Name: Rekonstrukcja in vitro przestrzennych wzorców kontaktu komórek z izolowanymi blastomerami zarodkowymi Caenorhabditis elegans i adhezyjnymi kulkami polistyrenowymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Poznaj metodę rekonstrukcji przestrzennych wzorców kontaktu komórek z blastomerami zarodkowymi Caenorhabditis elegans i adhezyjnymi kulkami polistyrenowymi. Technika ta pozwala badać zależności między sygnałami kontaktowymi a zachowaniem komórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jamesowi Priessowi i Bruce'owi Bowermanowi za rady i udostępnienie szczepów C. elegans, Donowi Moermanowi, Kota Mizumoto i Life Sciences Institute Imaging Core Facility za udostępnienie sprzętu i odczynników, Aoi Hiroyasu, Lisie Fernando, Min Jee Kimowi za utrzymanie C. elegans i krytyczną lekturę naszego rękopisu. Nasza praca jest wspierana przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC), (RGPIN-2019-04442).

1. Przygotowanie kleju do polistyrenu
UWAGA: Ten protokół nie wymaga techniki aseptycznej.
<ol>
	<li>Odważyć 10 mg kulek polistyrenowych modyfikowanych karboksylanem w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Aby umyć kulki, dodaj 1 ml buforu kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) do probówki. Ponieważ bufor MES nie zawiera fosforanów i octanów, które mogą zmniejszać reaktywność karbokodiymidu, nadaje się do stosowania w reakcji sprzęgania białek. Obracaj rurkę, aby wymieszać koraliki.</li>
	<li>Wirować probówkę przez 60 s przy 2 000 x g za pomocą wirówki stołowej.</li>
	<li>Odrzucić sklarowany nad osadem, ostrożnie odmierzając bufor.</li>
	<li>Ponownie umyj kulki 1 ml buforu MES, wykonując czynności 1.2-1.4.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu MES zawierającego 10 mg EDAC do probówki, aby aktywować powierzchniowe grupy karboksylowe. Obracaj rurkę, aby wymieszać koraliki.</li>
	<li>Obracać i inkubować probówkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wiruj koraliki przez 60 s przy 2,000 x g.</li>
	<li>Odrzucić sklarowany nad osadem, ostrożnie odmierzając bufor.</li>
	<li>Aby umyć kulki, dodaj 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do probówki. Obracaj rurkę, aby wymieszać koraliki.</li>
	<li>Wiruj rurkę przez 60 s przy 2,000 x g.</li>
	<li>Odrzucić sklarowany nad osadem, ostrożnie odmierzając bufor.</li>
	<li>Ponownie umyj koraliki 1 ml PBS, wykonując czynności 1.10-1.12.</li>
	<li>Ostateczne stężenie użytej rodaminy będzie zależało od obrazowanego szczepu. Przygotować 1 ml serii 1-, 100- i 1000-krotnych rozcieńczeń Rhodamine Red-X z 0,65 mM roztworu podstawowego Rhodamine Red-X.</li>
	<li>Odpipetować 20 μl kulek do każdej probówki do rozcieńczania szeregowego.</li>
	<li>Obracać i inkubować probówkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj koraliki dwukrotnie 1 ml PBS, powtarzając kroki 1.10-1.12.</li>
	<li>Dodać 1 ml PBS do probówki i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 tygodni. Sprawdź intensywność fluorescencji koralików pod mikroskopem używanym do obrazowania na żywo. Odpowiednie stężenie estru sukcynimidylowego Rhodamine Red-X zależy od warunków obrazowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Koraliki bez obróbki Rhodamine Red-X nie przylegają do komórek. Rodamina Red-X służy zarówno jako marker fluorescencji, jak i cząsteczka adhezyjna. Oddziaływanie elektrostatyczne między dodatnio naładowaną rodaminą Red-X a ujemnie naładowaną błoną plazmatyczną jest przypuszczalną przyczyną adhezji.</li>
</ol>
2. Montaż pipety do ust
<ol>
	<li>Wytnij szerokie (średnica wewnętrzna 6,35 mm) i wąskie (średnica wewnętrzna 3,175 mm) rurki Tygon odpowiednio na około 25 cm i 40 cm długości (<klasa silna="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Połącz rurki Tygon z filtrem z politetrafluoroetylenu (PTFE) (wielkość porów 0,2 μm) (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2).</li>
	<li>Zdemontuj dostępną w handlu rurkę aspiratora i przymocuj jej uchwyt kapilarny i ustnik odpowiednio do końca wąskich i szerokich probówek Tygon (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
	UWAGA: Filtr PTFE został zastosowany w celu zapobieżenia wdychaniu oparów roztworu podchlorynu przez pipetę doustną.</li>
</ol>
3. Izolacja blastomeru zarodkowego
UWAGA: Nosić rękawice i fartuch laboratoryjny, aby uniknąć skaleczenia i kontaktu z roztworem wybielającym.
<ol>
	<li>Trzymaj każdy koniec mikrokapilary (pojemność; 10 μl) prawą i lewą ręką.</li>
	<li>Pociągnij mikrokapilę w kierunku obu końców, aby wywrzeć napięcie i przesuń środek kapilary nad palnikiem, aby utworzyć dwie ręcznie ciągnięte kapilary (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Przytnij końcówki ręcznie naciągniętych naczyń włosowatych kleszczami pod mikroskopem preparacyjnym i przymocuj wyciągniętą kapilę do aparatu do pipetowania doustnego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Przygotuj dwa rodzaje pipet. Rozmiary otworów końcówek dla pipet powinny być w przybliżeniu 2x i 1x krótsze długości zarodków C. elegans (30 μm) odpowiednio do transferu zarodków i usuwania skorupek jaj <silna klasa="xfig">Rysunek 3B-D).</li>
	<li>Odpipetować 45 μl roztworu soli jaja do dołka szkiełka wielodołkowego (<klasa silna = "xfig">Rysunek 4A; na dole).</li>
	<li>Umieść 5-10 dorosłych C. elegans w studzience zawierającej roztwór soli jajecznej.</li>
	<li>Aby uzyskać wczesne zarodki C. elegans, pokrój dorosłe osobniki na kawałki, umieszczając dwie igły po prawej i lewej stronie ciała C. elegans i przesuwając igły obok siebie (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A; górne schematy).</li>
	<li>Pobrać pipetą 45 μl roztworu podchlorynu do studzienki obok studzienki zawierającej roztwór soli jaj (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B).</li>
	<li>Odpipetować 45 μl pożywki wzrostowej Sheltona do kolejnych trzech studzienek obok studzienki zawierającej roztwór podchlorynu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4B).</li>
	<li>Przenieś zarodki w stadium 1-komórkowym i we wczesnym stadium 2-komórkowym do roztworu podchlorynu przez pipetowanie doustne za pomocą ręcznie narysowanej kapilary do transferu zarodków (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 4B).</li>
	<li>Poczekaj 40–55 sekund.</li>
	<li>Umyj zarodki, przenosząc je z roztworu podchlorynu do pożywki wzrostowej Sheltona, pipetując doustnie za pomocą ręcznie narysowanej kapilary do transferu zarodków (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4B).</li>
	<li>Ponownie umyj zarodki, przenosząc je do nowego dołka pożywki Sheltona za pomocą doustnego pipetowania za pomocą ręcznie narysowanej kapilary do transferu zarodków (<silna klasa = "xfig">Ryc. 4B).</li>
	<li>Przenieś umyte zarodki do nowego dołka pożywki Sheltona za pomocą doustnego pipetowania za pomocą ręcznie narysowanej kapilary do transferu zarodków. Używając ręcznie narysowanej kapilary do usuwania skorupki jajka, ostrożnie powtórz pipetowanie (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C; środkowy schemat). Jeśli skorupka jaja zostanie pomyślnie usunięta, komórki embrionalne staną się bardziej kuliste (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C; po prawej).</li>
	<li>Oddziel blastomery embrionalne w stadium 2-komórkowym, delikatnie i w sposób ciągły pipetując ręcznie narysowaną kapilarą w celu usunięcia skorupki jaja (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4D).</li>
</ol>
4. Odtwarzanie wzorców kontaktowych za pomocą blastomerów i koralików
UWAGA: Pracuj pod mikroskopem obrazowania, aby uniknąć dysocjacji komórki od koralika i ułatwić szybkie uzyskanie obrazu.
<ol>
	<li>Aby prowadzić obserwacje za pomocą mikroskopu odwróconego, przygotuj komorę obrazowania, jak w Rysunek 5.
	<ol>
		<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na uchwycie szkiełka nakrywkowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A).</li>
		<li>Zaklej krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby je ustabilizować. Strona z taśmą to strona "tylna" (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A,B).</li>
		<li>Odwróć uchwyt na szkiełko nakrywkowe na "przednią" stronę i narysuj okrąg na szkiełku nakrywkowym za pomocą hydrofobowego pisaka (<silna klasa="xfig">Rysunek 5C). 
		UWAGA: Każde naczynie ze szklanym dnem również działa, pod warunkiem, że zarodki można manipulować za pomocą pipety doustnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj pożywkę wzrostową Sheltona w okręgu narysowanym przez marker hydrofobowy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5D).</li>
	<li>Przenieś wyizolowany blastomer do komory obrazowania.</li>
	<li>Dozuj niewielką objętość chemicznie funkcjonalizowanych kulek za pomocą ręcznie rysowanej kapilary do transferu zarodków.</li>
	<li>Kontroluj położenie kulek polistyrenu, wdmuchując je w ręcznie rysowaną kapilę, aż koralik przyczepi się do izolowanego blastomeru.</li>
	<li>Zamontuj szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć parowania podłoża (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 5E). Wykonywanie obrazowania na żywo.</li>
</ol>
5. Przygotowanie ważnych odczynników
<ol>
	<li>Roztwór soli jaj (10 ml): Połącz 235 μl 5 M NaCl i 240 μl 2 M KCl z 9525 μl dH2O.</li>
	<li>Roztwór podchlorynu (10 ml): Połącz 7,5 ml Cloroxu (zawierającego około 7,5% podchlorynu sodu) z 2,5 ml 10 N NaOH (końcowe stężenie podchlorynu sodu wynosi około 5,625%). 
	UWAGA: Chociaż wiele opublikowanych metod wykorzystywało chitynazę do trawienia chitynowych skorupek jaj, przyjęliśmy metodę wykorzystującą roztwór podchlorynu11. Unikając różnic w aktywności chitynazy między partiami, uważamy, że metoda ta jest bardziej powtarzalnym i opłacalnym podejściem.</li>
	<li>0,81 mM roztwór inuliny (40 ml)
	<ol>
		<li>Dodać 0,2 g inuliny do 40 ml dH2O.</li>
		<li>Autoklaw do rozpuszczenia. 
		UWAGA: Przechowywać przez 1 miesiąc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bufor MES 0,5 m (500 ml)
	<ol>
		<li>Rozpuścić 48,81 g MES w 400 ml wody destylowanej (dH2O).</li>
		<li>Dostosuj pH do 6,0.</li>
		<li>Doprowadzić całkowitą objętość do 500 ml za pomocą dH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór PBS (1 l)
	<ol>
		<li>Aby przygotować 10-krotny roztwór PBS, rozpuść 1 opakowanie proszku premiksu PBS w 1 l dH2O.</li>
		<li>Połączyć 100 ml 10-krotnego roztworu PBS z 900 ml dH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>5% roztwór poliwinylopirolidonu (PVP) (4 ml)
	<ol>
		<li>W sterylnych warunkach rozpuść 0,2 g PVP w 4 ml pożywki Drosophila Schneider's Medium. 
		UWAGA: Zawsze otwieraj kaptur Schneider Medium do hodowli tkankowych (TC). Przechowywać przez 1 miesiąc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>0,65 mM roztworu podstawowego rodaminy Red-X (2 ml)
	<ol>
		<li>Odważyć 1 mg Rhodamine Red-X.</li>
		<li>Dodać 2 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) do rozpuszczenia.</li>
		<li>Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pożywka Sheltona (SGM) (10,25 ml)
	<ol>
		<li>W sterylnych warunkach połącz ze sobą 8 ml pożywki Drosophila Schneider's Medium, 1 ml roztworu PVP, 1 ml roztworu inuliny, 1 ml witamin Basal Medium Eagle (BME), 50 μl penicyliny-streptomycyny i 100 μl koncentratu lipidowego.</li>
		<li>Porcję 325 μl SGM do mikroprobówek o pojemności 1,5 ml. 
		UWAGA: Przechowywać przez około 1 miesiąc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>W dniu izolacji blastomerów dodać 175 μl płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do SGM (dla całkowitej objętości 500 μL). 
		UWAGA: Przechowywać FBS w temperaturze -20 °C i rozmrozić przed użyciem. FBS nie musi być zabijany cieplnie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Herman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hermaphrodite+cell-fate+specification%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Hermaphrodite cell-fate specification.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Rose, L., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+establishment%2C+asymmetric+division+and+segregation+of+fate+determinants+in+early+C.+elegans+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos.</a> WormBook. , (2014).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1(1986).</li>
<li>Mango, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+pharynx%3A+a+model+for+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">The C. elegans pharynx: a model for organogenesis.</a> WormBook. , (2007).</li>
<li>McGhee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">The C. elegans intestine.</a> WormBook. , (2007).</li>
<li>Edgar, L. G., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+Manipulation+of+Embryonic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Culture and Manipulation of Embryonic Cells.</a> Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).</li>
<li>Stein, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+eggshell%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">The C. elegans eggshell.</a> WormBook. , (2018).</li>
<li>Quash, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preparation+of+latex+particles+with+covalently+bound+polyamines%2C+IgG+and+measles+agglutinins+and+their+use+in+visual+agglutination+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests.</a> Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).</li>
<li>Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tyrosine+aminotransferase+by+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).</li>
<li>Sugioka, K., Bowerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+contact+cues+specify+cell+division+orientation+by+directing+cortical+myosin+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows.</a> Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).</li>
<li>Park, F. D., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+POP-1+asymmetry+in+early+C.+elegans+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos.</a> Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Gillies, T. E., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Division+Orientation+in+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Division Orientation in Animals.</a> Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).</li>
<li>Poulson, N. D., Lechler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+cell+divisions+in+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric cell divisions in the epidermis.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).</li>
<li>Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+cell+division%3A+recent+developments+and+their+implications+for+tumour+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Dupont, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+YAP%2FTAZ+in+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of YAP/TAZ in mechanotransduction.</a> Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).</li>
<li>Schierenberg, E., Junkersdorf, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+eggshell+and+underlying+vitelline+membrane+for+normal+pattern+formation+in+the+early+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Roux%27s+Archives+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo.</a> Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).</li>
<li>Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+neighbor+determination+in+the+metazoan+embryo+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+8th+ACM+International+Conference+on+Bioinformatics%2C+Computational+Biology%2C+and+Health+Informatics%22%5BJournal%5D)">Cell neighbor determination in the metazoan embryo system.</a> Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).</li>
<li>Shaya, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+contact+area+affects+notch+signaling+and+notch-dependent+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning.</a> Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+single+cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li>
<li>Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signals+can+function+as+positional+cues+in+establishing+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity.</a> Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).</li>
<li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , (2005).</li>
<li>Müller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+cell+division+in+the+C.+elegans+embryo+is+coordinated+by+G-protein+signaling+dependent+on+the+adhesion+GPCR+LAT-1%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1.</a> PLOS Genetics. 11 (10), 1005624(2015).</li>
<li>Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+during+Caenorhabditis+elegans+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development.</a> Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).</li>
<li>Habib, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+localized+Wnt+signal+orients+asymmetric+stem+cell+division+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro.</a> Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Rekonstrukcja uproszczonych wzorców kontaktu komórkowego pozwoli naukowcom przetestować rolę określonych wzorców kontaktu komórkowego w różnych aspektach morfogenezy. Użyliśmy tej techniki, aby pokazać, że oś podziału komórki jest kontrolowana przez fizyczny kontakt z kulkami adhezyjnymi10. Ponieważ specyfikacja osi podziału ma kluczowe znaczenie dla rozwoju wielokomórkowego, przyczyniając się do morfogenezy14, podziału komórek macierzystych15,16<sup...

Podczas rozwoju wielokomórkowego, zachowania komórkowe (np. oś podziału) poszczególnych komórek są określane przez różne chemiczne i fizyczne wskazówki. Zrozumienie, w jaki sposób poszczególni komórki interpretują te informacje i jak regulują składanie się wielu komórek jako właściwość emergentną, jest jednym z ostatecznych celów badań morfogenezy. Organizm modelowy C. elegans znacząco przyczynił się do zrozumienia regulacji morfogenezy na poziomie komórkowym, takich jak polaryzacja komórek1, wzorzec podziału komórek1, cell fate decision2 oraz regulacje skali tkankowej, takie jak okablowanie neuronalne3 i organogeneza4,5. Chociaż dostępnych jest wiele narzędzi genetycznych, metody inżynierii tkankowej są ograniczone.
Najbardziej udaną metodą inżynierii tkankowej w badaniu C. elegans jest klasyczna izolacja blastomerów6; ponieważ zarodek C. elegans jest otoczony skorupką jaja i barierą przepuszczalności7, ich usunięcie jest jedną z głównych procedur tej metody. Chociaż ta metoda izolacji blastomerów umożliwia odtworzenie kontaktu komórka-komórka w uproszczony sposób, nie pozwala na eliminację niepożądanych sygnałów; Kontakt z komórką nadal stwarza zarówno mechaniczne (np. adhezja), jak i chemiczne wskazówki, ograniczając w ten sposób naszą zdolność do pełnej analizy związku przyczynowego między wskazówką a zachowaniem komórki.
Metoda przedstawiona w tym artykule wykorzystuje modyfikowane karboksylami kulki polistyrenowe, które mogą kowalencyjnie wiązać się z dowolnymi cząsteczkami amino-reaktywnymi, w tym białkami jako ligandami. W szczególności użyliśmy reagującej z aminą formy Rhodamine Red-X jako liganda, aby koraliki były zarówno wizualnie śledzone, jak i przyklejane do komórki. Grupy karboksylowe powierzchni kulki i pierwszorzędowych grup aminowych cząsteczki liganda są sprzężone rozpuszczalnym w wodzie karbodimidem 1-etylo-3-(dimetyloaminopropylo)karbodimidem (EDAC)8,9. Otrzymane kulki adhezyjne pozwalają na uwzględnienie wpływu mechanicznej wskazówki na dynamikę komórkową10. Użyliśmy tej techniki do zidentyfikowania wskazówek mechanicznych wymaganych do orientacji podziału komórki10.

<table><tbody><tr><td>Chlorowodorek 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodimidu</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAA1080703</td><td>Do przygotowania kulek</td></tr><tr><td>Zespół rurki aspiratora</td><td>Drummond</td><td>21-180-13</td><td>Do izolacji blastomerów.</td></tr><tr><td>Szczep Caenorhabditis elegans: N2, typ dziki</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>Szczep N2</td><td>użyty w tym badaniu</td></tr><tr><td>Szczep Caenorhabditis elegans: KSG5, genotyp: zuIs45; itIs37</td><td>w domu</td><td>Szczep KSG5</td><td>użyty w tym badaniu</td></tr><tr><td>Kalibrowane Mircopipety, 10 i mikro; L</td><td>Drummond</td><td>21-180-13</td><td>Do izolacji blastomerów</td></tr><tr><td>Koraliki polistyrenowe modyfikowane karboksylanem (30 &mikro; m średnicy)</td><td>KISKER Biotech</td><td>PPS-30.0COOHP</td><td>Do przygotowania kulek</td></tr><tr><td>CD Lipid Concentrate</td><td>Life Technologies</td><td>11905031</td><td>Do izolacji blastomerów. Praca w kapturze do hodowli tkankowych.</td></tr><tr><td>Clorox</td><td>Clorox</td><td>N. A.</td><td>Do izolacji blastomerów. Otwórz nową butelkę, gdy leczenie podchlorynem nie działa dobrze.</td></tr><tr><td>Uchwyt na szkiełko nakrywkowe</td><td>w domu</td><td>N.A.</td><td>Do izolacji blastomerów.</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny: Zeiss Stemi 508 ze statywem M. Źródłem światła jest wbudowana dioda LED. Powiększenie okularu wynosi 10X.</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td>Do izolacji blastomerów.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana jednorazowa strzał, pochodzenie</td><td>z Kanady Gibco</td><td>A3160701</td><td>Do izolacji blastomerów. Praca w kapturze do hodowli tkankowych.</td></tr><tr><td>Igły podskórne ogólnego zastosowania i precyzyjnego ślizgu, 25 gauge</td><td>BD</td><td>14-826AA</td><td>Do izolacji blastomerów</td></tr><tr><td>Inulina</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAA1842509</td><td>Do izolacji blastomerów</td></tr><tr><td>Roztwór witaminowy MEM (100x)</td><td>Gibco</td><td>11120052</td><td>Do izolacji blastomerów.</td></tr><tr><td>MES (drobne białe kryształy)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP300-100</td><td>Do przygotowania kulek</td></tr><tr><td>Multitest Slide 10 Well</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN6041805</td><td>Do izolacji blastomerów</td></tr><tr><td>PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 10 x proszek</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP665-1</td><td>Do przygotowania kulek</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td>Dla izolacja blastomerów.</td></tr><tr><td>Poliwinylopirolidon</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP431-100</td><td>Do izolacji blastomerów</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Bioshop</td><td>POC888</td><td>Do izolacji blastomerów</td></tr><tr><td>Rodamina Red-X, ester sukcynimidylowy, 5-izomerowe</td><td>sondy molekularne</td><td>R6160</td><td>Do przygotowania kulek</td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila Sterile Medium</td><td>Gibco</td><td>21720024</td><td>Do izolacji blastomerów. Praca w kapturze do hodowli tkankowych.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Bioshop</td><td>SOD001</td><td>Do izolacji blastomerów</td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku sodu, 10 N</td><td>Fisher Chemical</td><td>SS255-1</td><td>Do izolacji blastomerów</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem: Yokogawa CSU-X1, odwrócony zakres Zeiss Axiovert, kamera Quant EM 512, 63X NA 1.4 Planaryczna soczewka obiektywowa. System był sterowany przez Slidebook 6.0.</td><td>Innowacja w zakresie inteligentnego obrazowania</td><td>N.A.</td><td>Do obrazowania na żywo</td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe, PTFE, niesterylne</td><td>Basix</td><td>13100115</td><td>Do izolacji blastomerów.</td></tr><tr><td>Rurki laboratoryjne Tygon S3,, Formulacja E-3603, Średnica wewnętrzna 3,175 mm</td><td>Saint Gobain Performance Plastics</td><td>89403-862</td><td>Do izolacji blastomerów.</td></tr><tr><td>Rurki laboratoryjne Tygon S3,, Formulacja E-3603, Średnica wewnętrzna 6,35 mm</td><td>Saint Gobain Performance Plastics</td><td>89403-854</td><td>Do izolacji blastomerów.</td></tr></tbody></table>

rekonstrukcja in vitro przestrzennych wzorców kontaktu komórek z izolowanymi blastomerami zarodkowymi caenorhabditis elegans i adhezyjnymi kulkami polistyrenowymi

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

W systemach wielokomórkowych, pojedyncze komórki są otoczone różnymi fizycznymi i chemicznymi sygnałami pochodzącymi z sąsiednich komórek i środowiska. Ta złożoność tkanki utrudnia identyfikację związku przyczynowego między sygnałami zewnętrznymi a dynamiką komórkową. Syntetycznie odtworzony system wielokomórkowy rozwiązuje ten problem, umożliwiając naukowcom testowanie pod kątem określonej wskazówki, jednocześnie eliminując inne. W tym miejscu przedstawiamy metodę odtwarzania wzorców kontaktowych komórek za pomocą izolowanych blastomerów Caenorhabditis elegans i adhezyjnych kulek polistyrenowych. Zabiegi obejmują usunięcie skorupki jaja, izolację blastomerów poprzez przerwanie adhezji komórka-komórka, przygotowanie adhezyjnych kulek polistyrenowych oraz odtworzenie kontaktu komórka-komórka lub komórka-kulka. Na koniec przedstawiono zastosowanie tej metody do badania orientacji osi podziału komórkowego, która przyczynia się do regulacji przestrzennego wzorca komórkowego i specyfikacji losu komórki w rozwijających się zarodkach. Ta solidna, powtarzalna i wszechstronna metoda in vitro umożliwia badanie bezpośrednich relacji między przestrzennymi wzorcami kontaktu komórek a reakcjami komórkowymi.

W celu przygotowania kulek określono optymalną ilość estru succynimidylowego Rhodamine Red-X dla szczepu transgenicznego wykazującego ekspresję GFP-myosin II oraz mCherry-histone (Ryc. 1A-D). Jako marker progresji cyklu komórkowego wykorzystano histon z tagiem mCherry. Ponieważ zarówno Rhodamine Red-X, jak i mCherry są wzbudzane laserem o długości fali 561 nm, optymalne natężenie sygnału Rhodamine Red-X powinno być porównywalne z natężeniem sygnału histonu, aby umożliwić jed...

Złożoność tkanek systemów wielokomórkowych utrudnia identyfikację związku przyczynowego między sygnałami zewnątrzkomórkowymi a indywidualnymi zachowaniami komórek. W tym miejscu przedstawiamy metodę badania bezpośredniego związku między wskazówkami zależnymi od kontaktu a osiami podziału przy użyciu blastomerów zarodkowych C. elegans i adhezyjnych kulek polistyrenowych.

Rekonstrukcja in vitro przestrzennych wzorców kontaktu komórek z izolowanymi blastomerami zarodkowymi Caenorhabditis elegans i adhezyjnymi kulkami polistyrenowymi

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

kompleks tkanek wielokomórkowych, protokół ten odtwarza przewodzenie komórkowe w uproszczony sposób. Jedną rzeczą jest ta technika do badania bezpośrednich relacji między protonami przewodnika komórkowego a odpowiedzią komórkową. Protokół ten wykorzystuje chemicznie funkcjonalne kulki polistyrenowe do odtworzenia protonów przewodnika komórkowego.Koraliki można ciąć dowolnymi protonami, aby przetestować ich wpływ na odpowiedź komórkową. Zastosowaliśmy tę metodę w C-Elegance na zarodkach myszy. Dlatego protokół ten może być zgodny z badaniami nad szerokimi organizmami.Ponieważ zarodki są delikatne po leczeniu wysokim poziomem chlorynu, wymagana jest znaczna praktyka, zanim będzie można skutecznie wyizolować blastomer. Demonstracja wizualna pozwoli lepiej zrozumieć, w jaki sposób należy obchodzić się z kapilarnością podczas metod izolacji blastomerów. Na początek zważ 10 miligramów kulek polistyrenowych modyfikowanych karboksylanem w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówki.Dodaj jeden mililitr buforu MES do probówki do umycia. Obracaj rurkę, aby wymieszać koraliki. Wiruj probówkę przez 60 sekund w temperaturze 2000XG za pomocą wirówki stołowej.Odrzucić supernatant, ostrożnie odpipetowując bufor. Ponownie umyj kulki jednym mililitrem bufora MES. Po przepłukaniu dodać do probówki jeden mililitr buforu MES zawierającego 10 miligramów EDAC, aby aktywować powierzchniowe grupy karboksylowe.Obracaj rurkę, aby wymieszać koraliki. Obracać i inkubować probówkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Obracaj koraliki przez 60 sekund w temperaturze 2000XG.Odrzucić supernatant ostrożnie odpipetując bufor i przemyć jednym mililitrem PBS. Odwiruj rurkę, aby wymieszać kulki i powtórz pranie PBS jeszcze raz. Przygotować jeden mililitr jednej, 10, 100 i tysiąckrotnej serii rozcieńczeń Rhodamine Red-X z 0,65 mililitra roztworu podstawowego Rhodamine Red-X.Pippette 20 mikrolitrów kulek do każdej seryjnej probówki do rozcieńczania. Obracać i inkubować probówki przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umyj koraliki dwukrotnie jednym mililitrem PBS.Po umyciu dodaj jeden mililitr PBS do probówek i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do sześciu tygodni. Sprawdź intensywność fluorescencji kulek pod mikroskopem używanym do obrazowania na żywo. Trzymaj każdy koniec mikrokapilary o pojemności 10 mikrolitrów prawą i lewą ręką.Pociągnij mikrokapilę w kierunku obu końców, aby wywrzeć napięcie i przesuń środek kapilary nad palnik, aby utworzyć dwie ręcznie ciągnięte kapilary. Pod mikroskopem preparacyjnym przytnij końcówki ręcznie naczyń włosowatych za pomocą kleszczy. Spraw, aby oba rozmiary otworów końcówki były około dwa razy większe niż krótsza długość dostępu zarodków C-Elegance odpowiednio do transferu zarodków i usuwania skorupki jaja.Podłącz wyciągniętą kapilarnę do aparatu do pipetowania jamy ustnej. Pippette 45 mikrolitrów roztworu soli jaj na studzienkę szkiełka wielostudziennego. Umieść od pięciu do 10 dorosłych C-Elegance na studni.Aby uzyskać wczesną C-Elegance, zarodki tną dorosłe osobniki na kawałki, umieszczając dwie igły po prawej i lewej stronie ciała C-Elegance i przesuwając igły obok siebie. Pipetę wlać 45 mikrolitrów roztworu podchlorynu do studzienki obok studni zawierającej roztwór soli jajecznej i wylać 45 mikrolitrów pożywki Sheltona na kolejne trzy dołki. Przenieś zarodki w jednym stadium komórkowym i wczesne zarodki w stadium dwukomórkowym do roztworu podchlorynu za pomocą pipety doustnej z większym otworem i odczekaj od 40 do 55 sekund.Umyj zarodki, przenosząc je do kolejnych trzech dołków za pomocą pożywki Sheltona. Z jedną do dwóch sekund w każdym z pierwszych dwóch dołków. Korzystając z ręcznie narysowanej kapilary z otworem o mniejszym rozmiarze, ostrożnie powtórz pipetowanie zarodka w celu usunięcia skorupki jaja.Następnie w sposób ciągły pipetuj ręcznie narysowaną kapilarą, aby oddzielić blastomery embrionalne w stadium dwukomórkowym. Po usunięciu skorupki jaja zminimalizuj siłę podczas pippetowania zarodków w górę iw dół, aby zapobiec pęknięciu. Przygotuj komorę obrazowania, umieszczając szkiełko nakrywkowe na uchwycie szkiełka nakrywkowego i zaklej krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby je ustabilizować.Odwróć uchwyt szkiełka nakrywkowego i narysuj okrąg na szkiełku nakrywkowym za pomocą hydrofobowego pisaka. Dodaj pożywkę wzrostową Sheltona do okręgu narysowanego przez marker hydrofobowy i przenieś wyizolowany blastomer do komory obrazowania w okręgu. Teraz nałóż niewielką objętość chemicznie funkcjonalizowanych kulek na szkiełko nakrywkowe za pomocą ręcznie rysowanej kapilary z większym otworem.Kontroluj położenie koralików, w ręcznie rysowaną kapilę, aż koraliki przyczepią się do izolowanego blastomeru. Zamontuj szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć parowania pożywki i wykonaj obrazowanie na żywo za pomocą odwróconego mikroskopu. W tym badaniu sygnał fluorescencyjny z kulki potraktowanej 0,005 mikrograma na mililitr estru sukcynimidylu Rhodamine Red-X dla szczepu transgenicznego eksprymującego miozynę-2 GFP i M-cherihiston był zbyt słaby.Z drugiej strony, sygnał fluorescencyjny z kulek potraktowanych pięcioma mikrogramami na mililitr Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester był zbyt silny. Stężenie estru sukcynimidylu Rhodamine Red-X na poziomie 0,5 mikrograma na mililitr było optymalne dla tego konkretnego szczepu transgenicznego. Podczas obrazowania na żywo zidentyfikowano płaszczyznę, w której dwa centrosomy były ustawione pionowo.Płaszczyzna o kącie dodatnim lub minus 90 stopni tej płaszczyzny to płaszczyzna wrzeciona. Kąt orientacji wrzeciona względem granicy kontaktu komórka/koralik po cytokinezie pokazuje, że obie komórki potomne były przyłączone do koralika w linii, która przechodzi przez oba celowniki kontaktowe, została użyta jako orientacja kontaktowa. Trzeba się dowiedzieć, jak zarodki i skorupki jaj reagują na pewne siły zewnętrzne wywierane przez gębową pipette.Teoretycznie można badać każdą odpowiedź komórkową, na przykład specyfikację siarczanów można badać poprzez hodowlę komórek i kontakt z kulkami adhezyjnymi przez dłuższy czas. Technika ta została wykorzystana do zrozumienia mechanizmu orientacji podziału komórki zależnego od kontaktu. Filtr PTF zastosowano w celu zapobieżenia wdychaniu oparów roztworu podchlorynu przez pytki ustne.

in-vitro-reconstitution-spatial-cell-contact-patterns-with-isolated

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przedstawiamy prostą metodę rozmieszczania komórek w wybranych miejscach na podłożu. Metoda ta polega na tworzeniu wzorów komórkowych poprzez odwrócenie krzemowego chipa zawierającego wypełnione komórkami mikrownęki i dociśnięcie go do podłoża. Metoda ta stanowi nowy sposób modulowania sygnalizacji dyfuzyjnej oraz jukstakrynnej między komórkami.

Wzorowanie embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem Bio Flip Chip

Obrazowanie time-lapse trójwymiarowych kultur tkankowych umożliwia badanie zachowań migracyjnych poszczególnych komórek pochodzących z wyniesienia zwojowego w reakcji na frakcjonowany ekstrakt białkowy z kory mózgu.

Zachowanie migracyjne komórek generowanych w kulturach eminencji zwojowej

Ten film przedstawia metodę izolowania blastomerów C. elegans z wczesnych zarodków. Otrzymane komórki nadają się do hodowli komórkowej lub eksperymentów ex vivo.

C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie blastomerów: metoda usuwania skorupki jaja i dysocjacji komórek embrionalnych

Opisujemy tutaj poprawiony protokół dla hodowli na dużą skalę embrionalnych komórek C. elegans. Embrionalne komórki C. elegans hodowane in vitro przy użyciu tej metody wydają się różnicować i rekapitulować ekspresję genów w sposób specyficzny dla komórki. Techniki, które wymagają bezpośredniego dostępu do komórek lub izolacji określonych typów komórek z innych tkanek, mogą być stosowane na komórkach hodowanych przez C. elegans.

Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans

Zgłaszamy urządzenie i nową metodę badania komórek i embrionów. Pojedyncze komórki są precyzyjnie uporządkowane w układach mikrownękowych. Ich uwięzienie w 3D jest krokiem w kierunku środowisk 3D spotykanych w warunkach fizjologicznych i umożliwia orientację organelli. Kontrolując kształt komórki, ta konfiguracja minimalizuje zmienność zgłaszaną w standardowych testach.

Porządkowanie pojedynczych komórek i pojedynczych zarodków w zamknięciu 3D: nowe urządzenie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości

Opracowaliśmy protokół do generowania agregatów embrionalnych komórek macierzystych myszy, które wykazują samoorganizację, łamanie symetrii i wydłużanie równolegle do rozwoju osiowego. Technika ta pozwala na badanie osiowych procesów rozwojowych i generowanie typów komórek, które w innym przypadku są trudne do wykonania w hodowli jednowarstwowej.

Generowanie agregatów embrionalnych komórek macierzystych myszy, które wykazują łamanie symetrii, polaryzację i emergentne zachowania zbiorowe in vitro

Tutaj pokazano, jak śledzić i określać ilościowo procesy rozwojowe u C. elegans. Przedstawione metody oparte są na narzędziach open-source, które można łatwo wdrożyć. Pokazano, jak rekonstruować modele 3D w kształcie komórki, jak ręcznie śledzić struktury subkomórkowe i jak analizować korowy przepływ skurczowy.

Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Montaż i ustawienie wrzeciona mitotycznego zależy od połączonych sił generowanych przez dynamikę mikrotubul, białka motoryczne i sieciery. Tutaj przedstawiamy nasze ostatnio opracowane metody, w których geometryczne uwięzienie sferycznych kropelek emulsji jest wykorzystywane do odtworzenia od dołu do góry podstawowych wrzecion mitotycznych.

Rekonstytucja podstawowych wrzecion mitotycznych w sferycznych kropelkach emulsji

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje mikrowzorce wraz z obrazowaniem ilościowym, aby ujawnić organizację przestrzenną w kulturach ssaków. Technika ta jest łatwa do wdrożenia w standardowym laboratorium biologii komórki i oferuje elastyczny system do badania wzorców in vitro.

Mapowanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej komórek ssaków za pomocą mikrowzorców i obrazowania ilościowego

Ligandy macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być wzorowane na hydrożelach poliakrylamidowych, aby umożliwić hodowlę ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w zamkniętych koloniach na podatnych podłożach. Metodę tę można połączyć z mikroskopią sił trakcyjnych i testami biochemicznymi w celu zbadania wzajemnych zależności między geometrią tkanki, siłami generowanymi przez komórkę i specyfikacją losu.

Modelowanie geometrii kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na podatnych podłożach w celu kontrolowania mechaniki na poziomie tkankowym

Poznaj metodę rekonstrukcji przestrzennych wzorców kontaktu komórek z blastomerami zarodkowymi Caenorhabditis elegans i adhezyjnymi kulkami polistyrenowymi. Technika ta pozwala badać zależności między sygnałami kontaktowymi a zachowaniem komórkowym.

Rekonstrukcja in vitro przestrzennych wzorców kontaktu komórek z izolowanymi blastomerami zarodkowymi Caenorhabditis elegans i adhezyjnymi kulkami polistyrenowymi (Wideo) | JoVE Journal

Rekonstrukcja in vitro przestrzennych wzorców kontaktu komórek z izolowanymi blastomerami zarodkowymi Caenorhabditis elegans i adhezyjnymi kulkami polistyrenowymi

Przeglądaj więcej filmów