Badanie wpływu ligandów parakrynnych wydzielanych przez guz na aktywację makrofagów przy użyciu kokultury z przepuszczalnymi nośnikami błonowymi

Ta metoda kohodowli Transwell jest stosowana do badania sygnalizacji parakrynnej wykorzystywanej przez komórki nowotworowe do tłumienia odpowiedzi immunologicznej. Metoda ta może być wykorzystana do odkrycia nowych wydzielanych ligandów, a także mechanistycznych podstaw ich działania immunosupresyjnego. Wcześniej stosowaliśmy tę metodę, aby pokazać, w jaki sposób czynniki wydzielane przez guz mogą tłumić transkrypcję genów prozapalnych makrofagów.

Uważamy, że to narzędzie ma szerokie implikacje w badaniach nad supresją immunologiczną pochodzącą z nowotworu. Jedną z głównych zalet tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do badania sygnalizacji parakrynnej między komórkami nowotworowymi a komórkami odpornościowymi bez potencjalnie mylącej zmiennej, jaką jest kontakt międzykomórkowy. Platforma ta jest również podatna na różnorodne techniki biologii molekularnej do dalszej analizy.

Po zebraniu makrofagów otrzewnowych umieść je bezpośrednio w górnych komorach sześciodołkowej płytki z membraną poliestrową o grubości 0,4 mikrometra. Następnie dodano uzupełniony DMEM do studzienki tak, aby górna komora zawierała jeden mililitr, a dolna komora zawierała 1,5 mililitra. Inkubować przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Po pierwsze, hoduj dostępne na rynku komórki nowotworowe w ich odpowiednim pożywce, zgodnie z zalecanymi przez ATCC metodami hodowli tkankowej. Następnie umyj przylegające komórki nowotworowe raz za pomocą PBS. Dodaj 0,05% trypsyny do EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki się oderwą.

Następnie ponownie zawieś komórki na nośniku zawierającym FBS. Użyj hemocytometru lub licznika komórek, aby określić ilościowo całkowitą liczbę komórek i odwirować przy 220 razy G przez pięć minut w celu osadzania. Podczas wirowania należy zassać pożywkę z górnej i dolnej komory makrofaga zawierającego przepuszczalne membranowe płytki nośne i zastąpić świeżą pożywką.

W przypadku dolnych komór, w których zostaną posiane komórki nowotworowe, wypełnij je jednym mililitrem pożywki zamiast 1,5 mililitra, aby pozostawić wystarczającą objętość do dodania komórek. Po zakończeniu wirowania odessać pożywkę z granulowanych komórek nowotworowych i ponownie zawiesić komórki w uzupełnionym DMEM w stężeniu 300 000 komórek na mililitr. Dodaj 0,5 mililitra tej zawiesiny komórek do dolnej komory żądanych studzienek.

Aby indukować ekspresję genów prozapalnych makrofagów, należy leczyć makrofagi pojedynczo lub z hodowlą współistniejącą, dodając interferon gamma o stężeniu 100 nanogramów na mililitr i LPS o stężeniu 50 nanogramów na mililitr. W razie potrzeby należy zmieniać czas trwania leczenia w hodowli. Aktywacja makrofagów następuje w ciągu dwóch godzin, a pewna supresja za pośrednictwem guza następuje w ciągu ośmiu godzin.

Wspólna hodowla przez 24 godziny zapewnia solidną i spójną supresję pochodzącą z guza. Jako kontrolę negatywną, makrofagi hoduje się pojedynczo i pozostawia nieleczone. Jako kontrolę pozytywną należy poddać pojedynczo hodowane makrofagi interferonem gamma i LPS w tych samych stężeniach, które zastosowano w próbkach.

Po upływie pożądanego czasu inkubacji należy wyizolować lizat komórkowy lub kondycjonować pożywkę hodowlaną zgodnie z potrzebami, w zależności od potrzeb testowych. Aby wyizolować lizat komórkowy do ilościowej analizy łańcuchowej reakcji polimerazy, należy odessać pożywkę z obu komór studni i przemyć raz dwoma mililitrami PBS. Nałożyć bufor do lizy RNA do górnej komory zawierającej makrofagi.

Następnie delikatnie zeskrob membranę, aby uwolnić lizat komórkowy i przenieś go do probówki zbiorczej w celu dalszego przetwarzania zgodnie z protokołem producenta zestawu do izolacji RNA. Opisana tutaj metoda kohodowli polega na hodowli makrofagów i komórek nowotworowych bez kontaktu fizycznego. Makrofagi otrzewnowe hodowane przy braku komórek nowotworowych są stosowane jako kontrole negatywne i pozytywne.

Makrofagi otrzewnowe hodowane wspólnie w obecności komórek nowotworowych B16F10, ale bez bodźców aktywujących, nie zwiększają ekspresji genów związanych z prozapaleniem. Oznacza to, że ligandy wydzielane przez guz albo nie są wystarczające do samodzielnego wywołania prozapalnej ekspresji genów, albo jeśli dochodzi do aktywacji immunologicznej przez wydzieliny guza, ligandy parakrynne są wystarczające, aby stłumić ją do jej natywnego poziomu. Ta metoda kohodowli ilustruje, że gdy makrofagi spolaryzowane przez interferon gamma i LPS są hodowane w obecności komórek nowotworowych, supresja ekspresji genów związanych ze stanem zapalnym została zmniejszona nawet o 60%Porównywalny poziom supresji genów prozapalnych makrofagów obserwuje się, gdy mysia linia komórkowa makrofagów J774 jest podstawiona na makrofagi otrzewnowe.

Wcześniejsze prace zidentyfikowały białko S jako czynnik wydzielany przez nowotwór, który może hamować aktywację makrofagów, dlatego model kohodowli przepuszczalnego nośnika błony jest używany w połączeniu z lizą A do oznaczania stężenia białka S w kondycjonowanych pożywkach po 24 godzinach. W kondycjonowanych pożywkach z komórek czerniaka B16F10 leczonych interferonem gamma i LPS, białko S ulega ekspresji w stężeniu około 475 nanogramów na mililitr. Makrofagi otrzewnowe traktowane w tych samych warunkach wykazywały ekspresję białka S na poziomie około 61 nanogramów na mililitr.

Co ciekawe, podczas wspólnej hodowli stężenie białka S w interferonie gamma i studni traktowanej LPS wynosiło około 86 nanogramów na mililitr. Sugeruje to, że albo makrofagi spożywają białko S wydzielane przez nowotwór, albo że ilość białka S wydzielanego przez komórki B16F10 jest znacznie zmniejszona w obecności makrofagów. Wyniki te podkreślają głębokie zmiany w aktywacji makrofagów i sygnalizacji parakrynnej, gdy makrofagi są hodowane jednocześnie z komórkami nowotworowymi.

Metoda kohodowli Transwell może odpowiedzieć na wiele pytań dotyczących sygnalizacji parakrynnej. Analizę Western blot można przeprowadzić w celu określenia, w jaki sposób białka wydzielane przez guz zmieniają różne szlaki sygnałowe w makrofagach.