Subkomórkowe frakcjonowanie pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej w celu monitorowania transportu białek jądrowych/cytoplazmatycznych

Opracowanie technik badania transportu makrocząsteczek między jądrem a cytoplazmą oraz identyfikacja nieprawidłowej lokalizacji białek supresorowych nowotworu jest niezbędne do głębszego zrozumienia patogenezy PBL i pomocy w opracowaniu nowych terapii. Protokół ten zapewnia szybką i wydajną metodę generowania frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych z pierwotnych komórek CLL. Frakcje te mogą być wykorzystywane w dalszych eksperymentach, w tym w testach aktywności enzymatycznej, analizie proteomicznej i western blot.

Technika ta poszerzy naszą wiedzę na temat tego, w jaki sposób terapie i sygnały mikrośrodowiskowe w guzach zmieniają transport białek między jądrem a cytoplazmą w komórkach PBL i potencjalnie innych nowotworach złośliwych komórek B. Metoda ta może być stosowana do określania lokalizacji białek i/lub przyciągania ruchu białek, w zależności od przypadku. Wykonaj gradient detergentu na każdej pojedynczej linii komórkowej, której planujesz użyć, aby zapewnić optymalne wytwarzanie wysoko wzbogaconych frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych.

Obok Jodie Hay i Michaela Molesa, tę procedurę zademonstruje Jennifer Cassels, technik z mojego laboratorium. Pobrać próbki krwi obwodowej od pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową, którzy wcześniej wyrazili zgodę, w probówkach do pobierania krwi EDTA, wraz z liczbą białych krwinek. Próbki krwi ludzkiej należy uznać za niebezpieczne, ponieważ mogą zawierać wirusy przenoszone przez krew.

Upewnij się, że próbki te są obsługiwane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej i że użytkownik przez cały czas nosi fartuch laboratoryjny i rękawice. Materiały skażone krwią należy utylizować w środkach dezynfekujących. Jeśli liczba białych krwinek jest równa lub większa niż 40 milionów komórek na mililitr, rozcieńczyć próbkę w stosunku jeden do jednego za pomocą buforu do płukania RT CLL.

Następnie podwielokrotną pożywkę gradientu gęstości RT do stożkowej probówki wirówkowej o odpowiedniej wielkości dla próbki. Ostrożnie ułożyć próbkę warstwami na wierzchu pożywki i odwirować przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura delikatnie zbierz białą warstwę komórek jednojądrzastych, które zebrały się na granicy faz pożywki o gradiencie gęstości w buforze płuczącym CLL. Przenieś tę izolowaną monowarstwę do świeżej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów.

Aby umyć komórki, dodaj 40 mililitrów buforu płuczącego CLL do tej monowarstwy i odwiruj przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzuć supernatant, przesuń dolną część probówki, aby ponownie zawiesić osad i powtórz to pranie. Wyrzuć supernatant, ponownie przesuń dno probówki, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w ustalonej objętości buforu płuczącego CLL, w zależności od wielkości osadu.

Po zliczeniu komórek i po zastosowaniu cytometrii przepływowej w celu sprawdzenia czystości komórek, należy umieścić komórki na płytkach do hodowli tkankowych o wymaganej gęstości komórek, gotowych do stymulacji lub leczenia farmakologicznego. Po stymulacji i/lub leczeniu farmakologicznym inkubacja jest zakończona. Przenieś komórki do indywidualnie oznakowanych 1,5-mililitrowych probówek do mikrofuge i osadzaj przez wirowanie w temperaturze 200 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze lodowatego PBS z inhibitorami fosfatazy. Wirować przy 200 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i przechowywać te granulki ekstraktu z całych komórek na lodzie do dalszych przygotowań.

Aby przygotować frakcje cytoplazmatyczne, delikatnie ponownie zawiesić granulki komórek w 50 mikrolitrach 1x buforu hipertonicznego. Aby komórki pęczniały, inkubuj je na lodzie przez 15 minut. Po wykonaniu gradientu detergentu w celu określenia optymalnego stężenia detergentu do użycia dla określonego typu ogniwa, dodaj 0,8 do 2,5 mikrolitra detergentu do każdej próbki i wiruj na najwyższym ustawieniu przez 10 sekund.

Aby zweryfikować lizę komórek, obserwuj je pod mikroskopem kontrastu fazowego przed i po dodaniu detergentu. Wszystkie komórki mają gęste, ciemne jądro otoczone cytoplazmą, która wygląda jak jasne halo. Po lizie próbki należy odwirować w temperaturze 14 000 x g przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Ostrożnie, nie naruszając osadu, przenieś supernatant do wstępnie schłodzonej, znakowanej probówki z mikrodymką i przechowuj tę frakcję cytoplazmatyczną w temperaturze 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy. Zapewnić całkowite usunięcie frakcji cytoplazmatycznej, aby zapobiec zanieczyszczeniu frakcji jądrowej. Do pozostałej osadki, która zawiera frakcję jądrową, dodać 50 mikrolitrów kompletnego buforu do lizy i ponownie zawiesić, pipetując w górę iw dół.

Aby rozpuścić białka związane z błoną jądrową, dodaj 2,5 mikrolitra detergentu, wiruj na najwyższym ustawieniu przez 10 sekund i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Wirować na najwyższym ustawieniu przez 30 sekund i odwirować. Następnie przenieś supernatant do wstępnie schłodzonej, znakowanej probówki do mikrofugi i przechowuj tę frakcję jądrową w temperaturze 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy.

W przypadku lizatów z całych komórek ponownie zawiesić granulki ekstraktu z całych komórek w 100 mikrolitrach kompletnego buforu do lizy, pipetując w górę iw dół. Aby zapewnić całkowitą lizę komórek, dodaj pięć mikrolitrów detergentu i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Wirować na najwyższym ustawieniu przez 30 sekund, a następnie wirować przy 14 000 x g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przenieś supernatant do wstępnie schłodzonej probówki do mikrofuge i przechowuj cały lizat komórkowy w temperaturze 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy. Aby określić ilościowo transport białek między frakcjami jądrowymi i cytoplazmatycznymi, należy przeprowadzić ilościową analizę western blot i zaimportować obrazy. Aby wyświetlić obraz na wstążce Obraz, kliknij przycisk Wybierz w grupie Wyświetlanie i kliknij Kanał Chemi.

Otworzy się okno dialogowe Wybierz wyświetlanie, aby w razie potrzeby umożliwić dalsze regulacje. Zaimplementuj dodatkowe ulepszenia za pomocą regulowanych suwaków na karcie obrazu LUT, w tym jasność lub kontrast. Użyj karty Krzywe, aby uzyskać dokładniejsze korekty.

W przypadku analizy danych najpierw kliknij wstążkę Analiza. Aby przeanalizować tylko jeden kanał, odznacz kanały, które nie są analizowane, klikając miniaturę kanału Nie pokazuj kanału, pozostawiając wyświetlany tylko żądany kanał. Aby określić ilościowo intensywność sygnału, kliknij przycisk Dodaj prostokąt, aby dodać prostokąty do obrazu.

Kliknij środek elementu, takiego jak pasmo białka, aby umieścić wokół niego prostokąt. Po dodaniu żądanych kształtów kliknij przycisk Wybierz, aby powrócić kursorem do narzędzia do zaznaczania. Aby odjąć szum tła, kliknij pierwszy przycisk w grupie Tło i wybierz opcję Mediana z menu rozwijanego.

Ustaw szerokość obramowania na trzy w oknie dialogowym Tło i wybierz segmenty, które najlepiej reprezentują tło obrazu, które ma być używane do obliczania tła. Aby wyeksportować dane, kliknij kartę Kształty nad tabelą. W przypadku densytometrii wymagane są wartości w kolumnie Sygnał.

Sygnał to suma wartości intensywności pikseli lub suma dla kształtu pomniejszona o iloczyn tła w obszarze. Następnie kliknij przycisk Raport, kliknij Zapisz jako lub Uruchom arkusz kalkulacyjny. Aby obliczyć znormalizowane wyrażenie białka będącego przedmiotem zainteresowania dla każdej płaszczyzny lub zmiennej w zapisanym arkuszu kalkulacyjnym, należy podzielić uzyskany sygnał dla białka będącego przedmiotem zainteresowania przez sygnał dla odpowiedniego pasma kontrolnego obciążenia białka.

Aby wyeksportować obraz, kliknij kartę Obrazy znajdującą się nad tabelą, a następnie kliknij obraz, który chcesz wyeksportować. Jeśli używasz obrazu do prezentacji slajdów lub innych formatów cyfrowych, kliknij ikonę oprogramowania, najedź kursorem na Eksportuj, kliknij Obraz do multimediów cyfrowych, a następnie zapisz obraz zgodnie z wymaganiami. Wzbogacanie komórek PBL o WCC większe niż 40 milionów na mililitr za pomocą wirowania o dużej gęstości umożliwia wysoki odzysk komórek.

Analiza próbki za pomocą cytometrii przepływowej po bramkowaniu na FSC i SSC ujawnia, że czystość komórek CLL wynosi ponad 95%, na co wskazuje podwójna ekspresja powierzchniowa markerów komórkowych CLL, CD19 i CD5. Gdy przeprowadzono immunobloty na wynikowych frakcjach linii komórkowej CLL, Mac-1 i pierwotnych komórkach CLL, frakcjonowanie wykazało, że optymalny poziom detergentu dla komórek Mac-1 wynosił od jednego do 60 rozcieńczeń, w porównaniu z 1 do 30 dla pierwotnych komórek CLL. Gdy określono subkomórkową lokalizację FOXO1 we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych w komórkach Mac-1 i pierwotnych CLL, wytwarzanie wysoce wzbogaconych frakcji wykazano przez prawie wyłączną ekspresję laminy we frakcjach jądrowych i beta tubuliny we frakcjach cytoplazmatycznych.

Ekspresja FOXO1 była zmniejszona w cytoplazmie po leczeniu AZD 8055 w porównaniu z NDC, czemu towarzyszył wzrost ekspresji FOXO1 w kompartmencie jądrowym, wykazując w ten sposób translokację białka. Po ilościowym określeniu pojedynczych blotów immunologicznych z pięciu pierwotnych próbek PBL we frakcjach subkomórkowych stwierdzono, że AZD 8055 zmniejsza poziomy ekspresji FOXO1 w cytoplazmie i zwiększa ekspresję w jądrze. Sieciowanie BCR zwiększyło cytoplazmatyczną ekspresję FOXO1.

Pamiętaj, aby wszystkie odczynniki i próbki przechowywać na lodzie, aby zapobiec degradacji białek. Frakcje subkomórkowe wygenerowane w tej procedurze mogą być również wykorzystane w testach aktywności enzymatycznej, takich jak test aktywności FOXO, który umożliwia narysowanie paraleli między lokalizacją komórkową FOXO1 a jego aktywnością wiązania DNA. Opracowanie tej techniki umożliwiło nam zajęcie się transportem określonych białek w komórkach PBL w odpowiedzi na selektywne inhibitory i wspiera nasze równoległe badania immunofluorescencyjne w celu wygenerowania solidnego i wymiernego zestawu danych.