Oznaczanie tożsamości i czystości komórek odpornościowych za pomocą epigenetycznego ilościowego PCR

Protokół ten oferuje ustandaryzowaną metodę określania tożsamości i czystości komórek odpornościowych oraz rozwiązuje problemy związane z cytometrią przepływową, takie jak wymagania dotyczące dużej próby, duża zmienność między użytkownikami i subiektywna analiza danych. Test ten zawiera zautomatyzowany szablon analizy danych, który pozwala użytkownikom obiektywnie ocenić tożsamość i czystość komórek odpornościowych. To, wraz z wieloma testami kontrolnymi, oferuje gotową, łatwą do ustandaryzowania metodę oceny tożsamości i czystości komórek odpornościowych.

Technikę tę zademonstruje Jerry Guzman, naukowiec z naszego laboratorium. Po wyizolowaniu genomowego DNA z próbki komórek krwiotwórczych, która jest przedmiotem zainteresowania, użyj jednego mikrolitra genomowego DNA do zmierzenia czystości próbki na spektrofotometrze, uzyskując gęstość optyczną na 260, 280 i 230 nanometrach. Następnie rozcieńczyć od 400 do 1200 nanogramów próbki genomowego DNA do końcowej objętości 142 mikrolitrów z buforem elucyjnym z zestawu do izolacji genomowego DNA.

Dodać 75 mikrolitrów kalibratora do 67 mikrolitrów buforu elucyjnego. I rozcieńczyć 1200 nanogramów referencyjnego genomowego DNA do całkowitej objętości 142 mikrolitrów z buforem elucyjnym. Następnie inkubuj probówki przez pięć minut w temperaturze 56 stopni Celsjusza i 900 obrotów na minutę w mieszalniku termicznym.

W celu konwersji wodorosiarczynu dodaj 270 mikrolitrów wodorosiarczynu amonu i 90 mikrolitrów THFA do wszystkich probówek. I wymieszaj rurki, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Krótko odwiruj próbki, aby zebrać ciecz i umieść probówki w mieszalniku termicznym na 45 minut w temperaturze 80 stopni Celsjusza i 900 obrotach na minutę.

Następnie ponownie krótko odwirować próbki i pozostawić je do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez trzy do pięciu minut. W celu oczyszczenia DNA po konwersji wodorosiarczynu, należy wirować kulki paramagnetyczne izolacji DNA przez 30 sekund. Dodaj etanol i izopropanol do do płukania zgodnie z objętościami podanymi na butelkach.

Wiruj ponownie, aż kulki zostaną całkowicie ponownie zawieszone i przy 870 mikrolitrach buforu wiążącego lizę i 105 mikrolitrach DNA wiążącego kulki paramagnetyczne do każdej probówki. Zagmatwać probówki, aby wymieszać, a następnie na krótko odwirować próbki. Dodaj 570 mikrolitrów 2-propanolu do każdej probówki i wymieszaj przez wirowanie.

Inkubuj probówki przez siedem minut w temperaturze pokojowej i 50 obr./min na minutę, a następnie ponownie krótko odkręć probówki i umieść je na stojaku magnetycznym na pięć minut. Pod koniec inkubacji usunąć supernat, nie naruszając kulek. Przemyć próbkę buforem 1 i wymieszać probówki.

Po krótkim odwirowaniu umieść probówki z powrotem w stojaku na trzy minuty i usuń supernat, nie naruszając kulek. Przemyć próbkę dwukrotnie buforem płuczącym 2 i suszyć probówki w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie dodaj 60 mikrolitrów buforu ewolucyjnego do każdej probówki.

Po siedmiominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej i 1400 obrotach na minutę, na krótko odkręć rurki i włóż je z powrotem do magnesu na dwie minuty. Pod koniec inkubacji przenieś 55 mikrolitrów biosiarczynu zawartego w nim przekształconego DNA do nowej probówki bez naruszania kulek. Aby przeprowadzić ilościowy PCR na próbkach, przypisz każdemu wzorcowi standard zadania w ilościowym oprogramowaniu PCR i określ końcowe numery kopii zgodnie z tabelą.

Przygotować seryjne rozcieńczenia wzorcowego DNA i przygotować jeden ilościowy koktajl wzorcowy PCR dla docelowego typu komórki. I jeden ilościowy koktajl PCR master mix dla GAPDH, zgodnie z tabelą. Załadować trzy mikrolitry DNA z matrycy do odpowiednich studzienek 96-dołkowej zaokrąglonej płytki dolnej, a następnie siedem mikrolitrów mieszanki wzorcowej.

Po załadowaniu wszystkich studzienek zamknij płytkę ilościową folią PCR i krótko obróć płytkę przed załadowaniem jej do ilościowego przyrządu do PCR. Następnie uruchom reakcję zgodnie ze wskazaniami w tabeli. Po zakończeniu przebiegu wyeksportuj ilościowe dane PCR jako plik txt lub xlsx.

Po oczyszczeniu DNA przekształconego w wodorosiarczyn za pomocą uderzeń paramagnetycznych, jak pokazano, eluuj 25 mikrolitrów DNA. Przenieś DNA przekształcone w wodorosiarczyn do nowej probówki i dodaj dwa mikrolitry próbki do pojedynczych probówek paskowych PCR. Dodaj dwa mikrolitry wody do probówki kontrolnej bez matrycy i przygotuj główny miks preamplifikacji dla wszystkich próbek zgodnie z tabelą.

Dodaj 23 mikrolitry mieszanki głównej do każdej probówki i nakrętki, odwiruj i krótko odwiruj probówki. Następnie uruchom protokół preamplifikacji na termocyklerze za pomocą podgrzewanej pokrywy. Po zakończeniu przebiegu na krótko odwiruj probówki i przenieś do mikrolitrów amplifikowane DNA do nowych probówek.

Następnie rozcieńczyć próbki w 78 mikrolitrach wody do stężenia od 1 do 40 i przeprowadzić ilościowy PCR próbek, jak pokazano. Tutaj pokazano reprezentatywne dane z testu limfocytów T CD8 + uzyskanego z analizy zarówno krwi obwodowej, komórek jednojądrzastych, jak i limfocytów T od trzech różnych dawców przy użyciu zarówno cytometrii przepływowej, jak i testów metylacji. Tendencje między tymi dwiema metodami u wszystkich dawców w obu typach komórek były podobne.

Te reprezentatywne dane z testu Treg również wykazują podobne wyniki między metodami. Jednak we wszystkich przypadkach ten test metylacji dał wyższe wartości zarówno w warunkach stymulowanych, jak i niestymulowanych. Czułość i swoistość każdego testu wykazano za pomocą wartości granicy ślepej próby, granicy wykrywalności i granicy oznaczalności.

Ponieważ ten test oferuje zautomatyzowany szablon analizy danych, poprawia obiektywną analizę i zwiększa możliwości standaryzacji. Jest to idealne rozwiązanie do produkcji terapii komórkowych, gdzie ustandaryzowane metody mają kluczowe znaczenie dla stworzenia spójnego produktu terapii komórkowej.