demonstrację procedury przeprowadzą Mirna Swayden i Aurelie Dobric, dwie doktorantki laboratorium. Na początek dodaj 0,5 razy 10 do szóstej komórki HEK 293T na sześciodołkowej płytce z dwoma mililitrami na dołek DMEM z 10% FBS do wysiewu i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 100% wilgotności.

Następnego dnia osiąga się 50 do 70% zbieżności. Kotransfekcja komórek mieszanką jednego mikrograma pCCL-6HF ubikwityny lub pCCL-GFP, jednego mikrograma PBS VG i jednego mikrograma wektorów pomocniczych delta przy użyciu odczynnika transfekcji i protokołu do produkcji lentiwirusa. Po sześciu godzinach od transfekcji zmień pożywkę na świeżą, odpowiadającą pożywce komórek, które mają być transdukowane.

Zasiej komórki, które mają być transdukowane, na sześciodołkowej płytce ze standardowymi pożywkami hodowlanymi, aby uzyskać 10 do 20% konfluencji następnego dnia. 24 godziny po transfekcji odzyskaj pożywkę zawierającą cząstki lentiwirusa i przefiltruj za pomocą filtrów 0,45 mikrona. Zastąpić pożywkę komórek, która ma być poddana transdukcji, przefiltrowaną pożywką zawierającą lentiwirusy.

Inkubuj komórki z lentiwirusami przez 24 do 72 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, a następnie zmień pożywkę na świeżą, standardową. Sprawdź ekspresję GFP za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby ocenić skuteczność transdukcji. Jeśli nie zostanie wykryta fluorescencja, odczekaj dodatkowe dwa do trzech dni.

Jeśli kontrola GFP jest dodatnia z zieloną fluorescencją, hoduj wszystkie komórki, aż będą wystarczające do przeprowadzenia kontroli ekspresji ubikwityny podobnej do 6-His-FLAG przez immunofluorescencję, jak pokazano tutaj, i western blot przy użyciu przeciwciała anty-FLAG. Po wyhodowaniu komórek w 15-centymetrowych naczyniach umyj naczynia hodowlane co najmniej raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanami w temperaturze pokojowej. Aby rozpocząć lizę komórek, dodaj dwa mililitry buforu po jednym do każdego 15-centymetrowego naczynia w temperaturze pokojowej.

Użyj skrobaka do komórek, aby odzyskać wszystkie lizaty do 50-mililitrowych stożkowych probówek wirówkowych. Sonikuj listany trzy razy przez 30 sekund, oddzielone jednominutową przerwą. Odwirować sonikowane lizaty 15 000 razy g przez 15 minut.

Przenieść supernatant do nowej probówki przez sitko do komórek o średnicy 40 mikronów. Bardzo ważne jest, aby filtrować lizaty po sonikacji i odwirowaniu. Zaniechanie tego może skutkować kooczyszczaniem wielu białek nieswoistych, zwiększając tym samym tło i znacznie zmniejszając rozmiar profilu PTM.

Przenieś równą ilość białka od 50 do 100 miligramów do nowych probówek Falcona. Dodaj kulki NTA z jonami niklu do każdej probówki w ilości dwóch mikrolitrów kulek na jeden miligram białka. Umieść rurki na rotatorze, aby obracały się z prędkością 30 obr./min przez 2 1/2 godziny w temperaturze pokojowej.

Następnie granuluj kulki 500 razy g przez pięć minut. Umyj kulki jednym mililitrem buforowym i przenieś próbki do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Umieść rurkę na lodzie.

Przemyć dwukrotnie jednym mililitrem lodowatego buforu dwa zawierające dziesięciomilimolowy imidazol. Aby eluować białka związane, dodaj 600 mikrolitrów buforu dwa zawierającego 250-milimolowy imidazol i obracaj przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po granulowaniu kulek przez odwirowanie w ilości 500 razy g przez jedną minutę, przenieść supernatant do nowej wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 mililitra i dodać 50 mikrolitrów kulek sprzężonych z przeciwciałem anty-FLAG M2.

Obracaj z prędkością 30 obr./min przez 2 1/2 godziny w czterech stopniach Celsjusza. Następnie przemyć dwukrotnie 500 mikrolitrami buforu drugiego, a następnie dwukrotnie 500 mikrolitrami buforu trzeciego. Aby uzyskać ostateczną elucję, dodaj 100 mikrolitrów buforu trzeciego zawierającego peptyd FLAG w ilości 0,01 mikrograma na mikrolitr i obracaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 1 1/2 godziny.

Po odwirowaniu w ilości 500 razy g przez jedną minutę, przenieść supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki. Weź 10 mikrolitrów, aby załadować na SDS-PAGE i wykonaj barwienie żelu srebrem, aby kontrolować jakość oczyszczania. Jeśli oczyszczanie wygląda dobrze, przeanalizuj 90% pozostawione przez LC-MS.

Aby przeprowadzić normalizację, użyj formuł do normalizacji wartości ubikwityny i GFP między komórkami leczonymi lekiem a komórkami nieleczonymi. Aby usunąć tło, odejmij wartości w próbce kontrolnej GFP od wartości w próbkach ubikwityny, aby uzyskać określone wartości dla każdego zidentyfikowanego białka w obu warunkach. Aby uzyskać zmienność ubikwitynacji, należy uzyskać wynik od minus 100 do plus 100 dla pozytywnych i ujemnych zmian PTM indukowanych przez lek.

Różnicę między wartościami właściwymi próbek poddanych działaniu substancji i niepoddanych działaniu substancji dzieli się przez sumę wszystkich wartości, w tym wartości w próbie kontrolnej, i mnoży przez 100. Odchylenia poniżej minus 50, reprezentujące tłumienie PTM, lub powyżej 50, reprezentujące indukcję PTM, są uważane za znaczące. Użyj tej formuły, aby uzyskać wartość ufności z zakresu od zera do 100%Wartości powyżej 50 są zwykle uważane za pewne.

Aby uzyskać ładniejszy rozkład wartości indukcji i represji oraz uwzględnić zarówno parametry zmienności, jak i ufności, użyj tej formuły w celu pomnożenia wartości wariancji i ufności. W tym badaniu osiągnięto transdukcję komórek ssaków hodowlanych w celu wytworzenia komórek wyrażających ubikwitynę GFP i 6-histydyny FLAG. Skuteczność transdukcji lentiwirusowej po raz pierwszy kontrolowano, przyglądając się fluorescencji GFP komórek transdukowanych GFP.

Ekspresja FLAG-ubikwityny została dokonana przez barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu przeciwciała anty-FLAG, które pokazuje procent transdukowanych komórek. W celu kontrolowania poziomu ekspresji egzogennej ubikwityny FLAG, lizaty z transdukowanych komórek analizowano za pomocą SDS-PAGE, a następnie western blot z przeciwciałem anty-FLAG. Po oczyszczeniu ubikwitynowanych białek, 10% końcowej elucji wykorzystano do kontroli ilości i integralności oczyszczonego materiału za pomocą SDS-PAGE i barwienia srebrem żelu.

Za pomocą odejmowania próbki GFP zidentyfikowano 364 białka istotnie ubikwitynowane z wynikiem powyżej 50%Przeprowadzono analizę wzbogacenia zestawu genów tych ubikwitynowanych białek w celu podkreślenia procesów biologicznych, w których były one zaangażowane. Potencjalne oddziałujące sieci utworzone przez wywołane gemcytabiną zmiany ubikwitynacji. Doprowadziło to do zidentyfikowania funkcjonalnych sieci oddziałujących silnie pod wpływem zwiększonej lub zmniejszonej ubikwitynacji zaangażowanych białek.

Potwierdzono również, że ubikwitynacja PCNA zwiększyła się po leczeniu gemcytabiną. Bardzo ważne jest, aby unikać przenoszenia niektórych kulek po obu etapach elucji, ponieważ może to spowodować znaczny wzrost tła. Procedura ta wygeneruje specyficzne modyfikacje potranslacyjne, które poprzez porównanie różnych warunków umożliwią identyfikację konkretnych zmian.

Pierwszym kolejnym krokiem będzie walidacja co najmniej interesujących zmian w oparciu o podejścia biochemiczne. Opracowaliśmy tę metodę, aby zbadać modyfikacje potranslacyjne oparte na ubikwitynie w celu zidentyfikowania nowych sposobów i mechanizmów komórek raka trzustki. Od tego czasu ten protokół i inne opracowane na całym świecie są z powodzeniem stosowane do rozszyfrowywania różnych procesów biologicznych.

Lentiwirusy muszą być używane co najmniej w laboratorium BL-2. Guanidyna jest silnym środkiem denaturującym i musi być stosowana ostrożnie. Sonikator może być również szkodliwy dla uszu i musi być używany zgodnie z zaleceniami.