Rekonstrukcja in vitro przestrzennych wzorców kontaktu komórek z izolowanymi blastomerami zarodkowymi Caenorhabditis elegans i adhezyjnymi kulkami polistyrenowymi
26 listopada 2019
Złożoność tkanek systemów wielokomórkowych utrudnia identyfikację związku przyczynowego między sygnałami zewnątrzkomórkowymi a indywidualnymi zachowaniami komórek. W tym miejscu przedstawiamy metodę badania bezpośredniego związku między wskazówkami zależnymi od kontaktu a osiami podziału przy użyciu blastomerów zarodkowych C. elegans i adhezyjnych kulek polistyrenowych.
kompleks tkanek wielokomórkowych, protokół ten odtwarza przewodzenie komórkowe w uproszczony sposób. Jedną rzeczą jest ta technika do badania bezpośrednich relacji między protonami przewodnika komórkowego a odpowiedzią komórkową. Protokół ten wykorzystuje chemicznie funkcjonalne kulki polistyrenowe do odtworzenia protonów przewodnika komórkowego.
Koraliki można ciąć dowolnymi protonami, aby przetestować ich wpływ na odpowiedź komórkową. Zastosowaliśmy tę metodę w C-Elegance na zarodkach myszy. Dlatego protokół ten może być zgodny z badaniami nad szerokimi organizmami.
Ponieważ zarodki są delikatne po leczeniu wysokim poziomem chlorynu, wymagana jest znaczna praktyka, zanim będzie można skutecznie wyizolować blastomer. Demonstracja wizualna pozwoli lepiej zrozumieć, w jaki sposób należy obchodzić się z kapilarnością podczas metod izolacji blastomerów. Na początek zważ 10 miligramów kulek polistyrenowych modyfikowanych karboksylanem w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówki.
Dodaj jeden mililitr buforu MES do probówki do umycia. Obracaj rurkę, aby wymieszać koraliki. Wiruj probówkę przez 60 sekund w temperaturze 2000XG za pomocą wirówki stołowej.
Odrzucić supernatant, ostrożnie odpipetowując bufor. Ponownie umyj kulki jednym mililitrem bufora MES. Po przepłukaniu dodać do probówki jeden mililitr buforu MES zawierającego 10 miligramów EDAC, aby aktywować powierzchniowe grupy karboksylowe.
Obracaj rurkę, aby wymieszać koraliki. Obracać i inkubować probówkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Obracaj koraliki przez 60 sekund w temperaturze 2000XG.
Odrzucić supernatant ostrożnie odpipetując bufor i przemyć jednym mililitrem PBS. Odwiruj rurkę, aby wymieszać kulki i powtórz pranie PBS jeszcze raz. Przygotować jeden mililitr jednej, 10, 100 i tysiąckrotnej serii rozcieńczeń Rhodamine Red-X z 0,65 mililitra roztworu podstawowego Rhodamine Red-X.
Pippette 20 mikrolitrów kulek do każdej seryjnej probówki do rozcieńczania. Obracać i inkubować probówki przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umyj koraliki dwukrotnie jednym mililitrem PBS.
Po umyciu dodaj jeden mililitr PBS do probówek i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do sześciu tygodni. Sprawdź intensywność fluorescencji kulek pod mikroskopem używanym do obrazowania na żywo. Trzymaj każdy koniec mikrokapilary o pojemności 10 mikrolitrów prawą i lewą ręką.
Pociągnij mikrokapilę w kierunku obu końców, aby wywrzeć napięcie i przesuń środek kapilary nad palnik, aby utworzyć dwie ręcznie ciągnięte kapilary. Pod mikroskopem preparacyjnym przytnij końcówki ręcznie naczyń włosowatych za pomocą kleszczy. Spraw, aby oba rozmiary otworów końcówki były około dwa razy większe niż krótsza długość dostępu zarodków C-Elegance odpowiednio do transferu zarodków i usuwania skorupki jaja.
Podłącz wyciągniętą kapilarnę do aparatu do pipetowania jamy ustnej. Pippette 45 mikrolitrów roztworu soli jaj na studzienkę szkiełka wielostudziennego. Umieść od pięciu do 10 dorosłych C-Elegance na studni.
Aby uzyskać wczesną C-Elegance, zarodki tną dorosłe osobniki na kawałki, umieszczając dwie igły po prawej i lewej stronie ciała C-Elegance i przesuwając igły obok siebie. Pipetę wlać 45 mikrolitrów roztworu podchlorynu do studzienki obok studni zawierającej roztwór soli jajecznej i wylać 45 mikrolitrów pożywki Sheltona na kolejne trzy dołki. Przenieś zarodki w jednym stadium komórkowym i wczesne zarodki w stadium dwukomórkowym do roztworu podchlorynu za pomocą pipety doustnej z większym otworem i odczekaj od 40 do 55 sekund.
Umyj zarodki, przenosząc je do kolejnych trzech dołków za pomocą pożywki Sheltona. Z jedną do dwóch sekund w każdym z pierwszych dwóch dołków. Korzystając z ręcznie narysowanej kapilary z otworem o mniejszym rozmiarze, ostrożnie powtórz pipetowanie zarodka w celu usunięcia skorupki jaja.
Następnie w sposób ciągły pipetuj ręcznie narysowaną kapilarą, aby oddzielić blastomery embrionalne w stadium dwukomórkowym. Po usunięciu skorupki jaja zminimalizuj siłę podczas pippetowania zarodków w górę iw dół, aby zapobiec pęknięciu. Przygotuj komorę obrazowania, umieszczając szkiełko nakrywkowe na uchwycie szkiełka nakrywkowego i zaklej krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby je ustabilizować.
Odwróć uchwyt szkiełka nakrywkowego i narysuj okrąg na szkiełku nakrywkowym za pomocą hydrofobowego pisaka. Dodaj pożywkę wzrostową Sheltona do okręgu narysowanego przez marker hydrofobowy i przenieś wyizolowany blastomer do komory obrazowania w okręgu. Teraz nałóż niewielką objętość chemicznie funkcjonalizowanych kulek na szkiełko nakrywkowe za pomocą ręcznie rysowanej kapilary z większym otworem.
Kontroluj położenie koralików, w ręcznie rysowaną kapilę, aż koraliki przyczepią się do izolowanego blastomeru. Zamontuj szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć parowania pożywki i wykonaj obrazowanie na żywo za pomocą odwróconego mikroskopu. W tym badaniu sygnał fluorescencyjny z kulki potraktowanej 0,005 mikrograma na mililitr estru sukcynimidylu Rhodamine Red-X dla szczepu transgenicznego eksprymującego miozynę-2 GFP i M-cherihiston był zbyt słaby.
Z drugiej strony, sygnał fluorescencyjny z kulek potraktowanych pięcioma mikrogramami na mililitr Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester był zbyt silny. Stężenie estru sukcynimidylu Rhodamine Red-X na poziomie 0,5 mikrograma na mililitr było optymalne dla tego konkretnego szczepu transgenicznego. Podczas obrazowania na żywo zidentyfikowano płaszczyznę, w której dwa centrosomy były ustawione pionowo.
Płaszczyzna o kącie dodatnim lub minus 90 stopni tej płaszczyzny to płaszczyzna wrzeciona. Kąt orientacji wrzeciona względem granicy kontaktu komórka/koralik po cytokinezie pokazuje, że obie komórki potomne były przyłączone do koralika w linii, która przechodzi przez oba celowniki kontaktowe, została użyta jako orientacja kontaktowa. Trzeba się dowiedzieć, jak zarodki i skorupki jaj reagują na pewne siły zewnętrzne wywierane przez gębową pipette.
Teoretycznie można badać każdą odpowiedź komórkową, na przykład specyfikację siarczanów można badać poprzez hodowlę komórek i kontakt z kulkami adhezyjnymi przez dłuższy czas. Technika ta została wykorzystana do zrozumienia mechanizmu orientacji podziału komórki zależnego od kontaktu. Filtr PTF zastosowano w celu zapobieżenia wdychaniu oparów roztworu podchlorynu przez pytki ustne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia metodę badania bezpośredniego związku między sygnałami zależnymi od kontaktu a zachowaniami komórkowymi przy użyciu blastomerów zarodków C. elegans i klejących się kul polistyrenowych. Protokół upraszcza złożoności systemów wielokomórkowych, aby lepiej zrozumieć reakcje komórkowe na sygnały pozakomórkowe.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Biologia rozwojowa
Tło
- Tkanki wielokomórkowe wykazują złożone interakcje.
- Rozumienie reakcji komórkowych jest kluczowe dla biologii rozwojowej.
- Sygnały zależne od kontaktu odgrywają znaczącą rolę w zachowaniach komórkowych.
- Rekonstytuowanie zachowań komórkowych może pomóc w badaniu tych interakcji.
Cel badania
- Ustanowienie metody badania reakcji komórkowych na sygnały pozakomórkowe.
- Wykorzystanie kul polistyrenowych do rekonstytuowania środowiska komórkowego.
- Zastosowanie tej metody do zarodków C. elegans w celu uzyskania szerszych wniosków biologicznych.
Stosowane metody
- Wykorzystanie chemicznie funkcjonalnych kul polistyrenowych.
- Rekonstytuowanie zachowań komórkowych w uproszczony sposób.
- Zastosowanie metody do zarodków C. elegans.
- Testowanie efektów różnych sygnałów na reakcje komórkowe.
Główne wyniki
- Wykazano bezpośredni związek między sygnałami kontaktowymi a zachowaniami komórkowymi.
- Zweryfikowano zastosowanie kul polistyrenowych w badaniu reakcji komórkowych.
- Zdobyto wgląd stosowany w szerokim zakresie organizmów.
- Ułatwiono lepsze zrozumienie interakcji wielokomórkowych.
Konkluzje
- Metoda skutecznie łączy sygnały pozakomórkowe z zachowaniami komórkowymi.
- Kule polistyrenowe są wszechstronnym narzędziem do takich badań.
- To podejście może wzbogacić badania w dziedzinie biologii rozwojowej i komórkowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables direct interrogation of contact-dependent signaling in a controlled in vitro system, reducing confounding variables from multicellular complexity. By isolating blastomeres and using adhesive beads to define precise spatial contact patterns, researchers can establish causal links between extracellular cues and cellular responses such as division orientation. This supports mechanistic de-risking in early target validation by clarifying how physical microenvironmental inputs regulate cell fate decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Tests hypotheses about how specific cell-contact geometries influence division axis orientation and downstream fate specification.
- Operational Value: Provides a reductionist platform to deconvolute contact-mediated signaling from soluble factor effects.
- Predictive Value: Enables quantitative correlation of contact pattern parameters with cellular phenotypic outputs for target confidence assessment.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible cell-bead interfaces for consistent phenotypic readouts across experimental replicates.
- Scalability: Supports preparation of bead libraries with graded ligand densities to probe dose-dependent contact responses.
- Workflow Integration: Outputs such as spindle orientation angles or division symmetry serve as quantifiable endpoints for automated image-based screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Findings on contact-dependent division orientation inform models of tissue patterning defects relevant to congenital disorders.
- Translational Continuity: Establishes a bridge from in vitro contact mechanism discovery to in vivo validation in developing embryos.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from direct contact modulation versus secondary signaling cascades.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where understanding spatial regulation of cellular behavior informs target selection and lead optimization strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of how adhesive interface composition and geometry regulate mitotic spindle alignment.
- Screening: Enables assay standardization via fluorescently tagged beads and controlled contact geometry for reproducible phenotypic scoring.
- Analytics: Generates quantitative spatial readouts (e.g., division axis angle relative to contact plane) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Links in vitro contact response data to in vivo spatial patterning outcomes in embryonic development.
- Enterprise Reuse: The bead functionalization and blastomere isolation workflow can be adapted to other model systems for cross-species target validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in attributing cellular responses to specific spatial contact cues.
- Operational Value: Delivers a robust, reproducible system for generating defined cell-contact microenvironments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by validating targets within physiologically relevant spatial contexts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on evidence of contact-dependent mechanism validity.
Implementation Considerations
- Expertise in microsurgical techniques for blastomere isolation and capillary handling.
- Access to fluorescence microscopy and microfluidic-compatible imaging chambers for live-cell analysis.
- Standardization of bead functionalization protocols (e.g., EDAC activation, Rhodamine labeling) across users and batches.
- Adaptation considerations for applying the method to non-nematode blastomeres or alternative adhesive substrates.
- Practical limitations include embryo fragility post-isolation and the need for optimization of bead concentration and ligand density per cell type.
