Name: Badanie wpływu ligandów parakrynnych wydzielanych przez guz na aktywację makrofagów przy użyciu kokultury z przepuszczalnymi nośnikami błonowymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Poznaj metodę kokultury Transwell do badania parakrynnej sygnalizacji guz-makrofag bez bezpośredniego kontaktu komórkowego. Technika umożliwia identyfikację sekretowanych ligandów immunosupresyjnych i analizę molekularną mechanizmów hamowania aktywacji makrofagów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Eric Ubil został częściowo sfinansowany przez American Cancer Society Postdoctoral Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). Prace były wspierane przez grant z NIH (R01-CA205398) oraz nagrodę Fundacji Badań nad Rakiem Piersi (BCRF-18-041) dla HSE.

Wszystkie procedury związane z pozyskiwaniem i używaniem mysich makrofagów otrzewnowych zostały przeprowadzone na Uniwersytecie Północnej Karoliny w Chapel Hill (UNC) i zostały zatwierdzone przez UNC Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Kultura makrofagów
UWAGA: Ta procedura może wykorzystywać pierwotne makrofagi otrzewnowe (opisane szczegółowo poniżej), makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego lub linie komórkowe makrofagów, takie jak J774 (ATCC) lub RAW264 (ATCC).
<ol>
	<li>Zbierz makrofagi otrzewnowe zgodnie z wcześniejszym opisem16,17 i umieść bezpośrednio w górnej komorze (komorach) płytki 6-dołkowej z wkładką z membrany poliestrowej 0,4 μm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
	UWAGA: Przybliżona wydajność makrofagów z każdej izolacji wynosi łącznie 1 x 106 komórek, więc średnia liczba komórek na studzienkę wynosi ~ 1,5–1,6 x 105 komórek na płytce 6-dołkowej.</li>
	<li>Hodowla zebranych makrofagów w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Eagle Medium (DMEM)/F12, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1x penicylina/streptomycyna, 20 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) przez 3 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 
	UWAGA: Górna komora zawiera 1 ml pożywki hodowlanej, podczas gdy dolna komora jest wypełniona 1,5 ml. Do każdej komory należy dodać pożywkę.</li>
</ol>
2. Kokultura komórek nowotworowych z makrofagami
<ol>
	<li>Przed użyciem należy wyhodować dostępne w handlu komórki nowotworowe w ich odpowiednim pożywce, postępując zgodnie z metodami hodowli tkankowych zalecanymi przez ATCC.</li>
	<li>Przemyć przylegające komórki nowotworowe raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), dodać 0,05% trypsyny + kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) i inkubować w temperaturze 37 °C, aż komórki się odłączą. Ponownie zawiesić komórki w pożywce zawierającej FBS, oznaczyć ilościowo całkowitą liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub licznika komórek, a następnie wirować przez 5 minut przy 220 x g do osadzania.</li>
	<li>Podczas wirowania należy zassać pożywkę z górnej i dolnej komory przepuszczalnych membranowych płytek nośnych zawierających makrofagi i zastąpić świeżą pożywką.
	<ol>
		<li>W przypadku dolnych komór, w których komórki nowotworowe będą powlekane, należy wypełnić 1 ml pożywki zamiast 1,5 ml, aby zapewnić wystarczającą objętość do dodania komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odessać pożywkę z granulowanych komórek nowotworowych i zawiesić komórki w DMEM/F12 z 10% FBS, 1x penicyliną/streptomycyną i 20 ng/mL M-CSF w stężeniu 3 x 105 komórek/ml.</li>
	<li>Dodaj 0,5 ml 3 x 105 komórek/ml komórek nowotworowych do dolnej komory pożądanych studzienek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B). 
	UWAGA: Komórki można leczyć natychmiast.</li>
</ol>
3. Leczenie komórek współhodowanych
<ol>
	<li>Aby indukować prozapalną ekspresję genów makrofagów, należy traktować makrofagi hodowane pojedynczo lub w kogeneracji, dodając 100 ng / ml IFNγ i 50 ng / ml LPS.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby należy zmieniać czas trwania leczenia w hodowli. Aktywacja makrofagów następuje w ciągu 2 godzin, a pewna supresja za pośrednictwem guza następuje po 8 godzinach. Kohodowla przez 24 godziny zapewnia solidną i spójną supresję pochodzącą z guza. 
		UWAGA: Alternatywnie, makrofagi można skłonić do przyjęcia fenotypu sprzyjającego gojeniu się ran poprzez dodanie czynników, takich jak interleukina-10 (IL10) i oceniany wpływ ligandu wydzielanego przez nowotwór.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jako kontrolę negatywną, makrofagi hoduje się pojedynczo i pozostawia nieleczone. Jako kontrolę pozytywną należy traktować makrofagi hodowane pojedynczo za pomocą 100 ng/ml IFNγ i 50 ng/ml LPS.</li>
</ol>
4. Dalsza analiza współhodowanych komórek
<ol>
	<li>Po upływie pożądanego czasu inkubacji należy wyizolować lizat komórkowy lub kondycjonowaną pożywkę hodowlaną zgodnie z potrzebami, w zależności od potrzeb testowych.</li>
	<li>Aby wyizolować lizat komórkowy do ilościowej analizy reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), należy odessać pożywkę z obu komór studzienki i przemyć raz 2 ml PBS. Nałożyć bufor do lizy RNA do górnej komory zawierającej makrofagi. Delikatnie zeskrob membranę, aby uwolnić lizat komórkowy i przenieś do probówki zbiorczej w celu dalszego przetwarzania zgodnie z protokołem producenta zestawu do izolacji RNA.</li>
</ol>

<ol><li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li>
<li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li>
<li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+B7-H1+promotes+T-cell+apoptosis%3A+a+potential+mechanism+of+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.</a> Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).</li>
<li>Sznol, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonist+antibodies+to+PD-1+and+B7-H1+%28PD-L1%29+in+the+treatment+of+advanced+human+cancer--response%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response.</a> Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542(2013).</li>
<li>Kortylewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+IL-23+and+IL-12+balance+by+Stat3+signaling+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).</li>
<li>Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-induced+interleukin-10+inhibits+type+1+immune+responses+directed+at+a+tumor+antigen+as+well+as+a+non-tumor+antigen+present+at+the+tumor+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site.</a> Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+innate+and+adaptive+immune+responses+by+Stat-3+signaling+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells.</a> Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).</li>
<li>Mazzoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+suppressor+lines+inhibit+T+cell+responses+by+an+NO-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).</li>
<li>Zea, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginase-producing+myeloid+suppressor+cells+in+renal+cell+carcinoma+patients%3A+a+mechanism+of+tumor+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion.</a> Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).</li>
<li>Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+macrophage+content+in+human+breast+cancer+is+not+associated+with+favourable+prognostic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors.</a> British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).</li>
<li>Evans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T-+and+B+lymphocyte+responses+to+mitogens+by+tumor-associated+macrophages%3A+the+dependency+on+the+stage+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth.</a> Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).</li>
<li>Noy, R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages%3A+from+mechanisms+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li>
<li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li>
<li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).</li>
<li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144(2018).</li>
<li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li>
<li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).</li>
<li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+%28Taxol%29+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj test kohodowli jest modyfikacją wcześniej ustalonych testów, która pozwala na badanie czynników wydzielanych przez nowotwór na aktywację komórek odpornościowych. Podczas gdy wiadomo, że kontakt komórka-komórka indukuje zmiany w aktywności immunologicznej, zdolność ligandów wydzielanych przez guz do modulowania aktywacji immunologicznej jest mniej dobrze poznana. Opisujemy metodę, która, w przeciwieństwie do bezpośredniej kohodowli, może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób czynniki wydzielane p...

Ostatnie badania skupiały się na zdolności komórek nowotworowych do unikania wykrycia przez komórki odpornościowe, tłumienia lokalnej aktywacji immunologicznej lub wytwarzania tolerogennego środowiska permisywnego dla guza w mikrośrodowisku guza. Opisano dwie szerokie klasy interakcji między guzem a komórkami odpornościowymi, które ułatwiają te efekty: interakcje kontaktowe lub ligandy wydzielane przez nowotwór. Jednym z najlepiej zbadanych i klinicznie wykonalnych mechanizmów kontaktowego hamowania immunologicznego wykorzystywanego przez nowotwory jest ekspresja PD-L1, która oddziałuje z PD-1 na limfocytach T, hamując ich aktywację i funkcję1,2. W odpowiedzi na interferon-gamma (IFNγ), który ulega ekspresji przez wiele aktywowanych komórek odpornościowych, komórki nowotworowe mogą zwiększać ekspresję PD-L1, aby wywołać wyczerpanie aktywowanych limfocytów T eksprymujących PD-1, uniemożliwiając im w ten sposób skuteczne wyeliminowanie komórek nowotworowych3. Stosowanie przeciwciał w celu zablokowania interakcji między PD-L1 i PD-1 jest obecnie stosowane w leczeniu wielu typów nowotworów u ludzi4. W świetle tego i innych sukcesów klinicznych, coraz większą uwagę poświęca się identyfikacji i celowaniu w mechanizmy immunosupresyjne pochodzenia nowotworowego.
Poza tłumieniem odporności adaptacyjnej, nowotwory są również znane z tego, że wydzielają czynniki, które tłumią prozapalne reakcje wrodzonych komórek odpornościowych. Wykazano, że wydzieliny pochodzące z guza lub wywołane przez nowotwór, w tym IL-6, IL-10, VEGF, IL-23 i czynnik stymulujący tworzenie kolonii (CSF-1), hamują odpowiedzi przeciwnowotworowe komórek NK (natural killer), granulocytów i komórek dendrytycznych w mikrośrodowisku guza5,6,7. Komórki nowotworowe mogą również wydzielać czynniki, które zniekształcają rekrutację i różnicowanie komórek pochodzących z mieloidu w mikrośrodowisku guza, aby promować supresję aktywacji limfocytów T8,9.
Jednym z typów wrodzonych komórek odpornościowych, które mają głęboki wpływ na postęp nowotworu, są makrofagi. Przez wiele lat obecność makrofagów związanych z nowotworem (TAM) była wykorzystywana jako negatywny prognostyk przeżycia pacjenta10. Koncepcja, że immunosupresyjne TAM tłumią klirens nowotworów za pośrednictwem komórek odpornościowych, została wprowadzona ponad 40 lat temu11. Niedawno wykazano, że odpowiedź prozapalna makrofagów może być obniżona, podczas gdy fenotyp pronowotworowy może być indukowany w mikrośrodowisku guza. Te immunosupresyjne makrofagi mogą przyczyniać się do odpowiedzi tolerogennej, napędzając progresję guza i oporność na chemio- i immunoterapię12. Biorąc pod uwagę, że makrofagi są często jednymi z najliczniejszych leukocytów z guzem, przywrócenie ich specyficznej dla nowotworu aktywności immunologicznej stanowi potencjalny cel dla terapii przeciwnowotworowych13.
Podczas gdy interakcje kontaktowe między komórkami nowotworowymi a makrofagami mogą być modelowane poprzez bezpośrednią kokulturę, użycie przepuszczalnych podpór błonowych może wyjaśnić, które czynniki wydzielane przez nowotwór są immunomodulujące, bez potencjalnie mylącego wpływu kontaktu komórka-komórka nowotworowo-immunologiczna. Korzystając z nieco podobnych metod, inni wykazali potencjał identyfikacji wydzielanych czynników w interakcjach mikrogleju/neuronów14, a także komórek nowotworowych z komórkami międzybłonka15. Z powodzeniem wykorzystaliśmy również tę technikę kohodowli do scharakteryzowania roli białka wydzielanego przez nowotwór, Pros1, jako supresora ekspresji genów prozapalnych po stymulacji makrofagów otrzewnowych za pomocą LPS i interferonu gamma16. Tutaj opisujemy prostą metodologię, którą można wykorzystać do zbadania, w jaki sposób czynniki wydzielane przez guz mogą wpływać na aktywację makrofagów.

<table><tbody><tr><td>B16-F10</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-6475</td><td></td></tr> zestaw <tr><td>do syntezy cDNA</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>podłoże ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Milipore Milipore</td><td>płodowej surowicy bydlęcej</td><td>TMS-013-B</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-67</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy z Escherichia coli O111:B4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5293-2ML</td><td></td></tr><tr><td>Mysz mysia M-CSF</td><td>Prospec</td><td>CYT-439</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pros1 ELISA</td><td>MyBioSource</td><td>MBS2886720</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz IFN&gamma;</td><td>BioLegend</td><td>575302</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Sensimix SYBR Low-ROX</td><td>Bioline</td><td>QT625-05</td><td></td></tr><tr><td>Przepuszczalne podpory Transwell</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-170</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie wpływu ligandów parakrynnych wydzielanych przez guz na aktywację makrofagów przy użyciu kokultury z przepuszczalnymi nośnikami błonowymi

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Sygnalizacja parakrynna pochodząca z guza jest pomijanym elementem miejscowej immunosupresji i może prowadzić do powstawania środowiska sprzyjającego ciągłemu wzrostowi raka i przerzutom. Sygnały parakrynne mogą obejmować kontakt komórka-komórka między różnymi typami komórek, takimi jak PD-L1 wyrażony na powierzchni guzów oddziałujących bezpośrednio z PD-1 na powierzchni limfocytów T lub wydzielanie ligandów przez komórkę nowotworową w celu wpływu na komórkę odpornościową. Tutaj opisujemy metodę kohodowli w celu zbadania wpływu ligandów wydzielanych przez guz na aktywację komórek odpornościowych (makrofagów). Ta prosta procedura wykorzystuje dostępne na rynku membrany poliwęglanowe o średnicy 0,4 μm, przepuszczalne podłoża i standardowe płytki do hodowli tkankowych. W opisanym procesie makrofagi są hodowane w górnej komorze, a komórki nowotworowe w dolnej komorze. Obecność bariery 0,4 μm pozwala na badanie sygnalizacji międzykomórkowej bez zakłócającej zmiennej, jaką jest kontakt fizyczny, ponieważ te dwa typy komórek mają to samo podłoże i ekspozycję na ligandy parakrynne. Podejście to można połączyć z innymi, takimi jak zmiany genetyczne makrofagów (np. izolacja od myszy z genetycznym nokautem) lub guz (np. zmiany za pośrednictwem CRISPR) w celu zbadania roli określonych wydzielanych czynników i receptorów. Podejście to nadaje się również do standardowych analiz biologii molekularnej, takich jak ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) lub analiza Western blot, bez konieczności sortowania przepływowego w celu oddzielenia dwóch populacji komórek. Testy immunoenzymatyczne (ELISA) mogą być podobnie wykorzystywane do pomiaru wydzielanych ligandów, aby lepiej zrozumieć dynamiczną interakcję sygnalizacji komórkowej w kontekście wielu typów komórek. Czas trwania kokultury może być również zróżnicowany w celu badania zdarzeń regulowanych czasowo. Ta metoda kohodowli jest solidnym narzędziem, które ułatwia badanie sygnałów wydzielanych przez guz w kontekście immunologicznym.

W celu określenia wpływu ligandów wydzielanych przez guza na polaryzację makrofagów zastosowano opisaną procedurę. Makrofagi otrzewnowe hodowane bez komórek nowotworowych posłużyły jako kontrola ujemna (niepoddane działaniu czynników = skrajna lewa strona) oraz dodatnia (stymulowane IFNγ i LPS = 2nd (od lewej) kontrole (Rycina 2A). Alternatywnie, makrofagi otrzewnowe współhodowano z komórkami czerniaka B16F10 (ATCC) (Rycina 1A). Bezpośrednio po wysiew...

Tutaj prezentujemy metodę wykorzystującą przepuszczalne nośniki błonowe, aby ułatwić badanie bezkontaktowej sygnalizacji parakrynnej używanej przez komórki nowotworowe do tłumienia odpowiedzi immunologicznej. System jest podatny na badanie roli czynników wydzielanych przez nowotwór w tłumieniu aktywacji makrofagów.

Badanie wpływu ligandów parakrynnych wydzielanych przez guz na aktywację makrofagów przy użyciu kokultury z przepuszczalnymi nośnikami błonowymi

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Ta metoda kohodowli Transwell jest stosowana do badania sygnalizacji parakrynnej wykorzystywanej przez komórki nowotworowe do tłumienia odpowiedzi immunologicznej. Metoda ta może być wykorzystana do odkrycia nowych wydzielanych ligandów, a także mechanistycznych podstaw ich działania immunosupresyjnego. Wcześniej stosowaliśmy tę metodę, aby pokazać, w jaki sposób czynniki wydzielane przez guz mogą tłumić transkrypcję genów prozapalnych makrofagów.Uważamy, że to narzędzie ma szerokie implikacje w badaniach nad supresją immunologiczną pochodzącą z nowotworu. Jedną z głównych zalet tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do badania sygnalizacji parakrynnej między komórkami nowotworowymi a komórkami odpornościowymi bez potencjalnie mylącej zmiennej, jaką jest kontakt międzykomórkowy. Platforma ta jest również podatna na różnorodne techniki biologii molekularnej do dalszej analizy.Po zebraniu makrofagów otrzewnowych umieść je bezpośrednio w górnych komorach sześciodołkowej płytki z membraną poliestrową o grubości 0,4 mikrometra. Następnie dodano uzupełniony DMEM do studzienki tak, aby górna komora zawierała jeden mililitr, a dolna komora zawierała 1,5 mililitra. Inkubować przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Po pierwsze, hoduj dostępne na rynku komórki nowotworowe w ich odpowiednim pożywce, zgodnie z zalecanymi przez ATCC metodami hodowli tkankowej. Następnie umyj przylegające komórki nowotworowe raz za pomocą PBS. Dodaj 0,05% trypsyny do EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki się oderwą.Następnie ponownie zawieś komórki na nośniku zawierającym FBS. Użyj hemocytometru lub licznika komórek, aby określić ilościowo całkowitą liczbę komórek i odwirować przy 220 razy G przez pięć minut w celu osadzania. Podczas wirowania należy zassać pożywkę z górnej i dolnej komory makrofaga zawierającego przepuszczalne membranowe płytki nośne i zastąpić świeżą pożywką.W przypadku dolnych komór, w których zostaną posiane komórki nowotworowe, wypełnij je jednym mililitrem pożywki zamiast 1,5 mililitra, aby pozostawić wystarczającą objętość do dodania komórek. Po zakończeniu wirowania odessać pożywkę z granulowanych komórek nowotworowych i ponownie zawiesić komórki w uzupełnionym DMEM w stężeniu 300 000 komórek na mililitr. Dodaj 0,5 mililitra tej zawiesiny komórek do dolnej komory żądanych studzienek.Aby indukować ekspresję genów prozapalnych makrofagów, należy leczyć makrofagi pojedynczo lub z hodowlą współistniejącą, dodając interferon gamma o stężeniu 100 nanogramów na mililitr i LPS o stężeniu 50 nanogramów na mililitr. W razie potrzeby należy zmieniać czas trwania leczenia w hodowli. Aktywacja makrofagów następuje w ciągu dwóch godzin, a pewna supresja za pośrednictwem guza następuje w ciągu ośmiu godzin.Wspólna hodowla przez 24 godziny zapewnia solidną i spójną supresję pochodzącą z guza. Jako kontrolę negatywną, makrofagi hoduje się pojedynczo i pozostawia nieleczone. Jako kontrolę pozytywną należy poddać pojedynczo hodowane makrofagi interferonem gamma i LPS w tych samych stężeniach, które zastosowano w próbkach.Po upływie pożądanego czasu inkubacji należy wyizolować lizat komórkowy lub kondycjonować pożywkę hodowlaną zgodnie z potrzebami, w zależności od potrzeb testowych. Aby wyizolować lizat komórkowy do ilościowej analizy łańcuchowej reakcji polimerazy, należy odessać pożywkę z obu komór studni i przemyć raz dwoma mililitrami PBS. Nałożyć bufor do lizy RNA do górnej komory zawierającej makrofagi.Następnie delikatnie zeskrob membranę, aby uwolnić lizat komórkowy i przenieś go do probówki zbiorczej w celu dalszego przetwarzania zgodnie z protokołem producenta zestawu do izolacji RNA. Opisana tutaj metoda kohodowli polega na hodowli makrofagów i komórek nowotworowych bez kontaktu fizycznego. Makrofagi otrzewnowe hodowane przy braku komórek nowotworowych są stosowane jako kontrole negatywne i pozytywne.Makrofagi otrzewnowe hodowane wspólnie w obecności komórek nowotworowych B16F10, ale bez bodźców aktywujących, nie zwiększają ekspresji genów związanych z prozapaleniem. Oznacza to, że ligandy wydzielane przez guz albo nie są wystarczające do samodzielnego wywołania prozapalnej ekspresji genów, albo jeśli dochodzi do aktywacji immunologicznej przez wydzieliny guza, ligandy parakrynne są wystarczające, aby stłumić ją do jej natywnego poziomu. Ta metoda kohodowli ilustruje, że gdy makrofagi spolaryzowane przez interferon gamma i LPS są hodowane w obecności komórek nowotworowych, supresja ekspresji genów związanych ze stanem zapalnym została zmniejszona nawet o 60%Porównywalny poziom supresji genów prozapalnych makrofagów obserwuje się, gdy mysia linia komórkowa makrofagów J774 jest podstawiona na makrofagi otrzewnowe.Wcześniejsze prace zidentyfikowały białko S jako czynnik wydzielany przez nowotwór, który może hamować aktywację makrofagów, dlatego model kohodowli przepuszczalnego nośnika błony jest używany w połączeniu z lizą A do oznaczania stężenia białka S w kondycjonowanych pożywkach po 24 godzinach. W kondycjonowanych pożywkach z komórek czerniaka B16F10 leczonych interferonem gamma i LPS, białko S ulega ekspresji w stężeniu około 475 nanogramów na mililitr. Makrofagi otrzewnowe traktowane w tych samych warunkach wykazywały ekspresję białka S na poziomie około 61 nanogramów na mililitr.Co ciekawe, podczas wspólnej hodowli stężenie białka S w interferonie gamma i studni traktowanej LPS wynosiło około 86 nanogramów na mililitr. Sugeruje to, że albo makrofagi spożywają białko S wydzielane przez nowotwór, albo że ilość białka S wydzielanego przez komórki B16F10 jest znacznie zmniejszona w obecności makrofagów. Wyniki te podkreślają głębokie zmiany w aktywacji makrofagów i sygnalizacji parakrynnej, gdy makrofagi są hodowane jednocześnie z komórkami nowotworowymi.Metoda kohodowli Transwell może odpowiedzieć na wiele pytań dotyczących sygnalizacji parakrynnej. Analizę Western blot można przeprowadzić w celu określenia, w jaki sposób białka wydzielane przez guz zmieniają różne szlaki sygnałowe w makrofagach.

studying-effects-tumor-secreted-paracrine-ligands-on-macrophage

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film demonstruje test do badania regulacji fagocytozy makrofagów za pomocą mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w kokulturze. Po jednoczesnej hodowli MSC z makrofagami, nieopsonizowane cząstki zymosanu sprzężone z fluoroforem wrażliwym na pH są dodawane w celu fagocytozy przez makrofagi. Wraz ze wzrostem fagocytozy wzrasta intensywność fluorescencji, co pozwala na określenie regulacji aktywności fagocytarnej za pośrednictwem MSC.

Test do badania regulacji fagocytozy makrofagów przez mezenchymalne komórki macierzyste

Tutaj prezentujemy protokół do ko-hodowli w trzech wymiarach, który jest przydatny do badania interakcji wielokomórkowych i zależnej od macierzy zewnątrzkomórkowej modulacji zachowania komórek rakowych. W tym eksperymentalnym modelu komórki rakowe są hodowane na żelach kolagenowych osadzonych w ludzkich fibroblastach związanych z rakiem.

Trójwymiarowy model kokultury dla interakcji guz-zręb

Zrozumienie złośliwego zachowania raka wymaga stworzenia dokładnych modeli interakcji komórek nowotworowych z elementami mikrośrodowiska guza, takimi jak makrofagi. W tym miejscu opisujemy dwie metody badania interakcji komórek glejaka z makrofagami związanymi z nowotworem i mikroglejem, w których oceniany jest wpływ na inwazję glejaka.

Testy kokulturowe w celu zbadania stymulacji makrofagów i mikrogleju inwazji glejaka

Dostosowaliśmy przepuszczalną mikroporowatą wkładkę membranową do naśladowania mikrośrodowiska guza (TME). Model składa się z mieszanej hodowli komórek, pozwala na uproszczone generowanie wysoce wzbogaconych pojedynczych populacji komórek bez użycia znakowania fluorescencyjnego lub sortowania komórek oraz pozwala na badanie komunikacji międzykomórkowej w obrębie TME w warunkach normalnych lub stresowych.

Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

Tutaj opisujemy metodę hodowli trójwymiarowej do analizy morfologii komórek pierwotnego raka piersi, a także do badania ich bezpośrednich/pośrednich interakcji z monocytami i wyników, takich jak degradacja kolagenu, rekrutacja komórek odpornościowych, inwazja komórek i promowanie stanu zapalnego związanego z rakiem.

Analiza komunikacji między monocytami a pierwotnymi komórkami raka piersi w trójwymiarowym systemie opartym na ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME)

Interakcje komórkowe parakrynne i juktakrynowe odgrywają ważną rolę w wielu procesach biologicznych, w tym w progresji guza, odpowiedziach immunologicznych, angiogenezie i rozwoju. W tym przypadku stosuje się metodę hodowli proksymalnej do badania sygnalizacji parakrynnej, w której utrzymywane są zlokalizowane stężenia wydzielanych czynników, jednocześnie zapobiegając bezpośredniemu kontaktowi komórkowemu.

Metoda hodowli proksymalnej do badania sygnalizacji parakrynnej między komórkami

Ten artykuł przedstawia użyteczny test in vitro do oceny zdolności kondycjonowanej pożywki z komórek nowotworowych do przyciągania makrofagów.

Test in vitro w celu zbadania interakcji między guzem a makrofagami

Aktywność fagocytarna makrofagów przeciwko komórkom rakowym, w szczególności komórkom raka sutka myszy 4T1, została zobrazowana w tym badaniu. Stworzono model kokultury żywych komórek i obserwowano go za pomocą kombinacji fluorescencyjnej i różnicowej interferencyjnej mikroskopii kontrastowej. Ocena ta została zobrazowana za pomocą oprogramowania do obrazowania w celu opracowania wielopunktowego filmu poklatkowego.

Poklatkowe obrazowanie 2D aktywności fagocytarnej w komórkach raka sutka myszy M1 Macrophage-4T1 w kokulturach

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów z sferoidą guza w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenu I, z możliwością porównania wpływu rozpuszczalnych i fizycznych właściwości mikrośrodowiska na inwazję komórek.

Test koinwazji sferoidów makrofagów i guzów

Biorąc pod uwagę ograniczone modele ksenoprzeszczepów dostępne do badania interakcji między ludzkim CART-em a komórkami szpikowymi, stworzyliśmy modele in vitro i in vivo , aby zrozumieć wpływ ludzkich makrofagów na komórki CART. Wyniki można potencjalnie uogólnić, aby ocenić rolę makrofagów w mikrośrodowisku guza i przetestować immunoterapie ukierunkowane na makrofagi.

Badanie interakcji między komórkami szpikowymi a limfocytami CAR T in vitro i in vivo

Poznaj metodę kokultury Transwell do badania parakrynnej sygnalizacji guz-makrofag bez bezpośredniego kontaktu komórkowego. Technika umożliwia identyfikację sekretowanych ligandów immunosupresyjnych i analizę molekularną mechanizmów hamowania aktywacji makrofagów.

Badanie wpływu ligandów parakrynnych wydzielanych przez guz na aktywację makrofagów przy użyciu kokultury z przepuszczalnymi nośnikami błonowymi (Wideo) | JoVE Journal

Badanie wpływu ligandów parakrynnych wydzielanych przez guz na aktywację makrofagów przy użyciu kokultury z przepuszczalnymi nośnikami błonowymi

Przeglądaj więcej filmów