Name: Hodowla wariantu Pseudomonas aeruginosa w małej kolonii i ocena ilościowa jego alginianu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj metodę hodowli wariantu małej kolonii Pseudomonas aeruginosa oraz techniki ilościowej oceny alginianu przy użyciu testu ELISA i klasycznego oznaczenia kwasu karbazolowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) R44GM113545 i P20GM103434.

1. Warunki wzrostu SCV i fizjologiczna aktywacja szlaku ratunkowego
<ol>
	<li>Wykrywanie ERK.
	<ol>
		<li>Szczepy P. aeruginosa należy rozprowadzić na podgrzanych płytkachz agarem izolacyjnym Pseudomonas (PIA) i rosnąć w temperaturze 37 °C przez 48 godzin. Na płytce wzrostowej zidentyfikuj pojedynczy izolat kolonii, który ma fenotyp SCV (wielkość kolonii 1−3 mm w przeciwieństwie do normalnej wielkości kolonii 3−5 mm).</li>
		<li>Powtórzyć krok 1.1.1, aby uzyskać czysty izolat SCV. 
		UWAGA: Wzrost może wymagać do 72 godzin ze względu na powolne tempo wzrostu kolonii SCV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fizjologiczna aktywacja szlaku ratunkowego.
	<ol>
		<li>Używając sterylnej pętli inokulacyjnej, wybierz kolonię SCV z płytki PIA i rozprowadź smugi na wstępnie podgrzanym PIA uzupełnionym 0,1 mM uracylu. Talerz do uprawy w temperaturze 37 °C przez 24−48 h. 
		UWAGA: Wszystkie płytki PIA używane w tym protokole zawierają 20 ml/l glicerolu dodanego do mieszaniny przed autoklawowaniem. Po sterylizacji w autoklawie i gdy temperatura mieszaniny spadnie poniżej 55 °C, dodać 11,21 mg/l uracylu (0,1 mM) do płynnego podłoża przed zalaniem płytek. Metoda ta pomogłaby zidentyfikować mutacje pirymidynowe, które powodują fenotyp SCV u P. aeruginosa. Jeśli fenotyp SCV jest wynikiem wspomnianej mutacji, wówczas normalny wzrost i rozmiar kolonii (3−5 mm) można zaobserwować na płytkach PIA z dodatkiem uracylu. Jeśli szczepy miałyby zdolność do wytwarzania alginianu, to fenotyp śluzowaty również powróci po suplementacji uracylem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test karbazolu z kwasem uronowym
<ol>
	<li>Z czystej kultury pożądanego szczepu, który ma być przetestowany, zidentyfikuj pojedynczą kolonię. Za pomocą sterylnej wykałaczki wybierz kolonię i umieść wykałaczkę w probówce hodowlanej zawierającej 5 ml bulionu izolacyjnego Pseudomonas (PIB). Rosnąć w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C przez 24 h. 
	UWAGA: Następujące szczepy PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carB i PAO581pyrD były hodowane na płytkach PIA lub płytkach PIA uzupełnionych 0,1 mM uracylem w celu zebrania alginianu do pomiaru.</li>
	<li>Na podgrzaną płytkę PIA dodać 150 μl bulionu PIB (dla płytek 15 mm x 100 mm) lub 450 μl bulionu (dla płytek 15 mm x 150 mm). Za pomocą sterylnego rozsiewacza komórek rozprowadź bulion na talerzu. Hoduj płytkę w temperaturze 37 °C przez 24 h. 
	UWAGA: Odessać nadmiar płynu, jeśli występuje, z płytki za pomocą pipety, przechylając płytkę na bok. Zarówno płytki PIB, jak i PIA użyte w protokole zawierają 20 ml/l glicerolu, który ma być wykorzystany przez komórki jako źródło węgla wspomagające produkcję alginianów.</li>
	<li>Za pomocą kontrolera pipet i sterylnej pipety o pojemności 50 ml dodaj 0,85% NaCl do uprawianego trawnika i zbierz próbkę, złomując płytkę za pomocą rozsiewacza komórek. Odessać próbkę za pomocą świeżej pipety o pojemności 50 ml do probówki zbiorczej o pojemności 50 ml. Wirować próbkę na wysokim poziomie, aby wymieszać i umieścić próbki na lodzie. 
	UWAGA: Objętość dodanego 0,85% NaCl różni się w zależności od wielkości płytki. W przypadku płytek 15 mm x 100 mm użyj 10−30 ml, a w przypadku płytek 15 mm x 150 mm użyj 20−50 ml.</li>
	<li>Zmierzyć gęstość optyczną próbek przy długości fali 600 nm (OD600), dodając 1 ml próbki do jednorazowej kuwety i odczytując średnicę zewnętrzną za pomocą spektrofotometru. Powtórz ten krok 2 razy, aby uzyskać potrójną liczbę odczytów dla każdej próbki.</li>
	<li>Dodać 3 ml roztworu kwasu siarkowego/boranu do probówek hodowlanych i pozostawić na lodzie. Dodaj 350 μl pobranej próbki POWOLI do mieszanki kwasów w probówkach i krótko wiruj na niskim ogniu.
	<ol>
		<li>Przygotuj bulion boranowy, dodając 10,099 g wodorotlenku potasu (KOH) w proszku do 45 ml wody. Do mieszaniny dodać 24,74 g kwasu borowego (H3BO3) i doprowadzić objętość do 100 ml.</li>
		<li>Umieść 1 l butelkę w zlewie z lodem i napełnij butelkę 500 ml stężonego kwasu siarkowego. POWOLI dodawać 15 ml przygotowanego bulionu boranowego. Pozostaw butelkę do ostygnięcia.</li>
		<li>Dodaj kolejne 10 ml bulionu boranowego, co daje w sumie 25 ml. Po schłodzeniu butelki zwiększyć objętość do 1 l. 
		UWAGA: Ta metoda polega na użyciu wysoko stężonego kwasu siarkowego. W celu zapewnienia bezpieczeństwa należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i przestrzegać właściwego protokołu usuwania próbki. 
		UWAGA: Do celów kontroli dodatniej należy użyć znanego stężenia kwasu D-mannuronowego i/lub znanych próbek alginianu bakteryjnego zebranych i oczyszczonych za pomocą szczepów P. aeruginosa wytwarzających alginian (np.: PAO581-PAO1mucA25). Do kontroli ujemnej należy użyć 0,85% roztworu NaCl i/lubPAO1Δ algD (delecja genu algD w ramce, która sprawia, że bakterie są całkowicie niezdolne do wytwarzania alginianu). Z każdej próbki można wykonać wiele probówek, aby zwiększyć liczbę powtórzeń technicznych, aby pomóc w analizie statystycznej. Przygotuj 3-5 probówek z każdej próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 100 μl 0,1% karbazolu w roztworze etanolu do mieszaniny kwas/próbka. Zakryj rurkę i wiruj na średnim ustawieniu przez 5 sekund. Umieścić w suchej kąpieli w temperaturze 55 °C na 30 minut.</li>
	<li>Po inkubacji wyjąć probówki i krótko wirować na wysokich obrotach i pozostawić do ostygnięcia na 5 min. 
	UWAGA: Kolor, który ma być widoczny, to odcień fioletu. Kolor pozostanie stabilny przez pomiar przez 1-2 godziny.</li>
	<li>Odczytać OD530 każdej probówki, dodając 1 ml mieszaniny do czystej kuwety i odczytując OD próbek przy 530 nm na spektrofotometrze. Użyj probówki z 0,85% NaCl jako ślepej próby do spektrofotometru.</li>
	<li>Przygotować krzywą wzorcową, mierząc OD530 seryjnych rozcieńczeń znanych stężeń kwasu D-mannuronowego (1,024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/ml, 64 μg/ml, 32 μg/mL, 16 μg/ml i 8 μg/ml). Powtórz 2 razy. Wyodrębnij równanie liniowe z tych odczytów. 
	UWAGA: Krzywą standardową należy wykonać tylko raz. Wyodrębnione z niego równanie liniowe można wykorzystać do późniejszych testów.
	<ol>
		<li>Obliczyć stężenie alginianu w każdej próbce, stosując krzywą wzorcową i podzielić stężenie alginianu z równania liniowego przez OD600, aby otrzymać całkowitą ilość alginianu na OD600.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. ELISA dla oznaczania ilościowego alginianów
<ol>
	<li>Powtórz kroki 2.1−2.4, aby uzyskać próbki do pomiaru alginianów. 
	UWAGA: Użyto szczepów PAO1, PAO1ΔalgD i PAO1 przenoszących pHERD20T-algU.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety dodać 50 μl pobranej próbki do niepoddanej działaniu substancji płytki 96-dołkowej. Dodać 50 μl buforu powlekającego (bufor węglanowy/wodorowęglanowy o pH 9,6) do studzienek. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 2 h. 
	UWAGA: Do kontroli pozytywnej można użyć znanego stężenia kwasu D-mannuronowego i/lub znanego stabilnego szczepu wytwarzającego alginian (np.: PAO581-PAO1mucA25). Do kontroli ujemnej należy użyć 0,85% roztworu NaCl i/lubPAO1Δ algD (delecja genu algD w ramce sprawia, że bakterie są całkowicie niezdolne do wytwarzania alginianu). Z każdej próbki można wykonać wiele dołków, aby zwiększyć liczbę powtórzeń technicznych, aby pomóc w analizie statystycznej. Przygotuj 3-5 dołków każdej próbki.</li>
	<li>Za pomocą butelki ze spryskiwaczem umyj studzienki płytkowe 2x solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) z 0,05% Tween 20 (PBS-T), napełniając dołki, a następnie opróżniając je, odwracając płytkę.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety dodaj 200 μl buforu blokującego (10% odtłuszczonego mleka w PBS-T) do studzienek. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. 
	UWAGA: Owiń talerz folią parafinową lub folią termokurczliwą, aby uniknąć parowania w lodówce.</li>
	<li>Za pomocą butelki ze spryskiwaczem umyj dołki talerzowe 2x za pomocą PBS-T, napełniając dołki, a następnie opróżniając je, odwracając płytkę.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego (mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko alginianowi) do studzienek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1−2 h, 
	UWAGA: Przeciwciało pierwszorzędowe (mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko alginianowi) podano w stężeniu 0,5 μg/ml (rozcieńczenie 1:2,000 z 1 mg/ml bulionu) w roztworze rozcieńczalnika przeciwciał (1% mleko odtłuszczone w 1x PBS).</li>
	<li>Za pomocą butelki ze spryskiwaczem umyj dołki talerzowe 3x za pomocą PBS-T, napełniając dołki, a następnie opróżniając je, odwracając płytkę.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do studzienek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1−2 h. 
	UWAGA: Użytym przeciwciałem drugorzędowym było przeciwciało anty-mysie poli-HRP przebijające kozę o stężeniu 0,25 μg/ml (rozcieńczenie 1:2,000 0,5 mg/ml zapasu) w roztworze rozcieńczalnika przeciwciał.</li>
	<li>Za pomocą butelki ze spryskiwaczem umyj dołki talerzowe 3x za pomocą PBS-T, napełniając dołki, a następnie opróżniając je, odwracając płytkę.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety dodać 100 μl roztworu TMB-ELISA (tabela materiałów) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności. 
	UWAGA: Kolor pozytywnej reakcji byłby odcieniem niebieskiego.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety dodać 100 μl roztworu zatrzymującego (2 N kwas siarkowy). 
	UWAGA: Kolor zmieni kolor z niebieskiego na żółty po dodaniu roztworu zatrzymującego. Kolor utrzymuje się do 30 minut po zatrzymaniu reakcji.</li>
	<li>Za pomocą czytnika płytek odczytać średnicę zewnętrzną przy długości fali 450 nm.</li>
	<li>Sporządzić krzywą wzorcową, mierząc OD450 seryjnych rozcieńczeń znanych stężeń kwasu D-mannuronowego (1,024 μg/ml, 512 μg/ml, 256 μg/mL, 128 μg/ml, 64 μg/ml, 32 μg/mL, 16 μg/ml i 8 μg/ml). Powtórz 2 razy. Z tych odczytów wyodrębnij równanie liniowe. 
	UWAGA: Krzywą standardową należy wykonać tylko raz. Wyodrębnione z niego równanie liniowe można wykorzystać do późniejszych testów.
	<ol>
		<li>Obliczyć stężenie alginianu w każdej próbce, stosując krzywą wzorcową i podzielić stężenie alginianu z równania liniowego przez OD600, aby otrzymać całkowitą ilość alginianu na OD600.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza statystyczna pomiaru alginianów
<ol>
	<li>W graficznym arkuszu oprogramowania ustaw kolumnę z równaniem liniowym wyprowadzonym z krzywej standardowej. Ustaw wyniki osi y jako stężenie alginianów, a wyniki na osi x jako OD530 dla testu kwasu uronowego i OD450 dla ELISA, aby uzyskać stężenia alginianów w każdej próbce.</li>
	<li>Aby znormalizować ilość alginianu w każdej próbce do ilości na 5,5 x108 jtk/ml (1 OD600), należy podzielić stężenie każdej próbki otrzymanej powyżej przez odpowiednią wartość OD600. Jeżeli dla każdej próbki zmierzono wiele OD600, podzielić przez średnią OD600.</li>
	<li>Wykonaj analizę statystyczną przy użyciu preferowanego oprogramowania statystycznego (np. GraphPad Prism 7.02).</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie. Wybierz pozycję Kolumna w obszarze Nowa tabela i wykres i wybierz jednokierunkowy zestaw danych ANOVA.</li>
	<li>Nazwij każdą kolumnę badanym szczepem i dodaj stężenia alginianów pod spodem.</li>
	<li>Po wprowadzeniu wszystkich danych kliknij Analizuj w górnym menu. Spowoduje to otwarcie okna ustawień analizy. Wybierz odpowiednie parametry do testowania i wskaż, czy konieczne jest przeprowadzenie wielu porównań. 
	UWAGA: Po analizie zestaw danych będzie zawierał wartość p, która pomoże określić istotność statystyczną danych. Dane zostaną uznane za statystycznie istotne, jeśli wartość p jest mniejsza niż ustawiona wartość α (zwykle wartość α jest ustawiona dla p < 0,01).</li>
	<li>Na karcie wykresu wybierz typ wykresu słupkowego. Spowoduje to automatyczne wykreślenie danych ze wskazanym tytułem z arkusza danych wejściowych. W razie potrzeby należy wskazać istotność statystyczną danych, pokazując symbol * nad liniami łączącymi między słupkami zainteresowania.</li>
</ol>

<ol><li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis%3A+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).</li>
<li>Hogardt, M., Heesemann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+Pseudomonas+aeruginosa+during+persistence+in+the+cystic+fibrosis+lung%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung.</a> International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).</li>
<li>Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+colony+variants+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+bacterial+infection+of+the+lung+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis.</a> Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).</li>
<li>Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+Genotypic+Characteristics+of+Small+Colony+Variants+and+Their+Role+in+Chronic+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Insights%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection.</a> Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).</li>
<li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+rugose+small-colony+variants+evade+host+clearance%2C+are+hyper-inflammatory%2C+and+persist+in+multiple+host+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogones%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments.</a> PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842(2018).</li>
<li>Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrimidine+Biosynthesis+Regulates+Small+Colony+Variant+and+Mucoidy+in+Pseudomonas+aeruginosa+Through+Sigma+Factor+Competition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition.</a> Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).</li>
<li>Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+control+of+Pseudomonas+aeruginosa+alginate+synthesis+and+the+prospects+for+management+of+chronic+infections+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).</li>
<li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+control+of+the+algT+%28algU%29-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+%28AlgN%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).</li>
<li>Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+AlgU%2C+a+member+of+the+sigma+E-like+family+of+stress+sigma+factors%2C+by+the+negative+regulators+MucA+and+MucB+and+Pseudomonas+aeruginosa+conversion+to+mucoidy+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).</li>
<li>Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRehm%2C+BHA+%22Alginates%3A+Biology+and+Applications%22">Alginates: Biology and Applications</a>. Rehm, B. H. A. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. 55-71 (2009).</li>
<li>Remminghorst, U., Rehm, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+alginates%3A+from+biosynthesis+to+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Bacterial alginates: from biosynthesis to applications.</a> Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).</li>
<li>Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sigma+factors+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).</li>
<li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).</li>
<li>Bowness, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+carbazole+reaction+to+the+estimation+of+glucuronic+acid+and+flucose+in+some+acidic+polysaccharides+and+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine.</a> The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).</li>
<li>Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimations+of+uronic+acids+as+quantitative+measures+of+extracellular+and+cell+wall+polysaccharide+polymers+from+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples.</a> Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).</li>
<li>Knutson, C. A., Jeanes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+modification+of+the+carbazole+analysis%3A+application+to+heteropolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).</li>
</ol>

Autor Hongwei D. Yu jest dyrektorem naukowym i współzałożycielem Progenesis Technologies, LLC.

Zarówno SCV, jak i alginian są ważnymi markerami choroby związanymi z kilkoma przewlekłymi infekcjami. W związku z tym zdolność do hodowli SCV, a także badania regulacji i produkcji alginianów przez P. aeruginosa jest integralną częścią odkrycia nowych metod leczenia tych przewlekłych chorób.
Szczepy SCV są notorycznie trudne w uprawie ze względu na ich powolne tempo wzrostu4 w porównaniu z innymi szczepami P. aeruginosa , co pomaga w ich oporności na ...

Przewlekłe infekcje płuc wywołane przez Pseudomonas aeruginosa są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności u pacjentów z mukowiscydozą (CF). We wczesnym dzieciństwie pacjenci są kolonizowani przez wiele patogenów bakteryjnych, w tym nieśluzowate izolaty P. aeruginosa1,2. Pojawienie się izolatów wariantu małej kolonii (SCV) oraz izolatów śluzowych jest markerem wystąpienia przewlekłych infekcji. Izolaty SCV są wysoce odporne na leki3 ze względu na ich powolne tempo wzrostu4, co czyni je poważnym środkiem odstraszającym w leczeniu i innych przewlekłych infekcji5 by P. aeruginosa. Praca Al Ahmara i wsp.6 wykazała związek między SCV a śluzówką związaną z biosyntezą pirymidyny de novo. Głód pirymidyny, spowodowany mutacjami w genach zaangażowanych w produkcję pirymidyny, spowodował fenotyp SCV w nieśluzowatym szczepie referencyjnym PAO1 i pochodnej śluzówki, PAO581 (PAO1mucA25).
Mimo że nadprodukcja alginianów jest ważnym markerem przewlekłych infekcji płuc w mukowiscydozie, nie jest jasne, czy istnieje bezpośrednia korelacja między ilością alginianu a patologią płuc, i nie jest jasne, czy alginian może być używany jako marker prognozy w leczeniu7. Produkcja alginianów jest regulowana głównie przez dwa operony, operon regulatorowy (algUmucABCD)8,9 oraz operon biosyntetyczny (operon algD)10,11. Produkcja alginianów jest ściśle regulowana przez czynnik sigma AlgU9,12 (znany również jako AlgT) oraz degradację czynnika anty-sigma MucA13. Możliwość monitorowania produkcji alginianów in situ z próbek plwociny pacjentów może pomóc w opracowaniu nowych opcji terapeutycznych.
Tutaj opisujemy stan wzrostu, który wykrywa obecność SCV spowodowaną przez mutanty, które nie mogą syntetyzować pirymidyny de novo. Suplementacja uracylu i/lub cytozyny, zasady azotowej nukleotydu pirymidynowego, do pożywki aktywuje szlak ratunkowy, przywracając w ten sposób prawidłowy wzrost mutantów. Ta metoda wzrostu tych specyficznych mutantów SCV może być stosowana jako metoda przesiewowa do identyfikacji mutacji pirymidynowych w próbkach pobranych od pacjentów. Ponadto omówiono dwie metody wykrywania i pomiaru alginianów wytwarzanych i wydzielanych przez P. aeruginosa. Pierwszą z nich jest tradycyjna metoda14,15,16 polegająca na degradacji polisacharydu przy użyciu wysokiego stężenia kwasu, a następnie dodaniu wskaźnika kolorymetrycznego w celu ilościowego określenia stężenia w próbce. Druga metoda, opracowana w naszym laboratorium, wykorzystuje test immunoenzymatyczny (ELISA) przy użyciu przeciwciała monoklonalnego przeciwko alginianowi (mAb) opracowanego przez QED Biosciences. Metoda ELISA okazuje się bardziej specyficzna i czuła niż test kwasu uronowego i pozwala na bezpieczniejsze stosowanie ze względu na unikanie wysoko stężonego kwasu siarkowego. Dzięki możliwości stosowania testu ELISA bezpośrednio na próbkach plwociny pacjenta w celu pomiaru alginianu, można go opracować jako narzędzie diagnostyczne do monitorowania w celu śledzenia ilości alginianu obecnego w płucach w różnych okresach infekcji.

<table><tbody><tr><td>1-etapowy Ultra TMB-ELISA</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Absolute Ethanol (200 dowodów)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>Molekularny biograde</td></tr><tr><td>Accu Block Cyfrowy</td><td>labnet</td> do suchej kąpieli <td>NC0205808</td><td>za pośrednictwem Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Assay Plates 96-dołkowy</td><td>CoStar</td><td>2021-12-20</td><td></td></tr><tr><td>Bench Top Vortex-Genie 2</td><td>Przemysł naukowy</td><td>G560</td><td></td></tr><tr>Produkty do badań<td>nad kwasem borowym</td><td>International Corp.</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator szafkowy</td><td>VWR</td><td>1540</td><td></td></tr><tr><td>Carbazole</td><td>Sigma</td><td>C-5132</td><td></td></tr><tr><td>Bufor węglanowo-wodorowęglanowy</td><td>Sigma</td><td>C3041</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe (50 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td>przez</td></tr><tr><td>probówki do hodowli</td> Fisher <td>Scientific Fisher Scientific</td><td>14-956-6D</td><td>przez Fisher Polistyren</td></tr> do <tr><td>kuwety naukowej (1,5 ml)</td><td>Fisher Scientific 14955127</td><td></td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Cytosine</td><td>Acros Organics</td><td>71-30-7</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pętle inokulacyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-597</td><td></td></tr><tr><td>Kwas D-mannuronowy Sód</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SMB00280</td><td></td></tr><tr><td>FMC Alginian</td><td>FMC</td><td>2133</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>do biologii molekularnej</td></tr><tr><td>mysie przeciwciało monoklonalne anty-alginianowe</td><td>QED Biosciences</td><td>Nie</td><td>dotyczy dużo #: 15725/15726</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami w proszku (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP</td><td>Przeciwciało Thermo Scientific</td><td>32230</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>1310-58-3</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas Agar izolacyjny (PIA)</td><td>Difco</td><td>292710</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pseudomonas Bulion izolacyjny (PIB)</td><td>Alpha Biosciences</td><td>P16-115</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Okrągłe wykałaczki</td><td>Diament</td><td></td><td>Dowolna marka</td></tr><tr><td>Alginian wodorostów (Protanal CR 8133)</td> <td>FMC Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko</td><td>Difco</td><td>232100</td><td>za pośrednictwem</td></tr><tr><td>spektrofotometru Fisher Scientific SmartSpec Plus</td><td>BioRad</td><td>170-2525</td><td>lub preferowanego dostawcy</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax i3x Wielomodowy czytnik mikropłytek</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>i3x</td><td>lub preferowany dostawca</td></tr><tr><td>Sterylna szalka Petriego 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A298-212</td><td>Techniczny</td></tr><tr><td>kwas siarkowy (2 roztwory Normal -Stop)</td><td>R& D Systems</td><td>DY994</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Acros Organics</td><td>66-22-8</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla wariantu pseudomonas aeruginosa w małej kolonii i ocena ilościowa jego alginianu

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, oportunistyczny patogen bakteryjny Gram-ujemny, może nadprodukować alginian egzopolisacharydu, co skutkuje unikalnym fenotypem zwanym śluzówką. Alginian jest związany z przewlekłymi infekcjami płuc powodującymi złe rokowanie u pacjentów z mukowiscydozą (CF). Zrozumienie szlaków regulujących produkcję alginianów może pomóc w opracowaniu nowych strategii terapeutycznych ukierunkowanych na powstawanie alginianów. Innym fenotypem związanym z chorobą jest wariant małej kolonii (SCV). SCV jest spowodowany powolnym wzrostem bakterii i często wiąże się ze zwiększoną opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe. W tym artykule po raz pierwszy przedstawiono metodę hodowli genetycznie zdefiniowanej formy P. aeruginosa SCV w wyniku mutacji biosyntezy pirymidyny. Suplementacja zasad azotowych, uracylu lub cytozyny, przywraca normalny wzrost tych mutantów, wykazując obecność szlaku ratunkowego, który wymiata wolne zasady ze środowiska. Następnie omówimy dwie metody pomiaru alginianu bakteryjnego. Pierwsza metoda opiera się na hydrolizie polisacharydu do monomeru kwasu uronowego, a następnie derywatyzacji odczynnikiem chromogennym, karbazolem, podczas gdy druga metoda wykorzystuje test ELISA oparty na dostępnym na rynku, specyficznym dla alginianu przeciwciałie monochromatycznemu. Obie metody wymagają krzywej standardowej do oznaczania ilościowego. Pokazujemy również, że metoda immunologiczna jest specyficzna dla oznaczania ilościowego alginianów i może być stosowana do pomiaru alginianów w próbkach klinicznych.

Rysunek 1 przedstawiono płytki z PAO1 i PAO581 z lub bez delecją w ramce odczytu w pyrD gen (gen w szlaku biosyntezy pirymidyn), którego mutacja prowadzi do powstania wariantów małych kolonii (SCV)6Mutant SCV szczepu PAO1 odzyskał prawidłowy wzrost w odpowiedzi na suplementację uracylu (Rycina 1A,B). Co więcej, szczep PAO581ΔpyrDMutant SCV powrócił do stanu mukoidalnego p...

Tutaj opisujemy warunki wzrostu do hodowli małego wariantu kolonii Pseudomonas aeruginosa. Opisujemy również dwie oddzielne metody wykrywania i oznaczania ilościowego alginianu egzopolisacharydów wytwarzanego przez P. aeruginosa przy użyciu tradycyjnego testu karbazolu kwasu uronowego i testu ELISA opartego na przeciwciałie monoklonalnym specyficznym dla alginianu (mAb).

Hodowla wariantu Pseudomonas aeruginosa w małej kolonii i ocena ilościowa jego alginianu

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

Wariant małej kolonii lub technika SCV pozwala na selekcję i wzrost małych wariantów kolonii Pseudomonas aeruginosa. Metoda jest bardzo ostateczna i pozwala na łatwiejszy wybór niż normalne metody. Protokół ten wyszczególnia również bezpieczniejszą, bardziej czułą metodę ELISA do oznaczania ilościowego alginianów w porównaniu ze standardową metodą karbazolu z kwasem uroronowym, umożliwiając bezpośrednią ocenę ilościową alginianów w próbkach bez kauteryzacji lub manipulacji próbkami.Procedurę zademonstrują Brandon Kirby, technik laboratoryjny, i Roy Al Ahmar, doktorant z mojego laboratorium. Aby wykryć wariant małej kolonii lub SCV, najpierw nałóż szczep PAO1 delta PYRD szczepu P.aeruginosa na wstępnie podgrzane płytki PIA. Uprawiaj odmiany w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin.Na płytce wzrostowej zidentyfikuj pojedynczy izolat kolonii, który ma fenotyp SCV charakteryzujący się wielkością kolonii od jednego do trzech milimetrów, w przeciwieństwie do normalnej wielkości kolonii od trzech do pięciu milimetrów. Ponownie narysuj wybrane kolonie, aby uzyskać czysty izolat SCV. Aby przeprowadzić fizjologiczną aktywację szlaku ratunkowego, użyj sterylnej pętli inokulacyjnej, aby pobrać kolonię SCV z płytki PIA.Umieść wybraną kolonię na wstępnie podgrzanej płytce PIA uzupełnionej 0,1 milimolowym uracylem. Hoduj talerz w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin. Aby rozpocząć test karbazolu z kwasem uronowym zidentyfikuj pojedynczą kolonię z czystej kultury pożądanego szczepu, który ma być testowany, i wybierz kolonię za pomocą sterylnej wykałaczki.Umieść wykałaczkę w probówce do hodowli zawierającej pięć mililitrów PIB. Hoduj w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po inkubacji dodaj porcję bulionu PIB na wstępnie podgrzaną płytkę PIA.Za pomocą sterylnego rozsiewacza komórek rozprowadź bulion na talerzu i rosj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Za pomocą kontrolera pipet i sterylnej pipety o pojemności 50 mililitrów dodaj 0,85% chlorku sodu do trawnika dla dorosłych i zbierz próbkę, zeskrobując płytkę za pomocą rozsiewacza komórek. Odessać próbkę za pomocą świeżej pipety o pojemności 50 mililitrów i przenieść do probówki zbiorczej o pojemności 50 mililitrów.Wirować próbkę na wysokim poziomie, aby wymieszać i umieścić próbki na lodzie. Aby zmierzyć OD600 w próbkach, najpierw przeprowadź ślepą próbę spektrofotometru za pomocą jednego mililitra 0,85% chlorku sodu. Następnie dodaj jeden mililitr próbki do nowej jednorazowej kuwety i odczytaj OD. Powtórz ten krok dwukrotnie, aby uzyskać trzykrotne odczyty dla każdej próbki.Teraz dodaj trzy mililitry roztworu boranu kwasu siarkowego do probówek hodowlanych i pozostaw na lodzie. Powoli dodawać 350 mikrolitrów pobranej próbki do mieszaniny kwasów w probówkach. Po krótkim wirowaniu na małym poziomie dodać 100 mikrolitrów 0,1% roztworu karbazolu i etanolu do mieszaniny próbek kwasów.Zakryj probówkę i wiruj na medium przez pięć sekund. Następnie umieść w suchej kąpieli w temperaturze 55 stopni Celsjusza na 30 minut. Po inkubacji krótko zwirować probówki na wysokich obrotach i pozostawić do ostygnięcia na pięć minut.Użyj probówki z 0.85% chlorkiem sodu jako ślepej próby do spektrofotometru. Następnie dodaj jeden mililitr mieszaniny do czystej kuwety i odczytaj OD próbek przy 530 nanometrach na spektrofotometrze. Przygotować krzywą wzorcową, mierząc OD530 w seryjnych rozcieńczeniach znanych stężeń kwasu d-mannuronowego.Powtórz dwa razy i wyodrębnij równanie liniowe z tych odczytów. Obliczyć stężenie alginianu w każdej próbce, korzystając z krzywej wzorcowej i podzielić stężenie alginianu z równania liniowego przez OD600, aby uzyskać całkowitą ilość alginianu na OD600. Za pomocą mikropipety dodać 50 mikrolitrów pobranej próbki do niepoddanej działaniu substancji płytki 96-dołkowej.Następnie dodaj 50 mikrolitrów buforu powlekającego ELISA do studzienek. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Używając butelki ze spryskiwaczem, umyj dołki dwukrotnie za pomocą PBS-T, napełniając dołki, a następnie opróżniając je, odwracając płytkę.Dodać 200 mikrolitrów buforu blokującego do studzienek za pomocą mikropipety i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia umyj płytkę dwukrotnie PBS-T, tak jak poprzednio. Następnie dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego do studzienek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin.Po inkubacji przemyć płytki trzykrotnie PBS-T, tak jak poprzednio. Następnie dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała wtórnego do studzienek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin. Po ponownym trzykrotnym umyciu płytki, za pomocą mikropipety dodać 100 mikrolitrów roztworu TMB ELISA.Inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności, umieszczając płytkę w szufladzie lub zawijając w folię. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu zatrzymującego. Użyj czytnika płytek, aby zmierzyć średnicę zewnętrzną przy 450 nanometrach.Sporządzić krzywą wzorcową, mierząc OD450 w seryjnych rozcieńczeniach znanych stężeń kwasu d-mannuronowego. Powtórz pomiary dwukrotnie i wyodrębnij równanie liniowe. Obliczyć stężenie alginianu w każdej próbce, stosując krzywą wzorcową i podzielić stężenie alginianu z równania liniowego przez OD600, aby uzyskać całkowitą ilość alginianu na OD600.Pokazano próbki PAO581 i PAO581 z mutacjami w genach regulujących biosyntezę pirymidyny de novo wyhodowane na PIA i PIA uzupełnione 0,1 milimola uracylu. Dane pokazują, że obecność uracylu w pożywce powoduje konwersję zmutowanego szczepu z powrotem do śluzówki, co widać po przywróceniu produkcji alginianu. Tutaj przedstawiono wyniki testu ELISA opartego na przeciwciałach monoklonalnych przeciwko alginianom.Kolonie są hodowane na płytkach PIA z arabinozą w celu indukcji promotora PBAD i plazmidu pHERD-20T. Pokazano PAO1, PAO1 przenoszący ekspresję plazmidu pHERD-20T z głównym czynnikiem sigma specyficznym dla alginianu algU oraz PAO1 z delecją genu algD w ramce w kodowaniu kluczowego enzymu biosyntetycznego alginianowego dehydrogenazy GDP-mannozy. Dane te porównują nieśluzowate poziomy alginianu mierzone dla PAO1 i PAO1 delta algD z poziomami śluzowatych alginianu mierzonymi dla PAO1 z pHERD-20T algU.Test ELISA antyalginianowy przetestowano również na próbkach plwociny pacjentów bez wcześniejszego wzrostu na płytkach. Trzy próbki plwociny CF, w których stwierdzono wzrost śluzowatego P.aeruginosa, wykazały wykrywalny alginian w porównaniu z dwiema próbkami plwociny pacjenta, które zawierały albo nieśluzowate P.aeruginosa, albo nie zawierały wzrostu P.aeruginosa. Przygotowanie krzywych wzorcowych do oznaczania ilościowego alginianów jest bardzo ważne, ponieważ pozwoli to na precyzyjny i dokładny pomiar alginianu w próbce.Roztwór kwasu stosowany w metodzie karbazolowej jest bardzo niebezpieczny, dlatego w celu zapewnienia bezpieczeństwa należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i środki ostrożności. Po wyizolowaniu SCV można przeprowadzić dalsze profilowanie genetyczne, aby lepiej zrozumieć występujące mutacje i patogenność związaną z takimi mutacjami. Metoda ELISA może być dostosowana do monitorowania przewlekłego zakażenia płuc u pacjentów z mukowiscydozą.Co więcej, nasza metoda wzrostu może pomóc w diagnozowaniu infekcji wywoływanych przez określone SCV.

culture-small-colony-variant-pseudomonas-aeruginosa-quantitation-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejsza praca opisuje różne metody hodowli biofilmu Pseudomonas aeruginosa na hodowlach ludzkich komórkach nabłonkowych dróg oddechowych. Protokoły te można dostosować do badania różnych aspektów tworzenia biofilmu, w tym wizualizacji biofilmu, barwienia biofilmu, pomiaru jednostek tworzących kolonie (CFU) w biofilmie oraz badania cytotoksyczności biofilmu.

Modele kokultury biofilmów Pseudomonas aeruginosa hodowanych na żywych komórkach dróg oddechowych człowieka

Źródło: Al Ahmar, R., et al. Hodowla wariantu Pseudomonas aeruginosa w małej kolonii i ocena ilościowa jego alginianu. J. Vis. Exp. (2020)Ten film przedstawia test kolorymetryczny do ilościowego oznaczania alginianów wytwarzanych przez Pseudomonas aeruginosa, przy użyciu karbazolu do wykrywania kwasów uronowych po hydrolizie kwasów. Metoda umożliwia analizę porównawczą produkcji alginianów znormalizowanych do biomasy bakteryjnej w badaniach naukowych i klinicznych.

Oznaczanie ilościowe alginianu bakteryjnego przy użyciu testu karbazolu z kwasem uronowym

Źródło: Al Ahmar, R., et al. Hodowla wariantu Pseudomonas aeruginosa w małej kolonii i ocena ilościowa jego alginianu. J. Vis. Exp. (2020)Ten film przedstawia kolorymetryczny test immunologiczny do ilościowego oznaczania alginianu, ochronnego egzopolisacharydu wytwarzanego przez Pseudomonas aeruginosa. Procedura polega na pokryciu mikropłytki próbką, zastosowaniu określonych przeciwciał i zastosowaniu reakcji enzym-substrat w celu wygenerowania mierzalnej zmiany koloru. Następnie stosuje się...

Ilościowe oznaczanie alginianu bakteryjnego za pomocą testu immunoenzymatycznego opartego na przeciwciałach

Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący mutagenezę za pośrednictwem transpozonu mini-himar1 mariner do generowania biblioteki mutantów insercyjnych o wysokiej gęstości do badania, izolacji i identyfikacji nowych regulatorów alginianu w prototypowym szczepie Pseudomonas aeruginosa PAO1.

Identyfikacja nowych genów związanych z produkcją alginianów u Pseudomonas aeruginosa przy użyciu mutagenezy za pośrednictwem transpozonu Mini-himar1 Mariner

Rozwój społeczności mikroorganizmów zależy od kombinacji czynników, w tym architektury środowiska, liczebności członków, cech i interakcji. Protokół ten opisuje syntetyczne, mikrofabrykowane środowisko do jednoczesnego śledzenia tysięcy społeczności zawartych w studniach femtolitrowych, w którym można przybliżyć kluczowe czynniki, takie jak wielkość niszy i zamknięcie.

Montaż i śledzenie rozwoju społeczności mikrobiologicznej w ramach platformy Microwell Array

Trwałość antybiotyku opisuje zdolność małych subpopulacji we wrażliwej populacji izogenicznej do przejściowego tolerowania wysokich dawek antybiotyków bakteriobójczych. Niniejszy protokół łączy podejścia do scharakteryzowania fenotypu trwałości antybiotyku na poziomie molekularnym i komórkowym po wystawieniu Escherichia coli na działanie śmiertelnych dawek ofloksacyny.

Analiza populacyjna i jednokomórkowa trwałości antybiotyków w Escherichia coli

Ten protokół opisuje czterogatunkowy model wielogatunkowego biofilmu polimikrobiologicznego dla płuc związanego z mukowiscydozą (CF), który może być wykorzystany do zbadania wpływu interakcji międzygatunkowych bakterii.

Hodowla biofilmu wielodrobnoustrojowego istotnego dla mukowiscydozy w celu zbadania fenotypów społeczności

Ta metodologia pozwala na stworzenie modelu wielomikrobiologicznego biofilmu w mukowiscydozie do testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe w laboratoriach badawczych i klinicznych. Model ten zapewnia dokładne i wiarygodne wyniki w szerokim zakresie danych wyjściowych.

Opracowanie wielomikrobiologicznego modelu biofilmu kolonijnego do badania środków przeciwdrobnoustrojowych w mukowiscydozie

To badanie nakreśla ramy dla rozwoju modelu zagregowanego biofilmu wielomikrobiologicznego i optymalizacji protokołu ekstrakcji RNA w celu oceny ekspresji genu Pseudomonas aeruginosa odzwierciedlającej środowisko płuc mukowiscydozy. Zastosowania obejmują ocenę działania przeciwdrobnoustrojowego i badanie alternatyw dla antybiotyków w warunkach istotnych dla mukowiscydozy.

Model zagregowanego biofilmu mukowiscydozy do badania ekspresji genów istotnych dla infekcji

Oporność na antybiotyki wśród szczepów Escherichia coli adhezywno-inwazyjnych stanowi wyzwanie dla oceny inwazji bakteryjnej przy użyciu tradycyjnego testu ochrony gentamycyną. Opisano ulepszoną metodę oceny ilościowej inwazji bakteryjnej poprzez liczenie jednostek tworzących kolonie i oceny jakościowej poprzez wizualizację zakażonych komórek za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Test ochrony amikacyny do ilościowego i wizualnego określenia Escherichia coli inwazji komórkowej

Poznaj metodę hodowli wariantu małej kolonii Pseudomonas aeruginosa oraz techniki ilościowej oceny alginianu przy użyciu testu ELISA i klasycznego oznaczenia kwasu karbazolowego.

Hodowla wariantu Pseudomonas aeruginosa w małej kolonii i ocena ilościowa jego alginianu

Przeglądaj więcej filmów