Obrazowanie bioluminescencyjne w czasie rzeczywistym dynamiki sygnalizacji Notch podczas neurogenezy myszy

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące znaczenia dynamiki ekspresji genów w proliferacji i różnicowaniu komórek, w szczególności dynamiki cząsteczek sygnałowych Notch w nerwowych komórkach macierzystych. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy monitorować ekspresję genów zarówno in vitro, jak i in vivo z bardzo dużą precyzją za pomocą obrazowania na żywo. Procedurę zademonstruje Hiromi Shimojo, adiunkt z mojego laboratorium, który opracował tę nową technologię.

W przypadku wprowadzenia lucyferazy Dll1 F do NPC, potwierdź brak reakcji na odruch pedałowania w embrionalnym dniu 12,5 do 14,5 ciężarnej myszy przed wykonaniem dwu- lub trzycentymetrowego nacięcia w jamie brzusznej, wzdłuż linii środkowej. Umieść gazę nasączoną PBS wokół nacięcia i użyj kleszczy w kształcie pierścienia, aby ostrożnie wydobyć prawy róg macicy. Po policzeniu zarodków użyj mikrokapilary, aby wstrzyknąć od jednego do dwóch mikrolitrów mieszanego DNA reporterowego lucyferazy Dll1 F do komory kresomózgowia każdego zarodka.

Udane wstrzyknięcie spowoduje zaobserwowanie niebieskiego barwnika na powierzchni macicy. W celu elektroporacji zwilż macicę i elektrodę PBS i delikatnie chwyć głowę pierwszego zarodka. Ustaw dodatnio naładowaną elektrodę po stronie półkuli, w którą wstrzyknięto DNA, i podaj pięć impulsów o napięciu od 30 do 50 woltów, 50 milisekund, z jednosekundową przerwą między impulsami, sprawdzając, czy z ujemnie naładowanej elektrody generowane są pęcherzyki.

Kiedy wszystkie zarodki zostaną wstrzyknięte, zwróć lewy róg macicy do brzucha i użyj 17-milimetrowej igły, aby zamknąć nacięcie jedwabnym szwem 4-0, umieszczając ciepły PBS w jamie brzusznej przed zakończeniem zamykania. Aby stworzyć zdysocjowaną hodowlę NPC, najpierw umieść macicę od 12,5 do 14,5 ciężarnej transgenicznej myszy z ubikwitynową lucyferazyną Dll1 na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej 25 mililitrów lodowatego PBS i użyj mikronożyczek i cienkich kleszczyków, aby usunąć zarodki z macicy. Po odcięciu głów embrionom umieść głowy na nowej 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej lodowaty DMEM/F12 i usuń naskórek i chrząstki otaczające każdy mózg.

Przenieś mózgi do 35-milimetrowej naczynia pod mikroskopem preparacyjnym zawierającym trzy mililitry lodowatego podłoża N2B27. Usuń prawą i lewą kresomózgowie z międzymózgowia. Użyj cienkich kleszczy, aby usunąć opony mózgowe pokrywające powierzchnię kresomózgowia i wypreparować grzbietowo-boczną część kory mózgowia z kresomózgowia.

Po wyizolowaniu wszystkich interesujących tkanek nerwowych użyj pipety P1000, aby przenieść próbki do pojedynczych probówek o pojemności 1,5 mililitra, a następnie użyj pipety P200, aby zassać dodatkowe medium z każdej probówki. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu papainy na parę kory i umieść próbki w temperaturze 24 stopni Celsjusza na 15 minut. Pod koniec inkubacji delikatnie odpipetować próbki 10 razy nową pipetą P1000 i przywrócić probówki do temperatury 24 stopni Celsjusza na dodatkowe 15 minut.

Pod koniec inkubacji należy ponownie delikatnie odpipetować próbki, a następnie zebrać strawione tkanki przez odwirowanie. Odessać supernatanty i delikatnie zawiesić każdą osadkę z jednym mililitrem pożywki DMEM/F12. Odwirować próbki jeszcze trzy razy, jak to właśnie pokazano, delikatnie zawieszając każdą osadkę świeżym mililitrem pożywki po każdym wirowaniu.

Po ostatnim odwirowaniu ponownie zawieś granulki w 500 mikrolitrach pożywki N2B27 uzupełnionej jednomilimolową lucyferyną i zasiew jeden razy 10 do sześciu komórek z każdej próbki na pojedynczych szklanych naczyniach pokrytych poli-L-lizyną. Następnie umieść płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych na jedną godzinę. Gdy komórki przylgną do naczynia, dodaj dwa mililitry świeżej pożywki N2B27 plus jednomilimolową lucyferynę do każdej płytki.

Aby zobrazować ekspresję reporterową lucyferazy w kulturach dysocjacji NPC, wybierz obiektyw immersyjny oleju i umieść naczynie z próbką na stoliku mikroskopu. Wyświetl pole ręcznie, aby określić najlepsze położenie do wyświetlenia komórek, a następnie skoncentruj się na interesujących komórkach. Kliknij przycisk Na żywo, aby uzyskać obraz testowy, a następnie użyj programu Multi-Dimensional Acquisition, aby uruchomić akwizycję poklatkową za pomocą akwizycji dwuwymiarowej luminescencji i jasnego pola przez 24 godziny.

Aby przygotować rozwijające się kultury plastrów kory mózgowej, jeden dzień po wstrzyknięciu reporterowym, należy pobrać embrionalne mózgi zarodkowe od 13,5 do 14,5 dnia, jak pokazano, i umieścić szalkę zawierającą mózgi na stoliku fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Upewnij się, że każda kora wyraża wstrzyknięty reporter fluorescencyjny pod odpowiednim światłem wzbudzenia i przenieś mózgi na deskę do krojenia z gumy silikonowej wypełnioną 30 mililitrami pożywki DMEM / F12, bąbelkowaną 100% gazowym tlenem. Użyj mikronoża chirurgicznego i cienkich kleszczy, aby przeciąć granicę między przyśrodkową i boczną częścią kresomózgowia grzbietowego i rozdzielić tkankę na dwie półkule.

Następnie użyj noża, aby przeciąć korę jak paski, aby uzyskać plasterki korowe, przenosząc plastry w podłożu z deski do krojenia na nową, 35-milimetrową szalkę Petriego w miarę ich pozyskiwania. Po zebraniu wszystkich plasterków umieść pokrojoną powierzchnię każdego plasterka na wkładce hodowlanej umieszczonej w naczyniu ze szklanym dnem zawierającym wzbogacone podłoże, dostosowując w razie potrzeby orientację każdego plasterka za pomocą drobnych kleszczyków. Następnie usuń nadmiar pożywki za pomocą pipety i umieść naczynie w inkubatorze wielogazowym ustawionym na 40% tlenu, 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza na 30 minut.

Pod koniec inkubacji dodaj 300 mikrolitrów wzbogaconej pożywki uzupełnionej jednomilimolową lucyferyną do naczynia hodowlanego. Aby zobrazować ekspresję reporterową lucyferazy w kulturach plastrów, wybierz obiektyw 40x i umieść naczynie z próbką na stoliku mikroskopu. Uzyskaj obraz testowy fluorescencji i ustaw pozycję i płaszczyznę ostrości na obszar zainteresowania pod oświetleniem odpowiednim światłem wzbudzającym.

Następnie uruchom akwizycję poklatkową za pomocą trójwymiarowej luminescencji, fluorescencji i akwizycji jasnego pola przez 24 godziny. Do monitorowania aktywności promotora oscylującego genu Dll1 można zastosować ubikwitynowaną lucyferazy, zdestabilizowany reporter lucyferazy o okresie półtrwania około 10 minut. Podobnie jak reporter fluorescencyjny, reporter lucyferazy może być używany do monitorowania dynamiki ekspresji białka poprzez fuzję z interesującą sekwencją kodującą gen

Aby uwidocznić ekspresję reporterową na poziomie pojedynczej komórki w hodowlach tkankowych, gen reporterowy może być przejściowo transfekowany do NPC za pomocą elektroporacji in utero, jak pokazano. Ponadto obrazowanie mikroskopowe umożliwia pozyskiwanie obrazów jasnego pola, fluorescencji i chemiluminescencji. Reporter aktywności promotora Dll1 wykazuje oscylacyjną ekspresję w NPC pochodzących z telecefalonu ubikwitynowanych myszy reporterowych Flucyferazy Dll1, przy czym zdestabilizowany reporter lucyferazy wskazuje na ostrą regulację ekspresji aktywności promotora w górę iw dół.

W sąsiednich wzmocnionych komórkach dodatnich z zielonym białkiem fluorescencyjnym przenoszących reporter Hes1 i komórki mCherry-dodatnie eksprymujące reporter białka Dll1, które nawiązały kontakt ze sobą podczas obserwacji, ekspresja reporterowa Hes1 wydaje się rozpoczynać około 60 minut po kontakcie, co sugeruje, że opóźnienie czasowe transmisji sygnalizacji Notch między sąsiednimi komórkami wynosi około jednej godziny. Ponadto podczas transmisji sygnału ekspresja białka Dll1 wykazuje dynamiczną translokację. Podczas wykonywania obrazowania bioluminescencyjnego należy utrzymywać pomieszczenie mikroskopu w całkowitej ciemności, ponieważ zewnętrzne światło może uniemożliwić optymalną akwizycję.

Najnowsze osiągnięcia w optogenetyce pozwalają nam kontrolować ekspresję genów za pomocą światła. Dzięki tej technice możemy jednocześnie wprowadzać różne wzorce ekspresji genów i monitorować odpowiedzi reporterowe lucyferazy.