Name: Izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych myszy transgenicznych z grupy prenatalnej mn:GFP (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Naucz się izolacji i hodowli neuronów ruchowych okoruchowych oraz rdzeniowych z myszy transgenicznych. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów chorób neuronów ruchowych i porównanie ich wrażliwości na degenerację.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, USA) za instrukcje dotyczące technik preparacji SMN; Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, Immunologia Division Flow Cytometry Facility of Harvard Medical School, The Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women's Hospital Flow Cytometry Core oraz Boston Children's Hospital Flow Cytometry Research Facility za izolację FACS pierwotnych neuronów ruchowych; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, dodatkowi członkowie laboratorium Engle oraz członkowie konsorcjum Projektu ALS za pomoc techniczną i przemyślaną dyskusję. Badanie to było wspierane przez Project ALS. Ponadto R.F. został sfinansowany przez Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant Abroad oraz grant szkoleniowy NIH w zakresie genetyki T32 GM007748; J.J. był wspierany przez program szkoleniowy NIH/NEI w zakresie molekularnych podstaw chorób oczu (5T32EY007145-16) za pośrednictwem Schepens Eye Research Institute oraz przez Developmental Neurology Training Program Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) przez Boston Children's Hospital; MCW był wspierany przez NEI (5K08EY027850) i Children's Hospital Ophthalmology Foundation (Faculty Discovery Award); E.C.E. jest badaczem w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa.

<ol><li>Kiernan, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).</li>
<li>Wood-Allum, C., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurone+disease%3A+a+practical+update+on+diagnosis+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Medicine+%28London%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management.</a> Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).</li>
<li>Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+vulnerability+and+resistance+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).</li>
<li>Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+motor+function+in+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Ocular motor function in motor neuron disease.</a> Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).</li>
<li>Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+diversity+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Motor neuron diversity in development and disease.</a> Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).</li>
<li>Nimchinsky, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+vulnerability+of+oculomotor%2C+facial%2C+and+hypoglossal+nuclei+in+G86R+superoxide+dismutase+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).</li>
<li>Angenstein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+MRI+of+motor+brain+stem+nuclei+in+a+mouse+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS.</a> Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).</li>
<li>Niessen, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+quantification+of+spinal+and+bulbar+motor+neuron+degeneration+in+the+G93A-SOD1+transgenic+mouse+model+of+ALS+by+T2+relaxation+time+and+apparent+diffusion+coefficient%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient.</a> Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).</li>
<li>Spiller, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Motor+Neuron+Resistance+and+Recovery+in+a+New+Inducible+Mouse+Model+of+TDP-43+Proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).</li>
<li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+mouse+motoneuron-enriched+fraction+from+mouse+spinal+cord+on+a+density+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier.</a> Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).</li>
<li>Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocols+for+isolation+of+primary+motor+neurons%2C+astrocytes+and+microglia+from+embryonic+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).</li>
<li>Beaudet, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+extraction+of+pure+spinal+motor+neurons%2C+astrocytes+and+microglia+from+single+embryo+and+adult+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord.</a> Scientific Reports. 5, 16763(2015).</li>
<li>Camu, W., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+embryonic+rat+motoneurons+by+panning+on+a+monoclonal+antibody+to+the+low-affinity+NGF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor.</a> Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).</li>
<li>Arce, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiotrophin-1+requires+LIFRbeta+to+promote+survival+of+mouse+motoneurons+purified+by+a+novel+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique.</a> Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).</li>
<li>Wiese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+enrichment+of+embryonic+mouse+motoneurons+from+the+lumbar+spinal+cord+of+individual+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos.</a> Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).</li>
<li>Conrad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-based+isolation+and+culture+of+mouse+embryonic+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li>
<li>Lerner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-derived+factor-1+and+hepatocyte+growth+factor+guide+axon+projections+to+the+extraocular+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles.</a> Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).</li>
<li>Ferrario, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+in+the+developing+ocular+motor+system+and+Duane+retraction+syndrome+depends+on+Semaphorin+signaling+via+alpha2-chimaerin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).</li>
<li>Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B12-Chimaerin+regulates+a+key+axon+guidance+transition+during+development+of+the+oculomotor+projection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).</li>
<li>Theofilopoulos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholestenoic+acids+regulate+motor+neuron+survival+via+liver+X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).</li>
<li>Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+and+In+Vitro+Knockdown+Approaches+in+the+Avian+Embryo+as+a+Means+to+Study+Semaphorin+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling.</a> Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).</li>
<li>Porter, J. D., Hauser, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+extraocular+muscle+in+long-term+organotypic+culture%3A+differential+influence+of+appropriate+and+inappropriate+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons.</a> Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).</li>
<li>Serafini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrin-1+is+required+for+commissural+axon+guidance+in+the+developing+vertebrate+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system.</a> Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).</li>
<li>Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+axon+subpopulations+respond+differentially+to+the+chemorepellents+netrin-1+and+semaphorin+D%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D.</a> Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).</li>
<li>Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+the+trochlear+motor+axon+trajectory%3A+role+of+the+isthmic+organiser+and+Fgf8%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8.</a> Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).</li>
<li>Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDNF+increases+the+survival+of+developing+oculomotor+neurons+through+a+target-derived+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).</li>
<li>Whitman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CXCR4%2FCXCL12+Signaling+Causes+Oculomotor+Nerve+Misrouting+and+Development+of+Motor+Trigeminal+to+Oculomotor+Synkinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).</li>
<li>Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+Vivo+Oculomotor+Slice+Culture+from+Embryonic+GFP-Expressing+Mice+for+Time-Lapse+Imaging+of+Oculomotor+Nerve+Outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth.</a> Journal of Visualized Experiments. , In press e59911(2019).</li>
<li>Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+ligase+Phr1+regulates+axon+outgrowth+through+modulation+of+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics.</a> Neuron. 56, 604-620 (2007).</li>
<li>Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+defined+and+uniform+population+of+CNS+progenitors+and+neurons+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).</li>
<li>An, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+cranial+and+spinal+motor+neurons+reveal+proteostatic+differences+between+ALS+resistant+and+sensitive+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons.</a> eLife. 8, e44423(2019).</li>
<li>Huber, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+secreted+semaphorin+signaling+in+spinal+motor+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance.</a> Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).</li>
<li>Plachta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+lectin+causing+the+degeneration+of+neuronal+processes+using+engineered+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells.</a> Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).</li>
<li>Eide, L., McMurray, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+adult+mouse+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Culture of adult mouse neurons.</a> BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).</li>
<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).</li>
<li>Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Hanson, M. G. Jr, Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+elevation+is+sufficient+to+promote+the+survival+of+spinal+motor+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).</li>
<li>Lamas, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+requirements+of+human+motor+neurons+defined+using+amplified+and+purified+stem+cell-derived+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures.</a> Plos One. 9 (10), (2014).</li>
<li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+binding+of+transcription+factors+to+cell-specific+enhancers+programs+motor+neuron+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity.</a> Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Historycznie rzecz biorąc, badania in vitro neuronów ruchowych CN3 i/lub CN4 opierały się na heterogenicznych kulturach, takich jak zdysocjowane 17,18,19,20,21, eksplantat 17,22,23,24,25,26 i plaster</sup...

Kultura pierwotnych neuronów ruchowych to potężne narzędzie, które umożliwia badanie rozwoju, funkcji i podatności neuronów na egzogenne stresory. Hodowle neuronów ruchowych są szczególnie przydatne do badania chorób neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS)1,2, których mechanizmy chorobowe nie są w pełni poznane. Co ciekawe, pomimo znacznej śmierci komórek rdzeniowych neuronów ruchowych (SMN) zarówno u pacjentów z ALS, jak i myszy modelowych ALS, śmierć komórek w neuronach okoruchowych (CN3) i neuronach bloczkowych (CN4) jest stosunkowo rzadka1,3,4,5,6,7,8,9. Dlatego analizy porównawcze czystych kultur CN3/CN4 i SMN mogą dostarczyć ważnych wskazówek na temat mechanizmów leżących u podstaw względnej podatności. Niestety, główną przeszkodą w takich analizach jest niemożność wyhodowania oczyszczonych kultur tych neuronów ruchowych.
Opisano wiele protokołów oczyszczania SMN z modeli zwierzęcych. Większość z tych protokołów wykorzystuje techniki wirowania w gradiencie gęstości10,11,12 i/lub p75 NTR-antibody-based cell sorting sorting technology13,14,15,16. Wirowanie w gradiencie gęstości wykorzystuje większy rozmiar SMN w stosunku do innych komórek rdzeniowych, podczas gdy p75NTR jest białkiem zewnątrzkomórkowym wyrażanym wyłącznie przez SMN w rdzeniu kręgowym. Prawie 100% czyste kultury SMN zostały wygenerowane przez jeden lub oba te protokoły11,12,14. Jednak protokoły te nie odniosły sukcesu w generowaniu kultur CN3 / CN4, ponieważ CN3 / CN4 nie wyrażają p75NTR, a inne specyficzne markery CN3 / CN4 nie zostały zidentyfikowane. Są one również mniejsze niż SMN i dlatego trudniej je odizolować na podstawie rozmiaru. Zamiast tego badania in vitro CN3 lub CN4 opierały się na dissociated17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26, and slice27,28 kultur, które składają się z heterogenicznych typów komórek, i nie istnieją żadne protokoły dotyczące izolacji i hodowli pierwotnych CN3 lub CN4.
Tutaj opisany jest protokół wizualizacji, izolacji, oczyszczania i hodowli CN3, CN4 i SMN z tego samego dnia embrionalnego 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgeniczne myszy29 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, <silna klasa="xfig">Rysunek 2A). IslMN: GFP specyficznie znakuje neurony ruchowe farnezylowanym GFP, który lokalizuje się w błonie komórkowej. Protokół ten umożliwia porównanie wielu typów neuronów ruchowych w zależności od gatunku i wieku w celu wyjaśnienia mechanizmów patologicznych w chorobie neuronu ruchowego.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488-sprzężony kozioł anty-mysi IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-sprzężony F(ab')2 kozia anty-królicza IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11072</td><td>1:400</td></tr><tr><td>B27 Suplement (50x), bez surowicy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria llu SORP Cytometr przepływowy</td><td>BD Bioscience</td><td>- </td><td>Posiada 4 systemy laserowe wyposażone w lasery 405, 488, 594 i 640 nm.</td></tr><tr><td>BD Falcon 70&mu; m Nylonowe sitka komórkowe</td><td>CORNING</td><td>352350</td><td>Do filtrowania komórek dysocjujących przed FACS.</td></tr><tr><td>Probówki BD Falcon z okrągłym dnem i zatrzaskiem</td><td>CORNING</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>BDNF Human</td><td>ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.</td><td>CYT-207</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytka do hodowli komórkowych, 96 dołków, PS, dno F (studnia kominowa)</td><td>Greiner Bio-One International</td><td>655090</td><td>Próbowaliśmy wielu naczyń 96-dołkowych i to była najlepsza do hodowli i analiz po</td></tr><tr><td>okrągłych szkłach nakrywkowych ICC do mikroskopii</td><td>Karl Hecht & Assistent</td><td>1001/14</td><td>Użyliśmy tego szkiełka nakrywkowego, ponieważ powierzchnia była duża (średnica: 14 mm).</td></tr><tr><td>CNTF Human</td><td>ProSpec-Tany TechnoGene, Sp. z o.o.</td><td>CYT-272</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cyklopiazonowy z Penicillium cyclopium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1530</td><td>CPA. Jeden ze stresorów ER.</td></tr><tr><td>4&,6-diamidino-2-fenylonolol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze Inox Rozmiar końcówki 0,05 mm x 0,01 mm Porady biologiczne</td><td>Instrument chirurgiczny Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP25205</td><td></td></tr><tr><td>GDNF Human</td><td>ProSpec-Tany TechnoGene, Sp. z o.o.</td><td>CYT-305</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX suplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate E</td><td>BrainBits</td><td>HE</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate E niska fluorescencja</td><td>BrainBits</td><td>HELF</td><td>Fluorescencja, która utrudnia obserwację ekspresji GFP zarodka, powinna być niska.</td></tr><tr><td>Surowica końska, inaktywowana termicznie, pochodzenia nowozelandzkiego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Tocris Cookson</td><td>2845</td><td>Izobutylometyloksantyna</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L15 średni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Mikro nożyczki preparacyjne</td><td>Roboz Instrument chirurgiczny</td><td>RS-5913</td><td></td></tr><tr><td>Mikronóż 4,75 "ostrze 1,7 mm x 27 mm</td><td>Roboz Instrument chirurgiczny</td><td>RS-6272</td><td></td></tr><tr><td>Moria Mini perforowana łyżka</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-19</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko neuronalnej klasie III i beta;-tubulinie (TUBB3)</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td>1:500, TUJ1</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny żywych komórek Nikon Perfect Focus Eclipse Ti i oprogramowanie Elements</td> Obrazy <td></td><td>kontrastowe interferencyjne różnicowe firmy Nikon i obrazy immunocytochemiczne kultur komórkowych zostały zarejestrowane za pomocą tych urządzeń:</td><td></td></tr> <tr><td>Kwas azotowy 90%, dymiący (certyfikowany ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A202-212</td><td>Do płukania szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>Olympus 1,7 ml mikroprobówki, przezroczyste</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-281</td><td>Są to probówki, które opisaliśmy w kontekście "probówki do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml".</td></tr><tr><td>System dysocjacji papainy</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>LK003150</td><td>Z tego zestawu przygotowuje się roztwór papainy i roztwór inhibitora alubumin-ovomucoid.</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Poly D-lizyna (PDL)</td><td>MiliporeSigma</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało monoklonalne przeciwko Islet1</td><td>Abcam</td><td>ab109517</td><td>1:200</td></tr><tr><td>SMZ18 i SMZ1500 mikroskopy stereoskopowe z zoomem DS-Ri1 </td><td></td><td>Wykonano dysekcję aparatu Nikon i uchwycono obrazy wypreparowanych zarodków i tkanek pod tymi mikroskopami fluorescencyjnymi.</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 170 silikonowa kapsułka - A+B 0,9 kg zestaw</td><td>Dow Corning</td><td>1696157</td><td>Za pomocą tego zestawu wykonujemy naczynia preparacyjne</td></tr>.<tr><td>Naczynia poddane obróbce TC, 100 mm x 20 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td>Za pomocą tego naczynia wykonujemy naczynia rozwarstwiające.</td></tr><tr><td>Kleszcze opatrunkowe Thum 4,5 "ząbkowane 2,2 mm szerokości końcówki</td><td>Roboz Instrument chirurgiczny</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik do LOGOQ e VET</td><td>GE Healthcare</td><td>L8-18i-RS</td><td>Do ultrasonografii u samic myszy</td></tr><tr><td>Ultrasonograf weterynaryjny</td><td>GE Healthcare</td><td>LOGOQ e VET</td><td>Do ultrasonografii u samic myszy</td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny Zeiss serii LSM 700 i oprogramowanie Zen</td><td>Carl Zeiss</td><td>-</td><td>Konfokalny obraz zarodka został uchwycony za pomocą tych urządzeń</td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych myszy transgenicznych z grupy prenatalnej mn:gfp

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Neurony okoruchowe (CN3) i neurony bloczkowe (CN4) wykazują niezwykłą odporność na choroby zwyrodnieniowe neuronów ruchowych, takie jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS) w porównaniu do rdzeniowych neuronów ruchowych (SMN). Zdolność do izolowania i hodowli pierwotnych mysich CN3, CN4 i SMN zapewniłaby podejście do badania mechanizmów leżących u podstaw tej selektywnej podatności. Do tej pory większość protokołów wykorzystuje heterogeniczne hodowle komórkowe, co może zakłócić interpretację wyników eksperymentów. Aby zminimalizować problemy związane z populacjami mieszanych komórek, niezbędne są czyste kultury. W tym miejscu pierwszy protokół szczegółowo opisuje, jak skutecznie oczyszczać i hodować CN3/CN4 wraz z odpowiednikami SMN z tych samych zarodków przy użyciu transgenicznych zarodków myszy IslMN:GFP dnia embrionalnego 11,5 (E11,5). Protokół zawiera szczegółowe informacje na temat rozwarstwienia i dysocjacji tkanek, izolacji komórek opartej na FACS oraz hodowli in vitro komórek z jąder CN3/CN4 i SMN. Protokół ten dodaje nowatorski system hodowli CN3/CN4 in vitro do istniejących protokołów, a jednocześnie zapewnia czystą kulturę SMN dopasowaną do gatunku i wieku do porównania. Analizy koncentrujące się na morfologicznych, komórkowych, molekularnych i elektrofizjologicznych cechach neuronów ruchowych są możliwe w tym systemie hodowli. Protokół ten umożliwi badania nad mechanizmami, które definiują rozwój neuronów ruchowych, selektywną podatność i chorobę.

Celem niniejszego protokołu było wysokiej jakości oczyszczenie i długoterminowa hodowla zarówno pierwotnych neuronów CN3/CN4, jak i SMN, aby umożliwić analizy porównawcze mechanizmów leżących u podstaw schorzeń neuronów ruchowych (przegląd przedstawiono na Rysunku 1 i Rysunku 2).
Po pomyślnej izolacji i wyhodowaniu neuronów w kulturze uzyskano niemal czyste kultury pier...

Ta praca przedstawia protokół do uzyskania jednorodnych kultur komórkowych pierwotnych neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych. Kultury te można wykorzystać do analiz porównawczych cech morfologicznych, komórkowych, molekularnych i elektrofizjologicznych neuronów ruchowych oka i rdzenia.

Izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych myszy transgenicznych z grupy prenatalnej mn:GFP

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Jest to pierwszy protokół do jednoczesnego i skutecznego oczyszczania i hodowli pierwotnych neuronów ruchowych oka i rdzenia kręgowego od embrionalnych myszy. Umożliwia badanie mechanizmów leżących u podstaw choroby neuronu ruchowego. Protokół ten dodaje nowy komponent hodowli okulomotorycznej in vitro do istniejących systemów i zapewnia czyste hodowle neuronów ruchowych rdzenia kręgowego dopasowane do gatunku i wieku do porównania.W stwardnieniu zanikowym bocznym neurony ruchowe rdzenia ulegają degeneracji, podczas gdy neurony okoruchowe są stosunkowo oszczędne. Porównanie tych kultur może dostarczyć informacji na temat mechanizmu choroby i terapii. Metoda ta ułatwi badania nad mechanizmami leżącymi u podstaw rozwoju neuronów ruchowych, chorób i selektywnej podatności.Nasz system hodowli umożliwia charakterystykę morfologii neuronów ruchowych, biologii molekularnej i elektrofizjologii. Dla tych, którzy są nowicjuszami w tej technice, zalecamy dużo praktyki. Sekcja może być trudna technicznie i może być konieczne przeprowadzenie wielu sekcji w celu uzyskania wystarczającej liczby neuronów do hodowli pierwotnej.Rozpocznij od pobrania zarodków Islet1 EGF dodatnich od ciężarnej myszy około 11,5 dnia po zapłodnieniu. Dokładnie spryskaj brzuch etanolem i usuń macicę sterylnymi nożyczkami do mikrodysekcji i kleszczykami do opatrunku kciuka. Krótko umyj macicę w sterylnym PBS.Następnie przenieś go na płytkę separacyjną wypełnioną wstępnie schłodzonym sterylnym PBS. W jasnym świetle mikroskopu ostrożnie usuń zarodki z macicy za pomocą nożyczek do mikrodysekcji, kleszczyków do opatrunku kciuka i pęsety Dumont 5. Następnie użyj sterylnej mini perforowanej łyżki Moria, aby przenieść każdy zarodek do oddzielnego dołka na 24-dołkowej płytce wypełnionej wstępnie schłodzoną hibernacją, pożywką o niskiej fluorescencji E, uzupełnioną 1X V27.Trzymając płytkę na lodzie, przenieś jeden zarodek na sterylną płytkę separacyjną i przykryj go całkowicie lodowatym sterylnym roztworem soli Hanka lub HBSS. Użyj pęsety, aby usunąć twarz zarodka i ogon bez uszkadzania śródmózgowia. Następnie umieść zarodek na brzuchu z kończynami okrakiem i ogonem skierowanym w stronę przodu mikroskopu.Użyj pęsety, aby rozciąć dach czwartej komory, aby wytworzyć mały otwór. Użyj tego otworu, aby zaczepić pęsetę w przestrzeni utworzonej między czwartą komorą a jej dachem. Rozkrój wzdłuż grzbietowej powierzchni zarodka rostralnego do kory i bocznie do płyty podłogowej i kolumny motorycznej.Następnie otwórz wypreparowaną tkankę w sposób otwartej książki, aby odsłonić jądra CN3 i CN4 GFP dodatnie. Ostrożnie oddziel brzuszne śródmózgowie od zarodka i usuń tkankę oponową za pomocą pęsety i noża do mikrodysekcji. Wypreparuj obustronne jądra CN3 i CN4 GFP dodatnie z dala od płytki podłogowej i innych otaczających tkanek GFP, uważając, aby nie dotykać ani nie uszkadzać neuronów.W przypadku pobierania oddzielnych jąder CN3 i CN4, przeciąć wzdłuż śródmózgowia tych dwóch jąder i użyć pipety P1000, aby pobrać wypreparowaną brzuszną tkankę śródmózgowia przy minimalnym HBSS. Umieść ją w oznakowanej 1.7 mililitrowej probówce wirówkowej wypełnionej pożywką separacyjną i przechowuj probówkę na lodzie do dysocjacji. Kontynuuj pobieranie brzusznego śródmózgowia z dodatkowych zarodków w tej samej probówce, aż całkowita liczba spełni wymagania eksperymentalne.Aby wypreparować brzuszny rdzeń kręgowy, trzymaj zarodek w pozycji leżącej z głową skierowaną do przodu mikroskopu. Przytrzymaj go jedną parą pęsety i włóż końcówkę drugiej pary do nieotwartej części ogonowej czwartej komory. Otwórz resztę tyłomózgowia i rdzeń kręgowy grzbietowo na całej długości ogonowej zarodka.Przetnij tkankę grzbietową, zaczynając od czwartej komory i kierując się w stronę centralnego kanału ogonowego rdzenia kręgowego, używając kleszczy jako nożyczek. Następnie przytrzymaj zarodek jednym zestawem pęsety i ściśnij płat tkanki grzbietowej z każdej strony drugą parą. Usuń brzuszny rdzeń kręgowy za pomocą noża do mikrodysekcji, aby przebić się bezpośrednio pod dodatnim SMN GFP, podnosząc brzuszny rdzeń kręgowy ruchami przypominającymi piłę po obu stronach.Przeciąć rdzeń kręgowy poprzecznie na górnej granicy kończyny dolnej i usunąć odcinek lędźwiowy szyjny. Przeciąć poprzecznie bezpośrednio nad C1, gdzie wystaje pierwszy przedni róg dodatni GFP. Umieść brzuszny rdzeń kręgowy grzbietową stroną do góry i przytrzymaj go, naciskając ujemną tkankę GFP między kolumnami GFP dodatni SMN za pomocą pęsety.Usuń pozostałą przyczepioną mezenchymę, DRG i grzbietowy rdzeń kręgowy, przycinając obie strony kolumny SMN z dodatnim GFP za pomocą noża do mikrodysekcji. Użyj pipety P1000, aby zebrać wypreparowaną tkankę brzusznego rdzenia kręgowego z minimalnym HBSS i umieść ją w oznakowanej 1,7 mililitrowej probówce do mikrowirówki wypełnionej pożywką do preparacji. Przechowuj go na lodzie do czasu dysocjacji i kontynuuj pobieranie brzusznego rdzenia kręgowego z dodatkowych zarodków w tej samej probówce.Dodać odpowiednią objętość roztworu papainy do każdej z probówek do mikrowirówek z wypreparowanymi próbkami tkanek. Inkubować probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, mieszając probówki co 10 minut, przesuwając palcem. Po inkubacji delikatnie rozetrzeć każdą zawiesinę osiem razy pipetą P200 i odwirować ją w ilości 300 razy g przez pięć minut.Zawiesić osady komórkowe z odpowiednią objętością roztworu inhibitora albuminy owomukoidów, delikatnie pipetując w górę iw dół. Powtórzyć wirowanie. Następnie ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety P1000.Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości pożywki preparyjnej. Przefiltrować zawiesiny przez sitko o średnicy 70 mikrometrów. Następnie użyj sortowania FACS, aby wyizolować komórki GFP dodatnie wypreparowane z CN3 / CN4 i SMN.Rozcieńczyć izolowane zawiesiny komórkowe pożywką do hodowli neuronów ruchowych wstępnie ogrzaną do 37 stopni Celsjusza do odpowiedniej gęstości i dodać 200 mikrolitrów zawiesiny do studzienki 96-dołkowej płytki pokrytej lamininą PDL. Hoduj neurony w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, upewniając się, że pożywka do hodowli neuronów ruchowych jest odświeżana co pięć dni. Kiedy pomyślnie wyizolowane neurony hodowano w hodowli, uzyskano prawie czyste pierwotne kultury CN3/CN4 i SMN, które utrzymywano przez 14 dni in vitro.Czystość kultur po dwóch dniach in vitro wynosiła 93,5% dla CN3 / CN4 i 86,7% dla SMN w ocenie immunocytochemicznej z markerem neuronu ruchowego Islet1 i markerem neuronalnym TUJ1. Czystość zależała w dużej mierze od wieku zarodków i od ustalenia odpowiednich progów dla bramek GFP podczas FACS. Czystość neuronów wyizolowanych z zarodków E10,5 była porównywalna do czystości zarodków E11,5.Jednak czystość znacznie spadła, gdy użyto zarodków E13,5. Aby ustalić, czy pierwotne CN3 / CN4 i SMN wykazywały zróżnicowane odpowiedzi na stresory retikulum endoplazmatycznego, komórki traktowano różnymi stężeniami kwasu cyklopiazonowego lub CPA przez dwa dni in vitro i utrwalano trzy dni później do immunocytochemii w celu oceny wskaźników przeżycia. Policzono liczbę żywotnych neuronów w każdej próbce i obliczono współczynniki przeżycia.Monokultury CN3/CN4 były znacznie bardziej odporne na leczenie CPA w porównaniu z monokulturami SMN. Po tej procedurze można wykonać wiele dodatkowych metod w celu zbadania neuronów ruchowych. Kilka przykładów obejmuje badania nad elektrofizjologią, biologią komórki, transkrypcją lub dostępnością chromatyny.

isolation-culture-oculomotor-trochlear-spinal-motor-neurons-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy protokół oparty na małych cząsteczkach służący do różnicowania mysich embrionalnych komórek macierzystych w komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC). Protokół ten pozwala na wysokowydajne generowanie komórek OPC Olig2+NG2+ w ciągu 30 dni różnicowania. Opisujemy również metodę generowania „spiking” OPC, które są zdolne do generowania potencjałów czynnościowych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych w prekursory oligodendrocytów

Opisano alternatywną metodę izolacji embrionalnych motoneuronów mysich z rdzenia kręgowego. Metoda ta wykorzystuje fakt, że lektyna może wiązać się z niskopodobnym receptorem czynnika wzrostu nerwów p75NTR. To oparte na lektynach wstępne wysiewanie (preplating) pozwala na puryfikację podobną do tej uzyskiwanej za pomocą specyficznego przeciwciała przeciwko p75NTR.

Izolacja i hodowla embrionalnych motoneuronów myszy z wykorzystaniem lektyn

Film pokazuje izolację neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych od transgenicznego zarodka myszy. Zarodek wykazuje ekspresję neuronów ruchowych znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w celu łatwej wizualizacji i identyfikacji. Neurony ruchowe są chirurgicznie izolowane pod mikroskopem fluorescencyjnym i utrzymywane w pożywce hodowlanej.

Izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych z zarodka myszy

Ten film demonstruje hodowlę ex vivo i obrazowanie wycinków okoruchowych z transgenicznych embrionów myszy. Zarodki są izolowane i osadzane w agarozie. Za pomocą wibratomu uzyskuje się plastry zawierające jądra okoruchowe i oczy. Plastry są utrzymywane w kulturze i obrazowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Hodowla ex vivo i obrazowanie wycinków okoruchowych z transgenicznych zarodków myszy

Wideo pokazuje proces izolacji i hodowli neuronów dopaminowych ze śródmózgowia embrionów myszy. Izolowane brzuszne dno śródmózgowia jest dysocjowane za pomocą enzymów. Powstałe neurony dopaminowe są zbierane i przenoszone do mikrowysp wewnątrz płytek wielodołkowych. Komórki są inkubowane z pożywką neuronów dopaminowych, aby utrzymać komórki w dużej gęstości wewnątrz mikrowysp.

Izolacja i hodowla pierwotnych embrionalnych neuronów dopaminowych śródmózgowia myszy

Przyczyny degeneracji neuronów dopaminergicznych śródmózgowia podczas choroby Parkinsona nie są w pełni zrozumiałe. Systemy hodowli komórkowych stanowią niezbędne narzędzie do badania właściwości neurofizjologicznych tych neuronów. Poniżej przedstawiamy zoptymalizowany protokół, który może być wykorzystany do modelowania neurodegeneracji in vitro.

Izolacja, hodowla i długotrwałe utrzymanie pierwotnych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych z embrionalnych mózgów gryzoni

Opisujemy immunomagnetyczną izolację pierwotnych oligodendrocytów myszy, która pozwala na szybką i specyficzną izolację komórek do hodowli in vitro.

Szybka i swoista izolacja immunomagnetyczna pierwotnych oligodendrocytów myszy

Celem tej techniki jest przygotowanie wysoce wzbogaconej kultury pierwotnych neuronów ruchowych (MN) z mysiego rdzenia kręgowego. Aby ocenić konsekwencje mutacji powodujących choroby MN, opisujemy tutaj izolację tych izolowanych MN i ich transfekcję przez magnetofekcję.

Modelowanie choroby Charcota-Marie-Tootha in vitro poprzez transfekcję pierwotnych neuronów ruchowych myszy

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Test ex vivo pozwala na obrazowanie przerostu nerwu okoruchowego w czasie rzeczywistym. Plastry są generowane przez osadzenie zarodków E10.5 IslMN:GFP w agarozie, krojenie na wibratomie i wzrost w inkubatorze typu stage-top. Rolę szlaków naprowadzania aksonów ocenia się poprzez dodanie inhibitorów do pożywki hodowlanej.

Hodowla plastrów okulomotorycznych ex vivo od embrionalnych myszy z ekspresją GFP do obrazowania poklatkowego wzrostu nerwu okoruchowego

Zwoje rzęskowe piskląt (CG) są częścią przywspółczulnego układu nerwowego. Wykazano, że hodowle neuronów CG piskląt są skutecznymi modelami komórkowymi w badaniu interakcji między mięśniami nerwowymi. Opisujemy szczegółowy protokół sekcji, dysocjacji i hodowli in vitro neuronów CG z zarodków piskląt.

Izolacja i hodowla neuronów zwojowych rzęsek piskląt

Naucz się izolacji i hodowli neuronów ruchowych okoruchowych oraz rdzeniowych z myszy transgenicznych. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów chorób neuronów ruchowych i porównanie ich wrażliwości na degenerację.

Izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych myszy transgenicznych z grupy prenatalnej ^mn:GFP

Przeglądaj więcej filmów