Name: Subkomórkowe frakcjonowanie pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej w celu monitorowania transportu białek jądrowych/cytoplazmatycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Poznaj metodę subkomórkowego frakcjonowania komórek CLL do badania transportu białek między jądrem a cytoplazmą. Technika umożliwia analizę lokalizacji białek i ich przemieszczania w odpowiedzi na leczenie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Natashy Malik za krytyczną recenzję manuskryptu. Badanie to zostało sfinansowane z grantu w ramach projektu Bloodwise przyznanego AMM (18003). Osprzęt analityczny FACS został sfinansowany przez Fundację Howat. MWM zostało sfinansowane ze stypendium doktoranckiego z Friends of Paul O'Gorman Leukaemia Research Centre, JC zostało sfinansowane przez Friends of Paul O'Gorman Leukaemia Research Center, a JH zostało sfinansowane z grantu projektu Bloodwise (18003).

Opisane tutaj użycie pierwotnych próbek od pacjentów z PBL zostało zatwierdzone przez West of Scotland Research Ethics Service, NHS Greater Glasgow and Clyde (UK) i wszystkie prace zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.
1. Izolacja komórek PBL z próbek krwi pacjenta
<ol>
	<li>Próbki krwi obwodowej od pacjentów, którzy wcześniej wyrazili zgodę na PBL, są odbierane z kliniki w probówkach do pobierania krwi EDTA, wraz z morfologią białych krwinek (WCC). Oczyść próbki CLL krwi obwodowej zgodnie z WCC. W przypadku WCC <40 x 10 6 komórek/ml przejdź do kroku 1.1.1; w przypadku WCC ≥40 x 10 6 komórek/ml przejdź do kroku 1.1.2.
	<ol>
		<li>Wlej zawartość wszystkich probówek z krwią EDTA do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dodaj 50 μl koktajlu wzbogacającego ludzkie komórki B na 1 ml krwi. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut. Przejdź do kroku 1.1.2.</li>
		<li>Rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:1 buforem do przemywania RT CLL (sól buforowana fosforanami (PBS), 0,5% płodowa surowica bydlęca (FBS) i 2 mM EDTA).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podwielokrotność pożywki o gradiencie gęstości RT do stożkowej probówki wirówkowej o odpowiedniej wielkości dla próbki (10 ml do probówki o pojemności 50 ml na 30 ml próbki lub 4 ml do probówki o pojemności 15 ml na 10 ml próbki).</li>
	<li>Ostrożnie ułożyć próbkę warstwowo na pożywce o gradiacji gęstości i odwirować przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze RT. 
	nuta: Upewnij się, że wirówka ma temperaturę toczną przed umieszczeniem próbek w wirówce, ponieważ zmiana temperatury spowoduje słabe wzbogacenie komórek jednojądrzastych i wyłącz hamulec wirówki, ponieważ nagłe hamowanie może zakłócić granicę faz cieczy.</li>
	<li>Delikatnie zebrać białą warstwę komórek jednojądrzastych, które gromadzą się na granicy pożywki gradientu gęstości i buforu płuczącego CLL, do świeżej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą plastikowej pipety Pasteura.</li>
	<li>Dodać 40 ml buforu płuczącego CLL do izolowanej monowarstwy w celu przepłukania komórek i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze suchej masy.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad, przesuwając dno probówki, a następnie powtórzyć etap płukania opisany w kroku 1.5.</li>
	<li>Wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad zgodnie z opisem w kroku 1.6, a następnie ponownie zawiesić osad w ustalonej objętości buforu do płukania CLL (do 40 ml, w zależności od wielkości osadu komórkowego).</li>
	<li>Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. Następnie przystąp do cytometrii przepływowej, aby sprawdzić czystość komórek CLL. 
	nuta: Na tym etapie komórki PBL mogą być hodowane w stężeniu 10 x 106 komórek/ml w pożywce do wykorzystania w eksperymentach i/lub kriokonserwowane w 10% dimetylosulfotlenku (DMSO)/FBS do przyszłych prac w stężeniach do 100 x 10,6 komórek/fiolkę.</li>
</ol>
2. Cytometria przepływowa komórek PBL
<ol>
	<li>Oznaczyć rurki polistyrenowe z okrągłym dnem o wymiarach 12 mm x 75 mm zgodnie z opisem w tabeli 1.</li>
	<li>W tubkach 2 – 5 umieść jedną kroplę kulek kompensacyjnych i przechowuj na lodzie. Dodać 1 μl odpowiedniego przeciwciała (anty-CD5, CD19, CD23 lub CD45, jak wskazano w tabeli 1) do probówek 2–5 i inkubować na lodzie przez 20 minut, chroniąc przed światłem, umieszczając folię aluminiową na wiadrze z lodem. 
	nuta: Rurki te służą jako elementy sterujące kompensacją do ustawiania matrycy cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Umieścić do 1 x 106 komórek CLL w probówkach 1, 6 i 7, dodać 2 ml buforu FACS (PBS + 2% FBS) do każdej probówki i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu przepłukania komórek. Odrzucić sklarowany osad i przechowywać probówki zawierające osady komórkowe na lodzie.
	<ol>
		<li>Zawiesić osady komórkowe i dodać odpowiednią kombinację przeciwciał do komórek w probówce 7, zgodnie z instrukcjami w tabeli 1, w końcowej objętości 100 μl z buforem FACS. Przeciwciała stosuje się w odpowiednim stężeniu zgodnie z wytycznymi producenta.</li>
		<li>Zawiesić osady komórek w probówkach 2 i 6 w 100 μl buforu FACS.</li>
		<li>Inkubować komórki na lodzie, wraz z barwionymi kulkami w probówkach 2 – 5, chronić przed światłem przez 20 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po inkubacji dodać 2 ml buforu FACS do wszystkich probówek i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu przemycia komórek. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki/komórki, delikatnie przesuwając probówki.</li>
	<li>Ponownie zawiesić probówki 1 - 5 w 100 μl buforu FACS i umieścić na lodzie, aż będą gotowe do analizy na cytometrze przepływowym.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór DAPI do 0,05-0,2 μg/ml w buforze FACS bezpośrednio przed użyciem. Optymalne stężenie może się różnić i zalecane jest miareczkowanie.</li>
	<li>Zawiesić probówki 6 i 7 w 100 μl rozcieńczonego roztworu DAPI i inkubować probówki na lodzie przez co najmniej 5 minut, aby umożliwić zabarwienie komórek. 
	nuta: Nie jest konieczne dalsze mycie, ponieważ DAPI musi być obecny w buforze, aby martwe komórki pozostały oznakowane. Po dodaniu DAPI komórki należy przeanalizować na cytometrze przepływowym w ciągu 4 godzin.</li>
	<li>Analizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego.</li>
</ol>
3. Przygotowanie frakcji subkomórkowych z komórek PBL
UWAGA: Planując przygotowanie eksperymentu, uwzględnij studzienkę z niestymulowanymi/nieleczonymi komórkami, z których można wygenerować ekstrakt z całych komórek.
<ol>
	<li>Przeprowadzić pożądaną stymulację i/lub leczenie farmakologiczne linii komórkowej CML1 PBL lub izolowanych pierwotnych komórek PBL, używając 10 – 20 x 106 komórek/warunek. Komórki zostaną następnie wykorzystane do frakcjonowania subkomórkowego (kroki 3.4 i 3.5) lub do wytworzenia ekstraktu z całych komórek (krok 3.6).</li>
	<li>Przygotowanie roztworów/probówek: Przygotować wszystkie roztwory/na świeżo w dniu frakcjonowania, przed zebraniem komórek. Roztwory należy przechowywać na lodzie do momentu, gdy będą potrzebne i zużyć w ciągu 4 godzin od przygotowania.
	<ol>
		<li>Roztwór inhibitora fosfatazy/PBS: Przygotować inhibitory fosfatazy w PBS, rozcieńczając inhibitory fosfatazy w stosunku 1:20 w 1x PBS (tj. 0,5 ml inhibitorów fosfatazy w 9,5 ml 1x PBS). 
		nuta: Upewnij się, że inhibitory fosfatazy nie wytrąciły się. Jeśli obecny jest osad, podgrzewać do 50 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Bufor hipotoniczny: Przygotuj 1x bufor hipotoniczny wykonując rozcieńczenie 1:10 10x buforu hipotonicznego w wodzie destylowanej (tj. 50 μl 10x buforu hipotonicznego na 450 μ l dH2O).</li>
		<li>10 mM ditiotreitol (DTT): Przygotować 10 mM DTT, rozcieńczając 1M DTT wodą destylowaną w stosunku 1:100 (tj. 10 μL 1 M DTT w 990 μL dH2O). 
		nuta: Naziemna telewizja cyfrowa jest bardzo labilna, więc za każdym razem przygotuj ją na świeżo. Unikaj powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania.</li>
		<li>Kompletny bufor do lizy: Określ, ile buforu jest wymagane dla każdego eksperymentu. Każda próbka wymaga 50 μl pełnego buforu do lizy, więc dodaj 5 μl 10 mM DTT (krok 3.2.3) do 44,5 μl buforu do lizy, a następnie dodaj 0,5 μl koktajlu inhibitorów proteazy. Ilość tę można skalować w górę w zależności od liczby próbek w eksperymencie.</li>
		<li>Oznaczyć cztery zestawy probówek do mikrofug o pojemności 1,5 ml dla każdej stymulacji i/lub leczenia farmakologicznego dla świeżo stymulowanych komórek (krok 3.3), świeżo wygenerowanych frakcji cytoplazmatycznych (krok 3.4.3), świeżo wygenerowanych frakcji jądrowych (krok 3.5.3) i lizatów całych komórek (krok 3.6.3). Wstępnie schłodź te rurki do mikrofuge na lodzie, aż będą potrzebne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść komórki do indywidualnie znakowanych probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i osadu przez odwirowanie w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml lodowatego PBS/inhibitorów fosfatazy (etap 3.2.1). Osadzać komórki przez odwirowanie w sile 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i utrzymać granulki komórek na lodzie.</li>
	<li>Przygotowanie frakcji cytoplazmatycznych: Delikatnie ponownie zawiesić granulki komórkowe, które mają być użyte do frakcjonowania subkomórkowego, w 50 μL 1x hipotonicznego buforu (krok 3.2.2). Inkubować komórki na lodzie przez 15 minut, aby umożliwić komórkom pęcznienie. 
	nuta: Objętość zastosowanego buforu hipotonicznego można zwiększyć empirycznie w zależności od liczby komórek.
	<ol>
		<li>Dodaj 0,8 - 2,5 μl (1:20 do 1:60) detergentu do każdej próbki i wiruj na najwyższym ustawieniu przez 10 sekund.
		<ol>
			<li>Aby określić optymalne stężenie detergentu, który należy zastosować dla określonego typu komórki w celu wyizolowania frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych, należy najpierw wykonać gradient detergentu. Zakres od 1:20 do 1:60 (tj. 2,5 μl do 0,8 μl detergentu w 50 μl buforu hipotonicznego) powinien być wystarczający. 
			UWAGA: Jeśli objętość buforu hipotonicznego w kroku 3.4 zostanie dostosowana, upewnij się, że zachowane są odpowiednie proporcje detergentu.</li>
			<li>Sprawdź lizę komórek, obserwując je za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym przed i po dodaniu detergentu. Całe komórki wydają się większe z gęstym, ciemnym jądrem. Cytoplazma pojawi się jako jasne halo wokół jądra. 
			nuta: Właściwa liza jest dodatkowo potwierdzana przez zastosowanie Western blot do analizy określonych białek w zlizowanych frakcjach generowanych z gradientu detergentu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po lizie próbki należy odwirować w temperaturze 14 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie przenieść supernatant do wstępnie schłodzonej, oznakowanej probówki do mikrofuge. Ta frakcja cytoplazmatyczna może być przechowywana w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebna do dalszej analizy. Pozostała osadka zawiera frakcję jądrową (krok 3.5). 
		nuta: Należy unikać powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie frakcji jądrowych: Zawiesić każdą osadkę jądrową w 50 μl pełnego buforu do lizy (etap 3.2.4), pipetując w górę i w dół. 
	nuta: Objętość pełnego buforu do lizy można dostosować empirycznie zgodnie z początkową liczbą komórek.
	<ol>
		<li>Dodać 2,5 μl detergentu, aby rozpuścić białka związane z błoną jądrową i wirować na najwyższym ustawieniu przez 10 s. Próbki inkubować na lodzie przez 30 minut.</li>
		<li>Wirować na najwyższym ustawieniu przez 30 s, a następnie odwirować próbki o stężeniu 14 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść supernatant do wstępnie schłodzonej, oznakowanej probówki do mikrofiltracji. Ta frakcja jądrowa może być przechowywana w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebna do dalszej analizy. 
		nuta: Należy unikać powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otrzymywanie lizatów pełnokomórkowych (WCL) z komórek CLL 
	nuta: Przygotowanie ekstraktu z całych komórek można przeprowadzić w tym samym czasie, co przygotowanie frakcji jądrowych (krok 3.5).
	<ol>
		<li>Zawiesić granulki ekstraktu z całych komórek w 100 μl kompletnego buforu do lizy (przygotowanego w kroku 3.2.4), pipetując w górę i w dół, a następnie dodać 5 μl detergentu, aby zapewnić całkowitą lizę komórek. Próbki należy inkubować na lodzie przez 30 minut.</li>
		<li>Wirować na najwyższym ustawieniu przez 30 s, a następnie odwirować próbki o stężeniu 14 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść supernatant do wstępnie schłodzonej probówki do mikrofuge. Ten lizat całego ogniwa może być przechowywany w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebny do dalszej analizy. 
		nuta: Należy unikać powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania próbek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Dalsza analiza frakcji subkomórkowych
UWAGA: W tym protokole, analiza wygenerowanych frakcji komórkowych została przeprowadzona za pomocą Western blotting przy użyciu standardowych protokołów, ładując równą liczbę komórek/linię (co odpowiada ~10 μg białka) dla frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych.
<ol>
	<li>Kwantyfikacja transportu białek między frakcjami jądrowymi i cytoplazmatycznymi: Wykonaj ilościową analizę Western blot poprzez kwantyfikację intensywności sygnału lub densytometrię przy użyciu bezpłatnego oprogramowania do analizy Western blot.</li>
	<li>Importowanie obrazów: Obrazy Western blot wygenerowane za pomocą różnych instrumentów wywoływania muszą być importowane jako pliki JPG, PNG lub TIFF. Zalecany jest plik RAW o 16-bitowej głębi. Aby zaimportować obraz, kliknij ikonę oprogramowania i najedź kursorem na Importuj. Następnie kliknij Obrazy innych firm. Wybierz plik obrazu i kliknij przycisk Otwórz.</li>
	<li>Wyświetlanie obrazu: Na wstążce Obraz kliknij przycisk Wybierz w grupie Wyświetlanie. Otworzy się okno dialogowe Dostosuj wyświetlanie, aby w razie potrzeby umożliwić dalsze regulacje. Zaimplementuj dodatkowe ulepszenia, w tym jasność lub kontrast, za pomocą regulowanych suwaków na karcie Image LUTs. Użyj karty Krzywe, aby uzyskać dokładniejsze korekty.</li>
	<li>Analiza danych (usunięcie wyboru kanału): Kliknij wstążkę Analiza. Aby przeanalizować tylko jeden kanał, usuń zaznaczenie kanałów, które nie są analizowane. Kliknij miniaturę kanału Nie pokazuj kanału w tablicach LUT obrazu, pozostawiając wyświetlany tylko żądany kanał. Obrazy importowane jako pliki JPG, PNG lub TIFF mogą wymagać odznaczenia wielu niechcianych kanałów RGB.
	<ol>
		<li>Dodawanie kształtów: Aby określić ilościowo intensywność sygnału, kliknij przycisk Dodaj prostokąt, aby dodać prostokąt do obrazu. Kliknij środek obiektu (np. pasma białka), aby umieścić wokół niego prostokąt. Alternatywnie, aby ręcznie narysować kształt, wybierz opcję Rysuj prostokąt. Po dodaniu wszystkich żądanych kształtów kliknij przycisk Wybierz, aby powrócić kursorem do narzędzia do zaznaczania. 
		nuta: Dodaj wiele kształtów w kolejności logicznej, ponieważ dane są sortowane według numeru identyfikacyjnego, który jest generowany sekwencyjnie.</li>
		<li>Odejmowanie tła: Aby odjąć szum tła, kliknij pierwszy przycisk w grupie Tło i wybierz opcję Mediana z menu rozwijanego. Ustaw szerokość obramowania na 3 w oknie dialogowym Tło i wybierz segmenty, które mają być używane do obliczania tła. Wybierając segmenty, które mają być używane, wybierz segmenty, które najlepiej reprezentują tło obrazu. 
		nuta: Szum tła może wpływać na kwantyfikację sygnału, dlatego należy go odjąć, aby dokładnie obliczyć sygnał z kształtów będących przedmiotem zainteresowania.</li>
		<li>Przytnij sygnał i przytnij tło — OPCJONALNIE: Pliki importowane w formatach JPG, PNG lub TIFF mogą wykazywać nasycenie pikseli: podświetlone/jasne obszary w paśmie białkowym. Opcja Przytnij sygnał i przytnij tło (Bkgnd) usuwa nasycone piksele z analizy. Aby wyświetlić te wartości, dodaj Trim Signal i Trim Bkgnd do tabeli, klikając przycisk Columns (Kolumny) po prawej stronie widoku tabeli. 
		nuta: Nasycenie pikseli może prowadzić do niewiarygodnej kwantyfikacji. Nasycone piksele można usunąć tylko wtedy, gdy nasyconych jest mniej niż 5% pikseli w kształcie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksportowanie danych: Kliknij w kartę Kształty nad tabelą. W przypadku densytometrii wymagane są wartości w kolumnie Sygnał. Sygnał to suma wartości intensywności pikseli (Total) dla kształtu pomniejszona o iloczyn Bkgnd i Obszaru. Kliknij przycisk Zgłoś. Kliknij Zapisz jako lub uruchom Arkusz kalkulacyjny. 
	Sygnał = Razem - (Bkgnd x Obszar) 
	nuta: Karta kształtów zawiera tabelę wartości ilościowych, w tym Sygnał, Suma, Obszar i Bkgrnd.</li>
	<li>Kwantyfikacja ekspresji białka: W zapisanym arkuszu kalkulacyjnym oblicz znormalizowane wyrażenie białka będącego przedmiotem zainteresowania dla każdego pasa lub zmiennej, dzieląc uzyskany sygnał dla białka będącego przedmiotem zainteresowania przez sygnał dla odpowiedniego pasma kontrolnego obciążenia białka. 
	nuta: Porównania między ilościami znormalizowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych nie mogą być bezpośrednio porównywane ze względu na różne kontrole obciążenia stosowane do rozróżnienia frakcji jądrowej i cytoplazmatycznej. Właściwe są jednak porównania w obrębie poszczególnych frakcji, np. po leczeniu farmakologicznym.</li>
	<li>Eksportuj obraz do publikacji lub prezentacji: Kliknij kartę Obrazy znajdującą się nad tabelą, a następnie kliknij obraz, który chcesz wyeksportować. Jeśli używasz obrazu do prezentacji slajdów lub innych formatów cyfrowych, kliknij ikonę oprogramowania, najedź kursorem na Eksportuj i kliknij Obraz do multimediów cyfrowych. Zapisz obraz jako plik JPG, PNG lub TIFF, zgodnie z wymaganiami.</li>
</ol>

<ol><li>Kau, T. R., Way, J. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+transport+and+cancer%3A+from+mechanism+to+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Nuclear transport and cancer: from mechanism to intervention.</a> Nature Reviews Cancer. 4, 106-117 (2004).</li>
<li>Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+of+proteins+and+drug+resistance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer.</a> Biochemical Pharmacology. 83, 1021-1032 (2012).</li>
<li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forkhead+transcription+factors+are+critical+effectors+of+cell+death+and+cell+cycle+arrest+downstream+of+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Forkhead transcription factors are critical effectors of cell death and cell cycle arrest downstream of PTEN.</a> Molecular and Cellular Biology. 20, 8969-8982 (2000).</li>
<li>Calnan, D. R., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FoxO+code%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The FoxO code.</a> Oncogene. 27, 2276-2288 (2008).</li>
<li>Cosimo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKT%2FmTORC2+inhibition+activates+FOXO1+function+in+CLL+cells+reducing+B+cell+receptor-mediated+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">AKT/mTORC2 inhibition activates FOXO1 function in CLL cells reducing B cell receptor-mediated survival.</a> Clinical Cancer Research. 25, 1574-1587 (2019).</li>
<li>Mahipal, A., Malafa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importins+and+exportins+as+therapeutic+targets+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Importins and exportins as therapeutic targets in cancer.</a> Pharmacology & Therapeutics. 164, 135-143 (2016).</li>
<li>Hing, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+XPO1+inhibitor+shows+improved+efficacy+and+in+vivo+tolerability+in+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Next-generation XPO1 inhibitor shows improved efficacy and in vivo tolerability in hematological malignancies.</a> Leukemia. 30, 2364-2372 (2016).</li>
<li>Lapalombella, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibitors+of+nuclear+export+show+that+CRM1%2FXPO1+is+a+target+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Selective inhibitors of nuclear export show that CRM1/XPO1 is a target in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 120, 4621-4634 (2012).</li>
<li>Hořejší, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+%CE%B3-tubulin+associates+with+nucleoli+and+interacts+with+tumor+suppressor+protein+C53%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nuclear γ-tubulin associates with nucleoli and interacts with tumor suppressor protein C53.</a> Journal of Cellular Physiology. 227, 367-382 (2012).</li>
<li>McCaig, A. M., Cosimo, E., Leach, M. T., Michie, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dasatinib+inhibits+B+cell+receptor+signalling+in+chronic+lymphocytic+leukaemia+but+novel+combination+approaches+are+required+to+overcome+additional+pro-survival+microenvironmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Dasatinib inhibits B cell receptor signalling in chronic lymphocytic leukaemia but novel combination approaches are required to overcome additional pro-survival microenvironmental signals.</a> British Journal of Haematology. 153, 199-211 (2011).</li>
<li>Fischer, K., Hallek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+frontline+therapy+of+CLL+based+on+clinical+and+biological+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology.+American+Society+of+Hematology.+Education+Program%22%5BJournal%5D)">Optimizing frontline therapy of CLL based on clinical and biological factors.</a> Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2017, 338-345 (2017).</li>
<li>Butera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+autophagy+by+nuclear+GAPDH+and+its+aggregates+in+cancer+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of autophagy by nuclear GAPDH and its aggregates in cancer and neurodegenerative disorders.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20, 2062(2019).</li>
<li>Virtanen, J. A., Vartiainen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+functions+for+different+forms+of+nuclear+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Diverse functions for different forms of nuclear actin.</a> Current Opinion in Cell Biology. 46, 33-38 (2017).</li>
<li>Friedenauer, S., Berlet, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+variability+of+the+Bradford+protein+assay+in+the+presence+of+detergents%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents.</a> Analytical Biochemistry. 178, 263-268 (1989).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany protokół zapewnia szybką i wydajną metodę generowania frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych z pierwotnych komórek CLL, a następnie ilościowego oznaczania transportu białek między frakcjami jądrowymi i cytoplazmatycznymi po stymulacji komórek i leczeniu farmakologicznym. Przedstawione dane wskazują na zdolność do wykrywania transportu określonych białek, na przykład FOXO1, między frakcją jądrową i cytoplazmatyczną, po leczeniu podwójnym inhibitorem mTOR AZD8055 w obecności/braku sieciowania BCR poprzez stymulację fragmentów F(ab')2 (Figura 3 i Figura 4). Sprzężenie tych eksperymentów z kwantyfikacją Western blot z indywidualnych próbek pacjentów z PBL, umożliwia obiektywną analizę wygenerowanych danych i pokazuje solidność testu opisanego w celu ilościowego określenia globalnych zmian w lokalizacji białek w komórkach CLL wyizolowanych z kohort pacjentów (Figura 4). Z danych jasno wynika, że średnio pięć próbek pobranych od pacjentów we frakcjach cytoplazmatycznych osiągnęło bliskie istotności. Biorąc pod uwagę niejednorodność kliniczną pacjentów z PBL11, analizy te byłyby zwykle przeprowadzane na większych kohortach pacjentów i/lub koncentrowałyby się na określonych podgrupach prognostycznych pacjentów, aby uzyskać pełniejsze zrozumienie odpowiedzi komórkowej komórek PBL na określone leczenie farmakologiczne.
Przedstawione dane pokazują, jak ważny jest wybór markerów białkowych, które znajdują się wyłącznie we frakcji cytoplazmatycznej lub jądrowej, ponieważ czystość frakcjonowania zostanie potwierdzona przez te markery. Do potwierdzenia frakcji cytoplazmatycznej wybrano β-tubulinę, a jako marker jądrowy Laminę A/C. Dodatkowymi powszechnie stosowanymi białkami są GAPDH i α-tubulina do identyfikacji frakcji cytoplazmatycznej lub Brg1 (SMARCA4), TFIID i polimerazy RNA II dla czystości frakcji jądrowej 4,5. Należy jednak zachować ostrożność przy wyborze białek, które są wysoko wzbogacone w określone frakcje, a nie występują w obu frakcjach (np. γ-tubulina) (ryc. 2C)9. Rzeczywiście, GAPDH i aktyna, choć ogólnie uważane za białka cytoplazmatyczne, mogą lokalizować się w jądrze 12,13, co podkreśla znaczenie wyboru markera frakcji, który nie przemieszcza się, gdy stymulacja lub leczenie jest stosowane do komórek. Ponadto ważne jest, aby potwierdzić, że wybrany marker białkowy ulega ekspresji w komórce będącej przedmiotem zainteresowania, prowadząc WCL wraz z frakcjonowaniem subkomórkowym.
W przedstawionym reprezentatywnym doświadczeniu użyto tej samej liczby komórek PBL dla każdego stanu (stymulacja/leczenie farmakologiczne), a następnie natychmiast przygotowano próbki frakcjonowane. Obciążenie 10 μg frakcjonowanego białka/tor zapewnia wystarczający materiał do wykrycia białek będących przedmiotem zainteresowania. Ponieważ próbki te poddano jedynie krótkotrwałemu leczeniu farmakologicznemu i stymulacji (do 4 godzin), założono, że poziom białka pozostanie taki sam w każdej próbce i nie przeprowadzono testu białkowego. Jeśli jednak leczenie komórkami zostanie przedłużone (18 - 72 godziny), poziom śmierci lub proliferacji komórek w komórkach może znacząco zmienić jakość i ilość wyekstrahowanego białka, w zależności od zastosowanego leku/stymulacji komórki, zmieniając w ten sposób poziom białka w próbkach poddanych działaniu środka/stymulowanych. W takich przypadkach, w przypadku długotrwałego leczenia farmakologicznego, zaleca się przeprowadzenie kwantyfikacji białka za pomocą testu Bradforda lub równoważnego, przed Western blot, aby upewnić się, że taka sama ilość białka jest uruchamiana w każdym pasie immunoblot. Obecność detergentów może zakłócać działanie określonych testów białkowych14, interferencję tę można zmniejszyć, rozcieńczając próbki białek frakcji komórkowej. Ponadto należy użyć pełnego buforu do lizy jako próby ślepej, stosując takie samo rozcieńczenie, jak w badanych próbkach.
Aby dostarczyć dowodów potwierdzających opisane tutaj wyniki, równoległe eksperymenty można przeprowadzić przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej w celu analizy lokalizacji FOXO1 w komórkach CLL, aby umożliwić wizualizację tych wyników5. Co więcej, wygenerowane frakcje subkomórkowe mogą być również wykorzystane do oznaczania aktywności enzymatycznej lub analizy proteomicznej w dalszych analizach.

Transport makrocząsteczek między jądrem a cytoplazmą od dawna odgrywa kluczową rolę w prawidłowym funkcjonowaniu komórek i często jest deregulowany w komórkach nowotworowych1,2. Taka deregulacja może wynikać z nadekspresji/mutacji białek, które kontrolują eksport jądrowy. Jedno z takich białek, Exportin-1 (XPO1), jest receptorem transportowym, który eksportuje białka zawierające >200 jądrowy sygnał eksportowy (NES) do cytoplazmy z jądra2. Ładunki XPO1 obejmują p53, członków rodziny FOXO i IB, przyczyniając się do ich inaktywacji poprzez hamowanie ich mechanizmu działania1,2,3. Dalsza błędna lokalizacja białek może wystąpić, gdy sygnały mikrośrodowiskowe uderzają w komórki nowotworowe, prowadząc do aktywacji wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych, takich jak szlak kinazy fosfatydylo-inozytolo-3 (PI3K)/Akt, co skutkuje inaktywacją członków rodziny FOXO, a następnie eksportem z jądra4,5. Taka błędna lokalizacja białek supresorowych nowotworów jest związana z progresją wielu nowotworów hematologicznych i litych1,2,6.
Rozwój inhibitorów małocząsteczkowych do użytku klinicznego w nowotworach hematologicznych (ostra białaczka szpikowa (AML)/CLL), które wiążą się z funkcją XPO1 i selektywnie ją hamują, podkreśla znaczenie opracowania odpowiednich technik w celu rozwiązania problemu wpływu środków farmakologicznych na przemieszczanie się białek między przedziałami jądrowymi i cytoplazmatycznymi6,7,8. Techniki obrazowania znacznie się rozwinęły, umożliwiając identyfikację białek w przedziałach subkomórkowych po zewnętrznej stymulacji leczenia farmakologicznego, jednak znaczenie solidnych i wspierających technik równoległych ma kluczowe znaczenie dla wiarygodnego informowania odbiorców naukowych o wiarygodności wyników.
Limfocyty spoczynkowe i złośliwe komórki CLL-B wyizolowane z próbek krwi pacjenta stanowią wyzwanie w generowaniu frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych ze względu na wysoki stosunek jądra do cytoplazmy. Optymalizacja warunków eksperymentalnych w celu wygenerowania solidnych i wiarygodnych danych eksperymentalnych ma oczywiście kluczowe znaczenie dla planowania przyszłych programów eksperymentalnych. Opisana tutaj metoda umożliwia ilościowe określenie białek we frakcji jądrowej i cytoplazmatycznej oraz określenie, w jaki sposób stymulacja komórkowa i/lub leczenie farmakologiczne może wpływać na te białka.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Griener Bio jeden</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Pipety Pasteura</td><td>Griener Bio one</td><td>612398</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm Probówki FACS</td><td>Elkay</td><td>2052-004</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówka</td><td>Griener Bio jedna</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówka</td><td>Griener Bio jeden</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-CD5 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555352</td><td>fenotypowy marker powierzchniowy</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-CD19 PE Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557835</td><td>fenotypowy marker powierzchniowy</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-CD23 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>558690</td><td>fenotypowy marker powierzchniowy</td></tr><tr><td>anty-CD45 Przeciwciało APC Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557833</td><td>fenotypowy marker powierzchniowy</td></tr><tr><td>anty-&beta;-tubulina</td><td>Komórka Sygnalizacja</td><td>2146</td><td>marker cytoplazmatyczny</td></tr><tr><td>anty-&gamma;-tubulina Przeciwciało myszy (klon GTU-88)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T5326</td><td></td></tr><tr><td>anty-FoxO1 (C29H4) Przeciwciało królika</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2880</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-Lamina A / C</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2032</td><td>marker jądrowy</td></tr><tr><td>anty-mysi IgG, sygnalizacja komórkowa przeciwciała sprzężona z HRP</td><td></td><td>7076</td><td>Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>anty-królicze IgG, przeciwciało sprzężone z HRP</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>7074</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-Rpb1 Przeciwciało CTD (klon 4H8)</td> <td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>Marker jądrowy</td><td>2629</td></tr><tr><td>BDFACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>Na żądanie</td><td>Cytometr przepływowy</td></tr><tr><td>Rozwiązanie DAPI BD</td><td>Biosciences</td><td>564907</td><td>dyskryminator żywy/martwy</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermofisher</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6</td><td>Oprogramowanie</td><td>GraphPad Oprogramowanie</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque1077 gradient gęstości</td><td>Sigma</td><td>H8889</td><td></td></tr><tr><td>HyperPAGE 10 - 190 kDa marker białkowy</td><td>Bioline</td><td>BIO-33066</td><td>Molekularny </td></tr><tr><td>znacznik wagi Image Studio Lite (wersja 5.2.5)</td><td>Oprogramowanie LI-COR</td><td>www.licor.com</td><td></td></tr><tr><td>Labnet VX100</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Vortex</td></tr><tr><td>Nucelar Extract Kit</td><td>Active Motif</td><td>40010</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>Thermofisher</td><td>01-111-42</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Thermofisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26619</td><td>Marker masy cząsteczkowej</td></tr><tr><td>Tabletki PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep Koktajl wzbogacający ludzkie komórki B</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>15064</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sigma 3-16P</td><td>SciQuip</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td> <td>Sigma 1-15PK</td><td>SciQuip</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr></tbody></table>

subkomórkowe frakcjonowanie pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej w celu monitorowania transportu białek jądrowych/cytoplazmatycznych

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Eksport jądrowy makromolekuł jest często deregulowany w komórkach rakowych. Białka supresorowe nowotworu, takie jak p53, mogą stać się nieaktywne z powodu nieprawidłowej lokalizacji komórkowej, która zakłóca ich mechanizm działania. Przeżywalność komórek przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL), wśród innych komórek nowotworowych, jest wspomagana przez deregulację przenoszenia jądrowego do cytoplazmatycznego, przynajmniej częściowo poprzez deregulację receptora transportowego XPO1 i konstytutywną aktywację szlaków sygnałowych za pośrednictwem PI3K. Niezbędne jest zrozumienie roli poszczególnych białek w kontekście ich lokalizacji wewnątrzkomórkowej, aby lepiej zrozumieć rolę takich białek w patobiologii choroby. Co więcej, identyfikacja procesów leżących u podstaw stymulacji komórek i mechanizmu działania określonych inhibitorów farmakologicznych w kontekście subkomórkowego transportu białek zapewni pełniejsze zrozumienie mechanizmu działania. Opisany tutaj protokół umożliwia optymalizację, a następnie efektywne generowanie frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych z pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej. Frakcje te można wykorzystać do określenia zmian w transporcie białek między frakcją jądrową i cytoplazmatyczną po stymulacji komórek i leczeniu farmakologicznym. Dane można określić ilościowo i przedstawić równolegle z obrazami immunofluorescencyjnymi, zapewniając w ten sposób solidne i wymierne dane.

Podczas planowania eksperymentów na pierwotnych komórkach CLL, jeśli testy wymagają dużej liczby komórek (&gt;50 x 106 komórek), zaleca się stosowanie świeżo wyizolowanych komórek CLL zamiast komórek krio konserwowanych wymagających rozmrażania, choć nie zawsze jest to możliwe. Wynika to z faktu, że proces zamrażania i rozmrażania może prowadzić do śmierci nawet 50% komórek CLL, choć zależy to od próbki. Wzbogacenie komórek CLL do poziomu WCC &gt;40 x 106/mL przy użyciu wirowania gęstościowego opisanego w niniejszym protokole (kroki 1.3 – 1.5) umożliwia wysoką odzyskowalność komórek przy wysokiej czystości (≥ 95%) pierwotnych komórek CLL. W przedstawionej próbce WCC = 177 x 106/mL: z 30 mL próbki krwi odzyskano 5 x 109 komórek, co stanowi wydajność na poziomie 94% całkowitej liczby komórek. Analiza tej próbki metodą cytometrii przepływowej wykazała czystość komórek CLL &gt;95%, co potwierdzono poprzez podwójną ekspresję powierzchniową markerów komórek CLL CD19 i CD5 po bramkowaniu według FSC/SSC oraz wyselekcjonowaniu pojedynczych komórek negatywnych względem DAPI (komórek żywych) (Rycina 1).
Optymalizację procedury frakcjonowania subkomórkowego przeprowadzono, stosując różne proporcje detergentu (od 1:20 do 1:60) podczas przygotowywania frakcji cytoplazmatycznej (krok 3.4). Następnie przygotowano frakcje jądrowe oraz WCL (odpowiednio kroki 3.5 i 3.6). Immunobloty wykonano na otrzymanych frakcjach linii komórkowej CLL MEC1 (Rycina 2A) oraz pierwotnych komórkach CLL (Rycina 2B). W celu potwierdzenia prawidłowego frakcjonowania komórek, na blotach wyznaczono markery frakcji: Lamin A/C (jądrowy; 74/63 kDa) oraz β-tubulinę (cytoplazmatyczną; 55 kDa). Frakcjonowanie wskazuje, że optymalny poziom detergentu dla komórek MEC1 to rozcieńczenie 1:60 (Rycina 2A), podczas gdy dla pierwotnych komórek CLL optymalne było rozcieńczenie 1:30 (Rycina 2B), co objawiło się wzbogaceniem frakcji w białka jądrowe przy jednoczesnym braku białek cytoplazmatycznych i odwrotnie. WCL reprezentują całkowitą zawartość białek i służą jako kontrola pozytywna dla przeciwciał użytych do analizy frakcji subkomórkowych. Ważne jest wybranie odpowiednich białek jako markerów frakcji: Rycina 2C przedstawia immunobloty frakcji jądrowych/cytoplazmatycznych przygotowanych z komórek MEC1, w których polimeraza RNA II (Rpb1 CTD; 250 kDa) oraz Lamin A/C zostały użyte jako markery frakcji jądrowych, natomiast β-tubulina i γ-tubulina (50 kDa) jako markery cytoplazmatyczne. Wyraźnie widać, że γ-tubulina jest wzbogacona w cytoplazmie, jednak jej ekspresja jest widoczna również w jądrze, co wykazano wcześniej9.
Po zoptymalizowaniu warunków eksperymentalnych można przystąpić do przeprowadzenia doświadczenia. W przedstawionych przykładach określono lokalizację subkomórkową FOXO1 w frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych po stymulacji komórek receptorem antygenowym limfocytów B (BCR) w obecności lub w nieobecności podwójnego inhibitora mTORC1/2 AZD8055, w komórkach MEC1 (Rysunek 3A) oraz pierwotnych komórkach CLL (Rysunek 3B)5,10. W obu przykładach uzyskano wysoką czystość frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych, co potwierdzono niemal wyłączną ekspresją Laminy w frakcji jądrowej i β-tubuliny w frakcjach cytoplazmatycznych. W obu typach komórek ekspresja FOXO1 w cytoplazmie była zmniejszona po zastosowaniu AZD8055 w porównaniu z NDC, co towarzyszyło zwiększeniu ekspresji FOXO1 w komponencie jądrowym, wykazując tym samym translokację białka (Rysunek 3). Aby wyeliminować subiektywizm interpretacji danych, poszczególne immunobloty z pięciu pierwotnych próbek CLL poddano kwantyfikacji w obrębie frakcji subkomórkowych (krok 4; Rysunek 4A), wykorzystując odpowiednie białka jądrowe lub cytoplazmatyczne jako wewnętrzne kontrole załadunku dla każdej próbki, a następnie normalizując każdą frakcję do nieestymulowanej (US) kontroli bez leku (NDC), zgodnie z oznaczeniami. Powstały wykres przedstawia tendencje przemieszczania się FOXO1 między frakcją jądrową a cytoplazmatyczną, gdzie AZD8055 obniża poziomy ekspresji FOXO1 w cytoplazmie, jednocześnie zwiększając ekspresję w jądrze. Ponadto widoczny jest wzrost ekspresji FOXO1 w cytoplazmie po sieciowaniu BCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Probówka</td>
			<td>Nazwa probówki</td>
			<td>Komórki/Kuleczki</td>
			<td>Antygen</td>
			<td>Fluorofor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Niefiksowany</td>
			<td>Komórki</td>
			<td>Brak danych</td>
			<td>ND</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Barwienie pojedyncze</td>
			<td>Kuleczki</td>
			<td>CD5</td>
			<td>FITC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Barwienie pojedyncze</td>
			<td>Kuleczki</td>
			<td>CD19</td>
			<td>PE-Cy7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>Barwienie pojedyncze</td>
			<td>Kuleczki</td>
			<td>CD23</td>
			<td>APC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Barwienie pojedyncze</td>
			<td>Kuleczki</td>
			<td>CD45</td>
			<td>APC-Cy7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>Barwienie pojedyncze</td>
			<td>Komórki</td>
			<td>Żywotność</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Barwienie CLL</td>
			<td>Komórki</td>
			<td>CD5, CD19, CD23, CD45 &amp; żywotność</td>
			<td>FITC, PE-Cy7, APC, APC-Cy7 &amp; DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Tabela przedstawiająca optymalny zestaw probówek z próbkami wymaganych do cytometrii przepływowej komórek CLL. Każdy eksperyment musi obejmować wszystkie odpowiednie kontrole w celu dokładnej analizy uzyskanych wyników.
<img alt="Schemat analizy cytometrycznej; identyfikacja limfocytów za pomocą markerów CD; wykresy rozrzutu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60426/60426fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Reprezentatywny wykres analizy cytometrycznej komórek wzbogaconych od pacjentów z CLL.Komórki mononuklearne CLL wzbogacone z krwi obwodowej pacjenta z CLL zostały wyselekcjonowane (gating) za pomocą FSC-A vs. SSC-A, a następnie wykluczono dublety przy użyciu FSC-A vs. FSC-H (A). Niebarwione komórki (probówka 1) oraz kontrole kompensacji (probówki 2-6) posłużyły do konfiguracji cytometru w celu detekcji komórek i kompensacji między kanałami fluorescencji, co zapewniło prawidłową detekcję sygnałów fluorescencyjnych. (B) Przykład barwienia negatywnego (komórki niebarwione; probówka 1) w kanałach fluorescencji CD19 i CD5. Wyselekcjonowano komórki żywe (negatywne pod kątem DAPI) i dodatnie pod kątem CD45 (C), a następnie określono proporcję komórek CD19+CD5+ (95,5%) i CD19+CD23+ (91,2%) w obrębie populacji DAPI-CD45+ (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60426/60426fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki Western blot; poziomy białek jądrowych i cytoplazmatycznych; Lamin, Tubulina; analiza ekspresji białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60426/60426fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Optymalizacja frakcjonowania jądrowego i cytoplazmatycznego. Frakcje cytoplazmatyczne i jądrowe oraz lizaty całych komórek (WCL) przygotowano z osadów komórkowych (10 – 20 x 106 komórek) linii komórkowej CLL (A) MEC1 lub (B) pierwotnych komórek CLL wyizolowanych z krwi obwodowej pacjentów, zgodnie z opisem w kroku 3. Optymalizację frakcjonowania subkomórkowego przeprowadzono, stosując różne proporcje detergentu (od 1:20 do 1:60) podczas przygotowywania frakcji cytoplazmatycznej (jak opisano w kroku 3.4). Otrzymane próbki poddano analizie immunoblottingowej z użyciem przeciwciał przeciwko Laminie A/C (jądrowej) i przeciwko β-tubulinie (cytoplazmatycznej), aby potwierdzić prawidłowe frakcjonowanie komórek wraz z WCL. Markery masy cząsteczkowej przedstawiono po lewej stronie blotu (M). Symbol * oznacza optymalne warunki użycia detergentu do lizy komórek. (C) Immunoblot frakcji jądrowej i cytoplazmatycznej z komórek MEC1 w warunkach kontrolnych (NDC) lub po podaniu leku (8055), w obecności lub przy braku stymulacji (odpowiednio + lub – crosslinking BCR). Bloty inkubowano z przeciwciałami przeciwko Rbp1 CTD (klon 4H8; rozpoznający podjednostkę B1 polimerazy RNA II), przeciwko Laminie A/C, przeciwko β-tubulinie lub przeciwko γ-tubulinie (klon GTU-88), aby zidentyfikować frakcje subkomórkowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60426/60426fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza Western blot dla BCR i FOXO1 w frakcjach jądrowych/cytoplazmatycznych, kontrole Lamin A/C i β-tubuliny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60426/60426fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Frakcjonowanie subkomórkowe wykazuje transport FOXO1 między jądrem a cytoplazmą w CLL.(A) komórki MEC-1 oraz (B) pierwotne komórki CLL poddano 30-minutowej obróbce wstępnej przy użyciu 100 nM AZD8055 (8055) lub pozostawiono nieleczone (NDC), zgodnie z oznaczeniami, a następnie BCR poddano ligacji przez 1 h lub pozostawiono bez stymulacji (US). Następnie przygotowano frakcje jądrowe i cytoplazmatyczne i wykonano immunoblotting. Po potwierdzeniu poprawności frakcjonowania za pomocą przeciwciał przeciwko Lamin A/C (jądro) i β-tubulinie (cytoplazma), oceniono wpływ leczenia lekiem oraz ligacji BCR na ekspresję białka FOXO1, wykorzystując przeciwciało anty-FOXO1. M oznacza marker masy cząsteczkowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60426/60426fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Western blot i wykres słupkowy ekspresji FOXO1 w cytoplazmie i jądrach wraz z analizą densytometryczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60426/60426fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Przykład przeprowadzenia ilościowej analizy Western blot (densytometrii). (A) Densytometria została wykonana przy użyciu dostępnego online oprogramowania do analizy Western blot. W skrócie, w karcie Analysis narysowano prostokąty wokół prążków białkowych na obrazie w celu obliczenia intensywności sygnału. Przedstawiono densytometrię reprezentacyjnego obrazu Western blot próbki od pacjenta z CLL, która została poddana frakcjonowaniu cytoplazmatycznemu/jądrowemu. Frakcje cytoplazmatyczne i jądrowe są rozróżnione na podstawie ekspresji markerów cytoplazmatycznych (β-tubulina) i jądrowych (Lamin A/C). Znormalizowaną ekspresję FOXO1 dla danego stanu można obliczyć, dzieląc sygnał uzyskany dla FOXO1 przez odpowiadający mu sygnał dla β-tubuliny lub Lamin A/C, w zależności od analizowanej frakcji. Względną ekspresję FOXO1 (w stosunku do kontroli nośnika US) można obliczyć, dzieląc znormalizowaną ekspresję FOXO1 dla danego stanu przez znormalizowaną ekspresję FOXO1 kontroli nośnika US w danej frakcji komórkowej. (B) Wykres przedstawiający poziomy ekspresji FOXO1 w frakcjach cytoplazmatycznych (lewa) lub jądrowych (prawa), znormalizowane do kontroli US-NDC w obrębie każdej frakcji komórkowej. Czerwona kropka na wykresie to przedstawiony przykład. Dane te pokazują średnią krotność zmiany ekspresji FOXO1 w porównaniu do US-NDC ± SEM. Wartości P zostały wyznaczone za pomocą obustronnego sparowanego testu t Studenta. n = 5 indywidualnych próbek od pacjentów z CLL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60426/60426fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół umożliwia optymalizację i późniejsze efektywne generowanie frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych z pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej. Próbki te są wykorzystywane do określenia lokalizacji białek, a także zmian w transporcie białek, które zachodzą między przedziałami jądrowymi i cytoplazmatycznymi po stymulacji komórek i leczeniu farmakologicznym.

Subkomórkowe frakcjonowanie pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej w celu monitorowania transportu białek jądrowych/cytoplazmatycznych

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Opracowanie technik badania transportu makrocząsteczek między jądrem a cytoplazmą oraz identyfikacja nieprawidłowej lokalizacji białek supresorowych nowotworu jest niezbędne do głębszego zrozumienia patogenezy PBL i pomocy w opracowaniu nowych terapii. Protokół ten zapewnia szybką i wydajną metodę generowania frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych z pierwotnych komórek CLL. Frakcje te mogą być wykorzystywane w dalszych eksperymentach, w tym w testach aktywności enzymatycznej, analizie proteomicznej i western blot.Technika ta poszerzy naszą wiedzę na temat tego, w jaki sposób terapie i sygnały mikrośrodowiskowe w guzach zmieniają transport białek między jądrem a cytoplazmą w komórkach PBL i potencjalnie innych nowotworach złośliwych komórek B. Metoda ta może być stosowana do określania lokalizacji białek i/lub przyciągania ruchu białek, w zależności od przypadku. Wykonaj gradient detergentu na każdej pojedynczej linii komórkowej, której planujesz użyć, aby zapewnić optymalne wytwarzanie wysoko wzbogaconych frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych.Obok Jodie Hay i Michaela Molesa, tę procedurę zademonstruje Jennifer Cassels, technik z mojego laboratorium. Pobrać próbki krwi obwodowej od pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową, którzy wcześniej wyrazili zgodę, w probówkach do pobierania krwi EDTA, wraz z liczbą białych krwinek. Próbki krwi ludzkiej należy uznać za niebezpieczne, ponieważ mogą zawierać wirusy przenoszone przez krew.Upewnij się, że próbki te są obsługiwane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej i że użytkownik przez cały czas nosi fartuch laboratoryjny i rękawice. Materiały skażone krwią należy utylizować w środkach dezynfekujących. Jeśli liczba białych krwinek jest równa lub większa niż 40 milionów komórek na mililitr, rozcieńczyć próbkę w stosunku jeden do jednego za pomocą buforu do płukania RT CLL.Następnie podwielokrotną pożywkę gradientu gęstości RT do stożkowej probówki wirówkowej o odpowiedniej wielkości dla próbki. Ostrożnie ułożyć próbkę warstwami na wierzchu pożywki i odwirować przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura delikatnie zbierz białą warstwę komórek jednojądrzastych, które zebrały się na granicy faz pożywki o gradiencie gęstości w buforze płuczącym CLL. Przenieś tę izolowaną monowarstwę do świeżej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów.Aby umyć komórki, dodaj 40 mililitrów buforu płuczącego CLL do tej monowarstwy i odwiruj przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzuć supernatant, przesuń dolną część probówki, aby ponownie zawiesić osad i powtórz to pranie. Wyrzuć supernatant, ponownie przesuń dno probówki, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w ustalonej objętości buforu płuczącego CLL, w zależności od wielkości osadu.Po zliczeniu komórek i po zastosowaniu cytometrii przepływowej w celu sprawdzenia czystości komórek, należy umieścić komórki na płytkach do hodowli tkankowych o wymaganej gęstości komórek, gotowych do stymulacji lub leczenia farmakologicznego. Po stymulacji i/lub leczeniu farmakologicznym inkubacja jest zakończona. Przenieś komórki do indywidualnie oznakowanych 1,5-mililitrowych probówek do mikrofuge i osadzaj przez wirowanie w temperaturze 200 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze lodowatego PBS z inhibitorami fosfatazy. Wirować przy 200 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i przechowywać te granulki ekstraktu z całych komórek na lodzie do dalszych przygotowań.Aby przygotować frakcje cytoplazmatyczne, delikatnie ponownie zawiesić granulki komórek w 50 mikrolitrach 1x buforu hipertonicznego. Aby komórki pęczniały, inkubuj je na lodzie przez 15 minut. Po wykonaniu gradientu detergentu w celu określenia optymalnego stężenia detergentu do użycia dla określonego typu ogniwa, dodaj 0,8 do 2,5 mikrolitra detergentu do każdej próbki i wiruj na najwyższym ustawieniu przez 10 sekund.Aby zweryfikować lizę komórek, obserwuj je pod mikroskopem kontrastu fazowego przed i po dodaniu detergentu. Wszystkie komórki mają gęste, ciemne jądro otoczone cytoplazmą, która wygląda jak jasne halo. Po lizie próbki należy odwirować w temperaturze 14 000 x g przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Ostrożnie, nie naruszając osadu, przenieś supernatant do wstępnie schłodzonej, znakowanej probówki z mikrodymką i przechowuj tę frakcję cytoplazmatyczną w temperaturze 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy. Zapewnić całkowite usunięcie frakcji cytoplazmatycznej, aby zapobiec zanieczyszczeniu frakcji jądrowej. Do pozostałej osadki, która zawiera frakcję jądrową, dodać 50 mikrolitrów kompletnego buforu do lizy i ponownie zawiesić, pipetując w górę iw dół.Aby rozpuścić białka związane z błoną jądrową, dodaj 2,5 mikrolitra detergentu, wiruj na najwyższym ustawieniu przez 10 sekund i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Wirować na najwyższym ustawieniu przez 30 sekund i odwirować. Następnie przenieś supernatant do wstępnie schłodzonej, znakowanej probówki do mikrofugi i przechowuj tę frakcję jądrową w temperaturze 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy.W przypadku lizatów z całych komórek ponownie zawiesić granulki ekstraktu z całych komórek w 100 mikrolitrach kompletnego buforu do lizy, pipetując w górę iw dół. Aby zapewnić całkowitą lizę komórek, dodaj pięć mikrolitrów detergentu i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Wirować na najwyższym ustawieniu przez 30 sekund, a następnie wirować przy 14 000 x g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przenieś supernatant do wstępnie schłodzonej probówki do mikrofuge i przechowuj cały lizat komórkowy w temperaturze 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy. Aby określić ilościowo transport białek między frakcjami jądrowymi i cytoplazmatycznymi, należy przeprowadzić ilościową analizę western blot i zaimportować obrazy. Aby wyświetlić obraz na wstążce Obraz, kliknij przycisk Wybierz w grupie Wyświetlanie i kliknij Kanał Chemi.Otworzy się okno dialogowe Wybierz wyświetlanie, aby w razie potrzeby umożliwić dalsze regulacje. Zaimplementuj dodatkowe ulepszenia za pomocą regulowanych suwaków na karcie obrazu LUT, w tym jasność lub kontrast. Użyj karty Krzywe, aby uzyskać dokładniejsze korekty.W przypadku analizy danych najpierw kliknij wstążkę Analiza. Aby przeanalizować tylko jeden kanał, odznacz kanały, które nie są analizowane, klikając miniaturę kanału Nie pokazuj kanału, pozostawiając wyświetlany tylko żądany kanał. Aby określić ilościowo intensywność sygnału, kliknij przycisk Dodaj prostokąt, aby dodać prostokąty do obrazu.Kliknij środek elementu, takiego jak pasmo białka, aby umieścić wokół niego prostokąt. Po dodaniu żądanych kształtów kliknij przycisk Wybierz, aby powrócić kursorem do narzędzia do zaznaczania. Aby odjąć szum tła, kliknij pierwszy przycisk w grupie Tło i wybierz opcję Mediana z menu rozwijanego.Ustaw szerokość obramowania na trzy w oknie dialogowym Tło i wybierz segmenty, które najlepiej reprezentują tło obrazu, które ma być używane do obliczania tła. Aby wyeksportować dane, kliknij kartę Kształty nad tabelą. W przypadku densytometrii wymagane są wartości w kolumnie Sygnał.Sygnał to suma wartości intensywności pikseli lub suma dla kształtu pomniejszona o iloczyn tła w obszarze. Następnie kliknij przycisk Raport, kliknij Zapisz jako lub Uruchom arkusz kalkulacyjny. Aby obliczyć znormalizowane wyrażenie białka będącego przedmiotem zainteresowania dla każdej płaszczyzny lub zmiennej w zapisanym arkuszu kalkulacyjnym, należy podzielić uzyskany sygnał dla białka będącego przedmiotem zainteresowania przez sygnał dla odpowiedniego pasma kontrolnego obciążenia białka.Aby wyeksportować obraz, kliknij kartę Obrazy znajdującą się nad tabelą, a następnie kliknij obraz, który chcesz wyeksportować. Jeśli używasz obrazu do prezentacji slajdów lub innych formatów cyfrowych, kliknij ikonę oprogramowania, najedź kursorem na Eksportuj, kliknij Obraz do multimediów cyfrowych, a następnie zapisz obraz zgodnie z wymaganiami. Wzbogacanie komórek PBL o WCC większe niż 40 milionów na mililitr za pomocą wirowania o dużej gęstości umożliwia wysoki odzysk komórek.Analiza próbki za pomocą cytometrii przepływowej po bramkowaniu na FSC i SSC ujawnia, że czystość komórek CLL wynosi ponad 95%, na co wskazuje podwójna ekspresja powierzchniowa markerów komórkowych CLL, CD19 i CD5. Gdy przeprowadzono immunobloty na wynikowych frakcjach linii komórkowej CLL, Mac-1 i pierwotnych komórkach CLL, frakcjonowanie wykazało, że optymalny poziom detergentu dla komórek Mac-1 wynosił od jednego do 60 rozcieńczeń, w porównaniu z 1 do 30 dla pierwotnych komórek CLL. Gdy określono subkomórkową lokalizację FOXO1 we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych w komórkach Mac-1 i pierwotnych CLL, wytwarzanie wysoce wzbogaconych frakcji wykazano przez prawie wyłączną ekspresję laminy we frakcjach jądrowych i beta tubuliny we frakcjach cytoplazmatycznych.Ekspresja FOXO1 była zmniejszona w cytoplazmie po leczeniu AZD 8055 w porównaniu z NDC, czemu towarzyszył wzrost ekspresji FOXO1 w kompartmencie jądrowym, wykazując w ten sposób translokację białka. Po ilościowym określeniu pojedynczych blotów immunologicznych z pięciu pierwotnych próbek PBL we frakcjach subkomórkowych stwierdzono, że AZD 8055 zmniejsza poziomy ekspresji FOXO1 w cytoplazmie i zwiększa ekspresję w jądrze. Sieciowanie BCR zwiększyło cytoplazmatyczną ekspresję FOXO1.Pamiętaj, aby wszystkie odczynniki i próbki przechowywać na lodzie, aby zapobiec degradacji białek. Frakcje subkomórkowe wygenerowane w tej procedurze mogą być również wykorzystane w testach aktywności enzymatycznej, takich jak test aktywności FOXO, który umożliwia narysowanie paraleli między lokalizacją komórkową FOXO1 a jego aktywnością wiązania DNA. Opracowanie tej techniki umożliwiło nam zajęcie się transportem określonych białek w komórkach PBL w odpowiedzi na selektywne inhibitory i wspiera nasze równoległe badania immunofluorescencyjne w celu wygenerowania solidnego i wymiernego zestawu danych.

subcellular-fractionation-primary-chronic-lymphocytic-leukemia-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

In situ frakcjonowanie subkomórkowe komórek ssaków na szkiełkach podstawowych do mikroskopu umożliwia wizualizację lokalizacji białek.

In situ frakcjonowanie subkomórkowe adherentnych i nieadherentnych komórek ssaków

Ten film opisuje technikę izolowania komórek przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL) od krwi obwodowej. Dzięki temu protokołowi wyizolujemy komórki PBL z próbki krwi ludzkiego pacjenta w celu późniejszego wydajnego generowania frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych.

Wirowanie w gradiencie gęstości: metoda izolowania komórek PBL z krwi obwodowej

Ten film opisuje przygotowanie frakcji subkomórkowych z komórek białaczkowych, co jest metodą generowania frakcji komórkowych i jądrowych z komórek białaczkowych. Frakcje jądrowe i cytoplazmatyczne można wykorzystać do dalszej analizy.

Przygotowanie frakcji subkomórkowych z komórek białaczkowych: metoda generowania frakcji komórkowych i jądrowych z komórek białaczkowych

Tutaj opisujemy protokół, który łączy dwie techniki proteomiczne, mianowicie dwuwymiarową elektroforezę (2DE) i spektrometrię mas (MS), w celu identyfikacji różnie wyrażonych/potranslacyjnych zmodyfikowanych białek wśród dwóch lub więcej grup próbek pierwotnych. Takie podejście, wraz z eksperymentami funkcjonalnymi, pozwala na identyfikację i charakterystykę markerów prognostycznych/celów terapeutycznych.

Od plamki 2DE-Gel do funkcji białka: lekcja wyciągnięta z HS1 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Opisany tutaj protokół reprezentuje łatwą i powtarzalną metodę, która wykorzystuje wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (RP-HPLC) do pomiaru metabolizmu puryn na komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL) hodowanych w różnych warunkach.

Test oparty na HPLC do monitorowania zewnątrzkomórkowego metabolizmu nukleotydów/nukleozydów w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej

Ten protokół opisuje metodę precyzyjnego pomiaru szybkości transportu nukleocytoplazmatycznego w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych poprzez ilościowe określenie zmian w czasie rzeczywistym w imporcie jądrowym białka NLS-NES-GFP.

Test do pomiaru transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych

Ten protokół opisuje użycie elutriacji odśrodkowej do rozdzielania komórek pierwotnej ostrej białaczki limfoblastycznej na różne fazy cyklu komórkowego.

Przygotowanie pierwotnych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej w różnych fazach cyklu komórkowego przez elutriację odśrodkową

Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL) jest najczęstszą białaczką w zachodnim świecie. Czynniki transkrypcyjne NFAT są ważnymi regulatorami rozwoju i aktywacji w wielu typach komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokół stosowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) w ludzkich komórkach PBL w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2.

Test immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Ten protokół frakcjonowania pozwoli badaczom wyizolować białka cytoplazmatyczne, jądrowe, mitochondrialne i błonowe z komórek ssaków. Dwie ostatnie frakcje subkomórkowe są dalej oczyszczane za pomocą gradientu gęstości izopikenowej.

Frakcjonowanie komórek U937 przez izopiknowe oczyszczanie w gradimencie gęstości

Obecny protokół oferuje efektywną i elastyczną metodę izolacji RNA z frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą hodowanych komórek, a następnie walidacji za pomocą qPCR. Skutecznie służy jako zamiennik dla innych zestawów do przygotowania RNA.

Przygotowanie cytoplazmatycznych i jądrowych długich RNA z komórek pierwotnych i hodowanych

Poznaj metodę subkomórkowego frakcjonowania komórek CLL do badania transportu białek między jądrem a cytoplazmą. Technika umożliwia analizę lokalizacji białek i ich przemieszczania w odpowiedzi na leczenie.

Subkomórkowe frakcjonowanie pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej w celu monitorowania transportu białek jądrowych/cytoplazmatycznych (Wideo) | JoVE Journal

Subkomórkowe frakcjonowanie pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej w celu monitorowania transportu białek jądrowych/cytoplazmatycznych

Przeglądaj więcej filmów