Name: Hodowla, manipulacja i ortotopowe przeszczepienie organoidów guza pęcherza moczowego myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj metodę hodowli, manipulacji genetycznej i ortotopowego przeszczepienia organoidów guza pęcherza moczowego myszy. Ten protokół umożliwia badanie biologii nowotworowej w modelu in vitro i in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z Narodowej Fundacji Badawczej Korei dla K.S: NRF-2017R1A2B4006043, NRF-2017M3C7A1047875, NRF-2017R1A5A1015366, Creative Economy Leading Technology Development Programme (SF317001A), POSCO (2018Y060) oraz BK21 Plus Research Fellowship.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w POSTECH (numer IACUC: POSTECH-2019-0055).
1. Hodowla in vitro organoidów guza pęcherza moczowego
<ol>
	<li>Ustalenie organoidów guza pęcherza moczowego z guza pęcherza moczowego myszy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
	UWAGA: Procedura generowania guzów pęcherza moczowego myszy wywołanych przez BBN jest opisana w Shin et al.17.
	<ol>
		<li>Dostarczaj 0,1% wody zawierającej BBN w ciemnej butelce myszom ad libitum przez 6 miesięcy. Zmieniaj wodę zawierającą BBN 2 razy w tygodniu. 
		UWAGA: Wykorzystano samca myszy C57BL/6 o masie ciała około 25 g w wieku 8–10 tygodni. Woda zawierająca BBN może być podawana maksymalnie pięciu myszom w jednej klatce.</li>
		<li>Po 6 miesiącach poddaj mysz eutanazji za pomocą inhalacji dwutlenku węgla i wyizoluj cały guz pęcherza moczowego. Przenieś go na szalkę Petriego o średnicy 90 mm.</li>
		<li>Usuń nienowotworowe części i martwicze obszary za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych i umyj fragmenty guza pęcherza moczowego 2-3 razy zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco (DPBS). Zbierz fragmenty i przenieś je na nową szalkę Petriego o średnicy 90 mm.</li>
		<li>Dodać 1 ml zmodyfikowanej minimalnej pożywki niezbędnej (DMEM) firmy Dulbecco z 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES).</li>
		<li>Zmiel tkankę nowotworową na jak najmniejsze kawałki (0,5–1 mm3) za pomocą wysterylizowanej żyletki.</li>
		<li>Dodaj 9 ml DMEM z 10 mM HEPES, 250 μg/ml kolagenazy typu I, 250 μg/ml kolagenazy typu II i 250 μg/ml termolizyny. Inkubować zmieloną tkankę nowotworową przez 1,5–2 godziny na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ), aby zdysocjować fragmenty do zawiesiny komórki. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml. 
		UWAGA: Jeśli wielkość guza pobranego od myszy jest większa niż 1 cm3, potraktuj go 2x większą ilością termolizyny lub wydłuż czas inkubacji.</li>
		<li>Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad za pomocą 5 ml buforu lizującego chlorek amonu i potasu (ACK) w celu lizy czerwonych krwinek. Inkubować probówkę przez 3–5 minut w temperaturze pokojowej (RT), aż do całkowitej lizy czerwonych krwinek. 
		UWAGA: Jeśli nie obserwuje się czerwonych krwinek, pomiń proces lizy.</li>
		<li>Dodać 20 ml DMEM do probówki. Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić osad za pomocą 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA i 10 μM dichlorowodorku Y-27632 (Y-27632), aby zdysocjować osad na pojedyncze komórki. Inkubować probówkę przez 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Obserwuj guz pod mikroskopem, aby potwierdzić całkowitą dysocjację na pojedyncze komórki. Jeśli fragmenty komórek utrzymują się, należy dalej pipetować zawiesinę.</li>
		<li>Zneutralizuj trypsynę za pomocą 10 ml DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko o pojemności 100 μm na nowej probówce o pojemności 50 ml, aby usunąć niestrawione zanieczyszczenia.</li>
		<li>Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.</li>
		<li>Pokryj studzienkę na 24-dołkowej płytce, używając 150 μl lodowatej matrycy membrany podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu (tabela materiałów) i umieść 24-dołkową płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) na 30 minut w celu zestalenia matrycy błony podstawnej. 
		UWAGA: Rozmrozić i utrzymać matrycę membrany podstawnej w temperaturze 4 °C, aby zapobiec zestaleniu się przed użyciem.</li>
		<li>Zawiesić osad za pomocą 1 ml DMEM i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Przenieś 3-4 x 104 komórek nowotworowych do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml na lodzie.</li>
		<li>Odwirować mikroprobówkę o sile 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i ostrożnie odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 500 μl wstępnie podgrzanego podłoża organoidowego (Tabela 1) i 10 μM Y-27632 i przenieść je do powleczonej studzienki. Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).</li>
		<li>Dodatkowe komórki nowotworowe pęcherza moczowego można zaopatrzyć w 1 ml DMEM zawierającego 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) w 1,5 ml kriowialiów. Umieścić je w kriowialnym pojemniku do zamrażania i przenieść pojemnik do zamrażarki o temperaturze -80 °C. Po przechowywaniu w zamrażarce przez noc przenieś kriowiale do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.</li>
		<li>Zmieniaj pożywkę co 2 dni, używając 500 μl wstępnie podgrzanego podłoża organoidowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Organoidy guza pęcherza moczowego subkultury. 
	UWAGA: Zaleca się przejście organoidów guza pęcherza moczowego, gdy osiągną średnicę 100–150 μm.
	<ol>
		<li>Dodać 500 μl kolagenazy/dypazy do podłoża organoidowego na 24-dołkowej płytce z organoidami nowotworowymi. Pipetować w górę i w dół matrycy błony podstawnej i pożywki. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C i zebrać komórki do probówki o pojemności 15 ml. 
		UWAGA: Zbadaj organoidy wyizolowane z macierzy błony podstawnej pod mikroskopem. Jeśli organoidy nie zostaną odłączone od matrycy błony podstawnej, należy wydłużyć czas inkubacji lub odpipetować więcej razy.</li>
		<li>Dodać 5 ml wstępnie podgrzanego DMEM, odwirować probówkę o sile 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad za pomocą 1 ml podgrzanej 0,25% trypsyny-EDTA i 10 μM Y-27632. Inkubować przez 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Energicznie pipetuj komórki w górę iw dół i zneutralizuj trypsynę za pomocą 5 ml DMEM z 10% FBS.</li>
		<li>Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad za pomocą 1 ml podgrzanego podłoża organoidowego i policzyć liczbę pojedynczych komórek nowotworowych.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.1.14−1.1.18.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Manipulacja genetyczna organoidów guza pęcherza moczowego za pomocą transdukcji za pośrednictwem lentiwirusa (Rysunek 2A)
<ol>
	<li>Wytwarzają cząsteczki lentiwirusowe wykazujące ekspresję GFP.
	<ol>
		<li>W dniu 0 umieść komórki HEK 293T w gęstości 5-6 x 106 komórek na 10 cm płytki do hodowli komórkowej w pożywce do hodowli linii komórkowej (tj. DMEM z 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny).</li>
		<li>W dniu 1 należy przygotować roztwór do transfekcji DNA zawierający plazmid transferowy zawierający GFP (8 μg), plazmid wypełniający lentiwirusa (10 μg pCMVR 8,74 i 3 μg pMD2.G) oraz 1 ml zredukowanej pożywki surowicy (tabela materiałów).</li>
		<li>Dodać 3 μl odczynnika do transfekcji (tabela materiałów) na 1 μg całkowitego plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta i delikatnie wymieszać pipetując. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej i dodać 9 ml DMEM z 10% FBS.</li>
		<li>Odessać pożywkę hodowlaną na płytce do hodowli komórkowej z komórkami HEK 293T. Ostrożnie przenieść 10 ml roztworu do transfekcji DNA na komórki HEK 293T i inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>W dniu 3 obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym (wzbudzenie przy 488 nm i emisja przy 512 nm), aby określić wydajność transfekcji. Prawie 90%-100% komórek w całej populacji komórek powinno wykazywać ekspresję GFP.</li>
		<li>Zebrać supernatant (zawierający wirusa) i przefiltrować supernatant za pomocą filtra polieterosulfonowego (PES) o wielkości 0,45 μm. 
		UWAGA: Użyj filtra o niskim poziomie wiązania białek, takiego jak filtr PES.</li>
		<li>W celu zagęszczenia wirusa należy odwirować supernatant wirusa w temperaturze 98,768 x g w ultrawirówce przez 2 godziny w temperaturze 4 °C w obracającym się wirniku kubełkowym (tabela materiałów) i ostrożnie wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad w 2,5 ml zimnego podłoża organoidowego.</li>
		<li>W przypadku długotrwałego przechowywania należy podatkować 250 μl pożywki lentiwirusowej do fiolek kriogenicznych i zamrozić je za pomocą ciekłego azotu. Zamrożone zapasy wirusów należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj transdukcję organoidów guza pęcherza moczowego za pośrednictwem lentiwirusa.
	<ol>
		<li>W dniu 2 należy podzielić organoidy nowotworowe zgodnie z powyższym opisem (krok 1.2) 12 godzin przed transdukcją, w której pośredniczy lentiwirus.</li>
		<li>W dniu 3 należy szybko rozmrozić podwielokrotność (etap 2.1.9) zawierającą wirusa w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i dodać 250 μl pożywki organoidowej z 10 μM Y-27632 i 8 μg/ml bromku heksadimetryny.</li>
		<li>Zastąp pożywkę organoidową na płytce 24-dołkowej organoidami nowotworowymi przez 500 μl pożywki zawierającej wirusa i inkubuj przez 12–16 godzin w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).</li>
		<li>W 4 dniu zmień pożywkę na 500 μl świeżej pożywki organoidowej. 
		UWAGA: Po 12–16 godzinach inkubacji należy zmienić pożywkę, ponieważ pożywka zawierająca lentiwirusa i bromek heksadimetryny jest cytotoksyczna.</li>
		<li>W 6 dniu monitoruj sygnał GFP z organoidów nowotworowych 3 dni po transdukcji pod mikroskopem fluorescencyjnym (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
		<li>W dniu 10 pasaż i zapas organoidów 7 dni po transdukcji, jak opisano w kroku 1.2, w celu utrzymania genetycznie zmodyfikowanych linii organoidów nowotworowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ortotopowa transplantacja organoidu pęcherza moczowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A)
<ol>
	<li>Przygotuj organoidy guza pęcherza moczowego do przeszczepu ortotopowego.
	<ol>
		<li>Przed przeszczepem należy hodować organoidy guza pęcherza moczowego przez 5-7 dni, jak opisano powyżej (krok 1.2).</li>
		<li>Dodać 500 μl kolagenazy/dypazy do podłoża organoidowego w 24-dołkowej płytce z organoidami nowotworowymi. Pipetować w górę i w dół matrycy błony podstawnej i podłoża. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C i zebrać komórki do probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Dodać 5 ml wstępnie podgrzanego DMEM, odwirować probówkę o sile 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad w 1 ml DMEM i przenieść roztwór na szalkę Petriego o średnicy 90 mm.</li>
		<li>Pod mikroskopem zbierz 10-100 organoidów nowotworowych za pomocą mikropipety p200 i zbierz je do mikroprobówki na lodzie.</li>
		<li>Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i ostrożnie wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Utrzymuj osad komórkowy na lodzie, aż myszy będą gotowe do operacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeszczep ściany pęcherza podśluzówkowego 
	UWAGA: Ta procedura jest modyfikowana w stosunku do protokołu opublikowanego przez Fu et al18.
	<ol>
		<li>Przygotuj 8 do 10 tygodniowego samca nagiej myszy (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) co najmniej 1 tydzień przed eksperymentem, aby umożliwić jej aklimatyzację w nowym środowisku. Enrofloksacynę (5 mg/kg) wstrzyknąć podskórnie 24 godziny przed zabiegiem.</li>
		<li>Oczyść powierzchnię ławki wodą z mydłem. Autoklawuj narzędzia chirurgiczne przed zabiegiem chirurgicznym i wykonaj operację przy użyciu sterylnych narzędzi.</li>
		<li>Strzykawkę insulinową 29 G, końcówki pipet i matrycę błony podstawnej należy przechowywać na lodzie. Ketoprofen (5 mg/kg) należy podawać podskórnie przed podaniem znieczulenia.</li>
		<li>Znieczulić mysz 4% izofluranem w komorze indukcyjnej. Po uzyskaniu znieczulenia ogólnego połóż mysz w pozycji leżącej na plecach i utrzymuj znieczulenie, wdychając maskę 2% odparowanego izofluranu. 
		UWAGA: Jeśli czas znieczulenia przekracza 30 minut, nałóż maść do oczu na oba oczy za pomocą bawełnianego wacika, aby uniknąć wysuszenia rogówki.</li>
		<li>Nałóż powidon-jod sterylną gazą i przetrzyj ją 70% etanolem. Powtórz 3x za każdym razem z nową gazą lub wacikiem.</li>
		<li>Zakryj odbyt i pole operacyjne za pomocą jednorazowych, sterylnych obłożeni chirurgicznych.</li>
		<li>Używając mikroskopu preparacyjnego do powiększenia, wykonaj małe poprzeczne nacięcie (mniejsze niż 1,5 cm) w skórze i ścianie mięśniowej dolnej linii środkowej brzucha za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych. Odsłoń pęcherz z jamy brzusznej i podeprzyj go wacikami nasączonymi solą fizjologiczną. 
		UWAGA: Jeśli pęcherz jest wypełniony moczem, delikatnie dociśnij pęcherz, aby go lekko rozprężyć.</li>
		<li>Zawiesić osady organoidów (krok 3.1.7) w 80 μl podłoża organoidowego zawierającego 50% matrycy błony podstawnej o wysokim stężeniu (tabela materiałów).</li>
		<li>Wstrzyknąć zawiesinę organoidową do przedniej części kopuły pęcherza moczowego za pomocą strzykawki insulinowej 29 G pod mikroskopem preparacyjnym</li>.
		<li>Zamknij wewnętrzną warstwę ściany brzucha antybakteryjnym szwem wchłanialnym, a następnie zamknij zewnętrzną warstwę nylonowym szwem 4-0. Zdezynfekować miejsce operacyjne jodonem powidonu i 70% etanolem.</li>
		<li>Pozwól myszy dojść do siebie pod promiennikiem podczerwieni przez 10–15 minut. Monitoruj mysz, aż odzyska przytomność i ruchliwość.</li>
		<li>Dzień po zabiegu należy sprawdzić ogólny stan myszy i nieszczelność zespolenia. Ketoprofen (5 mg/kg) należy podawać raz na dobę przez 3 dni po operacji i leczyć enrofloksacynę (5 mg/kg) raz na dobę przez 10 dni po operacji.</li>
		<li>Po zagojeniu się miejsca nacięcia (10-14 dni po zabiegu) należy zdjąć szwy. Monitoruj wzrost guza pęcherza myszy przez 2-3 tygodnie po wstrzyknięciu organoidu guza</li>.
		<li>Jeśli zaobserwuje się wzrost guza pęcherza moczowego, poddaj mysz eutanazji za pomocą inhalacji dwutlenku węgla i zbierz cały guz pęcherza moczowego. Umyj go za pomocą zimnego DPBS (Rysunek 3B)16.</li>
		<li>Aby przeanalizować histologię guza pęcherza moczowego, wybarwić zatopiony w parafinie odcinek tkanki za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H i E) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B)16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sanli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Bladder cancer.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17022(2017).</li>
<li>Stenzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+muscle-invasive+and+metastatic+bladder+cancer%3A+update+of+the+EAU+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22European+Urology%22%5BJournal%5D)">Treatment of muscle-invasive and metastatic bladder cancer: update of the EAU guidelines.</a> European Urology. 59 (6), 1009-1018 (2011).</li>
<li>Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cancer+Cell+Line+Encyclopedia+enables+predictive+modelling+of+anticancer+drug+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity.</a> Nature. 483 (7391), 603(2012).</li>
<li>Caponigro, G., Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+preclinical+testing+of+cancer+therapeutic+hypotheses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 179(2011).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407(2018).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246(2016).</li>
<li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+discovery%22%5BJournal%5D)">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-517 (2018).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-and+patient-derived+tumor+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364(2015).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+liver+cancer%E2%80%93derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human primary liver cancer–derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424(2017).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+mammalian+Hedgehog+signaling+to+the+stroma+determines+the+molecular+subtype+of+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of mammalian Hedgehog signaling to the stroma determines the molecular subtype of bladder cancer.</a> eLife. 8, 43024(2019).</li>
<li>Shin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origin+of+bladder+neoplasia+and+tissue+dynamics+of+its+progression+to+invasive+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular origin of bladder neoplasia and tissue dynamics of its progression to invasive carcinoma.</a> Nature Cell Biology. 16 (5), 469(2014).</li>
<li>Fu, C. L., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bladder+wall+injection%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%29%22%5BJournal%5D)">Mouse bladder wall injection.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (53), e2523(2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Protokół ten opisuje procedury eksperymentalne mające na celu hodowlę i utrzymanie organoidów guza pęcherza moczowego pochodzących z rakotwórczych guzów pęcherza moczowego.
W tym protokole istnieje kilka kroków eksperymentalnych, w których procedury mogą wymagać rozwiązania problemów. Po pierwsze, liczba komórek nowotworowych, które są początkowo wysiewane, jest czynnikiem krytycznym, ponieważ niska liczba komórek nowotworowych w hodowli (<2 x 104 komórek) najczęściej prowadzi do śmierci komórek z powodu braku interakcji między komórkami nowotworowymi. W przeciwieństwie do tego, rozpoczęcie od zbyt wielu komórek (>5 x 104 komórek) podczas wysiewu prowadzi do przepełnienia organoidów, co powoduje trudności podczas pracy z kulturami o słabym wzroście każdego organoidu. Zdecydowanie zaleca się, aby na początku założyć wiele płytek z różną liczbą komórek, aby zoptymalizować warunki eksperymentalne. Identyfikacja właściwej liczby początkowych komórek nowotworowych ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia najwyższej żywotności komórek i ustanowienia skutecznych organoidów guza pęcherza moczowego. Ponadto, w długotrwałej hodowli trwającej ponad 2 tygodnie bez pasażowania, większość organoidów nowotworowych przestaje rosnąć, potencjalnie z powodu niewystarczającego zaopatrzenia w składniki odżywcze w środku organoidów i wyczerpania czynnika wzrostu w macierzy błony podstawnej. Dlatego subkulturacja organoidów w odpowiednim czasie jest krytycznym krokiem w utrzymaniu hodowli organoidów nowotworowych.
Po drugie, produkcja cząstek lentiwirusa o wysokim mianie ma kluczowe znaczenie dla skutecznej manipulacji genetycznej organoidami nowotworowymi. Aby rozwiązać problemy związane z mianem wirusa, zdecydowanie zaleca się, aby miano wirusa było określane za każdym razem przed transdukcją wirusa, ponieważ konstrukty lentiwirusowe mają tendencję do wytwarzania cząstek wirusa z różną wydajnością. Jeśli organoidy nowotworowe wykazują niską żywotność po infekcji wirusowej, jest prawdopodobne, że miana wirusów są potencjalnie zbyt wysokie. W takim przypadku zdecydowanie zaleca się użycie mniejszej ilości wirusa. Po trzecie, podczas ortotopowego przeszczepu organoidów guza pęcherza moczowego indukowanych przez BBN kluczowe znaczenie ma utrzymanie integralności ściany pęcherza moczowego. W przypadku, gdy wstrzyknięcie dociera do światła pęcherza moczowego poprzez penetrację warstwy ściany pęcherza, eksperyment należy przerwać i odrzucić. Jeśli to możliwe, zaleca się monitorowanie wzrostu guza pęcherza moczowego za pomocą systemu obrazowania ultrasonograficznego.
Jednym z ograniczeń obecnych technik jest brak mikrośrodowiska lub zrębu guza w tych organoidach. Aby przezwyciężyć ten problem, zdecydowanie zaleca się, aby ortotopowe przeszczepianie organoidów nowotworowych wykorzystywało system in vivo do naśladowania natywnego mikrośrodowiska guza. W przyszłości konieczne będzie opracowanie 3D systemów organoidowych in vitro, które składają się z organoidów nowotworowych z innymi składnikami zrębu guza.
Jedną z głównych implikacji naszej techniki jest to, że w ortotopowym przeszczepie organoidów nowotworowych tylko 10 organoidów guza pęcherza moczowego może indukować wzrost guza w pęcherzu moczowym. W porównaniu z konwencjonalnymi eksperymentami przeszczepu guza, które wymagają pojedynczych komórek nowotworowych pęcherza moczowego 5 x 105-1 x 106 , nasze metody są znacznie bardziej wydajne i solidne. Inną istotną różnicą jest to, że organoidami można manipulować w różnorodny sposób przy użyciu różnych wektorów lentiwirusowych, takich jak konstrukty lentiwirusowe zawierające RNA o krótkiej spince do włosów, system CRISPR-Cas9 lub geny będące przedmiotem zainteresowania. Byłyby to potężne narzędzia, które można by dodać do obecnej technologii organoidów. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawione tutaj podejścia eksperymentalne mogą ułatwić ustanowienie modeli nowotworów in vitro, które mogą poprawić nasze zrozumienie patogenezy raka pęcherza moczowego, zamiast wykorzystywać linie komórkowe raka pęcherza moczowego 2D.
Metoda ta pozwoliła na ustalenie organoidów guza pęcherza moczowego pochodzących z wywołanego przez czynnik rakotwórczy mysiego guza pęcherza moczowego. Artykuł zawiera opis procedur eksperymentalnych za pośrednictwem lentiwirusa, za pomocą których modyfikacje genetyczne są wprowadzane i stabilnie utrzymywane w organoidach guza pęcherza moczowego. Ponadto uwzględniono procedurę ortotopowego przeszczepu organoidów nowotworowych. W połączeniu z obecnymi modelami nowotworów in vivo, technika ta będzie użytecznym narzędziem do badania molekularnych podstaw nowotworzenia pęcherza moczowego.

Rak pęcherza moczowego jest najbardziej rozpowszechnionym nowotworem dróg moczowych, z około 165 000 pacjentów umierających rocznie1. Wśród różnych typów raka pęcherza moczowego, inwazyjny rak urotelialny mięśni wykazuje agresywny fenotyp, a jego 5-letni wskaźnik przeżycia jest niższy niż 50%2. Nowatorskie opcje terapeutyczne dla inwazyjnych nowotworów urotelialnych nie zostały rozszerzone w ciągu ostatnich kilku dekad1.
Linie komórkowe raka były szeroko wykorzystywane do badań przesiewowych leków3. Chociaż zaobserwowano korzystne wyniki w przypadku wielu kandydatów na leki w liniach komórek rakowych, słabe wyniki są zgłaszane w badaniach klinicznych4. W związku ze zwiększoną adaptacją do dwuwymiarowych (2D) środowisk hodowli in vitro, coraz trudniej jest odtworzyć natywne nowotwory w liniach komórkowych. Zwierzęce modele raka lub ksenoprzeszczepy nowotworowe pochodzące od pacjentów mogą być wykorzystane do rozwiązania problemów związanych z ograniczeniami obserwowanymi w liniach komórkowych raka pęcherza moczowego. Jednak modele raka zwierzęcego są czasochłonne i zasobochłonne. W związku z tym od lat poszukiwano ulepszonych modeli chorób i opracowano nowatorski system modelowy, organoidy, w celu przezwyciężenia niedociągnięć istniejących modeli5.
Organoid to wielokomórkowy konstrukt 3D, który może podsumować in vitro fizjologiczne cechy odpowiadającego mu narządu in vivo. Organoidy normalne i nowotworowe mogą pochodzić odpowiednio z pluripotencjalnych lub dorosłych komórek macierzystych oraz pierwotnych komórek nowotworowych5,6. W ciągu ostatnich kilku lat organoidy nowotworowe zostały utworzone z dużej liczby różnych tkanek nowotworowych7, w tym colon8,9, bladder10, pancreas11,12, prostata13, wątroba14 i piersi15 tkanki nowotworowe. Takie organoidy nowotworowe naśladują swoje pierwotne guzy fenotypowo i genetycznie. Ze względu na ich podobieństwo do tkanek nowotworowych in vivo i ich liczne praktyczne zastosowania, naukowcy przyjęli je jako nowe modele chorób w badaniach patogenezy nowotworów.
Tutaj przedstawione są procedury tworzenia organoidów nowotworowych z indukowanego przez rakotwór mysiego inwazyjnego guza urotelialnego16. N-butylo-N-(4-hydroksybutylo)nitrozoamina (BBN) jest stosowana jako czynnik rakotwórczy do indukowania inwazyjnego raka urotelialnego u myszy17, a organoidy nowotworowe, które wykazują patologiczne cechy inwazyjnych guzów pęcherza moczowego inwazyjnych dla mięśni myszy, są tworzone z indukowanego przez BBN mysiego raka pęcherza moczowego16. Metoda genetycznej manipulacji organoidami guza została zilustrowana za pomocą transdukcji za pośrednictwem lentiwirusa w celu opracowania modelowego systemu do badania molekularnych podstaw rozwoju raka pęcherza moczowego. Ponadto opisano metodę ortotopowego przeszczepiania organoidów do pęcherza moczowego w celu zbadania roli rodzimego środowiska pęcherza moczowego w raku pęcherza moczowego.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mikro; m filtr strzykawkowy (membrana PES)</td>Płytka hodowlana <td>Millipore</td><td>SLHP033RS</td><td></td></tr><tr><td>10 cm</td><td>Eppendorf</td><td>0030-702-115</td><td></td></tr><tr><td>90 mm szalka Petriego</td><td>SPL</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m sitko komórkowe</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>15 ml rurka stożkowa</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>płytka 24-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>29 G 1/2 strzykawka</td><td>insulinowa SHINA</td><td>B299473538</td><td></td></tr> 3 <tr><td>ml</td><td>Norm-ject</td><td>N7. A03</td><td></td></tr><tr><td>Rurka stożkowa 50 ml</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>A8301</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>stężenie magazynowe: 25 mM</td></tr><tr><td>etanol absolutny</td><td>Daejung</td><td>4023-2304</td><td></td></tr><tr><td>Szew wchłanialny</td><td>Henry Schein</td><td>039010</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>Thermo</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu i potasu (ACK) liza bufor</td><td>Thermo</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>stężenie magazynowe: 50X</td></tr><tr><td>BBN(N-butylo-N-(4-hydroksybutylo)nitrozoamina)</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>B0938</td><td></td></tr><tr><td>Niebieski nylon 5/0-13mm</td><td>AILEE</td><td>NB521</td><td></td></tr><tr><td>C57BL Mysz</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (nude mysz)</td><td>Charles River</td><td>194</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Thermo</td><td>17100017</td><td>stężenie magazynowe: 20 mg/ml</td></tr><tr>Stężenie magazynowe<td>kolagenazy typu II</td><td>Thermo</td><td>17100015</td>: <td>20 mg/ml</td></tr> Stężenie <tr>magazynowe<td>kolagenazy/dypazy</td><td>Sigma</td><td>10269638001</td>: <td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Cyrovial</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (zmodyfikowane minimum niezbędne podłoża Dulbecco)</td> <td>Gibco</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimetylosulfotlenek)</td> <td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco)</td> <td>Welgene</td><td>LB 001-02</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloksacyna (Baytril)</td> <td>Bayer Healthcare</td><td>DIN: 02169428</td><td></td></tr><tr><td>FBS (płodowa surowica bydlęca)</td> <td>Millipore</td><td>ES009B-KC</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>100X</td></tr><tr><td>HEK 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>KWAS HEPES(4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy)Welgene</td><td></td> <td>BB001-01</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Hana Pharm Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen (Anafen)</td><td>Merial</td><td>DIN: 02150999</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Czynnik wzrostu o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR) Zredukowany czynnik wzrostu (GFR)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>zastosowanie do hodowli organoidów na płytce</td></tr><tr><td>Matrigel o wysokim stężeniu (HC)</td><td>Corning</td><td>354248</td><td>do przeszczepu organoidów</td></tr><tr><td>1,5 ml mikroprobówka</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji LT1</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>mysi EGF (naskórkowy czynnik wzrostu)</td> <td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>stężenie magazynowe: 100 i mikro; g / ml</td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>stężenie magazynowe: 200 mM</td></tr><tr>stężenie<td>nikotynamidu</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td>: 1M</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCMV.R 8.74</td><td>Addgene</td><td>22036</td><td>Opakowanie plazmidu</td></tr><tr><td>Penicylina / streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100X</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Plazmid kopertowy</td></tr><tr><td>Polybrene (bromek heksadyny etyny)</td> <td>Sigma</td><td>H9286</td><td>stężenie zapasów: 2 i mikro; g / mL</td></tr><tr><td>pSiCoR</td><td>Addgene</td><td>11579</td><td>Plazmid lentiwirusowy</td></tr><tr><td>Żyletka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor solny</td><td>JW Pharmaceutical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW41Ti wahliwy wirnik kubełkowy</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermolysin, Bacillus thermoproteolyticus</td><td>Millipore</td><td>58656-2500KUCN</td><td>stężenie zapasów: 250 KU/ml</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do ultrawirówki</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek</td><td>Abmole</td><td>M1817</td><td>stężenie fabryczne: 10 mM</td></tr></tbody></table>

hodowla, manipulacja i ortotopowe przeszczepienie organoidów guza pęcherza moczowego myszy

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

Rozwój zaawansowanych modeli nowotworów był od dawna wspierany, ponieważ obecne modele nowotworów wykazały ograniczenia, takie jak brak trójwymiarowej (3D) architektury guza i niskie znaczenie dla ludzkiego raka. Naukowcy opracowali niedawno trójwymiarowy model raka in vitro, określany jako organoidy nowotworowe, który może naśladować cechy rodzimego guza w naczyniu hodowlanym. Tutaj szczegółowo opisano procedury eksperymentalne dotyczące tworzenia organoidów guza pęcherza moczowego z wywołanego przez czynnik rakotwórczy mysiego guza pęcherza moczowego, w tym hodowla, pasaż i utrzymanie powstałych organoidów guza 3D in vitro. Ponadto opisano protokoły manipulowania ustalonymi liniami organoidów guza pęcherza moczowego na potrzeby inżynierii genetycznej przy użyciu transdukcji za pośrednictwem lentiwirusa, w tym zoptymalizowane warunki skutecznego wprowadzania nowych elementów genetycznych do organoidów nowotworowych. Na koniec przedstawiono procedurę ortotopowego przeszczepu organoidów guza pęcherza moczowego do ściany pęcherza myszy w celu dalszej analizy. Metody opisane w tym artykule mogą ułatwić stworzenie modelu in vitro raka pęcherza moczowego w celu opracowania lepszych opcji terapeutycznych.

Kultura in vitro organoidów guza pęcherza moczowego myszy 
Liczba komórek nowotworowych wydzielonych z guza o objętości ok. 1 cm3 indukowanego BBN wynosi co najmniej 4 x 105 komórek. Podczas początkowego wysiewu komórek w macierzy błony podstawnej mogą być widoczne komórki niezwyrodniałe oraz szczątki komórkowe. Szczątki te były stopniowo usuwane poprzez dalsze pasażowanie. Rysunek 1B przedstawia obrazy hodowanych organoidów w różnych punktach czasowych. Jeśli komórki nowotworowe nie tworzą organoidów, może to oznaczać, że komórki obumarły podczas etapu dysocjacji. W takim przypadku należy skorygować procedury dysocjacji, w tym czas inkubacji z enzymem, aby zwiększyć żywotność komórek.
Ekspresja GFP w organoidach guza pęcherza moczowego przy użyciu manipulacji genetycznej za pomocą lentiwirusa 
Organoidy guza pęcherza moczowego wykazały silne sygnały GFP po udanej infekcji lentiwirusowej (Rycina 2B). Po zagęszczeniu, łącznie 250 µL pożywki zawierającej wirusa wystarczyło do zainfekowania 3 x 104 pojedynczych komórek nowotworowych na macierzy błony podstawnej, przy zachowaniu wydajności infekcji na poziomie 90%–10%. Sygnały GFP można było wykryć w organoidach guza pęcherza moczowego 3 dni po transdukcji lentiwirusowej. Jeśli sygnały fluorescencji są słabe, wydajność infekcji wirusowej może być niska. Może to wynikać z licznych czynników, takich jak niski miano wirusa, w związku z czym procedury należy odpowiednio dostosować.
Ortotopowy przeszczep organoidów guza pęcherza moczowego 
Allograft guza pęcherza moczowego otrzymany z organoidów guza pęcherza moczowego indukowanych BBN przedstawiono na Rysunku 3B16. Allografty guza pęcherza moczowego pobrano 3 tygodnie po przeszczepieniu ortotopowym. Histologię przeszczepionego guza pęcherza moczowego przeanalizowano przy użyciu barwienia H&amp;E. Ortotopowe przeszczepy organoidów guza mogą rosnąć jako guzy pęcherza moczowego przez 2–3 tygodnie.
<img alt="Schemat procesu hodowli komórek nowotworu pęcherza moczowego; inkubacja krok po kroku, filtrowanie, wzrost komórek nowotworowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60469/60469fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Hodowla in vitro organoidów guza pęcherza moczowego myszy. (A) Schematycznego przedstawienia procesu tworzenia organoidów guza pęcherza moczowego myszy. (BReprezentatywne obrazy hodowli organoidów guza pęcherza moczowego w różnych punktach czasowych. Organoidy guza pęcherza moczowego myszy zostały ustanowione i hodowane przez 9 dni. Pasek skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60469/60469fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="transfekcja HEK 293T, ultrawirowanie wirusów; wzrost organoidów guza pęcherza moczowego, obrazy GFP w świetle przechodzącym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60469/60469fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ekspresja GFP w organoidach guza pęcherza moczowego z wykorzystaniem lentiwirusowej manipulacji genetycznej. (A) Schemat transfekcji lentiwirusowej i transdukcji organoidów guza pęcherza moczowego. (B) Reprezentatywne obrazy organoidów guza pęcherza moczowego wykazujących ekspresję GFP. Paski skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60469/60469fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu tworzenia organoidów guza pęcherza moczowego, konfiguracja transplantacji, mikroskopia wyników implantu organoidu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60469/60469fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3: Ortotopowy przeszczep organoidów guza pęcherza moczowego. (A) Schematyczny rysunek ortotopowej transplantacji organoidów guza pęcherza moczowego do myszy nago. (B) Reprezentatywne obrazy pęcherzy moczowych oraz przekrojów barwionych H&E u myszy z ortotopowo przeszczepionymi organoidami guza pęcherza moczowego. Powiększone widoki obszarów zaznaczonych ramkami na środkowych panelach przedstawiono na panelach lewych. Pasek skali = 500 µmRysunek ten został powielony z Rysunku 1–Rysunku uzupełniającego 1, Kim et al.16, opublikowane na podstawie międzynarodowej publicznej licencji Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY 4.0; https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60469/60469fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Pożywka do organoidów guza pęcherza moczowego myszy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12 (pożywka podstawowa)</td>
			<td>10 mM HEPES (pH 7,4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM nikotynamidu</td>
			<td>0,5x suplement bezsurowiczy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mM didepeptyd L-alanilo-L-glutaminy</td>
			<td>1% penicylina/streptomycyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM N-acetyl-L-cysteina</td>
			<td>50 ng/mL mysiego czynnika wzrostu naskórka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 µM A 83-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład pożywki do organoidów guza pęcherza moczowego.

Ten protokół dostarcza szczegółowych kroków eksperymentalnych w celu ustanowienia trójwymiarowej hodowli in vitro organoidów guza pęcherza moczowego pochodzących z wywołanego przez czynnik rakotwórczy mysiego raka pęcherza moczowego. Opisano metody hodowli, w tym pasażowanie, inżynierię genetyczną i ortotopowe przeszczepianie organoidów nowotworowych.

Hodowla, manipulacja i ortotopowe przeszczepienie organoidów guza pęcherza moczowego myszy

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Organoidy nowotworowe są szeroko stosowane jako model raka in vitro do badania biologii nowotworów. Nasz protokół zapewnia szczegółową procedurę izolacji, hodowli i genetycznej manipulacji organoidami guza pęcherza moczowego, służąc jako kluczowe narzędzie do badania różnych aspektów biologii raka. Korzystając z naszego protokołu, możemy genetycznie manipulować organoidami guza pęcherza moczowego, aby wyrazić lub znokautować gen, który nas interesuje.Ponadto, dzięki naszej metodzie przeszczepu ortotopowego, możemy stworzyć nienaruszone organoidy guza w mikrośrodowisku. Procedurę zademonstruje Yubin Kim, doktorant z naszego laboratorium. Zacznij od ustalenia organoidów guza pęcherza moczowego z mysiego guza pęcherza moczowego.Dodaj jeden mililitr 10 milimolowych HEPES-ów w DMEM do fragmentów guza i zmiel tkankę wysterylizowaną żyletką. Aby zdysocjować fragmenty do zawiesiny komórkowej, dodaj dziewięć mililitrów DMEM z HEPES, kolagenazą typu pierwszego i drugiego oraz termolizyną do kawałków guza i inkubuj je przez 1,5 do dwóch godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na wytrząsarce orbitalnej. Po inkubacji przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 mililitrów.Odwirować probówkę o ciśnieniu 400 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odessać supernatant. Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach buforu lizującego ACK i inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez trzy do pięciu minut, aby zlizować wszelkie czerwone krwinki. W międzyczasie pokryj studzienkę na 24-dołkowej płytce 150 mikrolitrami lodowatej matrycy membranowej o zmniejszonym czynniku wzrostu i umieść płytkę w inkubatorze na 30 minut.Dodaj 20 mililitrów DMEM do probówki z komórkami i powtórz wirowanie. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze 0,25% trypsyny EDTA i 10 mikromolowym dichlorowodorku Y-27632. Inkubuj probówkę przez pięć minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie zneutralizuj trypsynę, dodając 10 mililitrów DMEM z 10% FBS. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 100 mikrometrów na nowej probówce o pojemności 50 mililitrów, aby usunąć niestrawione zanieczyszczenia. Odwirować probówkę o ciśnieniu 400 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odessać supernatant.Następnie ponownie zawiesić osad jednym mililitrem DMEM i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Przenieś trzy do czterech razy 10 do czterech komórek nowotworowych do 1,5 mililitrowej mikroprobówki na lodzie i odwiruj ją w temperaturze 400 razy g przez trzy minuty w czterech stopniach Celsjusza. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach wstępnie podgrzanego podłoża organoidowego i 10 mikromolowych Y-27632.Przenieść zawiesinę komórkową do wcześniej przygotowanej matrycy membranowej, dobrze pokrytej i umieścić 24-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze. Wymieniaj pożywkę co dwa dni na 500 mikrolitrów podgrzanego podłoża organoidowego. Podziel organoidy guza na 12 godzin przed transdukcją, w której pośredniczy lentiwirus.Następnego dnia szybko rozmrozić wirusa zawierającego podwielokrotność w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodać rozmrożonego wirusa do 250 mikrolitrów pożywki organoidowej z 10 mikromolami Y-27632 i ośmioma mikrogramami na mililitr bromku heksadimetryny. Zastąp podłoże organoidowe na płytce 24-dołkowej 500 mikrolitrami pożywki zawierającej wirusa i inkubuj płytkę przez 12 do 16 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Aby przygotować organoidy guza pęcherza moczowego do przeszczepu ortotopowego, dodaj 500 mikrolitrów kolagenazy do podłoża organoidowego na płytce 24-dołkowej. Pipetować matrycę błony podstawnej i pożywkę w górę iw dół, a następnie inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji zebrać komórki do 15-mililitrowej probówki i dodać pięć mililitrów podgrzanego DMEM.Następnie odwirować probówkę o ciśnieniu 400 razy g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odessać supernatant. Ponownie zawiesić osad z jednym mililitrem DMEM i przenieść roztwór na 90-milimetrową szalkę Petriego. Pod mikroskopem zbierz od 10 do 100 organoidów nowotworowych za pomocą pipety P200 i zbierz je do mikroprobówki na lodzie.Odwirować mikroprobówkę i ostrożnie usunąć supernatant. Następnie utrzymuj osad na lodzie, aż myszy będą gotowe do operacji. Przed przeszczepem ściany pęcherza podśluzówkowego należy przechowywać strzykawki, końcówki pipet i matrycę błony podstawnej na lodzie, aż będą gotowe do użycia.Po znieczuleniu myszy połóż ją w pozycji leżącej na plecach i utrzymuj znieczulenie, wdychając maskę 2% odparowanego izofluranu. Nałóż jod powidonu sterylną gazą i przetrzyj go 70% etanolem. Wykonaj małe poprzeczne nacięcie w skórze i ścianie mięśniowej dolnej linii środkowej brzucha za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych.Odsłoń pęcherz z jamy brzusznej i podeprzyj go wacikiem nasączonym solą fizjologiczną. Zawiesić granulki organoidów w 80 mikrolitrach pożywki organoidowej zawierającej 50% matrycy błony podstawnej o wysokim stężeniu i wstrzyknąć zawiesinę do przedniej części kopuły pęcherza moczowego za pomocą strzykawki insulinowej. Zamknij nacięcie nylonowym szwem 4-0 i zdezynfekuj miejsce operowane jodonem i 70% etanolem.Pozwól myszy odzyskać sprawność pod promiennikiem podczerwieni przez 10 do 15 minut. Następnie ponownie monitoruj mysz, aż odzyska przytomność. Organoidy guza pęcherza moczowego myszy założono i hodowano przez dziewięć dni.Jeśli komórki nowotworowe nie tworzą organoidów nowotworowych, zostały potencjalnie zabite na etapie dysocjacji i może być konieczne dostosowanie czasu trawienia enzymatycznego. Organoidy guza pęcherza moczowego wykazywały silne sygnały GFP przy udanym zakażeniu lentiwirusowym. Po koncentracji łącznie 250 mikrolitrów pożywki zawierającej wirusa wystarczyło do zainfekowania 30 000 pojedynczych komórek nowotworowych na macierzy błony podstawnej i utrzymania skuteczności infekcji na poziomie od 90 do 100%.Allografie guza pęcherza moczowego pobrano trzy tygodnie po przeszczepie ortotopowym, a histologię guza przeanalizowano za pomocą barwienia H&E. Ortotopowe przeszczepy organoidów nowotworowych mogą rosnąć jako guzy pęcherza moczowego przez dwa do trzech tygodni. Po tej procedurze naukowcy mogą przeprowadzić immunohistochemię powstałych organoidów nowotworowych lub przeprowadzić ilościowy RT-PCR dla genów będących przedmiotem zainteresowania.Eksperymenty te mogą dodatkowo scharakteryzować organoidy guza. Nasz protokół pozwala nam łatwo manipulować genami w komórkach nowotworowych w porównaniu z modelem mysim, zachowując jednocześnie charakterystykę nowotworów in vivo w celu zbadania specyficznych funkcji różnych genów zaangażowanych w nowotworzenie raka pęcherza moczowego.

culture-manipulation-orthotopic-transplantation-mouse-bladder-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Wstrzykiwanie do ściany pęcherza moczowego myszy jest przydatnym podejściem do ortotopowych badań nad biologią komórek macierzystych pęcherza oraz biologią nowotworów. Tę precyzyjną metodę mikrochirurgiczną można opanować dzięki starannej technice i praktyce.

Iniekcja w ścianę pęcherza myszy

Guzy pęcherza moczowego u myszy żeńskich indukuje się w sposób małoinwazyjny poprzez cewnikowanie, lokalną kauteryzację oraz następującą po niej adhezję komórek raka do miejsc oparzeń.

Ortotopowy model mysiego raka pęcherza moczowego

Ustanowienie ortotopowego modelu nowotworu pęcherza moczowego w celu oceny efektów przeciwnowotworowych wewnątrz pęcherzowo podanego saRNA oraz monitorowanie wzrostu guza za pomocą ultradźwięków i obrazowania bioluminescencyjnego.

Ortotopowy model nowotworu pęcherza moczowego oraz ocena leczenia wewnątrz pęcherzowego za pomocą saRNA

W tym filmie opisujemy ortotopową transplantację hodowanych organoidów guza pęcherza moczowego do mysiego pęcherza moczowego, aby zbadać rolę środowiska narządu w rozwoju nowotworów.

Model organoidów guza pęcherza moczowego: metoda ortotopowego przeszczepu organoidów pęcherza moczowego do mysiego pęcherza biorcy

W tym filmie opisujemy dopęcherzową procedurę dostarczania komórek rakowych do pęcherza moczowego modelu mysiego. Procedura ta pomaga wygenerować ortotopowy model guza pęcherza moczowego, który można wykorzystać do opracowania strategii terapeutycznych.

Modelowanie ortotopowego guza pęcherza moczowego w modelu mysim: procedura dopęcherzowego podawania komórek rakowych do mysiego pęcherza moczowego

Implantacja komórek nowotworowych do narządu pochodzenia może służyć jako użyteczny model przedkliniczny do oceny nowych terapii. Komórki raka pęcherza moczowego MB49 mogą być hodowane w pęcherzu moczowym po wkropleniu dopęcherzowym. Protokół ten demonstruje cewnikowanie pęcherza myszy w celu implantacji guza i dostarczenia adenowirusa.

Ortotopowy model raka pęcherza moczowego do badań nad dostarczaniem genów

Opisana jest prosta metoda ustalania pierwotnego organoidu guza jelita grubego u myszy. Metoda ta wykorzystuje tę cechę, że komórki nowotworowe jelita grubego przeżywają i rosną w organoidy w pożywkach zawierających ograniczone czynniki wzrostu, podczas gdy normalny nabłonek okrężnicy nie.

Metody in vitro Hodowla organoidowa pierwotnych guzów jelita grubego myszy

Sprawdzona technika szczepienia pierwotnych inwazyjnych ksenoprzeszczepów raka ortotopowego pęcherza moczowego wymaga laparotomii i mobilizacji pęcherza. Procedura ta powoduje znaczną zachorowalność u myszy, jest technicznie trudna i czasochłonna. W związku z tym opracowaliśmy wysoce precyzyjne, przezskórne podejście wykorzystujące kontrolę ultrasonograficzną.

Małoinwazyjne założenie mysich ortotopowych ksenoprzeszczepów pęcherza moczowego

Ten protokół opisuje powstawanie mysich ortotopowych guzów pęcherza moczowego u samic myszy C57BL/6J oraz monitorowanie wzrostu guza.

Mysi ortotopowy model guza pęcherza moczowego i system wykrywania guzów

Organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) są potężnym narzędziem w translacyjnych badaniach nad rakiem, odzwierciedlając zarówno genetyczną i fenotypową heterogeniczność choroby, jak i odpowiedź na spersonalizowane terapie przeciwnowotworowe. W tym miejscu szczegółowo omówiono skonsolidowany protokół generowania PDO ludzkiego pierwotnego raka pęcherza moczowego w ramach przygotowań do oceny analiz fenotypowych i odpowiedzi na leki.

Hodowla organoidów raka pęcherza moczowego jako narzędzia medycyny precyzyjnej

Ten protokół opisuje proces generowania i charakterystyki mysich organoidów urotelialnych zawierających delecje w interesujących genach. Metody obejmują pobieranie mysich komórek urotelialnych, transdukcję ex vivo z adenowirusem napędzającym ekspresję Cre za pomocą promotora CMV oraz charakterystykę in vitro i in vivo.

Ex vivo Organoidalny model delecji genów za pośrednictwem adenowirusa-cre w mysich komórkach urotelialnych

Poznaj metodę hodowli, manipulacji genetycznej i ortotopowego przeszczepienia organoidów guza pęcherza moczowego myszy. Ten protokół umożliwia badanie biologii nowotworowej w modelu in vitro i in vivo.

Hodowla, manipulacja i ortotopowe przeszczepienie organoidów guza pęcherza moczowego myszy

Przeglądaj więcej filmów